CN101130820A - 一种中肋骨条藻pcna基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中肋骨条藻PCNA基因检测方法，包括：a.提取中肋骨条藻的RNA；b.分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得750～850bp的PCNA序列；c.根据获得的750～850bp的PCNA序列构建标准曲线，通过标准曲线检测待测中肋骨条藻PCNA基因。使用本发明中肋骨条藻PCNA基因检测方法，可以通过中肋骨条藻PCNA基因检测估算浮游藻类生产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测，克服现有技术中单一品种浮游藻现场基本生态学参数无法测定的缺陷。

Description

一种中肋骨条藻PCNA基因检测方法

技术领域

本发明涉及一种浮游硅藻的检测方法，特别涉及一种中肋骨条藻PCNA基因检测方法。

背景技术

中肋骨条藻(S.costatum)为多个细胞的长链，细胞为透镜形成圆柱形，直径6～7微米，壳缘刺8～30条，胞间隙一般较细胞长度大。色素体通常2个，位于壳面。核在中央。

中肋骨条藻是海洋次级生产者如牡蛎的优良饵料。另一方面，中肋骨条藻又是我国近海常见的赤潮生物，在经济海藻养殖区，常与海带、紫菜等争夺营养，该种的大量水华可引起经济藻类变色，甚至腐烂而失去食用和商业价值。在赤潮前后，海区内藻类的多样性具有很大差异，中肋骨条藻的密度急剧上升，其它藻类数量迅速减少，种群结构变得很简单，并认为藻类密度和种群结构的动态变化对赤潮的对赤潮预报具有重要价值。因此，及时、准确、快速地检测中肋骨条藻，了解其在养殖区的动态，当其数量增加时及时控制，这对海洋养殖业具有重要意义。

PCNA由两个不同组织独立地发现。它是一个核酸非组蛋白，分子量为36000道尔顿。1978年Moyahi等首先在人类自身免疫疾病(人类系统性狼疮红斑症)中发现一个自身抗原。由于这个蛋白是发现于处于分裂细胞的核中，因此他们将它命名为PCNA。几乎在同时Bravo和Celis用双向电泳发现一个在细胞周期的S期合成的蛋白，并将它命名为细胞周期蛋白(cyclin)，现在这个蛋白称为PCNA，而cyclin则被用来统称调节细胞周期的一类蛋白。

由于PCNA是真核生物的基本功能蛋白，因此广泛存在于各种生物门类中，如人类(Almendral et al.，1987)、高等植物(Markerly et al.，1992)、原生动物(Guerini et al.，2000)、病毒(O’Reilly et al.，1989；Ahrens et al.，1997)、产甲烷的古细菌(Bult et al.，1996)；林森杰等研究表明PCNA广泛存在于浮游植物的各个门类中，如绿藻、硅藻、隐藻、定鞭藻、甲藻(Lin et al.，1994；Chenget al.，1997；Lin&Carpenter，1998；Carpenter et al.，1998；Lin&Corstjens，2002)。

已经从几种真核生物和古细菌中分离出编码PCNA蛋白的基因，已知的几个PCNA基因序列和蛋白结构高度保守(Bult et al.，1996；Kelman et al.，1997)。一般说来，PCNA在生物体的一个类群中是高度保守的，但在不同的类群中有着明显的不同。Pfiesteria piscicida的PCNA基因的核苷酸序列(AY345906)与Pyrocystis lunula的pcna基因的核苷酸序列(AF508260)有86％的同源性。在氨基酸水平上有88％的同源性。P.piscicida的PCNA基因在氨基酸水平上，与alveolates Plasmodium(X68739)和Toxoplasma(AF242301)的PCNA基因同源性分别为37％和41％，与Rhodomonas sp.的PCNA基因同源性为43％，与其它生物的分别在39％～46％之间(Zhanget al.，2006)。几个物种的PCNA基因在染色体上的位置已明确(Henderson et al.，1994；Ku etal.，1989)。

关于甲藻PCNA方面的研究也有报道。免疫化学研究分析甲藻与PC10的反应揭示在不同的甲藻物种中存在一种分子大小不同的PCNA-like蛋白。在Prorocentrum minimum和Heterocapsa triquetra中是36kD，是典型的真核生物PCNA的大小。在C.cohnii和Gymnodinium catenatum中与PC10抗体起反应的蛋白是50kD，在细胞周期的S期大量增加，被认为可能是PCNA(Leveson et al.，1999)。2003年Okamoto等从Pyrocystis lunula获得一个代表PCNA基因的EST，由此推测的蛋白也与真核生物典型的PCNA大小相似。林森杰等对实验室培养的费氏杀鱼藻(Pfiesteria piscicida)的进一步研究表明，PCNA基因的表达在不同的生长时期有着巨大的变化(Lin et al.，1994；Cheng et al.，1997；Lin et al.，2002；Zhang et al.，2006)。

整体来说，国际上在该领域的研究仍处于起步阶段，有待于进一步发展。目前采用细胞周期标志物估算现场生产率的研究中面临的主要问题有以下几个方面：

(1)目前的研究主要是针对费氏杀鱼藻Dunaliella tertiolecta的，缺乏对其它浮游植物，特别是海域优势藻和多发赤潮藻的研究，研究多处于对实验室培养的纯种藻的测定，缺乏更多的现场实验。

(2)前述研究采用的PCNA抗体是借用的针对哺乳动物的商业抗体(PCIO)，由于浮游植物与哺乳动物的PCNA基因差异较大，抗体仅对绿、藻等几种藻有效，效价低，且其种属特异性较差。

(3)在采用定量PCR技术时，由于已知PCNA基因序列的藻种类较少，难以设计种间特异性高的引物和探针，从而影响了该方法测定单一藻种生长率的优势。

(4)通常作为管家基因的

基因在不同种类间具有高度的同源性，在对现场样品测定时会产生非特异性扩增，影响结果的准确性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种中肋骨条藻PCNA基因检测方法，用于估算浮游藻类生产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测，克服现有技术中单一品种浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数无法测定的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种中肋骨条藻PCNA基因检测方法，包括以下步骤：

a．提取中肋骨条藻的RNA；

b．分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得750～850bp的PCNA序列；

c．将所述750～850bp自勺PCNA序列基因导入质粒，根据转载所述750～850bp的PCNA序列的质粒构建标准曲线，通过标准曲线检测待测中肋骨条藻PCNA基因。

所述步骤b可以为：分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得786bp的PCNA序列。

所述步骤c中可以进一步包括：通过对已知浓度样品的检测，验证所建立标准曲线的准确性。

所述步骤a提取中肋骨条藻RNA可以进一步包括：

(1)收集藻细胞，在不断添加液氮条件下用研钵研磨成细粉状；

(2)将研磨液加入到1mL TRIZOL试剂中，置室温下匀化5min；

(3)加入200μL氯仿剧烈振荡15s，室温下温育3min；

(4)4℃条件下以12000rpm离心15min；

(5)获取界面上层液体加入250μL高浓度盐溶液，混匀后再加入250μL异丙醇，混匀后于室温下沉淀10min，再在4℃以12000rpm转速离心10min；

(6)移去上清后用1mL 75％乙醇漂洗沉淀，4℃以11000rpm转速离心5min；

(7)适量DEPC水或去离子甲酰氨溶液溶解，RNA于-80℃保存。

所述步骤b中，克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列使用的引物序列可以为：5-CAG TCT CGG GTT CAA TGC GGC-3，ScPCNArp 5-GGA TACTCC ACC ACC ACA GGC-3。

所述步骤b中，应用于3’端RACE的4个引物可以如下：

pcfp1：AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGT

Adaptor dT：GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTT

Adaptor：GACTCGAGTCGACGAATTCAA

Pcfp2：TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG。

所述步骤b中，可以进一步包括下列PCNA序列分析的过程：用ClustalXV1.81比对PCNA的核酸序列，通过运行ProtTest V1.3确定最适进化模式，使用PHYML V2.4.3程序构建进化树，ProtTest参数值被应用于最大相似度分析和系统树优化。

所述步骤b中，可以进一步包括：使用克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列的引物对与中肋骨条藻分类地位相近的4～20种藻cDNA进行扩增，并以28S rDNA通用引物为阳性验证，验证所述引物对中肋骨条藻的特异性。

所述步骤c可以进一步包括：

根据测得的PCNA序列设计RFQ-PCR引物与探针，所设计的引物SC-FQ-PCNA序列为：fp，5-AGG TGT CCG GTT CTC AGT ATC AG-3；rp，5-AGT AGC CTT GGT AAA GAA GTT GAG G-3；探针SC-FQ-PCNA序列为：5-GTC CTC GTT CGT℃AA AAC AGC TCT CA-3；探针5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记。

所述步骤c可以进一步包括：

在ABI7500荧光定量仪上进行荧光定量PCR反应，体系为：

双蒸水8.5μL，

2×TaqMan^Universal PCR Master Mix12.5μL，

SC-FQ-PCNA 10μM正反向引物各1μL，

10mM TaqMan SC-FQ-PCNA  1μL，

模板1μL；

PCR程序：52℃2分钟，95℃10分钟；95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。每个质粒稀释浓度做三个平行样；以质粒浓度对数值为横座标，以实时荧光定量PCR反应中相应的CT值为纵座标，绘制标准曲线。

所述步骤c可以进一步包括：

分别提取多种分类地位与中肋骨条藻相近的藻类的RNA，用dT18 Oligo反转录成cDNA，用核糖体大亚基通用引物LSU5’：5’-CGG AGG AAA AGAAAC TAA C-3’和LSU3’：5’-GCG AAA GAC TAA TCG AAC-3’扩增各藻的cDNA，用于验证cDNA的质量。

本发明建立的中肋骨条藻PCNA检测方法，可以准确定量10⁸～10²个拷贝，且标准曲线回归系数达0.998，稳定性好，且6份样品的CT值的相对标准偏差为1.5％，也证明了RNA提取与反转录体系的稳定。

样品检测的数据看，PCNA基因表达量在中肋骨条藻培养的不同时期有着明显变化，培养6天时藻处于指数增长期，PCNA的表达量处于较高水平(46.2PCNA copy/cell)，11天时处于生长平稳期，PCNA表达量处于较低水平(0.950PCNA copy/cell)，而18天时已处于衰亡期，PCNA表达量最低(0.040PCNA copy/cell)。

本发明可以应用于现场的观测研究中，这就必须解决检测特异性的问题，以便区分不同藻类的生长参数。本发明中通过用SC-FQ-PCNA引物对16种藻cDNA的扩增，并以28S rDNA通用引物为阳性验证，从而证实了SC-FQ-PCNA引物对中肋骨条藻的特异性。

附图说明

图1为本发明实施例所述cDNA的SC-FQ-PCNA PCR扩增图，图中：1：H₂O；2：新月菱形藻；3：红色裸甲藻；4：微小原甲藻；5：直链藻；6：圆海链藻；7：柔弱角毛藻；8：纤细角毛藻；10：旋链角毛藻；11：膜质舟形藻；12：米氏裸甲藻；13：尖刺拟菱形藻；14：东海原甲藻；15：锥状斯克里普藻；16：塔玛亚历山大藻；17：球等鞭金藻；18：中肋骨条藻；9，19：DNA Marker；SC-FQ-PCNA引物对cDNA的扩增结果 只有中肋骨条藻得到约为160bp的扩增条带，其它藻均未得到扩增条带，表明所设计的SC-FQ-PCNA引物是对中肋骨条藻特异的。

图2为本发明实施例所述S.costatum培养3周的细胞密度变化图；培养条件为1.5L锥形瓶培养，起始浓度1.2×10³cells/mL；

图3为本发明实施例所述中肋骨条藻不同培养阶段的样品A、B、C的RFQ-PCR结果图。

具体实施方式

本发明实施例中，中肋骨条藻的培养过程为：中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)在实验室中用F/2培养基培养至对数生长期，培养条件：光照/黑暗周期为12h/12h，光照强度为4000Lux，培养温度为22～25℃。

收集5份培养一周的中肋骨条藻(细胞密度为4.1×107 cells/mL)约3.8×10⁷个细胞(藻浓缩液重量约为150mg)。用下列RNA提取方法提取：

(1)收集藻细胞，在不断添加液氮条件下用研钵研磨成细粉状；

(2)将研磨液加入到1mL TRIZOL试剂中，置室温下匀化5min；

(3)加入200μL氯仿剧烈振荡15s，室温下温育3min；

(4)4℃条件下以12000rpm离心15min；

(5)获取界面上层液体加入250μL高浓度盐溶液，混匀后再加入250μL异丙醇，混匀后于室温下沉淀10min，再在4℃以12000rpm转速离心10min；

(6)移去上清后用1mL 75％乙醇漂洗沉淀，4℃以11000rpm转速离心5min；

(7)适量DEPC水或去离子甲酰氨溶液溶解，RNA于-80℃保存。

提取后的中肋骨条藻PCNA基因cDNA的部分序列扩增产物，经EB染色的琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出特异性的条带，产物大小约为520bp。

RT-PCR引物为5-CAG TCT CGG GTT CAA TGC GGC-3，ScPCNArp5-GGA TAC TCC ACC ACC ACA GGC-3。

连接反应体系10μL，目标DNA片段的量约为50ng，按照插入片段与载体的摩尔比为1∶3做连接反应。反应物充分混匀后，于16℃连接过夜。

取E.coli DHα-5甘油菌于LB琼脂平皿上划线，37℃培养过夜。挑单个菌落接种于50mL LB培养液里，37℃摇床250rpm振荡培养过夜；细胞沉淀用10mL冰冷的CaCl₂溶液重悬，分装于预冷的无菌聚丙烯管中，冻存于-80℃中。

将所得的10μL体系全部转入感受态细胞，轻轻旋动，并于冰上放置30min。然后将试管放入42℃水浴2min进行热休克，快速移至冰浴中2分钟；加入100μL LB培养液，于37℃摇床250rpm振荡培养1h，使细胞复苏同时表达质粒编码的抗生素抗性基因；菌液涂布到含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基(100mL LB固体培养基中加入200μL的X-Gal的二甲基甲酰胺溶液(20mg/mL)、100μL的IPTG(24mg/mL)和60μL的Amp(100mg/mL)平板上，于37℃静置培养12-16h。

在过夜LB平板上挑取白色单菌落，置2mL LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，于37℃摇床上过夜培养。取1.5mL菌液，用微量离心机12000rpm离心一分钟(剩余菌液保存于4℃)。倾倒去上层清液，控干沉淀加入预冷的溶液I 100μL悬浮细胞，混匀，即加入溶液II 200μL，上下轻柔颠倒数次混匀，冰浴5分钟。加溶液III 150μL，小心混匀，冰浴5-10分钟。12000rpm离心10分钟，将上清液移至另一Eppendorf管中。加两倍体积预冷的无水乙醇混匀，室温放置10分钟，13500rpm离心10分钟，弃去上清液，70％乙醇洗涤，超净台中干燥。加含有胰RNA酶(20μg/mL)的TE(pH 8.0)溶液40-50μL，溶解质粒，待完全溶解后取5μL电泳鉴定。

双酶切反应体系为50μL，反应的条件为37℃过夜消化。酶切结果以琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检验。取经鉴定的阳性克隆，送交上海生物工程有限公司测序(ABI3730)。测序引物为M13/PUC Sequencing Primer(-20)和M13/PUC Reverse Sequencing Primer(-48)。

提交测序结果至NCBI的Blast服务器，验证克隆片段的PCNA基因同源性。

根据RACE的要求和测得的PCNA部分序列，设计应用于3’端RACE技术的4个引物如下：

pcfp1：AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGT

Adaptor dT：GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTT

Adaptor：GACTCGAGTCGACGAATTCAA

Pcfp2：TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG

RNA的提取同前述提取方法

cDNA链的生成：RT-PCR以引物Adaptor dT(GAC TCG AGT CGA CGAATT CAA TTT TTT TTT TTT TTT TT)介导生成cDNA链。

3’RACE第一轮PCR反应：以生成的cDNA链为模板，以表1中的体系和程序进行PCR扩增。

3’RACE第二轮PCR反应：第二轮PCR以第一轮PCR产物(稀释50倍)为模版，以表2中的体系和程序进行PCR扩增。

表1 3’RACE第一轮PCR反应反应体系及程序

PCR各反应成分

加样量

终浓度

PCR反应程序

10×PCR buffer	5.0	1×	94℃，5分钟
					MgCl2(25mM)	5.0	2.5mM	94℃，30秒	↑25个循环
dNTP(10mM)	1.0	200μM	50℃，30秒
				dd water	34.0	-	72℃，1分钟→
pcfpl(10μM)	1.0	0.2μM	72℃，10分钟
					Adaptor    dT(10μM)	1.0	0.2μM	4℃，保藏
Adaptor(10μM)	1.0
			cDNA	1.0	-
Taq	1	5U

表2 3’RACE第二轮PCR反应反应体系及程序

PCR各反应成分	加样量	终浓度	PCR反应程序
					10×PCR buffer	5.0	1×	94℃，5分钟
MgCl2(25mM)	5.0	2.5mM	94℃，30秒←	↑35个循环
					dNTP(10mM)	1.0	200μM	50℃，30秒
Dd water	33.0		72℃，1分钟→
					Pcfp2(10μM)	1.0	0.2μM	72℃，10分钟
Adaptor(10μM)	1.0	0.2μM	4℃，保藏
					cDNA	1.0	-
Taq	1	5U

分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得786bp的PCNA序列。

进化分析：用ClustalX V1.81比对PCNA的核酸序列。通过运行ProtTestV1.3(Abascal et a1.2005)确定最适进化模式。使用PHYML V2.4.3程序构建进化树，ProtTest参数值被应用于最大相似度分析和系统树优化。

使用SC-FQ-PCNA引物对16种藻cDNA的扩增，并以28S rDNA通用引物为阳性验证，证实了SC-FQ-PCNA引物对中肋骨条藻的特异性。

表3实验用藻种名称及来源

藻种名	拉丁文	来源
			旋链角毛藻	Chaetoceros curvisetus	胶州湾
柔弱角毛藻	C.debilis	胶州湾
			纤细角毛藻	C.gracile	胶州湾
膜质舟形藻	Navicula membranacea	胶州湾
			新月菱形藻	Nitzschia closterium	胶州湾
米氏裸甲藻	G.mikimoto	胶州湾
			直链藻	Melosira sp.	胶州湾
尖刺拟菱形藻	Pseudonitzschia pungens	胶州湾
			圆海链藻	Thalassiosira rotula	胶州湾
中肋骨条藻	Skeletonema costatum	胶州湾
			塔玛亚历山大藻	Alexandrium tamarens	大鹏湾
微小原甲藻	Prorocentrum minimun	渤海湾
			东海原甲藻	Prorocentrum donghaiense	胶州湾
锥状斯克里普藻	Scrippsiella trochoidea	胶州湾
			球等鞭金藻	Isochrysis galbana	胶州湾
红色裸甲藻	G.sanguineum	东海

如前述获得转入PCNA基因的阳性克隆，将培养好的带质粒的细菌收集到1.5mL离心管中，弃去上清，使细菌沉淀尽量干燥；加100μL预冷的质粒抽提溶液I悬浮细胞，混匀，即加200μL质粒抽提溶液II，上下轻柔颠倒数次混匀，冰浴5分钟；加150μL质粒抽提溶液III小心混匀，冰浴5-10分钟；12000rpm离心10分钟，将上清移至另一离心管中；加两倍体积的预冷的无水乙醇混匀，室温放置10分钟，13000rpm离心10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，干燥后加40μL TE缓冲液溶解。酶切验证，测260nm处的吸光度(Absorbance260，A260)得光密度(optical density，OD)(贝克曼核酸和蛋白质分析仪，Backman DU640)为0.0705，备用。

将测定的OD值换算成质粒的拷贝，浓度换算公式如下：拷贝浓度(copy/mL)＝[OD值×50×6.02×1023]/[碱基数×660]，求得浓度为1×10⁹copy/μL。将重组质粒标准品原液作梯度稀释成1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²copy/μL，-80℃保存。

根据测得的PCNA序列设计RFQ-PCR引物与探针，所设计的引物SC-FQ-PCNA序列为(fp，5-AGG TGT CCG GTT CTC AGT ATC AG-3；rp，5-AGT AGC CTT GGT AAA GAA GTT GAG G-3)，探针SC-FQ-PCNA序列为(5-GTC CTC GTT CGT CAA AAC AGC TCT CA-3)，探针5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记。在ABI7500荧光定量仪上进行荧光定量PCR反应，体系为：双蒸水8.5μL，2×TaqManUniversal PCR Master Mix12.5μL，SC-FQ-PCNA正反向引物(10μM)各1μL，TaqMan SC-FQ-PCNA(10mM)1μL，模板1μL；PCR程序：52℃2分钟，95℃10分钟；95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。每个质粒稀释浓度做三个平行样。以质粒浓度对数值为横座标，以实时荧光定量PCR反应中相应的CT值为纵座标，绘制标准曲线。

分别提取各藻的RNA，用Oligo(dT18)反转录成cDNA，用核糖体大亚基通用引物LSU5’(5’-CGG AGG AAA AGA AAC TAA C-3’)LSU3’(5’-GCGAAA GAC TAA TCG AAC-3’)扩增各藻的cDNA，验证cDNA的质量。用SC-FQ-PCNA引物对分别扩增各藻的cDNA.扩增。

培养中肋骨条藻，接种密度为1.2×10³cells/mL，收集处于指数生长期、稳定期、衰亡期的藻样品各一份，收集藻细胞，如上所述提取RNA，进行RT-PCR，取1μL进行Real Time PCR扩增。

稀释的质粒及primer SC-FQ-PCNA和TaqMan SC-FQ-PCNA进行荧光定量PCR检测。每个稀释度重复测量3次，用测得的CT值对细胞密度的对数值作图。回归曲线方程为y＝-3.055x+41.093，其中x为细胞数对数值，y为CT值，其回归系数为：R＝0.999。

不同培养阶段中肋骨条藻的PCNA基因表达量检测

如图2、图3所示，对培养的S.costatum每天进行细胞密度的计数，观察培养3周的细胞密度变化。从图2、图3中，我们发现，培养的第一周，S.costatum基本处于指数生长阶段，第二周基本处于稳定生长期，而第三周则处于衰亡期。收集样品A(培养6天的藻)1.26×10⁷个细胞，样品B(培养11天的藻)9.60×10⁶个细胞，样品C(培养18天的藻)3.75×10⁷个细胞。提取A、B、C的RNA，进行RT-RFQ-PCR，根据得到的CT值计算出不同生长阶段单个藻细胞中PCNA的拷贝数，计算公式为：[(PCNA copy/μLcDNA)×(20μL cDNA/μL RNA)×50μL RNA]/[cell number]。(表4)

表4不同培养阶段样品的RFQ-PCR结果及其单个细胞中PCNA拷贝数的变化

样品	A	B	C
				培养日期	6days	11days	18days
细胞密度(cells/mL)	4.2×105	9.6×106	7.5×105
				生长率(μ*)(day-1)	0.742	0.002	-0.104
收集细胞数	1.26×107	9.60×106	3.75×107
				CT值	23.48	28.99	31.40
标准曲线推算的PCNA拷贝数	582130	9162	1489
				单位细胞中PCNA拷贝数	46.2	0.950	0.0400

^*μ＝(lnX1-lnX2)/(T1-T2)，X1：cell density of T1，X2：cell density of T2.

荧光探针技术不仅拥有荧光染料技术的高灵敏性，且由于其加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了定量的高特异性。荧光定量PCR精确定量的前提是构建标准品和标准曲线，才能对未知模板进行定量分析。可以以DNA、RNA、质粒作为标准品。在考察PCNA基因表达量时，可以用PCNA的mRNA作为定量标准，但RNA的易降解性会导致标准的不稳定从而引起结果的不准确，因此，本发明用PCNA的cDNA作为参考标准并将目的片段重组至质粒从而得到稳定的标准品。在样品检测时，将提取的RNA反转录为cDNA并与质粒标准品同时进行RFQ-PCR，达到定量目的。实践证明，质粒法制备标准品是一个简便而准确的制备标准品的方法，并且能满足对标准品的长期和大量需求。

Claims (10)

1.一种中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.提取中肋骨条藻的RNA；

b.分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得750～850bp的PCNA序列；

c.将所述750～850 bp的PCNA序列基因导入质粒，根据转载所述750～850bp的PCNA序列的质粒构建标准曲线，通过标准曲线检测待测中肋骨条藻PCNA基因。

2.根据权利要求1所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤b中，分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得786bp的PCNA序列。

3.根据权利要求1所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤c中进一步包括：通过对已知浓度样品的检测，验证所建立标准曲线的准确性。

4.根据权利要求1所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤a提取中肋骨条藻RNA进一步包括：

(1)收集藻细胞，在不断添加液氮条件下用研钵研磨成细粉状；

(2)将研磨液加入到1mL TRIZOL试剂中，置室温下匀化5min；

(3)加入200μL氯仿剧烈振荡15s，室温下温育3min；

(4)4℃条件下以12000rpm离心15min；

(5)获取界面上层液体加入250μL高浓度盐溶液，混匀后再加入250μL异丙醇，混匀后于室温下沉淀10min，再在4C以12000rpm转速离心10min；

(6)移去上清后用1mL 75％乙醇漂洗沉淀，4℃以11000rpm转速离心5min；

(7)适量DEPC水或去离子甲酰氨溶液溶解，RNA于-80℃保存。

5.根据权利要求1所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤b中，克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列使用的引物序列为：5-CAG TCT CGG GTT CAA TGC GGC-3，ScPCNArp 5-GGA TAC TCC ACCACC ACA GGC-3。

6.根据权利要求1所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤b中，应用于3’端RACE的4个引物如下：

pcfp 1：AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGT

Adaptor dT；GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTT

Adaptor：GACTCGAGTCGACGAATTCAA

Pcfp 2：TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG。

7.根据权利要求1所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤b中，进一步包括：使用克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列的引物对与中肋骨条藻分类地位相近的4～20种藻cDNA进行扩增，并以28SrDNA通用引物为阳性验证，验证所述引物对中肋骨条藻的特异性。

8.根据权利要求1所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤c进一步包括：

根据测得的PCNA序列设计RFQ-PCR引物与探针，所设计的引物SC-FQ-PCNA序列为：fp，5-AGG TGT CCG GTT CTC AGT ATC AG-3；rp，5-AGT AGC CTT GGT AAA GAA GTT GAG G-3；探针SC-FQ-PCNA序列为：5-GTC CTC GTT CGT CAA AAC AGC TCT CA-3；探针5’端用FAM标记，3’端用TAMRA标记。

9.根据权利要求8所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤c进一步包括：

在ABI7500荧光定量仪上进行荧光定量PCR反应，体系为：

双蒸水8.5μL，

2×TaqMan^Universal PCR Master Mixl2.5μL，

SC-FQ-PCNA 10μM正反向引物各1μL，

10mM TaqMan SC-FQ-PCNA  1μL，

模板1μL；

PCR程序：52℃ 2分钟，95℃ 10分钟；95℃ 15秒，60℃1分钟，40个循环。每个质粒稀释浓度做三个平行样；以质粒浓度对数值为横座标，以实时荧光定量PCR反应中相应的CT值为纵座标，绘制标准曲线。

10.根据权利要求9所述中肋骨条藻PCNA基因检测方法，其特征在于，所述步骤c进一步包括：

分别提取多种分类地位与中肋骨条藻相近的藻类的RNA，用dT18 Oligo反转录成cDNA，用核糖体大亚基通用引物LSU5’：5’-CGG AGG AAA AGAAAC TAA C-3’和LSU3’：5’-GCG AAA GAC TAA TCG AAC-3’扩增各藻的cDNA，用于验证cDNA的质量。

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