CN115058520A - 一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、引物对、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、引物对、试剂盒及其应用。本发明首先提供了一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列，并提供了扩增所述靶序列的特异性引物对，所述的特异性引物对弥补了现有检测技术的不足，操作简便快捷，灵敏度高、特异性强、简单快速、成本低，提高了青海血蜱鉴定的效率和准确性，能够满足青海血蜱快速、准确的物种分子鉴定需求。适用于青海血蜱分布调查，种群分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作，具有重要的理论意义和应用价值。

Description

一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、引物对、试剂盒 及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、引物对、试剂盒及其应用。
背景技术
青海血蜱属于寄螨目，蜱总科，硬蜱科，主要分布在我国的青海省和甘肃省的牧区，属于我国的特有种，是广泛寄生于脊椎动物的体外寄生虫。一种蜱可传播多种不同的病原，一种病原也可由多种不同的蜱传播。青海血蜱可传播羊泰勒虫，羊巴贝斯虫和牦牛泰勒虫等，对牧区危害极大。青海血蜱为三宿主蜱，一个生活周期包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱4个阶段，更换3次宿主。蜱虫的分类鉴定对于蜱传播病原的溯源和流行病学调查非常重要。
蜱的鉴定包括形态学鉴定和分子生物学鉴定，传统的形态学鉴定，其优点是比较直观、操作简便、对环境条件要求低等，但这种方法对鉴定人员的专业知识、工作经验、特殊的仪器设备和标本的完整性等方面要求高。另外，形态学方法对一些外形比较相似的蜱、肢体不完整的蜱、亲缘种蜱以及处于卵发育阶段等的一些特殊蜱样品较难以鉴定。近几年发展起来的分子检测技术，特别是PCR技术，在微生物快速鉴定和检测方面的应用，为寄生虫的快速检测开辟了新的途径，对于克服蜱虫传统形态学鉴定的弊端有显著优势。在传统形态学分类的基础上，结合分子生物学鉴定方法，能简易、准确鉴定蜱的种类。
本发明在研究过程中发现，在Genbank数据库中登陆的青海血蜱一段基因组DNA序列(包括ITS1，5.8srRNA和ITS2基因)与Genbank数据库登陆号为(JQ737126.1)的镰形扇头蜱的基因组DNA序列完全一致。因镰形扇头蜱与青海血蜱在形态学和其他分子分类数据上差异非常大。因此，申请人认为登录号为(JQ737126.1)的基因组DNA序列实际上来源于青海血蜱。在传统形态学分类鉴定青海血蜱的基础上，为了进一步采用分子分类的方法明确鉴定青海血蜱，经过生物信息学序列分析，申请人发现了青海血蜱的一对特异性引物，所述的特异性引物对可以用于鉴定青海血蜱，有利于防控青海血蜱及其传播病原的溯源和流行病学调查。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的第二目的是提供所述的靶序列在非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中的应用。
本发明的第三目的是提供用于扩增所述靶序列的特异性引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明的第四目的是提供所述的特异性引物对在非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中的应用。
本发明的第五目的是提供所述的特异性引物对在制备鉴定或辅助鉴定青海血蜱试剂盒中的应用。
本发明的第六目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的试剂盒，所述的试剂盒中含有权利要求3所述特异性引物对。
本发明的第七目的是提供所述的试剂盒在非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中的应用。
本发明的第八目的是提供一种非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定待测硬蜱类寄生虫是否为青海血蜱的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测昆虫的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物对可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测硬蜱类寄生虫为或候选为青海血蜱；如果采用所述引物对不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测硬蜱类寄生虫不为或候选不为青海血蜱。
优选的，步骤(2)所述的PCR扩增：
反应体系为50μl，加入10×PCR buffer 5μl、上、下游引物对(10mM)各2μl、dNTPs(10mM)2μl、Taq酶(50U)1μl以及10～20ng DNA模板2μl，加灭菌双蒸水至50μl，以灭菌双蒸水为阴性对照。
优选的，步骤(2)所述的PCR扩增：
反应程序为：预热94℃，5min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。
本发明的有益效果是：本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、特异性引物对、试剂盒，并具体提供了鉴定方法，所述的鉴定方法对弥补了现有检测技术的不足，操作简便快捷，灵敏度高、特异性强、简单快速、成本低，提高了青海血蜱鉴定的效率和准确性，能够满足青海血蜱快速、准确的物种分子鉴定需求。适用于青海血蜱分布调查，种群分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作，具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明设计的青海血蜱正向扩增引物HQ-F序列与Genbank数据库其他血蜱ITS2序列进行BLAST比对分析的结果；
图2为本发明设计的青海血蜱反向扩增引物HQ-R序列与Genbank数据库其他血蜱ITS2序列进行BLAST比对分析的结果；
图3为用本发明设计的特异性引物对蜱虫DNA样本进行PCR检测的凝胶电泳图；其中M：DL2000Marker；1：青海血蜱成蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)2:青海血蜱幼蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)；3:青海血蜱卵(Haemaphysalis qinghaiensis)4：长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)；5：距刺血蜱(Haemaphysalis spinigera)；6:草原革蜱(Dermacentor nuttalli)；7：1#血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)；8：2#血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)；9：1#亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)；10：镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)；11：猛突血蜱(Haemaphysalis zoster)12：微小牛蜱(Boophilus microplus)。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明的青海血蜱、长角血蜱采自甘肃，微小牛蜱、血红扇头蜱、亚洲璃眼蜱、草原革蜱采自新疆。距刺血蜱、猛突血蜱采自云南。所有样品均保存于中国农业科学院兰州兽医研究所。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
实施例1青海血蜱特异性扩增引物的设计
本发明根据蜱虫内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列为基础，通过MEGA软件CLUSTALW程序，将该序列与Genbank数据库中其他血蜱ITS2序列进行比对分析，确定特异性扩增青海血蜱ITS2的靶序列，设计青海血蜱特异性扩增引物对，分别为：
正向引物HQ-F：5'GCTGGCGCACTGTCGGAAGGGCT 3'(如SEQ ID No.2所示)
反向引物HQ-R：5'GGACGGGGTAAGCGCACCAACG 3'。(如SEQ ID No.3所示)
引物设计BLAST比对结果如图1所示。选用HC-F和HC-R引物对进行PCR扩增，获得618bp的DNA特异性条带，如SEQ ID No.2-3所示，对其进行测序、BLAST比对，确定该特异性扩增引物对(SEQ ID No.2-3所示)可用于鉴定青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)。
本发明经过筛选获得的特异性扩增引物对为HQ-F和HQ-R，分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
实施例2鉴定青海血蜱的PCR方法的建立
1、样品处理及DNA基因组提取
将草原革蜱(Dermacentor nuttalli)；长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)；距刺血蜱(Haemaphysalis spinigera)；亚洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)；猛突血蜱(Haemaphysalis zoster)；青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)；微小牛蜱(Boophilus microplus)；血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)；镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)等样本用蒸馏水洗净，分别置于1.5ml离心管中，加入200μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0；50mmol/L NaCl；0.45％Tween20；0.45％NP-40)，用研磨棒将样品研碎，涡旋混匀，再加入10μl蛋白酶K(100μg/ml)，56℃消化过夜。然后95℃处理5分钟，12000rpm离心5分钟，转移上清至新的离心管中，得到基因组DNA，可用于PCR扩增。
2、特异性PCR扩增
反应体系为50μl，加入10×PCR buffer 5μl、上、下游引物对(10mM)各2μl、dNTPs(10mM)2μl、Taq酶(50U)1μl以及10～20ng DNA模板2μl，加灭菌双蒸水至50μl，以灭菌双蒸水为阴性对照。
PCR反应程序：预热94℃，5min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
结果如图3所示，阴性对照为灭菌双蒸水，青海血蜱样品的电泳结果出现清晰且亮度较高的618bp大小的条带，反之，其他泳道无此条带出现或出现拖尾、引物二聚体等非特异性扩增，则为其他蜱虫或非蜱虫样本。进一步说明本发明的方法特异性好，准确度高。
综上所述，本发明提供了用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、特异性引物对、试剂盒，并具体提供了鉴定方法，所述的鉴定方法对弥补了现有检测技术的不足，操作简便快捷，灵敏度高、特异性强、简单快速、成本低，提高了青海血蜱鉴定的效率和准确性，能够满足青海血蜱快速、准确的物种分子鉴定需求。适用于青海血蜱分布调查，种群分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作，具有重要的理论意义和应用价值。
本发明的试剂盒可用于对青海血蜱进行快速鉴定，具有特异性强、准确率高、低成本的特点，操作简便，适用于青海血蜱区域分布调查，种群进化分析及相关蜱传疫病的控制等研究分析工作。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的靶序列、引物对、试剂盒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> 青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)
<400> 1
gctggcgcac tgtcggaagg gctcggagcg gctgagccga gcgtgcttga aggcgcgctt 60
gaccgccggc ggcccccttt ccaggcttgt gcagtcgtct ctgggaatct gaattctccg 120
actccgtgtt ggcggtggaa atacgcgact cggccgcggc cttccgatgg gtgagaaggc 180
acgcggaagc ggattccccc cacttttgaa cgcgcgcgcg ttgcccggta gaagattagg 240
cgcgcgccgg ccagacgcac ttcgctgcag gaaagcctcg gaaacgattc ggaatgtttc 300
tacgagtcga ttgcctgcat gtgggawgga gatgcgttag ccggtgccct tttcycccgc 360
ggagaacgca ccctttgcca agttggacgc gatccgtcgt agtccgccgt cggtctaagt 420
gcttcgcagt ctctgcccca agtaatctgg gtcactccag tgggggcggg ggcgaacgtt 480
tcttgagatg atgctcgrca accggttgag gtcgtcctcg tgagggtttg cgaggcggca 540
gggaattatt cgaccgcggg tgcacacgag ctgccttatc gtttctgctg cgccgtcgtt 600
ggtgcgctta ccccgtcc 618
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctggcgcac tgtcggaagg gct 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacggggta agcgcaccaa cg 22

Claims (10)

1.一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱(Haemaphysalis qinghaiensis)的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的靶序列在非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中的应用。
3.用于扩增权利要求1所述靶序列的特异性引物对，其特征在于，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.如权利要求3所述的特异性引物对在非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中的应用。
5.如权利要求3所述的特异性引物对在制备鉴定或辅助鉴定青海血蜱试剂盒中的应用。
6.一种用于鉴定或辅助鉴定青海血蜱的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求3所述特异性引物对。
7.权利要求6所述的试剂盒在非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定青海血蜱中的应用。
8.一种非疾病诊断目的的鉴定或辅助鉴定待测硬蜱类寄生虫是否为青海血蜱的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测昆虫的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述引物对进行PCR扩增，然后进行如下判断：
如果采用所述引物对可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测硬蜱类寄生虫为或候选为青海血蜱；如果采用所述引物对不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测硬蜱类寄生虫不为或候选不为青海血蜱。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR扩增：
反应体系为50μl，加入10×PCR buffer 5μl、上、下游引物对(10mM)各2μl、dNTPs(10mM)2μl、Taq酶(50U)1μl以及10～20ng DNA模板2μl，加灭菌双蒸水至50μl，以灭菌双蒸水为阴性对照。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR扩增：
反应程序为：预热94℃，5min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，共30个循环；末次延伸72℃，7min，4℃保存。
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