CN102051417A - 扁浒苔的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了扁浒苔的检测试剂盒及检测方法，该检测试剂盒包括10×PCR反应缓冲液，MgCl₂溶液，dNTP溶液，TaqDNA聚合酶溶液，正向引物和反向引物，它们的体积比为2.5∶1.5∶2∶0.2∶1∶1，正向引物的核苷酸序列为：5′-CGTTTTCGGA ACCGCCGGTGA-3′，反向引物的核苷酸序列为5′-GGCCAGGTCCACGGCCCGCTCT-3′；检测方法通过DNA提取得到模板DNA溶液、模板DNA溶液与检测试剂盒的各溶液组成为PCR反应体系，通过PCR反应得到PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳，根据是否出现330bp的特异性片段条带就快速、简单地判定是否为扁浒苔，准确将扁浒苔从其他海藻样品种分离出来，能检测具有较多鉴定特征的扁浒苔成熟藻体，还可以对形态特征较少的幼苗以及其他发育形态扁浒苔藻体进行快速鉴定。

Description

扁浒苔的检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及检测试剂，具体涉及扁浒苔的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

扁浒苔属石莼属，可以食用或药用，但大量增殖会引发绿潮等海洋灾难，造成有害生物爆发和水生生物缺氧死亡等。目前鉴定石莼属绿藻的方法包括形态学观察、杂交测试鉴定和分子发育系统学鉴别等。形态学观察依据有叶状体或丝状体的形状、细胞的形状、细胞的大小、叶状体的厚度、细胞的排列方式、叶绿体的位置、蛋白核的数量等形态特征，但同种藻类生活环境不同会出现较大的变化，不同种的藻类则可能会有相似的形态，如肠浒苔通常没有分枝，而扁浒苔有分枝，但低盐或盐休克可以诱导肠浒苔形成分枝，同时形态学观察耗时较长，要求实际操作人员有一定形态学观察基础，难以满足快速、准确的鉴定要求。杂交测试通过对不同性别间配子的杂交实验来实现，根据是否存在生殖隔离，即能否杂交来判断种类，该方法操作要求更高，试验周期也较长。分子学鉴别主要是利用藻类细胞核的核糖体基因转录间隔区序列和叶绿体的核酮糖－二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因序列构建系统发育树，并综合形态学观察结果，来确定种类，但该方法同样存在实验周期较长问题，且该方法的准确性受分析所用序列、分析方法等多种因素影响，有时可能会获得不准确的结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供操作简单、快速、准确鉴别扁浒苔的检测试剂盒。

本发明还提供了用该试剂盒快速、简单地判定是否为扁浒苔的检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：扁浒苔的检测试剂盒，该检测试剂盒包括10×PCR反应缓冲液、双蒸水、摩尔浓度为25mM 的MgCl₂溶液、摩尔浓度为2.5 mM 的dNTP溶液、浓度为5 U /μL 的Taq DNA聚合酶溶液、摩尔浓度为10 μM的正向引物和反向引物，所述反应缓冲液与所述MgCl₂溶液、所述dNTP溶液、所述Taq DNA聚合酶、所述正向引物和所述反向引物的体积比为2. 5：1.5：2 ：0.2 ：1 ：1，所述正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTTTTCGGA  ACCGCCGGTG A-3’，所述反向引物的核苷酸序列为5’-GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT-3’。

若为25μL PCR反应体系，使用时取检测试剂盒中反应缓冲液2.5μL， MgCl₂溶液1.5μL， dNTP溶液2μL， Taq DNA聚合酶溶液0.2μL，正向引物和反向引物各1μL，加入终浓度约为1ng/μL的藻类DNA提取物即模板DNA溶液1μL，用双蒸水补充到25μL，若为50μL PCR反应体系，各成份体积就相应加倍。 

10×PCR反应缓冲液、dNTP溶液、Taq DNA聚合酶购于大连宝生物，正、反向引物引物由上海英俊合成。

扁浒苔的检测方法，包括下述步骤：

1）DNA提取：挑取单株藻体，称取0.1～0.2 g的藻体放入1.5 ml第一离心管中，加200μL 65℃水浴预热pH8.0的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）抽提液，研磨至匀浆，再加入400μL 65℃水浴预热的十六烷基三甲基溴化铵抽提液，颠倒混匀后于65℃水浴1 h，冷却至室温，12000 rpm离心10 min，取第一上清液至第二离心管中，加入体积为300μL的三羟基氨基甲烷饱和酚（Tris饱和酚），体积为300μL的氯仿和异戊醇混合液，颠倒混匀后静置，12000rpm离心10min，取第二上清液至第三离心管中，加入与第二上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min，取第三上清液至第四离心管中，加入与第三上清液等体积的异丙醇，轻轻颠倒混合均匀，于-20℃下沉淀1h，12000rpm离心10min，弃去第三上清液，在第四离心管加入质量百分浓度为70%的乙醇500μL，至沉淀悬浮，12000rpm离心5min，弃去第四上清液，室温干燥，再在第四离心管加入50μL 无菌水溶解沉淀，得到模板DNA溶液，使用分光光度计调整模板DNA溶液浓度为1ng/μL，于-20 ℃贮存备用，所述十六烷基三甲基溴化铵抽提液含有质量百分浓度为2% 的十六烷基三甲基溴化铵、摩尔浓度为1.4 M 的氯化钠（NaCl）, 摩尔浓度为20mM 的乙二铵四乙酸二钠（EDTA二钠）, 摩尔浓度为100mM 的三羟基氨基甲烷盐酸（Tris·HCl），所述氯仿和异戊醇混合液由氯仿与异戊醇按体积比为24：1配制； 

2）PCR反应：在所述检测试剂盒取反应缓冲液2.5μL、MgCl₂溶液1.5μL， dNTP溶液2μL， Taq DNA聚合酶溶液0.2μL，正向引物和反向引物各1μL，加入1μL模板DNA溶液，用双蒸水定容至25μL，进行PCR反应，PCR反应条件为：94℃，预变性2 min；然后进入下列循环：94℃，变性30 s，60℃，退火40 s, 72℃，延伸40 s，34个循环；最后72℃，延伸10 min；得到PCR产物；

3）检测：取上述PCR产物5μL于质量百分浓度为2％的琼脂糖TAE凝胶中，进行电泳分离，电泳后经EB染色，根据有无330bp特异性片段来判断，若有330bp特异性片段就为扁浒苔。

2％琼脂糖TAE凝胶由琼脂糖与TAE缓冲液按重量体积比2：100配置得到；CTAB、EDTA、Tris·HCl、琼脂糖、TAE缓冲液等均为市售化学产品。

与现有技术相比，本发明的优点在于：扁浒苔的检测试剂盒，该检测试剂盒包括10×PCR反应缓冲液，25mM的MgCl₂溶液，2.5mM的dNTP溶液， 5U/μL的Taq DNA聚合酶溶液，10μM的正向引物和反向引物，它们的体积比为2. 5：1.5：2 ：0.2 ：1 ：1，正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTTTTCGGA  ACCGCCGGTG A-3’，反向引物的核苷酸序列为5’-GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT-3’；该检测试剂盒只需要少量藻体在数小时内就可以获得准确结果， DNA含量为10pg也能灵敏检测，能够准确的将扁浒苔从其他海藻样品种分离出来，不仅能检测具有较多鉴定特征的扁浒苔成熟藻体，还可以对形态特征较少的幼苗以及其他发育形态扁浒苔藻体进行快速鉴定，该检测试剂盒对操作人员要求不高，因此本发明是一种操作简单、快速、准确鉴别扁浒苔的检测试剂盒。扁浒苔的检测方法通过DNA提取得到模板DNA溶液、模板DNA溶液与检测试剂盒的各溶液组成为PCR反应体系，通过PCR反应得到PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳，根据是否出现330bp的特异性片段就可快速、简单地判定是否为扁浒苔。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

扁浒苔的检测试剂盒，该检测试剂盒包括下述各管：10×PCR反应缓冲液2.5μL、摩尔浓度为25mM的MgCl₂溶液1.5μL、摩尔浓度为2.5mM的dNTP溶液2μL、浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶溶液0.2μL、摩尔浓度10μM的正向引物和反向引物各1μL和双蒸水，正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTTTTCGGA  ACCGCCGGTG A-3’，反向引物的核苷酸序列为5’-GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT-3’，该检测试剂盒可以与终浓度约为1ng/μL的藻类DNA提取物（模板DNA）1μL，用双蒸水补充到25μL，组成25μL PCR反应体系。

上述实施例中检测试剂盒的各成份的体积相应增加1倍，模板DNA的体积也增加1倍，用双蒸水补充到50μL，就为50μL PCR反应体系。

实施例2

 PCR反应体系的优化

镁离子浓度的优化：按如下PCR反应体系及循环条件对镁离子浓度进行优化，25μL反应体系为：2.5μL 10×PCR反应缓冲液、镁离子(25mM)(选择体积分别为1、1.5、2、2.5、3 μL)、2μL dNTP (2.5mM)、1μL检测扁浒苔的正向引物Ucm6f (10μM)，1μL检测扁浒苔的反向引物Ucm2r (10μM)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、1μL模板DNA(1ng/μL)，最后用双蒸水补充到25μL；反应条件为：94℃，预变性2 min；94℃，变性30 s，60℃，退火40 s, 72℃，延伸40 s，34个循环；72℃，延伸10 min；结果表明镁离子与反应缓冲液的体积比1.5μL：2.5μL较佳。

Taq DNA聚合酶浓度的优化：按如下PCR反应体系及循环条件对Taq DNA聚合酶浓度进行优化，25μL反应体系为：2.5μL 10×PCR反应缓冲液、1.5μL镁离子(25mM)、2μL dNTP (2.5mM)、1μL检测扁浒苔的正向引物Ucm6f (10μM)，1μL检测扁浒苔的反向引物Ucm2r (10μM)、选择体积分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μL的Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、1μL模板DNA(1 ng/μL)，最后用双蒸水补充到25μL；反应条件为：94℃，预变性2 min；94℃，变性30 s，60℃，退火40 s, 72℃，延伸40 s，34个循环；72℃，延伸10 min；结果表明Taq DNA聚合酶与反应缓冲液的体积比0.2μL：2.5μL较佳。

dNTP浓度的优化：按如下PCR反应体系及循环条件对dNTP浓度进行优化，25μL反应体系为：2.5μL 10×PCR反应缓冲液、1.5μL镁离子(25mM)、选择体积分别为0.5、1、2、2.5、3μL的dNTP (2.5mM)、1μL检测扁浒苔的正向引物Ucm6f (10μM)，1μL检测扁浒苔的反向引物Ucm2r (10μM)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、1μL模板DNA(1 ng/μL)，最后用双蒸水补充到25μL；反应条件为：94℃，预变性2 min；94℃，变性30 s，60℃，退火40 s, 72℃，延伸40 s，34个循环；72℃，延伸10 min；结果表明dNTP与反应缓冲液的体积比2μL：2.5μL较佳。

引物浓度的优化：按如下PCR反应体系及循环条件对引物浓度进行优化，25μL反应体系为：2.5μL 10×PCR反应缓冲液、1.5μL镁离子(25mM)、2μL dNTP (2.5mM)、选择体积分别为0.25、0.5、1、2、2.5μL的检测扁浒苔的正向引物Ucm6f (10μM)和反向引物Ucm2r (10μM)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、1μL模板DNA(1 ng/μL)，最后用双蒸水补充到25μL；反应条件为：94℃，预变性2 min；94℃，变性30 s，60℃，退火40 s, 72℃，延伸40 s，34个循环；72℃，延伸10 min；结果表明正向、反向引物与反应缓冲液的体积比1μL：2.5μL较佳。

实施例3

分别对来自我国不同地区的3株孔石莼U．pertusa, 2株缘管浒苔U. linza, 2株曲浒苔U. flexuosa，6株浒苔U. prolifera，3株石莼属未鉴定种分离物以及5株扁浒苔U. compressa共21个样品，进行检测。

按如下DNA提取方法分别提取得到各自的模板DNA溶液：挑取单株藻体，称取0. 1～0.2g的藻体放入1.5ml第一离心管中，加200μL 65℃水浴预热pH8.0的CTAB抽提液（含2% CTAB、1.4 M 的NaCl、20mM 的EDTA二钠和100 mM 的Tris·HCl），研磨至匀浆，再加入400μL 65℃水浴预热的CTAB抽提液，颠倒混匀后于65℃水浴1h，冷却至室温，12000 rpm离心10min，取第一上清液至第二离心管中，加入体积为300μL的Tris饱和酚和体积为300μL的氯仿和异戊醇混合液（氯仿24：异戊醇1），颠倒混匀后静置，12000rpm离心10min，取第二上清液至第三离心管中；加入与第二上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min，取第三上清液至第四离心管中，向第三上清液中加入与第三上清液等体积的异丙醇，轻轻颠倒混合均匀，于-20℃下沉淀1 h， 12000rpm离心10min，弃去第三上清液，在第四离心管加入质量百分浓度为70%的乙醇500μL，至沉淀悬浮，12000rpm离心5min，弃第四上清液，室温干燥，再在第四离心管加入50μL 无菌水溶解沉淀，得到模板DNA溶液，使用分光光度计调整模板DNA溶液浓度约为1 ng/μL，于-20℃贮存备用； 

取各自的模板DNA溶液1μL，分别与实施例1的检测试剂盒的反应体系混合，用双蒸水补充到25μL，组成25μL PCR反应体系进行PCR反应，PCR反应循环条件为：94℃，预变性2min；94℃，变性30 s，60℃，退火40 s, 72℃，延伸40 s，34个循环；72℃，延伸10 min，得到PCR产物；再对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，电泳后经EB染色，根据有无330bp特异性片段来判断，若有330bp特异性片段就为扁浒苔，结果显示：5个扁浒苔样品都能检测出330bp的特异性扩增片段，而其他样品没有特异性片段产生，PCR反应和糖凝胶电泳、染色都为常规技术，在此不作详细说明，本实施例检测结果说明本发明的检测试剂盒对扁浒苔特异，灵敏。

<110> 宁波出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国检验检疫科学研究院

<120> 扁浒苔的检测试剂盒及检测方法 

<160> 2    

<170> PatentInversion3.5

 

<210>1

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

 

<400> 1

CGTTTTCGGA ACCGCCGGTG A    21

 

<210>2

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

 

<400> 2

GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT    22

 

Claims (2)

1.扁浒苔的检测试剂盒，该检测试剂盒包括10×PCR反应缓冲液和双蒸水、摩尔浓度为25 mM 的MgCl₂溶液、摩尔浓度为2.5mM 的dNTP溶液、浓度为5 U /μL 的Taq DNA聚合酶溶液、摩尔浓度为10μM的正向引物和反向引物，其特征在于所述反应缓冲液与所述MgCl₂溶液、所述dNTP溶液、所述Taq DNA聚合酶、所述正向引物和所述反向引物的体积比为2. 5：1.5：2 ：0.2 ：1 ：1，所述正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTTTTCGGA  ACCGCCGGTG A-3’，所述反向引物的核苷酸序列为5’-GGCCAGGTCC ACGGCCCGCT CT-3’。

2.用权利要求1所述的检测试剂盒检测扁浒苔的方法，其特征在于包括下述步骤：

1）DNA提取：挑取单株藻体，称取0.1～0.2g的藻体放入1.5ml第一离心管中，加200μL 65℃水浴预热pH8.0的十六烷基三甲基溴化铵抽提液，研磨至匀浆，再加入400μL 65℃水浴预热的十六烷基三甲基溴化铵抽提液，颠倒混匀后于65℃水浴1h，冷却至室温，12000 rpm离心10min，取第一上清液至第二离心管中，加入体积为300μL的三羟基氨基甲烷饱和酚，体积为300μL的氯仿和异戊醇混合液，颠倒混匀后静置，12000rpm离心10min，取第二上清液至第三离心管中，加入与第二上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min，取第三上清液至第四离心管中，加入与第三上清液等体积的异丙醇，轻轻颠倒混合均匀，于-20℃下沉淀1h，12000rpm离心10min，弃去第三上清液，在第四离心管加入质量百分浓度为70%的乙醇500μL，至沉淀悬浮，12000rpm离心5min，弃去第四上清液，室温干燥，再在第四离心管加入50μL 无菌水溶解沉淀，得到模板DNA溶液，使用分光光度计调整模板DNA溶液浓度为1ng/μL，于-20℃贮存备用，所述十六烷基三甲基溴化铵抽提液含有质量百分浓度为2% 的十六烷基三甲基溴化铵、摩尔浓度为1.4M 的氯化钠, 摩尔浓度为20mM 的乙二铵四乙酸二钠, 摩尔浓度为100mM 的三羟基氨基甲烷盐酸，所述氯仿和异戊醇混合液由氯仿与异戊醇按体积比为24：1配制；

2）PCR反应：在所述检测试剂盒取反应缓冲液2.5μL、MgCl₂溶液1.5μL， dNTP溶液2μL， Taq DNA聚合酶溶液0.2μL，正向引物和反向引物各1μL，加入1μL模板DNA溶液，用双蒸水定容至25μL，进行PCR反应，PCR反应条件为：94℃，预变性2min；然后进入下列循环：94℃，变性30 s，60℃，退火40 s, 72℃，延伸40 s，34个循环；最后72 ℃，延伸10 min；得到PCR产物；

3）检测：取上述PCR产物5μL于质量百分浓度为2％的琼脂糖TAE凝胶中，进行电泳分离，电泳后经EB染色，根据有无330bp特异性片段来判断，若有330bp特异性片段就为扁浒苔。