CN101974644B

CN101974644B - 金黄色葡萄球菌肠毒素基因pcr分型检测试剂盒及方法

Info

Publication number: CN101974644B
Application number: CN2010105520682A
Authority: CN
Inventors: 孙边成; 张如胜; 欧新华; 宋克云; 陈法明
Original assignee: CHANGSHA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: CHANGSHA CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2010-11-19
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2030-11-19
Also published as: CN101974644A

Abstract

本发明涉及一种利用PCR方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的基因分型检测试剂盒和方法，属于生物检测试剂领域。该试剂盒包括扩增反应液，分型反应液A、B、C、E，Taq酶，ddH₂o，SEA、SEB、SEC、SEE的阳性标准品。其中分型反应液A中包含SEA引物：SEA-F，SEA-R；分型反应液B中包含SEB引物：SEB-F，SEB-R；分型反应液C中包含SEC引物：SEC-F，SEC-R；分型反应液E中包含SEE引物：SEE-F，SEE-R。检测方法包括细菌DNA的提取，同一台PCR仪及同一条件下，利用本发明设计的分型引物，同时进行肠毒素SEA，SEB，SEC，SEE基因的分型检测，电泳显示结果，该检测快速、准确、灵敏度高且成本低。

Description

金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR分型检测试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物检测试剂领域，涉及一种利用PCR方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的基因分型检测试剂盒，以及使用该种试剂盒快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)，是国内外最常见的细菌性食物中毒病原体之一，在引起的中毒暴发事件中，近年来首推2000年“雪印奶粉”事件，14000多人受感染。根据日本卫生部公布的数字，日本20年期间(1980-1999)由金葡菌引起的食物中毒共有2,525次暴发，感染59,964人。该菌引起食物中毒的主要原因是产生葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxins，SEs)，根据其血清学特性，SEs可分为5型(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)，其中SEC又分为C₁、C₂、C₃三个亚型。由SED肠毒素引起的食物中毒很少，国内引起食物中毒的金黄色葡萄球菌肠毒素主要是SEA、SEB、SEC、SEE。另外新的SEs也相继发现：SEG，SHE，SEI，SEJ，由该菌引起的食物中毒95％是由SEA-SEE引起。

对于SEs的检测及鉴定主要依赖免疫学技术，其中最常用的是反相间接血凝法(RPHA)和酶联免疫吸附试验，但由于此方法检测的是金黄色葡萄球菌产肠毒素的表现型，有些菌株虽然有产毒基因，但受培养等条件影响，其特异性和敏感性较差，故此不能满足公共卫生检测的需要。而PCR技术检测的是肠毒素的基因型，不会受培养等条件的影响而出现假阴性，这对食物中毒病原体——金黄色葡萄球菌SEs的检测和流行病学调查是具有重要意义的。

随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌PR72H序列的特异性，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法，结果表明，该方法敏感、准确、快速，特别适合病原微生物的检测。但是目前未有利用PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的基因分型检测试剂盒及方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种快速、特异性强、灵敏度高且成本低的基于PCR的金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型检测试剂盒，并提供使用该种试剂盒快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因的方法，从而为传染病的监测和食品安全提供一种有益的检测手段。

本发明涉及一种利用PCR方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的基因分型检测试剂盒，其试剂包括：

(1)扩增反应液成分：

10×Taq DNA Polymerase Buffer、150-250mM dNTP、ddH₂O；

其中10×Taq DNA Polymerase Buffer含有200mM pH 8.4的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、200mM氯化钾、100mM硫酸铵、15mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

(2)分型反应液A：包含SEA上、下游引物各20uM：

SEA-F：5′-CCGAGTCACGATCAATTTTTACAG-3′

SEA-R：5′-GCGGCTTGTATATAAATATATATCA-3′；

(3)分型反应液B：包含SEB上、下游引物各20uM：

SEB-F：5′-AATCTATAGATCAATTTCTATAC-3′

SEB-R：5′-CTTTTTCTTTGTCGTAAGATA-3′；

(4)分型反应液C：包含SEC上、下游引物各20uM：

SEC-F：5′-GTCTGTAGATAAATTTTTGGCA-3′

SEC-R：5′-TCCATTCTTTGTTGTAAGGTG-3′；

(5)分型反应液E：包含SEE上、下游引物各20uM：

SEE-F：5′-GGCCTATAGATAAAGTTAAAACAAGC-3′

SEE-R ：5′-CACCTTACCGCCAAAGCTG-3′；

(6)Taq plus DNA Polymerase：2.5U/ul；

(7)SEA阳性标准品、SEB阳性标准品、SEC阳性标准品、SEE阳性标准品分别为金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE菌株基因组DNA(10～200ng/ul)；

(8)阴性对照品为ddH₂O。

使用上述PCR方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因分型检测试剂盒的方法，依次包括下列步骤：

(1)细菌DNA的提取：待检标本用增菌液(所述的增菌液为7.5％氯化钠肉汤)增菌培养8-24小时后，取1.0ml培养后的增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒(如TIANamp Bacteria DNA Kit)提取模板DNA，提取后的DNA浓度为10～200ng/ul之间；

(2)金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的PCR扩增，在同一台PCR仪及同一PCR反应条件下，利用本发明针对SEA、SEB、SEC、SEE所设计的分型引物，同时扩增金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的靶基因：

A.在标明A，B，C，E的PCR反应管中分别加入扩增反应液22.5uL，其组成包括：2.5uL 10×Taq DNA Polymerase Buffer、2.0uL250mM dNTP、18uLddH₂O；然后再于相应管中分别加入1uL分型反应液A、分型反应液B、分型反应液C、分型反应液E，然后再于相应管中加入1uL待检模板和1.25U Taq plusDNA Polymerase；

B.将上述各管混匀点离后置于PCR仪上进行以下反应：①94℃5min，②94℃30sec，③60℃45sec，④72℃45sec，⑤72℃6min，其中②一④步循环40次；

(3)扩增产物的电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取3ul扩增产物与0.5ul上样缓冲液混匀后点样于含0.8ug/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中，90V电泳30min后放于凝胶成像系统中成像，观察PCR扩增产物有无预期大小的目的DNA片段：金黄色葡萄球菌肠毒素SEA片段为582bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEB片段为602bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEC片段为601bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEE片段为125bp。

(4)扩增产物的基因测序鉴定

分别取利用上述试剂盒和方法进行金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE PCR扩增的产物50uL及相应的PCR上、下游引物10uL送英骏公司测序，测序结果表明与相应的靶基因序列同源性达100％，显示了本发明的准确性。

本发明的优点：

本发明建立一种基于PCR的金黄色葡萄球菌肠毒素的基因分型检测试剂盒，且能在同一台PCR仪及同一PCR反应条件下，利用本发明针对SEA、SEB、SEC、SEE所设计的分型引物，同时扩增金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的靶基因，达到快速准确检测SEA、SEB、SEC、SEE靶基因的目的，本发明针对SEA、SEB、SEC、SEE靶基因分别设计了10余对PCR引物，在同一PCR反应条件下，再精心筛选1对特别适合各自靶基因的引物来组成本试剂盒，并通过大量试验摸索出反应的最佳条件。目前还没有利用PCR技术同时检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的基因分型检测试剂盒及相关方法。本发明方法与现有的使用免疫学方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素相比具有敏感性高、特异性强、方便快捷等优点，为传染病监测和食品安全提供了一种新的有益检测手段。

附图说明

图1为本发明所述试剂盒及方法同时进行金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE PCR扩增后电泳结果：

图中，M：100～600bp marker；1：金黄色葡萄球菌肠毒素SEA片段位于目的片段582bp处；2、金黄色葡萄球菌肠毒素SEB片段位于目的片段602bp处；3：金黄色葡萄球菌肠毒素SEC片段位于目的片段601bp处；4：金黄色葡萄球菌肠毒素SEE片段位于目的片段125bp处。

图2为本发明所述试剂盒及方法进行金黄色葡萄球菌肠毒素SEA特异性扩增后电泳结果：

图中，M：100～600bp marker；1：金黄色葡萄球菌SEA片段位于目的片段处582bp，阳性结果；2～17为阴性结果，分别为金黄色葡萄球菌SEB菌、金黄色葡萄球菌SEC菌、金黄色葡萄球菌SEE菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌O157：H 7、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、肠毒素型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌。其中2道金黄色葡萄球菌SEB菌显示于450bp左右可见一较淡条带，不在预期目的片段位置，不影响结果判断。

图3为本发明所述试剂盒及方法进行金黄色葡萄球菌肠毒素SEB特异性扩增后电泳结果：

图中，M：100～600bp marker；1：金黄色葡萄球菌SEB片段位于目的片段处602bp，阳性结果；2～17为阴性结果，分别为金黄色葡萄球菌SEA菌、金黄色葡萄球菌SEC菌、金黄色葡萄球菌SEE菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌O157：H 7、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、肠毒素型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌。

图4为本发明所述试剂盒及方法进行金黄色葡萄球菌肠毒素SEC特异性扩增后电泳结果：

图中，M：100～600bp marker；1：金黄色葡萄球菌SEC片段位于目的片段处601bp，阳性结果；2～17为阴性结果，分别为金黄色葡萄球菌SEA菌、金黄色葡萄球菌SEB菌、金黄色葡萄球菌SEE菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌O157：H 7、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、肠毒素型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌。

图5为本发明所述试剂盒及方法同时进行金黄色葡萄球菌肠毒素SEE特异性扩增后电泳结果：

图中，M：100～600bp marker；1：金黄色葡萄球菌SEE片段位于目的片段处125bp，阳性结果；2～17为阴性结果，分别为金黄色葡萄球菌SEA菌、金黄色葡萄球菌SEB菌、金黄色葡萄球菌SEC菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌O157：H 7、肠出血型大肠埃希菌、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、福氏志贺菌、肠毒素型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、肠侵袭型大肠埃希菌、伤寒沙门菌。其中15～17于500bp上方可见较淡DNA片段，不在预期目的片段区域，不影响结果判断。

具体实施方式

下列实施例是对本发明的进一步说明，不应该当作对本发明的限制。

实施例1

按下列配方制作基于PCR的金黄色葡萄球菌肠毒素的基因分型检测试剂盒：

(1)扩增反应液组分：

10×Taq DNA Polymerase Buffer、250mM dNTP、ddH₂O；其中10×Taq DNAPolymerase Buffer含有200mM pH 8.4的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、200mM氯化钾、100mM硫酸铵、15mM硫酸镁和1％曲拉通X-100。

(2)分型反应液A：包含SEA上、下游引物各20uM：

SEA-F：5′-CCGAGTCACGATCAATTTTTACAG-3′

SEA-R：5′-GCGGCTTGTATATAAATATATATCA-3′；

(3)分型反应液B：包含SEB上、下游引物各20uM：

SEB-F：5′-AATCTATAGATCAATTTCTATAC-3′

SEB-R：5′-CTTTTTCTTTGTCGTAAGATA-3′；

(4)分型反应液C：包含SEC上、下游引物各20uM：

SEC-F：5′-GTCTGTAGATAAATTTTTGGCA-3′

SEC-R：5′-TCCATTCTTTGTTGTAAGGTG-3′；

(5)分型反应液E：包含SEE上、下游引物各20uM：

SEE-F：5′-GGCCTATAGATAAAGTTAAAACAAGC-3′

SEE-R：5′-CACCTTACCGCCAAAGCTG-3′；

(6)Taq plus DNA Polymerase：2.5U/ul。

(8)阴性对照品为ddH₂O。

按照以下程序进行检测：

本实施例实验用菌株为：金黄色葡萄球菌产肠毒素SEA菌(ATCC-13565)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEB菌(ATCC-14458)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEC菌(ATCC-19095)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEE菌(ATCC-27664)、金黄色葡萄球菌(CMCC-26003-25)、肠炎沙门菌(ATCC-13076)、鼠伤寒沙门菌(CMCC-50115)、伤寒沙门菌(CMCC-50071)、痢疾志贺菌(CMCC-51252)、大肠杆菌O157：H7(CMCC-44050-3)、副溶血性弧菌(VPL 4-90)、奇异变形杆菌(CMCC-49005)、福氏志贺菌(CMCC-51572)、肠毒素型大肠埃希菌(CMCC-44824-3)、肠侵袭型大肠埃希菌(CMCC-44825-3)、肠致病型大肠埃希菌(CMCC-44155-10)、肠出血型大肠埃希菌(CMCC-44050-3)，上述供试菌株均为标准菌株。

1、本发明试剂盒准确性分析：

(1)细菌DNA的提取：细菌待检标本：金黄色葡萄球菌产肠毒素SEA菌(ATCC-13565)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEB菌(ATCC-14458)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEC菌(ATCC-19095)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEE菌(ATCC-27664)分别用7.5％氯化钠肉汤增菌培养；本发明中的其他细菌利用相应的肠道增菌液增菌培养8～12小时后，取1.0ml培养后的增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒(如TIANamp Bacteria DNA Kit)提取模板DNA；

(2)金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的PCR扩增，在同一台PCR仪和同一PCR反应条件下，利用本发明针对SEA、SEB、SEC、SEE所设计的分型引物，同时扩增金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的靶基因：

A.在标明A，B，C，E的PCR反应管中分别加入扩增反应液22.5uL，扩增反应液每管22.5uL的组成为：2.5uL 10×Taq DNA Polymerase Buffer、2.0uL 250mM dNTP、18uL ddH₂O；然后再于相应管中分别加入1uL分型反应液A、分型反应液B、分型反应液C、分型反应液E，然后再于相应管中分别加入1uL待检模板和1.25U Taq plus DNA Polymerase；

(3)扩增产物的电泳检测将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，取3ul扩增产物与0.5ul上样缓冲液混匀后点样于含0.8ug/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中，90V电泳30min后放于凝胶成像系统中成像，观察PCR扩增产物有无预期大小的目的DNA片段：金黄色葡萄球菌SEA片段为582bp；金黄色葡萄球菌SEB片段为602bp；金黄色葡萄球菌SEC片段为601bp；金黄色葡萄球菌SEE片段为125bp，见图1。

(4)扩增产物的基因测序鉴定

分别取利用上述试剂盒和方法进行金黄色葡萄球菌产肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE PCR扩增的产物50uL及相应的PCR上、下游引物10uL送英骏公司测序，测序结果表明与相应的靶基因序列同源性达100％，显示了本发明的准确性。

2、本发明基因分型检测试剂盒的特异性分析：

分别以金黄色葡萄球菌产肠毒素SEA菌(ATCC-13565)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEB菌(ATCC-14458)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEC菌(ATCC-19095)、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEE菌(ATCC-27664)四种之一为特异性检测目标，其余三种以及金黄色葡萄球菌(CMCC-26003-25)、肠炎沙门菌(ATCC-13076)、鼠伤寒沙门菌(CMCC-50115)、伤寒沙门菌(CMCC-50071)、痢疾志贺菌(CMCC-51252)、大肠杆菌O157：H7(CMCC-44050-3)、副溶血性弧菌(VPL 4-90)、奇异变形杆菌(CMCC-49005)、福氏志贺菌(CMCC-51572)、肠毒素型大肠埃希菌(CMCC-44824-3)、肠侵袭型大肠埃希菌(CMCC-44825-3)、肠致病型大肠埃希菌(CMCC-44155-10)、肠出血型大肠埃希菌(CMCC-44050-3)为对照菌，利用本试剂盒和上述检测方法进行PCR检测、经对PCR扩增产物的电泳检测，表明上述分型反应液分别只对金黄色葡萄球菌产肠毒素SEA菌、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEB菌、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEC菌、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEE菌出现PCR阳性扩增反应，出现预期大小的目的片段，对照菌未出现预期大小的目的条带，显示了良好的特异性，分别见图2、3、4、5。

(7)基因分型检测试剂盒的灵敏度分析

以金黄色葡萄球菌产肠毒素SEA菌、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEB菌、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEC菌、金黄色葡萄球菌产肠毒素SEE菌作为检测菌，7.5％氯化钠肉汤增菌培养12小时后用无菌生理盐水做10倍梯度稀释，再经平板菌落计数得知各梯度浓度为0.8×10⁶cfu/mL、0.8×10⁵cfu/mL、0.8×10⁴cfu/mL、0.8×10³cfu/mL、0.8×10²cfu/mL、0.8×10¹cfu/mL、0.8×10⁰cfu/mL，利用本试剂盒和上述检测方法同时进行PCR检测，检测结果表明本试剂盒和检测方法敏感性达0.8×10²CFU/mL，显示了良好的敏感性。

序列表

<110>长沙市疾病预防控制中心

<120>金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR分型检测试剂盒及方法

<130>无

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>引物SEA-F

<400>1

ccgagtcacg atcaattttt acag 24

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>引物SEA-R

<400>2

gcggcttgta tataaatata tatca 25

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>引物SEB-F

<400>3

aatctataga tcaatttcta tac 23

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>引物SEB-R

<400>4

ctttttcttt gtcgtaagat a 21

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>引物SEC-F

<400>5

gtctgtagat aaatttttgg ca 22

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>引物SEC-R

<400>6

tccattcttt gttgtaaggt g 21

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>引物SEE-F

<400>7

ggcctataga taaagttaaa acaagc 26

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>引物SEE-R

<400>8

caccttaccg ccaaagctg 19

Claims

1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR分型检测试剂盒，其特征在于，包括：

(1)扩增反应液成分：

10×Taq DNA Polymerase Buffer、150～250mM dNTP、ddH₂O；

(2)分型反应液A：包含SEA上、下游引物各20μmol/l：

SEA-F：5′-CCGAGTCACGATCAATTTTTACAG-3′

SEA-R：5′-GCGGCTTGTATATAAATATATATCA-3′；

(3)分型反应液B：包含SEB上、下游引物各20μmol/l：

SEB-F：5′-AATCTATAGATCAATTTCTATAC-3′

SEB-R：5′-CTTTTTCTTTGTCGTAAGATA-3′；

(4)分型反应液C：包含SEC上、下游引物各20μmol/l：

SEC-F：5′-GTCTGTAGATAAATTTTTGGCA-3′

SEC-R：5′-TCCATTCTTTGTTGTAAGGTG-3′；

(5)分型反应液E：包含SEE上、下游引物各20μmol/l：

SEE-F：5′-GGCCTATAGATAAAGTTAAAACAAGC-3′

SEE-R：5′-CACCTTACCGCCAAAGCTG-3′；

(6)Taq plus DNA Polymerase：2.5U/μl；

(7)SEA阳性标准品、SEB阳性标准品、SEC阳性标准品、SEE阳性标准品分别为10～200ng/μl的金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因组DNA；

(8)阴性对照品为ddH₂O。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的10×Taq DNAPolymerase Buffer含有200mM pH 8.4的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、200mM氯化钾、100mM硫酸铵、15mM硫酸镁和1％曲拉通X-100。

3.权利要求1或2所述的检测试剂盒用于金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因的分型检测。

4.根据权利要求3所述的检测的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)细菌DNA的提取：细菌待检标本增菌培养后，提取模板DNA；

(2)在PCR反应管中分别加入扩增反应液22.5μL，然后再于相应管中分别加入1μL分型反应液A、分型反应液B、分型反应液C、分型反应液E，然后再于相应管中分别加入1μL待检模板和1.25U Taq plus DNA Polymerase；所述的22.5μL扩增反应液的组成为：2.5μL10×Taq DNA Polymerase Buffer、2.0μL 250mM dNTP、18μL ddH₂O；

(3)将上述各管混匀后置于PCR仪上进行以下条件的扩增反应：①94℃5min，②94℃30sec，③60℃45sec，④72℃45sec，⑤72℃6min，其中②一④步循环40次；

(4)取扩增产物与上样缓冲液混匀后点样，电泳后放于凝胶成像系统中成像，观察PCR扩增产物有无预期大小的目的DNA片段：金黄色葡萄球菌肠毒素SEA片段为582bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEB片段为602bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEC片段为601bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEE片段为125bp。

5.根据权利要求4所述的检测的方法，其特征在于，

步骤(1)所述的细菌DNA的提取：待检标本用增菌液增菌培养8-24小时后，取1.0ml培养后的增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA。

6.根据权利要求5所述的检测的方法，其特征在于，所述的增菌液为7.5％的氯化钠肉汤。

7.根据权利要求4所述的检测的方法，其特征在于，步骤(4)点样时，取3μl扩增产物与0.5μl上样缓冲液混匀后点样于含0.8μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中，90v电泳30min后放于凝胶成像系统中成像。

8.根据权利要求4所述的检测的方法，其特征在于，步骤(3)所述的PCR反应在同一台PCR仪及同一PCR反应条件下进行。