CN104498608B - 利用snp标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法 - Google Patents

利用snp标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法，包括从要考察意大利蜂群中收集幼虫样本、幼虫DNA提取、合成目的引物、以提取的每个个体DNA为模版进行PCR、将PCR产物进行电泳检测后再测序、最后将获得的测序结果比对分析，根据从该蜂群中随机收集的幼虫个体在该SNP标记C2587245T出现C等位基因的频率<i>P</i><i>C</i>和T等位基因的频率<i>PT</i>之间是否存在差异鉴别蜂群抗白垩病性状。本发明从分子生物学水平，针对意大利蜜蜂蜂群受白垩病影响严重的问题，提供了使用意大利蜜蜂幼虫抗白垩病相关的SNP（C2587245T）标记能够科学、准确、快速地鉴别意大利蜜蜂蜂群抗白垩病性能强弱，可以大大缩短意大利蜜蜂抗白垩病育种的选育周期，加快蜜蜂育种速度，降低白垩病发生对养蜂业造成的损失。

Description

利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别蜜蜂蜂群抗白垩病性状的方法，具体涉及一种利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法。
背景技术
我国是养蜂大国，白垩病是蜜蜂幼虫的一种真菌性病害，在全球范围内普遍流行、发生。白垩病的发生可降低刚出房蜜蜂的数量，使蜂群的生产性能降低，有时还会造成严重的蜂群损失。目前，国内外有不少学者涉及白垩病的研究，一直以来，我国的蜂业科技工作者致力于蜜蜂的病理、抗病育种等相关研究，以期发现白垩病的发病机理、抗白垩病的遗传标记等，为蜜蜂抗病育种服务。就蜜蜂抗病的行为机制、分子标记意义和SNP技术及其在蜜蜂疾病领域的应用等方面进行的研究概述如下：
1、抗病行为机制
蜜蜂个体从患病幼虫中察觉到化学刺激之后就迅速从巢房中移走患病幼虫，从而减少病原菌的传播，这是蜜蜂的一种群体免疫机制的具体表现。有研究人员在以下几个领域研究发现，培育抗病和抗螨的蜜蜂品系时，发现清巢能力强的蜜蜂品系很少患美洲幼虫腐臭病、白垩病及被蜂螨寄生；具有较强卫生行为的蜂群其优势在于能够在早期发现感染幼虫的死亡并在它们变成干尸之前将其迅速清出巢房；鉴定和选育幼虫本身具有抗白垩病相关的基因也许是一种最有效的控制该病的方式。因此筛选与卫生行为相关的基因标记也有可能成为一种遗传标记，但是目前这种标记还没有公开发表出来。
2、分子标记意义
蜜蜂基因组测序工作的完成为从分子水平进一步研究蜜蜂的抗白垩病机制提供了重要基础。如果能够从分子水平掌握蜜蜂的抗白垩病机制，筛选出与蜜蜂抗白垩病性状密切相关的分子标记，可以为培育抗白垩病蜂种提供理论及技术支持。研究发现，相对与确定抗病性显性基因的大难度、高成本，筛选分子遗传标记无疑为一种有效的育种手段。蜜蜂的卫生行为等一些行为性状几乎都是最理想的抗白垩病性状，但是很难对它们进行准确的定性及定量检测，而分子遗传标记可以直接通过确定与目标基因紧密连锁的基因位点而加快选择速度和提高选择准确度，SNP位点就是这类标记，同时为改良蜜蜂遗传信息、辅助培育抗病蜂种提供宝贵的信息。
3、SNP技术
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基(A与G)和嘧啶碱基(C与T)之间。SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记之一。目前，可以通过提取基因组DNA并随机打断、加上接头、上机测序、生物信息学分析等步骤可以准确获得基因组的SNP信息，筛选出与特异性状相关的SNP分子标记。
作为新一代生物技术，虽然SNP技术具有极高的实用价值、在人类疾病领域的应用已相对成熟，且取得了一定进展，但是该技术在蜜蜂抗白垩病分子标记方面的研究及利用的仍然较少。因此，本方法采用SNP技术对意大利蜜蜂幼虫抗白垩病性状进行鉴定，据此可以准确、高效、快速地选择抗白垩病蜜蜂进行育种，甚至为通过基因手段培育更加优质的抗病蜂种奠定良好基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
本发明的利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法，其特征在于鉴别步骤如下：
（1）蜂群中蜜蜂幼虫取样：从要考察的意大利蜜蜂蜂群中随机收集3日龄的蜜蜂幼虫，每群20只蜜蜂幼虫，每个个体放在一个离心管里，于-20℃冷冻备用；
（2）幼虫样本DNA的提取：分别将步骤（1）的冷冻幼虫进行组织破碎，提取幼虫DNA，并进行DNA浓度和纯度测定；
（3）扩增产物含有该SNP标记的引物序列如下：
Primer-F：5’-GTCAAGGTATCACAAGCGTCA-3’
Primer-R：5’-ATAGTTCGCCCACGACCA-3’；
（4）PCR检测：以步骤（2）幼虫DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR；
反应的体系为：总体积25ul，内含反应底物Mix12.5ul，Primer-F0.6ul，Primer-R0.6ul，DNA模版1ul，ddH2O10.3ul；
反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min；
对PCR反应产物进行凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序；
（5）鉴别蜂群抗白垩病性状：将步骤（4）的测序结果用Sequencher软件进行序列分析，根据蜂群的C等位基因频率PC值，鉴别蜂群抗白垩病性状。当蜂群的C等位基因频率PC>54%，则此蜂群为抗白垩病蜂群。
所述SNP标记为蜜蜂幼虫抗白垩病相关的基因组位点C2587245T。
本发明的显著优点是：
1、蜂群的抗病能力会受到基因型的影响，而且存在抗病蜂群中特定等位基因显著高于敏感组蜂群。该SNP标记等位基因C基因频率PC在抗白垩病蜂群和白垩病敏感蜂群中的差异显著，即抗病蜂群中C等位基因频率显著高于白垩病敏感蜂群中C等位基因频率，因此根据此结果可以方便、快捷、准确地鉴定蜂群是具有抗白垩病的能力还是容易感染白垩病的敏感蜂群。
2、根据统计指标判断蜂群的抗白垩病能力：蜂群中随机收集的幼虫个体在该SNP标记位点PC和PT之间无显著差异的是抗白垩病蜂群，PC和PT之间有显著差异的是白垩病敏感蜂群。据此可以淘汰掉这些敏感的蜂群，以免白垩病爆发对养蜂生产造成严重损失。采用本发明利用蜜蜂幼虫抗白垩病相关的SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法，可以大大降低传统方的弊端。
3、当蜂群发生了白垩病以后，较多使用药物来进行治疗，使用化学药物治疗白垩病不仅会对蜂产品造成严重污染，严重影响了蜂产品品质；另外，长期使用药物防治很可能会使病原产生抗药性，以致使用药物防治白垩病无效。而使用本发明方法目前主要在实验室从分子水平掌握蜜蜂的抗白垩病机制，检测与抗病性状相关的分子遗传标记，并结合分子遗传标记辅助蜜蜂品种选育技术，不但能保证选择的准确性，还可以加快蜜蜂品种选育速度，大大提高了选育抗白垩病蜂种的成功率，可以安全、有效、快速地解决蜜蜂白垩病困扰。
4、由于白垩病的病原可以产生孢子，蜜蜂对白垩病死尸的清理实际上有可能使病原在蜂箱中及个体间传播，使用SNP分子标记辅助选育抗白垩病幼虫的蜜蜂品种是控制蜜蜂白垩病传播的一种有效途径。
附图说明
附图为蜜蜂幼虫抗白垩病相关的SNP标记的基因型判断参考峰图。其中：
图1中方框标注的SNP标记基因型为纯合CC，主要在抗病蜂群中出现；
图2中方框标注的SNP标记基因型为杂合CT，抗病蜂群和敏感蜂群中都存在；
图3中方框标注的SNP标记基因型为纯合TT，主要存在于敏感蜂群中。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1
一种利用SNP标记鉴别意大利蜜蜂蜂群抗白垩病性状的方法，包括以下步骤：
（1）蜜蜂幼虫取样：从要考察的没有其它明显的疾病影响的意大利蜜蜂蜂群中随机收集3日龄的蜜蜂幼虫，每群20只蜜蜂幼虫，每个个体放在一个离心管里，于-20℃冷冻保存备用；
（2）幼虫样本DNA的提取（使用生工公司的动物基因组快速提取试剂盒，SK8222）
将步骤（1）的幼虫放在离心管里面进行组织破碎，加入350ulBufferDigestion，震荡均匀，65℃水浴1h至细胞完全裂解。
加入150ulBufferPA，充分颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置5min。
室温10000rpm离心5min，将上清液400ul转移到新的1.5ml离心管中，如果上清液有浑浊，加入等体积的氯仿混匀，12000rpm离心取上清。
加入等体积的异丙醇，手工震荡1min，室温放置2min，室温10000rpm离心5min，弃上清液。
加入650ml体积比为75%的乙醇（超纯水稀释），手工震荡1min，使沉淀悬浮起来，室温10000rpm离心2min，弃上清液。
重复步骤一次。
打开离心管盖倒置在干净纸巾上，至残留的乙醇完全挥发，获得DNA。
将得到的DNA用150ulTEBuffer溶解，检测所提取的DNA的浓度和OD值，最后将其-20℃保存备用。
（3）含有该SNP标记扩增产物的上、下游引物序列如下
Primer-F：5’-GTCAAGGTATCACAAGCGTCA-3’
Primer-R：5’-ATAGTTCGCCCACGACCA-3’；
将其稀释至10umol/ul，用后-20℃保存。
（4）PCR检测：以步骤（2）的每个幼虫的个体的DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序。
PCR反应体系(25ul):
Mix:12.5ul
Primer-F:0.6ul
Primer-R:0.6ul
Template:1.0ul
ddH2O:10.3ul
反应条件：
预变性：94℃，4min
以下三步共35个循环
变性：94℃，30s
退火：58℃，30s
延伸：72℃，1min
延伸：72℃，8min
（5）SNP标记的筛选和对获得的测序结果分析：
标记筛选：
从三组不同的蜂群中移取1日龄幼虫在实验室采用成熟的幼虫饲养技术进行饲养，实验移虫和饲养技术能保证正常的对照组幼虫存活率在85%以上，对实验结果不会产生直接影响。
在第三日龄饲喂幼虫含有白垩病病原蜜蜂球囊菌的食物，在饲喂含有病原的食物感染后第九天时仍然没有表现出白垩病症状的蜜蜂幼虫作为抗病个体，而在饲喂含有病原的食物早期即感染白垩病的蜜蜂幼虫作为白垩病敏感的幼虫个体。
易感病蜜蜂幼虫个体采集过程中，当观察到蜜蜂幼虫身体末端出现白色菌丝，将此个体收集起来-20℃保存，以保证样本的新鲜度。抗病样品和敏感样品用灭菌过的离心管收集，做好标记，-20℃保存，备用。
样本收集完后，再随机选取来自于六个蜂群的抗白垩病个体两个和白垩病敏感个体两个，抗病个体六个，敏感个体六个，一共十二个个体。十二个样本的全基因组重测序工作委托华大基因公司完成，之后将获得的基因组序列数据进行比对分析，初步获得了很多SNP标记；最后对这些标记进一步过滤，只保留六个抗病个体共有而敏感个体没有的SNP标记，一共71个可能的与抗白垩病相关的SNP标记。
下一步再使用收集的抗病个体和敏感个体的DNA模版对这71个SNP标记进行验证，其中一个与蜜蜂幼虫抗白垩病密切相关的SNP标记为SNP（C2587245T）。
下面是部分该SNP标记PCR产物片段的参考序列，该SNP（C2587245T）标记在序列中的位置标记为C/T代表一个多态性标记。
5’-AGCGTCACTGTTCGAGAAAATTCTCCGAGAAAGTTGGCAAATTCGATGAACGTGATTCACGAATGGAAATATCTCGATTATGATTTCGGTAGCGACGAAAGGAGGCAAGCTGCGATTCAATCTGGCGAATATGACCATACGAAAAATTATCCCTTCGATGTCGATCAATGGCGTGGTAAAATATTCGTATTTTAATTAATATTGTATTTTGCTTCTCGAATCACTTAATATTCC/TATTCACTTAATATTCAATTTCGTTACTTGAATTTCTCAATTTTTAAATTGTTAGAATATATTCCACATTTTATTTCACGTTACTTGTTCAAGGTATGACTTTTGTAACCGTACCAAGATACAAAGGTGTACCTTCTTCTTTGAACGTGATATCTAAGAAAATTGGCAACGGTGGACGACTTCTACAACCGTATCCT-3’
查看PCR产物测序峰图，定位该SNP标记在峰图中的位置，基因型峰图标准如图1、图2、图3标记位置显示，判断每个样本该标记是纯合CC、杂合CT或纯合TT三种类型中的哪种基因型并统计。
（6）利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状：将步骤（4）的测序结果用Sequencher软件进行序列比对、统计该标记峰图类型，是单一峰，如图1和图3，还是出现重叠的套峰，如图2所示；计算出基因型和基因频率，如表1所示。根据分析结果，如果鉴定蜂群的C等位基因频率PC>54%，则符合抗病蜂群的标准，此蜂群为抗病蜂群。
实施例2利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法，通过对正常生产蜂场中50群群势基本一致的意大利蜜蜂蜂群进行蜂群水平的感染，从中筛选出了抗病能力差异显著的蜂群，即抗病的和敏感的各三群；每个蜂群中随机收集24个3日龄幼虫，PCR扩增含有该SNP（C2587245T）标记的DNA片段，测序之后，使用Sequencher软件看峰图、筛查该SNP标记在每个幼虫DNA片段上的多态性，统计出每个蜂群在该标记的基因频率。
具体整理的数据如下：
表1A不同基因型对蜂群抗病能力的影响及基因频率分布情况
注：不同基因型对蜂群抗病能力影响的卡方检验P<0.05。
表1B不同基因型对蜂群抗病能力的影响及基因频率分布情况
注：不同基因型对蜂群抗病能力影响的卡方检验P<0.05。
表1C不同基因型对蜂群抗病能力的影响及基因频率分布情况
注：不同基因型对蜂群抗病能力影响的卡方检验P<0.05。
(1)表1A、表1B、表1C通过费希尔确切概率T检验(Fisher’sExactTest)统计结果表明三组不同抗病能力的蜂群与不同基因型之间存在显著差异，都具有统计学意义（P<0.05），表明蜂群的抗病能力会受到基因型的影响。
(2)对六个蜂群进行归类，三个抗病组为3T组、三个敏感组为3S组，之后进行卡方检测，结果表明抗病能力不同的蜂群与不同基因型之间的关系达到极显著水平（P<0.05），见表2，其相对与表1A、表1B、表1C来说增加了样本量，同样表明蜂群的抗病能力受到基因型影响。
表2三个抗病群和三个敏感蜂群个体基因型分布情况交叉表
注：不同基因型对蜂群抗病能力影响的卡方检验P<0.05。
表3三个抗病群与三个敏感蜂群中个体的等位基因C的频率PC配对样本ｔ检验
注：P=0.048<0.05
根据表2的分组方法，对不同抗病能力蜂群与其个体在该SNP标记的等位基因频率进行统计分析，检测抗病蜂群和敏感蜂群中幼虫个体在该SNP标记处等位基因的类型，结果表明存在显著差异，有统计学意义（P<0.05），即抗病蜂群中C等位基因频率PC显著高于白垩病敏感蜂群中C等位基因频率，见表3。
另外，分析表明该SNP标记基因型频数分布符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）；风险估计统计分析表明等位基因C是抗病的优势基因，可以使疾病发生的危险程度降低（OR=1.939，95%CI：1.459~2.578），而等位基因T是暴露因素，携带T等位基因的个体白垩病发病风险提高（OR=0.584，95%CI：0.463~0.736），见表4。
对蜂群的抗病能力与等位基因频率之间相关系数的显著性检验表明：对于C等位基因，相关系数r**=-0.9371，P=0.0058<0.01，即C等位基因与每个蜂群中平均患白垩病尸体个体数之间存在极显著的负相关关系，PC越大蜂群患白垩病的尸体个数越少；对于T等位基因，相关系数r**=0.9371，P=0.0058<0.01，即T等位基因与每个蜂群平均患白垩病尸体个体数之间存在极显著的正相关关系，PT越大蜂群患白垩病的尸体个数越多；同时对发病风险基因T的基因频率PT与蜂群可能发病的情况进行建立回归方程来进行预测和控制：
y=-661.04597+16.1497x(x变量是PT，y变量是预测蜂群中可能的发病个体数目)
综合分析以上分析：
（1）蜂群抗白垩病的优势基因C等位基因频率与蜂群中平均患白垩病尸体个体数之在极
显著的负相关关系，即PC越大蜂群患白垩病的尸体个数越少；
（2）根据表3统计结果，C等位基因频率PC=（59.58±5.22）%，也就是抗病蜂群中幼
虫个体C等位基因的频率PC=54.36%~64.90%；
所以如果鉴定蜂群的C等位基因频率PC>54%，则符合抗病蜂群的标准，此蜂群为抗病蜂群。
本发明采用的主要试剂如下（所有化学试剂均为分析纯）：
无水乙醇，异丙醇，氯仿，超纯水，全式金TransDNAMarkerI，全式金2×EasyTaqPCRSuperMix，全式金琼脂糖，全式金Galstain，生工50×TAE电泳缓冲液，动物基因组快速提取试剂盒SK8222，上下游引物由合成，核酸酶A。
本发明所使用的仪器主要如下：
Axygen1.5ml离心管，AxygenPCR管，微波炉，电子天平，震荡器，小型离心机，水浴锅，微量移液枪，电泳仪，AB公司96孔PCR仪，上海培清科技有限公司凝胶成像分析仪，Qiagen组织破碎仪TissueLyserII，高速离心机，低温冰箱，高压灭菌锅，NanoDrop2000等。
<110>福建农林大学
<120>利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gtcaaggtatcacaagcgtca21
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atagttcgcccacgacca18
<210>3
<211>431
<212>DNA
<213>蜜蜂幼虫
<400>3
agcgtcactgttcgagaaaattctccgagaaagttggcaaattcgatgaacgtgattcac60
gaatggaaatatctcgattatgatttcggtagcgacgaaaggaggcaagctgcgattcaa120
tctggcgaatatgaccatacgaaaaattatcccttcgatgtcgatcaatggcgtggtaaa180
atattcgtattttaattaatattgtattttgcttctcgaatcacttaatattcctattca240
cttaatattcaatttcgttacttgaatttctcaatttttaaattgttagaatatattcca300
cattttatttcacgttacttgttcaaggtatgacttttgtaaccgtaccaagatacaaag360
gtgtaccttcttctttgaacgtgatatctaagaaaattggcaacggtggacgacttctac420
aaccgtatcct431

Claims (3)

1.一种利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法，其特征在于鉴别步骤如下：
（1）蜜蜂幼虫取样：从考察的意大利蜜蜂蜂群中，随机收集3日龄的蜜蜂幼虫，每群20只蜜蜂幼虫代表整个蜂群，每个个体放在一个1.5ml离心管里，于-20℃冷冻备用；
（2）幼虫样本DNA的提取：分别将步骤（1）的冷冻幼虫进行组织破碎，提取幼虫DNA，并进行浓度和纯度测定；
（3）鉴定引物序列如下：
Primer-F：5’-GTCAAGGTATCACAAGCGTCA-3’
Primer-R：5’-ATAGTTCGCCCACGACCA-3’
扩增产物目的片段大小为465bp；
（4）PCR检测：以步骤（2）幼虫DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR；
反应的体系为：总体积25ul，内含反应混合物Mix12.5ul，Primer-F0.6ul，Primer-R0.6ul，DNA模版1ul，ddH2O10.3ul；
反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min；
对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序；
（5）鉴别蜂群抗白垩病性状：将步骤（4）的测序结果用Sequencher软件进行序列比对分析，根据蜂群的C等位基因频率PC值，鉴别蜂群抗白垩病性状。
2.根据权利要求1所述的一种利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法，其特征在于蜂群的C等位基因频率PC>54%，则此蜂群为抗白垩病蜂群。
3.根据权利要求1所述的一种利用SNP标记鉴别蜂群抗白垩病性状的方法，其特征在于所述SNP标记为蜜蜂幼虫抗白垩病相关的基因组位点C2587245T。
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