CN116622862B - 棉鼠微卫星分子标记及其引物对与应用、棉鼠遗传检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及遗传检测的技术领域，具体公开了棉鼠微卫星分子标记及其引物对与应用、棉鼠遗传检测的方法。本申请提供了棉鼠微卫星分子标记，棉鼠微卫星分子标记选自30个STR位点的任意一种或多种，所述30个STR位点的核苷酸序列分别对应为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.30所示。本申请还提供了用于PCR扩增上述微卫星分子标记位点的引物对及其在棉鼠的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。本申请提供的为棉鼠微卫星分子标记及其引物对棉鼠的遗传学研究提供了分子技术支持，有助于建立实验动物棉鼠质量控制标准，进而有助于为生命科学和医学研究提供一种新型的合格实验动物。

Description

棉鼠微卫星分子标记及其引物对与应用、棉鼠遗传检测的 方法
技术领域
本申请涉及遗传检测的技术领域，具体涉及棉鼠微卫星分子标记及其引物对与应用、棉鼠遗传检测的方法。
背景技术
棉鼠，属于啮齿目、仓鼠科、棉鼠属，共有8个种属。刚毛棉鼠和黄腹棉鼠常被用作实验动物，以刚毛棉鼠更为常用。刚毛棉鼠有25个亚种，主要分布在美国南部、墨西哥和中美洲南方地区及南美洲北部。我国1972年引入棉鼠，并用于丝虫病的研究。
棉鼠（Cotton Rat，Sigmodom Hispidus）对包括病毒、细菌和寄生虫在内的多种人类病原体易感，尤其对呼吸道病原敏感，是呼吸道疾病研究的重要动物模型。棉鼠被认为是呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）治疗方法和候选疫苗临床前评估的“金标准”。棉鼠感染RSV的概率比其它小鼠高100倍甚至以上，棉鼠用于RSV感染研究的一个优势是其肺部解剖学结构与人类相似，其细支气管的内层由纤毛柱状呼吸道上皮细胞（RSV感染的靶点）组成，棉鼠感染RSV后主要集中在鼻上皮、支气管和细支气管的呼吸道上皮中，这种症状与人类患者感染后症状相似度极高。与其他啮齿动物模型相比，棉鼠发生原发性结核分枝杆菌感染后，在组织学上更类似于人类的原发性结核分枝杆菌疾病特征。棉鼠是唯一一个易受呼吸道麻疹病毒（Morbillivirus measles virus，MeV）感染的啮齿动物，这种感染伴随着有丝分裂原刺激后体内B和T细胞反应的抑制。通过对棉鼠丝虫两性成虫、胚胎及各发育期微丝蚴形态学的研究和了解，为抗丝虫药物研发提供实验基础和动物模型。为了研究RSV感染的单克隆抗体药物，赵晓东等在棉鼠注射RSV抑制剂帕利珠单抗（Palivizumab, PZ）后，用RSV感染棉鼠，以进行呼吸道合胞病毒单克隆抗体抵抗株的体内筛选。
标准化的棉鼠不仅可为药学研究和开发提供标准化的实验材料，极大地促进医药的研发，而且对于整合实验动物资源，促进实验动物新资源增量有重要作用。要使培育的棉鼠符合标准，为生命科学和医学研究提供一种新型的合格实验动物，研究建立实验动物棉鼠质量控制标准就显得尤为迫切。但是，国内外尚无棉鼠遗传检测方法的报道。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本申请提供了棉鼠微卫星分子标记及其引物对与应用、棉鼠遗传检测的方法。
第一方面，本申请提供了棉鼠微卫星分子标记（short tandem repeats，STR），所述棉鼠微卫星分子标记选自30个STR位点的任意一种或多种，所述30个STR位点分别为：所述30个STR位点分别为：SPF104、SPF105、SPF108、SPF109、SPF111、SPF112、SPF001、SPF014、SPF023、SPF025、SPF035、SPF036、SPF037、SPF040、SPF048、SPF049、SPF051、SPF060、SPF064、SPF069、SPF073、SPF076、SPF077、SPF080、SPF084、SPF030、SPF082、SPF072、SPF078、SPF092；所述30个STR位点的核苷酸序列分别对应为SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 30所示。
本申请基于微卫星位点标记技术，提供了棉鼠微卫星分子标记及其引物对与应用，并将其用于棉鼠遗传检测中。用微卫星标记侧翼序列设计引物进行PCR扩增，由于重复次数的不同形成片段长度不同，经毛细电泳分离，成像表现出不同的电泳带型。由于微卫星具有丰富的多态性、位点数量多并且分布广，检测方法简便、快速、稳定性好和结果可靠等优点，被认为是物种遗传多样性评估的最佳分子标记，已广泛地应用于生物群体遗传特性的检测中。
优选地，所述30个STR位点的核心序列分别为：
所述SPF104位点的核心序列为AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
所述SPF105位点的核心序列为TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；
所述SPF108位点的核心序列为AAAAAAAAAAAAAA；
所述SPF109位点的核心序列为GGGGGGGGGGGGGGGGGGG；
所述SPF111位点的核心序列为CCCCCCCCCCCCC；
所述SPF112位点的核心序列为CCCCCCCCCCC；
所述SPF001位点的核心序列为TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC；
所述SPF014位点的核心序列为TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
所述SPF023位点的核心序列为GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
所述SPF025位点的核心序列为ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC；
所述SPF035位点的核心序列为CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA；
所述SPF036位点的核心序列为ACACACACACACACACACACACACACACACACACAAACACAC；
所述SPF037位点的核心序列为GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
所述SPF040位点的核心序列为AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG；
所述SPF048位点的核心序列为GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
所述SPF049位点的核心序列为ACACACACACACACACACACACACACACACACAC；
所述SPF051位点的核心序列为GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA；
所述SPF060位点的核心序列为GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGAGA；
所述SPF064位点的核心序列为TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
所述SPF069位点的核心序列为ACACACACACACACACACACAC；
所述SPF073位点的核心序列为CACACACACGCGCGCACACACACACACACACACACACACACACACACACACA；
所述SPF076位点的核心序列为GTGTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
所述SPF077位点的核心序列为GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
所述SPF080位点的核心序列为TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
所述SPF084位点的核心序列为ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC；
所述SPF030位点的核心序列为TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
所述SPF082位点的核心序列为GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGA；
所述SPF072位点的核心序列为ATAATAATAATAATAATAATA；
所述SPF078位点的核心序列为AGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAT；
所述SPF092位点的核心序列为ATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAA。
第二方面，本申请提供了用于PCR扩增上述棉鼠微卫星分子标记的引物对，所述的引物对为SEQ ID NO. 31至SEQ ID NO. 90所示；其中：
用于PCR扩增SPF104的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO.32；
用于PCR扩增SPF105的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO.34；
用于PCR扩增SPF108的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO.36；
用于PCR扩增SPF109的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO.38；
用于PCR扩增SPF111的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO.40；
用于PCR扩增SPF112的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO.42；
用于PCR扩增SPF001的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO.44；
用于PCR扩增SPF014的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO.46；
用于PCR扩增SPF023的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO.48；
用于PCR扩增SPF025的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO.50；
用于PCR扩增SPF035的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO.52；
用于PCR扩增SPF036的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO.54；
用于PCR扩增SPF037的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO.56；
用于PCR扩增SPF040的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 57、SEQ ID NO.58；
用于PCR扩增SPF048的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 59、SEQ ID NO.60；
用于PCR扩增SPF049的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 61、SEQ ID NO.62；
用于PCR扩增SPF051的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 63、SEQ ID NO.64；
用于PCR扩增SPF060的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 65、SEQ ID NO.66；
用于PCR扩增SPF064的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 67、SEQ ID NO.68；
用于PCR扩增SPF069的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO.70；
用于PCR扩增SPF073的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 71、SEQ ID NO.72；
用于PCR扩增SPF076的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 73、SEQ ID NO.74；
用于PCR扩增SPF077的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 75、SEQ ID NO.76；
用于PCR扩增SPF080的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 77、SEQ ID NO.78；
用于PCR扩增SPF084的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 79、SEQ ID NO.80；
用于PCR扩增SPF030的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 81、SEQ ID NO.82；
用于PCR扩增SPF082的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 83、SEQ ID NO.84；
用于PCR扩增SPF072的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 85、SEQ ID NO.86；
用于PCR扩增SPF078的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 87、SEQ ID NO.88；
用于PCR扩增SPF092的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO. 89、SEQ ID NO.90。
优选地，所述的引物对的上游引物5’端设带有荧光标记。
优选地，所述荧光标记为FAM荧光基团。
第三方面，本申请提供了棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合，用于PCR扩增SPF104、SPF105、SPF108、SPF109、SPF111、SPF112、SPF001、SPF014、SPF023、SPF025、SPF035、SPF036、SPF037、SPF040、SPF048、SPF049、SPF051、SPF060、SPF064、SPF069、SPF073、SPF076、SPF077、SPF080、SPF084、SPF030、SPF082、SPF072、SPF078、SPF092的引物对中的两种或多种。
第四方面，本申请提供了一种试剂盒，包括上述棉鼠微卫星分子标记的引物对或上述棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合。
第五方面，本申请提供了上述棉鼠微卫星分子标记、上述棉鼠微卫星分子标记的引物对、上述棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合或上述试剂盒在棉鼠的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。
第六方面，本申请提供了一种棉鼠遗传检测的方法，基于上述棉鼠微卫星分子标记、上述棉鼠微卫星分子标记的引物对、上述棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合或上述试剂盒，具体包括以下步骤：
提取棉鼠基因组DNA；
合成如SEQ ID NO. 31至SEQ ID NO. 90所示的引物对；
以提取的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增获得扩增产物；
对扩增产物进行分离和多态性检测。
优选地，所述PCR扩增的反应体系如下：
PCR总反应体积为20μL，其中含2×PCR Mix：2μL，上下游引物（100pmol/μL）各1μL，基因组DNA：1μL，纯水（ddH2O）：7μL。PCR反应程序为：95℃预变性，5min；95℃变性，30s；退火温度60℃，30s；72℃延伸，45s；30个循环；72℃继续延伸7min；扩增产物4℃保存。
综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：
本申请提供的为棉鼠微卫星分子标记及其引物对棉鼠的遗传学研究提供了分子技术支持，有助于建立实验动物棉鼠质量控制标准，进而有助于为生命科学和医学研究提供一种新型的合格实验动物。
附图说明
图1为本申请纯合子棉鼠30个STR位点的STR扫描和条带大小分析结果。
具体实施方式
本申请从棉鼠基因组（Whole Genome Shotgun (WGS): INSDC: PVIH00000000.1；ID：56361）数据中导出核心序列为1~6个碱基的微卫星位点和核心序列两端各500 bp的侧翼序列，用在线引物设计网站Primer Blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）设计各位点的扩增引物，并用PCR和Sanger测序法证实这些微卫星引物的存在。后续通过琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序、TA克隆测序和STR扫描等方式筛选出一组30个STR位点的组合用于棉鼠遗传检测。
一、30个STR位点的引物对的上下游序列为SEQ ID NO. 31至SEQ ID NO. 90所示，具体如表1所示：
表1 30个STR位点的引物对的上下游序列
二、30个STR位点的核苷酸序列对应为SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 30所示，30个STR位点及各位点的核心序列如表2所示：
表2 30个STR位点的核苷酸序列及各位点的核心序列
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三、具体实施方案如下：
1. 仪器设备
4℃和-20℃冰箱，低温高速离心机，水浴锅，感量为0.0001g的分析天平，Nanodrop，PCR仪，电泳仪和电泳槽，震荡仪，组织匀浆器，微波炉，凝胶成像仪等。
2. 基因组DNA的提取
取0.1g小鼠组织/细胞、或2 mm左右鼠尾尖等，用酚-氯仿萃取法或试剂盒提取基因组DNA，试剂盒法步骤如下：
把待测样本放入1.5mL无菌离心管中，用StarSpin柱式通用DNA提取试剂盒（GenStar，D133）提取基因组DNA，步骤如下：
2.1向离心管中加入200μL Buffer GA和20μL蛋白酶K于56℃水浴锅中过夜、裂解。
2.2向离心管中加入200μL Buffer GB，颠倒混匀，于70℃水浴锅中孵育10min。
2.3向离心管中加入200μL无水乙醇，震荡混匀，12000rmp离心10s去除挂壁的液体。
2.4将离心管内的液体全部转移到Spin Columns with Collection Tubes-GC（吸附柱放入收集管中）中，12000 rmp离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
2.5向吸附柱中500μL Buffer GW1，12000rmp离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
2.6向吸附柱中加入500μL Buffer GW2，12000rmp离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
2.7重复步骤2.6。
2.8将吸附柱放回收集管中，12000rmp离心3min，弃掉收集管，将吸附柱放置在新的无菌EP管中，打开吸附柱管盖，室温静置5min。
2.9向吸附柱中加入60μL Buffer EB，室温静置5min，12000rmp离心2min。长期不使用DNA放置于-20℃保存。
3.聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增
引物送天一辉远合成。
以待测样本基因组DNA为模板，按照表1中各位点对应引物进行PCR扩增，注意加样时避光。
PCR总反应体积为20μL，其中含2×PCR Mix：2μL，上下游引物（100pmol/μL）各1μL，基因组DNA：1μL，纯水（ddH2O）：7μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性，5min；95℃变性，30s；退火温度60℃，30s；72℃延伸，45s；30个循环；72℃继续延伸7min；扩增产物4℃保存。
4. PCR产物的检测
5μL PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。
5.扩增产物测序和结果判读
剩余PCR产物避光送天一辉远进行STR扫描，后根据扫描结果进行分析，STR扫描的条带大小分析结果如图1所示（单位：bp）。
6. 结果判定
近交系定义为“一个群体动物中，任何个体基因组中98.6%以上的座位为纯合的品系”（引自GB14923-2022）。
6.1近交系棉鼠采用20-30个STR分子标记位点进行评价，群体内各位点第一次遗传检测结果作为标准参考位点。当品系内所有遗传检测个体的STR位点条带大小完全一致，且与参考位点一致时，该群体未发生遗传变异，遗传质量合格；当有1个位点与标准参考位点不一致时，增加检测位点数目和增加检测方法后复检，当只有1个标记基因改变且检测个体均一致时，可命名为同源突变系；当有1个位点表现为多态/杂合子时，增加检测位点数目和增加检测方法后复检仍表现为多态/杂合子，该群体发生遗传突变，需要溯源或育种；1个或1个以上位点的标记基因与标准参考位点不一致或为多态/杂合子时，近交系群体判为不合格。
其中，STR位点的纯合和杂合基因型是根据STR扫描峰图分析，纯合子：该位点的等位基因大小相同；杂合子：该位点的等位基因大小不同。只有一个主峰，即为纯合子；有两个主峰即为杂合子。条带大小通过STR扫描结果判读峰图为准，一般情况下，峰图片段大小的读取结果会有1bp左右的误差。通过峰图判断个体的纯合子和杂合子之后，数字大小是比对各个纯合子样本之间基因型是否一致的方法。一般根据核心序列的碱基数目来区分，两个样本片段大小大小差异至少要达到核心序列的碱基数，才认为两个个体的基因型不一致。例AG为核心序列的位点，2个个体差距在2bp以上才认为基因型不一致。差距在1bp以下，我们认为两个样本基因型一致。必要时进行TA克隆测序验证个体基因型结果。
6.2封闭群棉鼠用群体是否达到平衡状态来判定，群体观测的平均杂合度在0.5~0.7 之间，且期望杂合度与观测杂合度经χ2检验无明显差异时，则判定该封闭群合格，否则该封闭群群体判为不合格；或按照哈代-温伯格（Hardy-Weiberg）定律，根据各位点的等位基因数计算封闭群的基因频率，进行χ2检验。如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群群体判为不合格。
以下结合实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1
选择来源自斯贝福（北京）生物技术有限公司的近亲交配的近交系棉鼠进行遗传检测，种群中选择14个个体、20个STR位点进行遗传检测。各棉鼠个体剪5mm尾尖，并按照上述DNA提取步骤进行DNA提取，终浓度为50-150 ng/μl。接着按上述流程进行PCR扩增和STR扫描，基因型和条带大小结果（单位：bp）如表3所示（注：只记录一个条带大小即为纯合子）。
表3 实施例1中STR扫描的条带大小结果
表3的 结果显示，群体内所有遗传检测个体的STR位点各个体条带大小完全一致，该群体为近交系棉鼠群体。
实施例2
选择来源自斯贝福（北京）生物技术有限公司的近亲交配的近交系棉鼠进行遗传检测，种群中选择14个个体、10个STR位点（实施例1中20个位点以外的）进行遗传检测。各棉鼠个体剪5mm尾尖，并按照上述DNA提取步骤进行DNA提取，终浓度为50-150 ng/μl。接着按上述流程进行PCR扩增和STR扫描，条带大小结果（单位：bp）如表4所示。
表4 实施例2中STR扫描的条带大小结果
结果显示，部分个体部分位点（加粗）与其他个体扩增产物不一致，说明扩大位点检测中，该种群存在一定量的突变，需要进一步育种。
实施例1和实施例2的结果说明，本发明的STR位点组合可以用于近交系棉鼠的遗传检测，但是由于位点选择位置和种群特性的选择的问题，选择部分位点时，可能存在由于位点代表性的问题，可能会存在有些突变检测不到的情况出现，即20个STR位点支持该群体为近交系种群，但是30个位点检测时，有三个位点存在杂合。建议在对遗传检测结果存在疑问时，扩大样本量或者STR位点数目进行检测。
实施例3
选择来源自某公司随机交配繁育的引种棉鼠进行遗传检测，种群中选择20个个体进行20个STR位点遗传检测。各棉鼠个体剪5mm尾尖，并按照上述DNA提取步骤进行DNA提取，终浓度为50-150 ng/μl。接着按上述流程进行部分为点的PCR扩增和STR扫描，条带大小结果（单位：bp）如表5所示。
表5 实施例3中STR扫描的条带大小结果
表6 实施例3中单态位点与多态位点的分析结果
用常规的20个位点用于遗传检测，结果显示单态位点共有10个，分别为SPF104、SPF108、SPF109、SPF037、SPF064、SPF069、SPF073、SPF077、SPF072和SPF092，多态位点和多个基因型的位点也有10个，按照检测标准“1个或1个以上位点的标记基因与标准参考位点不一致或为多态/杂合子时，近交系群体判为不合格”，该群体判断为不合格的近交系棉鼠种群。反向证明了我们的棉鼠近交系遗传检测STR位点组合在近交系遗传检测中的有效性。
实施例4
微卫星位点组合常用于近交系和封闭群动物的遗传检测，我们的位点在检测过程中也存有杂合子存在，我们对实施例3中的多态位点按照封闭群动物的检测方案进行检测。为了进行群体遗传学分析，我们将STR扫描结果用字母进行标注和分析，A指代最常见的等位基因型（片段长度）、B指代第二常见的等位基因型（片段长度），必要时（有第三种或第四种等位基因型/片段长度），用字母C、D表示。根据每一个的个体的结果标注其基因型，AA或BB为纯合子、AB为杂合子，结果显示10个多态位点和多个基因型的棉鼠位点其基因型分析如表7所示。
表7 实施例4中10个多态位点和多个基因型的棉鼠位点的基因型分析结果
将所有样本的每个STR位点的基因型以 AA、BB 、AB等形式输入 Popgen1.32 软件中分析。利用该软件计算不同个体在各位点上的观测杂合度、期望杂合度、及香隆信息指数等群体遗传参数，分析结果如表8所示。
表8 实施例4中STR位点的多态性参数分析结果
封闭群棉鼠用群体是否达到平衡状态来判定，群体观测的平均杂合度在0.5~0.7之间，且期望杂合度与观测杂合度经χ2检验无明显差异时，则判定该封闭群合格，否则该封闭群群体判为不合格。本群体中，平均杂合度在0.5~0.7 之间的位点共有1个，但是这个位点期望杂合度与观测杂合度之间有显著差异；或按照哈代-温伯格（Hardy-Weiberg）定律，该10个位点未达到平衡状态。综上分析，该群体不是封闭群群体。
总的来说，因为目前没有标准封闭群棉鼠群体证明该检测位点可用于封闭群棉鼠的检测。但是SPF084位点杂合度上的表现、多各位点的杂合性，以及不同单位繁育封闭群动物的遗传差异性，我们有理由相信该位点组合中，对标准封闭群棉鼠遗传检测时，可一共检测方法和检测位点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.棉鼠微卫星分子标记，其特征在于，所述棉鼠微卫星分子标记为20个STR位点：所述20个STR位点分别为：SPF104、SPF108、SPF109、SPF112、SPF001、SPF014、SPF025、SPF035、SPF036、SPF037、SPF064、SPF069、SPF073、SPF076、SPF077、SPF084、SPF030、SPF072、SPF078、SPF092；所述20个STR位点的核苷酸序列分别对应为SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3-4、SEQID NO. 6-8、SEQ ID NO. 10-13、SEQ ID NO. 19-23、SEQ ID NO. 25-26、SEQ ID NO. 28-30所示。
2.根据权利要求1所述的棉鼠微卫星分子标记，其特征在于，所述20个STR位点的核心序列分别为：
所述SPF104位点的核心序列为AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
所述SPF108位点的核心序列为AAAAAAAAAAAAAA；
所述SPF109位点的核心序列为GGGGGGGGGGGGGGGGGGG；
所述SPF112位点的核心序列为CCCCCCCCCCC；
所述SPF001位点的核心序列为TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC；
所述SPF014位点的核心序列为TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
所述SPF025位点的核心序列为ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC；
所述SPF035位点的核心序列为CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA；
所述SPF036位点的核心序列为ACACACACACACACACACACACACACACACACACAAACACAC；
所述SPF037位点的核心序列为GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
所述SPF064位点的核心序列为TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
所述SPF069位点的核心序列为ACACACACACACACACACACAC；
所述SPF073位点的核心序列为CACACACACGCGCGCACACACACACACACACACACACACACACACACACACA；
所述SPF076位点的核心序列为GTGTGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
所述SPF077位点的核心序列为GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
所述SPF084位点的核心序列为ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC；
所述SPF030位点的核心序列为TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
所述SPF072位点的核心序列为ATAATAATAATAATAATAATA；
所述SPF078位点的核心序列为AGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAT；
所述SPF092位点的核心序列为ATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAA。
3.用于PCR扩增权利要求1所述的棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合，其特征在于，
用于PCR扩增SPF104的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32；
用于PCR扩增SPF108的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36；
用于PCR扩增SPF109的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38；
用于PCR扩增SPF112的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42；
用于PCR扩增SPF001的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44；
用于PCR扩增SPF014的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46；
用于PCR扩增SPF025的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50；
用于PCR扩增SPF035的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52；
用于PCR扩增SPF036的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54；
用于PCR扩增SPF037的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56；
用于PCR扩增SPF064的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 67、SEQ ID NO. 68；
用于PCR扩增SPF069的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 70；
用于PCR扩增SPF073的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 71、SEQ ID NO. 72；
用于PCR扩增SPF076的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 73、SEQ ID NO. 74；
用于PCR扩增SPF077的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 75、SEQ ID NO. 76；
用于PCR扩增SPF084的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 79、SEQ ID NO. 80；
用于PCR扩增SPF030的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 81、SEQ ID NO. 82；
用于PCR扩增SPF072的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 85、SEQ ID NO. 86；
用于PCR扩增SPF078的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 87、SEQ ID NO. 88；
用于PCR扩增SPF092的引物对，上下游序列分别为SEQ ID NO. 89、SEQ ID NO. 90。
4.根据权利要求3所述的棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合，其特征在于，所述的引物对的上游引物5’端设带有荧光标记。
5.根据权利要求4所述的棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合，其特征在于，所述荧光标记为FAM荧光基团。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求3-5任一项所述的棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合。
7.权利要求1-2任一项所述的棉鼠微卫星分子标记、权利要求3-5任一项所述的棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合或权利要求6所述的试剂盒在棉鼠的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。
8.一种棉鼠遗传检测的方法，其特征在于，基于权利要求1-2任一项所述的棉鼠微卫星分子标记、权利要求3-5任一项所述的棉鼠微卫星分子标记的引物对的组合或权利要求6所述的试剂盒，具体包括以下步骤：
提取棉鼠基因组DNA；
合成所述的棉鼠微卫星分子标记的引物对；
以提取的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增获得扩增产物；
对扩增产物进行分离和多态性检测。
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光间受体视黄类物质结合蛋白基因(IRBP)在棉鼠亚科物种中的序列变异及其系统发育意义;张静;夏珊;;四川动物(02);第35-40页 *

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