RU2413774C1 - Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля - Google Patents
Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля Download PDFInfo
- Publication number
- RU2413774C1 RU2413774C1 RU2009138182/10A RU2009138182A RU2413774C1 RU 2413774 C1 RU2413774 C1 RU 2413774C1 RU 2009138182/10 A RU2009138182/10 A RU 2009138182/10A RU 2009138182 A RU2009138182 A RU 2009138182A RU 2413774 C1 RU2413774 C1 RU 2413774C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- potato
- varieties
- potatoes
- variety
- Prior art date
Links
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 title claims abstract description 73
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 title claims abstract description 64
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 title claims description 23
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 23
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 67
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 4
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 claims description 3
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 2
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 4
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 31
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 5
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 3
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 description 3
- 244000079002 Solanum demissum Species 0.000 description 3
- 241000706359 Solanum phureja Species 0.000 description 3
- 241000896503 Solanum stoloniferum Species 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005725 8-Hydroxyquinoline Substances 0.000 description 1
- 108091000069 Cystinyl Aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009809 Humulus lupulus var lupuloides Nutrition 0.000 description 1
- 235000006878 Humulus lupulus var neomexicanus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009800 Humulus lupulus var pubescens Nutrition 0.000 description 1
- 235000009808 Humulus lupulus var. lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 102100020872 Leucyl-cystinyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- GKXJWSZPLIKUPS-IUNAMMOKSA-N N-[(2Z,6Z)-2,6-bis(hydroxyimino)cyclohexylidene]hydroxylamine Chemical compound O\N=C1\CCC\C(=N\O)C1=NO GKXJWSZPLIKUPS-IUNAMMOKSA-N 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical group [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 241000379547 Trifolium medium Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011021 lapis lazuli Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229960003540 oxyquinoline Drugs 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N quinolin-8-ol Chemical compound C1=CN=C2C(O)=CC=CC2=C1 MCJGNVYPOGVAJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013526 red clover Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Для определения сортовой принадлежности растений картофеля выделяют ДНК из свежего растительного материала и исследуют ее с помощью ПЦР. ПЦР проводят, используя набор, содержащий биологический маркер, реакционную смесь, состоящую из 160 мкМ каждого динуклеотидтрифосфата dNTP, 1.6 мМ MgCl2, 0.3 мкМ каждого праймера из набора, 0.3 единицы фермента Taq-полимеразы, 1× буфера для Taq-полимеразы и эталонные ДНК известных сортов картофеля в количестве 20-50 нг. Получают полиморфные маркеры ДНК, визуализируют их с помощью электрофореза в геле, а затем для типирования выявленных в изученной группе аллелей проводят сравнение аллельных спектров анализируемой и контрольной групп образцов. Биологический маркер, содержащий полиморфную ДНК, представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, получаемую при использовании диагностического набора из трех пар праймеров и характеризует сортовую принадлежность. наиболее распространенных и хозяйственно-значимых сортов картофеля, а также образцов родственных видов Solarium, наиболее часто используемых в скрещиваниях при создании новых сортов картофеля. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям, к области, связанной с сортовой идентификацией картофеля, контроля сортовой однородности картофеля, интрогрессии генетического материала в потомстве от скрещиваний при создании новых сортов.
Известен способ молекулярного маркирования и идентификации пола хмеля обыкновенного с использованием двух комбинаций олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции, которые обеспечивают амплификацию специфичных для мужских растений фрагментов ДНК (RU 2272840 (13) 2004.03.09). Недостатком этого способа является гено- и геномспецифичность праймеров, использование которых возможно только на хмеле и только для определения пола растений хмеля.
Известен способ молекулярного маркирования селекционных достижений клевера лугового на основе RAPD-маркеров в оценке ДНК-полиморфизма RAPD-методом с использованием набора 10-членных праймеров (RU 2244416 (13) 2002.02.06). Недостатком этого способа является малая воспроизводимость самого RAPD-метода и зачастую невозможность использования данных, полученных в разных лабораториях.
Известен способ идентификации гибридов сельскохозяйственных культур путем определения аллельного состояния исследуемых локусов по продуктам амплификации, полученным с использованием праймеров к подобранным в тест-системе маркерам, сравнение генотипа образца с известными генотипами, причем отдельно выделяют ДНК и идентифицируют генотип материнской ткани семени и отдельно выделяют ДНК и идентифицируют генотип гибридной ткани семени (UA 79346 (13) 2005.07.18). Недостатком этого способа является возможность его использования только для идентификации семян гибридов сельскохозяйственных культур и непригодность идентификации сортов картофеля.
Известны способы идентификации генотипов ячменя на основе использования системы микросателлитных ДНК-маркеров (UA 67905 (13) 2003.03.20), праймеров к LTR-последовательности ретротранспазонов ячменя (UA 15273 (13) 2006.01.03). Также известны способы регистрации и паспортизации генотипов ячменя на основе анализа компонентов электрофоретического спектра, получаемого с помощью полимеразной цепной реакции IRAP (UA 15277 (13) 2006.01.03), реакции REMAP (UA 16082 (13) 2006.02.20), дифференциации генотипов сортов ячменя на основе полимеразной цепной реакции с праймерами, гомологичными фрагментам ретротранспазонов (LTR-праймеры) и рядом расположенного простого микросателлитного повтора (ISSR-праймеры) (UA 16084 (13). Вид документа U (14). Дата публикации 2006.02.20).
Недостатками данных способов является геном специфичность (ячмень) предлагаемых праймеров и, следовательно, непригодность их для сортовой идентификации картофеля.
Наиболее близким к предлагаемому способу определения сортовой принадлежности культурных растений найдены следующие способы.
Способы оценки типичности инбредных линий и уровня гибридности семян F1 подсолнечника по микросателлитным локусам НА 432, НА 514, НА 1442 и ORS 5 с использованием праймеров, соответствующих фланкирующим областям этих локусов (RU 2294965 (13) 2005.07.04).
Известен способ определения типичности и уровня гибридности генотипов подсолнечника путем определения процента типичных для определенной линии или гибрида растений путем выделения ДНК из трехдневных проростков 100 семян, проведения амплификации определенных микросателлитных локусов в полимеразной цепной реакции, распределения продуктов реакции в 10% полиакриламидном геле и сравнения электрофоретических спектров и подсчета количества растений с одинаковым аллельным составом (UA 63265 (13) 2003.03.20)
Известен способ классификации ржи по типу молекулы ДНК на основе анализа молекулы ДНК, выделенной из тканей зерна, ростков или других тканей, определение чистоты повторения аллелей микросателлитных локусов в различных сортах ржи и определение генотипа сорта в виде формулы (UA 10230 (13) 2005.03.23).
Известен способ идентификации генотипов подсолнечника с помощью определения и записи набора аллелей по микросателлитным локусам генома путем их амплификации в полимеразной цепной реакции и электрофореза в полиакриламидном геле. (UA 68813 (13) 2003.10.30).
Недостатками известных способов является геном специфичность (подсолнечник, рожь) предлагаемых праймеров и, следовательно, их непригодность для сортовой идентификации картофеля, а также отсутствие праймеров и набора для идентификации и паспортизации сортов картофеля, невозможность создания генетического паспорта сортов картофеля.
Таким образом, изобретение - биологический ДНК маркер должен быть а) специфичен для картофеля, то есть быть пригодным для анализа генотипов картофеля; б) применим для идентификации и паспортизации сортов картофеля, то есть должен выявлять индивидуальные генетические особенности сортов картофеля.
Изобретение также должно предполагать наличие набора пригодного для анализа генотипов картофеля, а также способа, обеспечивающего быстроту и точность анализа.
Задачей предлагаемого изобретения является определение сортовой принадлежности наиболее распространенных и практически значимых сортов картофеля (Solaum tuberosum), а также образцов родственных видов Solanum наиболее часто используемых в скрещиваниях при создании новых сортов картофеля и составление паспорта этих сортов картофеля.
В результате использования предлагаемого биологического маркера для сортовой идентификации картофеля, набора и способа идентификации появляется возможность создания молекулярно-генетического паспорта сорта и повышение эффективности сортовой идентификации в генетико-селекционных мероприятиях, связанных с выведением новых сортов и размножением уже имеющихся элитных растений сортов.
В таблице представлено распределение полиморфных биологических ДНК маркеров у сортов картофеля, а также аллельные формулы сортов, представляющие индивидуальные генетические характеристики (паспорта) каждого сорта. С помощью предлагаемого набора биологических ДНК маркеров и способа получения индивидуальных генетических характеристик осуществляется сортовая идентификация картофеля.
Вышеуказанный результат достигается тем, что биологический маркер, содержащий полиморфную ДНК, характеризует сортовую принадлежность наиболее распространенных и хозяйственно значимых сортов картофеля и представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, получаемую при использовании диагностического набора из следующих трех пар праймеров
Результат достигается также тем, что используют набор для определения сортовой принадлежности растений картофеля, содержащий биологический маркер, реакционную смесь, состоящую из 160 мкМ каждого динуклеотидтрифосфата dNTP, 1.6 мМ MgCl2, 0.3 мкМ каждого праймера из набора, 0.3 единицы фермента Taq-полимеразы, 1× буфера для Taq-полимеразы и эталонные ДНК растения картофеля в количестве 20-50 нг.
В способе определения сортовой принадлежности растений/клубней картофеля - выделение ДНК из свежего растительного материала и анализ геномной ДНК картофеля с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
ПЦР-анализ проводят, используя предлагаемый набор праймеров, получают полиморфные маркеры ДНК разного размера, визуализируют эти маркерные ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле, затем для типирования выявленных в изученной группе аллелей проводят сравнение генетического разнообразия определяемой и контрольной групп образцов амплифицируемых фрагментов ДНК. Набор контрольных амплификатов содержит образцы амплифицированной ДНК, характерные для каждого из тестируемых сортов картофеля Solanum tuberosum. Сортовую принадлежность определяют по отсутствию или присутствию в исследуемой группе определенных сортоспецифических аллельных фенотипов. Размер амплифицируемых продуктов определяют с помощью маркера молекулярных масс (10 bp Ladder).
Результат достигается также тем, что для каждого сорта картофеля составляют молекулярно-генетический паспорт, представленный в таблице 1, в которой указано распределение выявленных с помощью трех пар праймеров (STU005F/STU005R, STU012F/STU012R, STU104F/STU104R) полиморфных микросателлитных маркеров, соответствующих локусам (STU005, STU012, STU104), по которым определяют сорт картофеля.
В предлагаемом способе верификацию сортовой принадлежности проверяют с помощью различных вариантов многомерного анализа (например, нейронных сетей Кахонена, кластерного анализа, метода главных компонент и т.п.), в которых в качестве обучающей выборки может служить выборка аллелей и аллельных фенотипов одного из сортов набора картофеля.
Таким образом, генетическая идентификация растений сортов картофеля как отечественной, так и зарубежной селекции с применением предлагаемых биологических маркеров и набора осуществляется в результате фингерпринтинга сортов или коллекционных образцов картофеля. Посредством предлагаемого способа получают молекулярно-генетические характеристики сортов картофеля как отечественной, так и зарубежной селекции, а также коллекционных образцов близкородственных видов/подвидов/разновидностей картофеля рода Solarium ("секция Petota), определяют сортоспецифичные маркеры с целью паспортизации сортов. При изучении сортов картофеля и близкородственных видов/подвидов/разновидностей выявляют несколько сортоспецифичных маркеров, которые в дальнейшем используют в качестве эталона для определения сортовой принадлежности любого сорта картофеля.
На заключительном этапе для каждой идентифицируемой группы составляют таблицу-паспорт с указанием распределения выявленных аллельных фенотипов и их аллелей по трем полиморфным локусам. На основании этой таблицы с высокой вероятностью либо визуально, либо с помощью многомерного статистического анализа определяют принадлежность (или отсутствие принадлежности) исследуемого растения картофеля к одному из сортов.
Методика использования изобретения
Для идентификации сортовой принадлежности сорта собирают живой растительный материал от 5-10 растений сорта (лучше молодые ткани - листья/почки). Наилучшим материалом для последующего выделения суммарной ДНК являются молодые ткани - листья/листовые или цветочные почки живых растений. Поэтому при наличии клубневого материала клубни предварительно проращивают до появления из глазковых почек 1-2 листков.
Выделение и хранение ДНК
1. Выделение ДНК из свежей растительной ткани
Выделение тотальной ДНК проводили по модифицированной методике Эдвардса (Edwards et al., 1991) с дополнительными этапами депротеинизации смесью фенол/хлороформ (1:1). Выделение ДНК заключается в последовательном прохождении следующих фаз: лизис клеток и ядер, депротеинизация ДНК с помощью 5 М ацетата калия, фенол-хлороформная депротеинизация, осаждение и растворение ДНК.
2. Лизис клеток
К листовой высечке (~0.05 мг) в пробирке типа Eppendorf объемом 1,5 мл добавляют 400 мкл лизирующего буфера. Состав лизирующего буфера: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5; 250 мМ NaCl; 25 мМ EDTA; 0,5% SDS. Растительный материал в буфере при комнатной температуре гомогенизируют с помощью специальных пестиков. Смесь инкубируют в термостате или водяной бане в течение 15-20 минут при 65°С.
3. Депротеинизация ДНК
В пробирку со смесью, содержащей лизированные клетки и ядра, добавляют 200 мкл предварительно охлажденного 5 М ацетата калия, смесь тщательно перемешивают и инкубируют на ледяной бане 10-20 мин. После инкубации смесь центрифугируют 15 мин при 16000 g. Полученный надосадочный супернатант (около 450 мкл) переносят в новую пробирку и подвергают двукратной очистке равным объемом смеси фенол/хлороформ. Смесь фенола и хлороформа приготавливают путем смешивания равных объемов фенола и хлороформа. Готовый фенол содержит 0.1% антиоксидантов 8-оксихинолина и 0.2% меркаптоэтанола. Готовый хлороформ представляет собой смесь хлороформа и изоамилового спирта (24:1). Супернатант и смеси фенол/хлороформ плавно перемешивают до образования эмульсии, а затем центрифугируют 5 минут при 16000 g. После чего верхнюю фазу с растворенной ДНК отбирают пипеткой, стараясь не захватывать интерфазу, содержащую белки и нижнюю фазу, содержащую фенол:хлороформ. Фенол-хлороформная депротеинизация повторяется 2-3 раза до полной очистки раствора ДНК от белков.
4. Осаждение ДНК
Осаждение ДНК производят путем добавления к очищенному супернатанту 0.6 V изопропанола; смесь перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 16000 g. Спирт сливают и осадок промывают 70% этанолом не менее 3 раз, просушивают и растворяют в 20-25 мкл бидистилированной стерильной воды.
После определения концентрации и чистоты ДНК (на спектрофотометре/или в геле) концентрации ДНК в пробах стандартизируют путем разведения в стерильной бидистиллированной воды до 50 мкг/мкл.
Продолжительность выделения ДНК составляет 3 часа.
5. Оценка качества и количества экстрагированной ДНК
Оценку качества и количества экстрагированной ДНК производят путем измерения оптической плотности раствора ДНК на анализаторе типа Биофотометр (Bio Photometer Eppendorf) либо путем проведения аналитического электрофореза.
Измерение оптической плотности раствора ДНК при длине волны 260 нм позволяет установить концентрацию и чистоту нуклеиновых кислот. Оптическая плотность D=1 соответствует приблизительно 50 мкг/мл двуцепочечной ДНК. Отношение величины D при длине волны 260 нм к D при длине волны 280 нм позволяет судить о чистоте нуклеиновой кислоты. Чистые препараты ДНК имеют отношение D260/D280, равное 1.6-1.8. Если препарат содержит примеси белка и/или фенола, то D260/D280 значительно меньше этих значений. Соотношение D260/D230 говорит о загрязнении полисахаридами. Для чистых препаратов ДНК это соотношение должно быть 1.8.
Определение концентрации и качества выделенных образцов ДНК методом электрофореза в агарозном геле проводится в горизонтальной камере в 1х трис-боратным буфере (ТВЕ), рН 7,5-7,8 (0,089 М трис, 0,089 М борной кислоты и 0,002 М ЭДТА). При внесении ДНК в карманы геля используется буфер для нанесения (0.25% бромфеноловый синий, 40% (w/v) сахароза, 6 мМ ЭДТА). После электрофореза гель окрашивают в растворе бромистого этидия в течение 5-10 минут или добавляют бромистый этидий непосредственно в гель. Вхождение ДНК в гель осуществляют при 50 V в течение 15-20 минут, далее электрофорез ведут при 75-90 V в течение 1-2 часов. В качестве маркера концентрации используется ДНК фага λ, внесенная в разных количествах, например, 0,5; 1; 2 мкг.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
1. Проведение ПЦР
Выделенную ДНК используют в качестве матрицы в реакции амплификации. Амплификацию ДНК проводят в реакционной смеси объемом 15 мкл, содержащей 1х буфер из соответствующего набора, 0,16 мМ каждого dNTP, 1.2 mM MgCl2, 0.3 мкМ праймера, 0.3 ед. Taq полимеразы и 100 нг геномной ДНК в термоциклере «Applied Biosystems 2700» (США) в режиме: денатурация - 30 сек - 94°С; отжиг праймера - 45 сек - 50-60°С; синтез ДНК - 1 мин - 72°С (35 циклов) с предварительной денатурацией - 5 мин (94°С) и заключительной элонгацией PCR-фрагментов 10 мин - 72°С. Температура отжига для каждого праймера рассчитывалась отдельно по формуле Та=Tm-4, где температура плавления Tm=69.3+0.41(%GC)-650/L нуклеотидов, L - длина праймера (число нуклеотидов), %GC - процент GC нуклеотидов от длины праймера. Для проведения ПЦР предлагается использовать три пары праймеров следующего состава:
2. Электрофоретическое разделение продуктов и визуализация ПЦР-продуктов
Продукты амплификации подвергают аналитическому электрофорезу в 1.7% агарозном геле толщиной 5-7 мм, содержащем бромистый этидий в 1х ТВЕ буфере. В качестве маркеров молекулярного веса используется O'Range Ruler™ 100 bp DNA ladder Plus ("Fermentas", США). Вхождение фрагментов в гель осуществляют при 50 V в течение 10-20 минут, а разделение фрагментов - в течение 1-2 часов при 75-90 V.
В случае эффективной амплификации продукты амплификации подвергают электрофоретическому разделению в вертикальной камере (например, Sequi-Gen GT Sequencing Cell «Bio-Rad», США) в 6% ПААГе, содержащем 7% мочевину.
Визуализацию осуществляют путем окрашивания гелей азотнокислым серебром из набора Silver Sequence Staining Kit (Promega, США) согласно инструкции производителя с последующим фотографированием цифровым фотоаппаратом Nicon либо любой другой системы визуализации. Размер амплифицируемых продуктов определяют с помощью маркера молекулярных масс O'Range Ruler™ 50 bp и DNA Ladder O'Range Ruler™ 10 bp DNA Ladder ("Fermentas", США).
Затем проводят статистическую обработку результатов и составляют сортовой молекулярно-генетический паспорт.
Для типирования аллельных вариантов (определения размера в п.н.), выявленных в изученной группе растений картофеля, необходимо провести обязательное сравнение генетического разнообразия данной и контрольной (эталонной) групп образцов амплифицируемой ДНК. Набор контрольных амплификатов может содержать в среднем от 5 до 20 образцов амплификатов, характерных для 5-20 микросателлитных аллельных вариантов. Отсутствие или присутствие в исследуемой группе генотипов растений определенных аллелей или аллельных сочетаний позволяет надежно определять сортовую принадлежность. Верификацию сортовой принадлежности проводят с помощью различных вариантов многомерного (кластерного анализа, нейронных сетей Кахонена, дискриминантного анализа или метода главных компонент), в котором в качестве обучающей выборки может служить выборка аллельных вариантов и аллельных фенотипов одного из ранее изученных сортов картофеля.
Список сортов картофеля, которые могут служить обучающей выборкой и для которых известно генетическое разнообразие и сортоспецифические аллели и аллельные фенотипы, представлен в табл. 1 (Russet Burbunck, Mondeal, Bintije, Romano, Пушкинский, Чародей, Невский, Петербургский, Лазурит, Яхонт, Эффект, Лорх, Лукьяновский, Раменский, Никулинский, Осень, Скороплодный, Корона, Резерв, Удача, Загадка, Волжанин, Ранняя Роза, Красноярский, Беглицкий, Ильинский, Бронницкий, Вестник, Жуковский).
На фиг.1 представлен набор полиморфных ДНК, выявляемых с помощью праймера STU104 у различных сортов картофеля.
На фиг.2 представлен набор полиморфных ДНК, выявляемых с помощью праймера STU005 у различных сортов картофеля.
На фиг.3 представлен набор полиморфных ДНК, выявляемых с помощью праймера STU012 у различных сортов картофеля.
Примеры выполнения предлагаемого способа.
Пример 1. Способ определения сорта картофеля с помощью праймеров STU104F/ STU104R
Из растительного материала сортов картофеля выделяют ДНК способом, указанным выше. На каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с одной из трех пар предлагаемых праймеров, а именно STU104F/ STU104R. Полученные продукты амплификации визуализируют путем электрофореза в геле, и после окрашивания геля нитратом серебра идентифицируют маркерные аллели различной длины, представляющие аллельные фенотипы сортов картофеля. На фиг.1 представлены полиморфные маркеры для каждого тестированного сорта картофеля, а также образцов, часто используемых в селекции сортов культурного картофеля видов S. stoloniferum, S. demissum и S. phureja.
Каждый из сортов характеризуется определенным набором или сочетанием аллелей, то есть сортоспецифичными аллельными фенотипами, представленными в таблице 2. Это распределение служит эталоном при сравнении и идентификации растений неизвестных сортов картофеля. Путем сравнения распределения полиморфных ДНК разной длины среди исследуемых и эталонных образцов определяют сортовую принадлежность.
Пример 2. Способ определения сорта картофеля с помощью праймеров STU005F/STU005R
Из растительного материала сортов картофеля выделяют ДНК способом, указанным выше. На каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с одной из трех пар предлагаемых праймеров, а именно STU005F/STU005R. Полученные амплификационные продукты визуализируют путем электрофореза в геле, и после окрашивания геля нитратом серебра идентифицируют маркерные аллели различной длины, представляющие аллельные фенотипы сортов картофеля. На фиг.2 представлены полиморфные маркеры для каждого тестированного сорта картофеля, а также образцов часто используемых в селекции сортов культурного картофеля видов S. stoloniferum, S. demissum и S. phureja.
Каждый из сортов характеризуется определенным набором или сочетанием аллелей, то есть сортоспецифичными аллельными фенотипами, представленными в таблице 3, Это распределение служит эталоном при сравнении и идентификации растений неизвестных сортов картофеля. Путем сравнения распределения полиморфных ДНК разной длины среди исследуемых и эталонных образцов определяют сортовую принадлежность.
Пример 3. Способ определения сорта картофеля с помощью праймеров STU012F/STU012R
Из растительного материала сортов картофеля выделяют ДНК способом, указанным выше. На каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с одной из трех пар предлагаемых праймеров, а именно STU012F/STU012R. Полученные амплификационные продукты визуализируют путем электрофореза в геле, и после окрашивания геля нитратом серебра идентифицируют маркерные аллели различной длины, представляющие аллельные фенотипы сортов картофеля. На фиг.3 представлены полиморфные маркеры для каждого тестированного сорта картофеля, а также образцов часто используемых в селекции сортов культурного картофеля видов S. stoloniferum, S. demissum и S. phureja.
Каждый из сортов характеризуется определенным набором или сочетанием аллелей, то есть сортоспецифичными аллельными фенотипами, представленными в таблице 4. Это распределение служит эталоном при сравнении и идентификации растений неизвестных сортов картофеля. Путем сравнения распределения полиморфных ДНК разной длины среди исследуемых и эталонных образцов определяют сортовую принадлежность.
Молекулярно-генетический паспорт по всем трем парам праймеров составляется для каждого известного сорта и представлен в таблице 1. Аналогичный паспорт можно составить для любой выборки растений неизвестного происхождения.
Claims (5)
1. Биологический маркер, содержащий полиморфную ДНК, характеризующий сортовую принадлежность наиболее распространенных и хозяйственно значимых сортов картофеля, и представляющий собой нуклеотидные последовательности из группы трех пар праймеров следующего состава:
Пары праймеров Первичная последовательность праймеров
STU005 F 5'AATTCATGTTTGCGGTACGTC3'
R 5'ATGCAGAAAGATGTCAAAATTGA3'
STU012 F 5'AACATTACAACACATTAGCA3'
R 5'AACTTATCTGAAACTCTCGT3'
STU0104 F 5'GGGACATCACAGTCT3'
R 5'GGTGCTCCTATTGGTG3”
2. Набор для определения сортовой принадлежности растений картофеля, содержащий биологический маркер по п.1, реакционную смесь, состоящую из 160 мкМ каждого динуклеотидтрифосфата dNTP, 1.6 мМ MgCl2, 0.3 мкМ каждого праймера из набора, 0.3 единицы фермента Taq-полимеразы, 1· буфера для Taq-полимеразы и эталонные ДНК растения картофеля в количестве 20-50 нг.
3. Способ определения сортовой принадлежности растений картофеля, включающий выделение ДНК из свежего растительного материала, исследование геномной ДНК картофеля с помощью ПЦР, отличающийся тем, что ПЦР-анализ проводят, используя набор по п.2, получают полиморфные маркеры ДНК разного размера, визуализируют эти ДНК при электрофорезе в акриламидном или агарозном геле, затем для типирования выявленных в изученной группе аллелей проводят сравнение генетического разнообразия определяемой и контрольной групп образцов амплифицируемой ДНК, и по отсутствию или присутствию в исследуемой группе определенных единичных сортоспецифичных аллельных фенотипов определяют сортовую принадлежность.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что для каждого сорта картофеля составляют генетический паспорт, представленный в таблице 1, в которой указано распределение выявленных с помощью трех пар праймеров (STU005, STU012, STU104) полиморфных микросателлитных маркеров, соответствующих локусам (STU005, STU012, STU104), и по которым определяют сорт картофеля; размер амплифицируемых продуктов определяют с помощью маркера молекулярных масс (10 bp Ladder); набор контрольных амплификатов содержит образцы амплифицированной ДНК, характерные для каждого из изученных сортов картофеля.
5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что верификацию сортовой принадлежности проверяют с помощью различных вариантов многомерного анализа, например, путем кластерного анализа, дискриминантного анализа, метода главных компонент, или нейронных сетей Кахонена, в котором в качестве обучающей выборки может служить выборка аллелей и аллельных фенотипов одного из набора сортов картофеля.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009138182/10A RU2413774C1 (ru) | 2009-10-16 | 2009-10-16 | Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009138182/10A RU2413774C1 (ru) | 2009-10-16 | 2009-10-16 | Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2413774C1 true RU2413774C1 (ru) | 2011-03-10 |
Family
ID=46311130
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009138182/10A RU2413774C1 (ru) | 2009-10-16 | 2009-10-16 | Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2413774C1 (ru) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2539756C1 (ru) * | 2013-09-30 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Высокоспецифичный днк-маркер, используемый в качестве эндогенного референсного контроля для обнаружения геномной днк картофеля в растительном материале и пищевых продуктах, в том числе при идентификации гмо |
| RU2758718C2 (ru) * | 2015-12-16 | 2021-11-01 | Зингента Партисипейшнс Аг | Участки генов и гены, ассоциированные с повышенной урожайностью у растений |
| RU2823809C1 (ru) * | 2023-09-02 | 2024-07-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С.М. Кирова" | BpCW1 - молекулярный маркер для выявления генотипов карельской березы на ранних стадиях развития |
| CN119082343A (zh) * | 2024-08-26 | 2024-12-06 | 青海省农林科学院 | 一种用于鉴定马铃薯块茎薯肉颜色的snp位点及应用 |
| CN119491061A (zh) * | 2024-08-05 | 2025-02-21 | 云南师范大学 | 用于马铃薯Chr5同源染色体分型鉴定的SSR标记检测引物及用途 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1420182A (zh) * | 2002-10-11 | 2003-05-28 | 覃文 | 用于转基因马铃薯实时荧光pcr检测的探针序列和试剂盒 |
| KR20040021215A (ko) * | 2002-09-03 | 2004-03-10 | 대한민국(관리부서:농촌진흥청) | 감자 특이 ｄｎａ를 증폭하는 단일 ｐｃｒ 프라이머 및이를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 ｐｃｒ 판별방법 |
| RU2265668C1 (ru) * | 2004-09-15 | 2005-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью Инновационная Корпорация "БИОЗАЩИТА" | Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа |
| RU2270254C2 (ru) * | 2004-04-30 | 2006-02-20 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа |
| JP2009000071A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Kirin Holdings Co Ltd | バレイショ品種識別用プライマーセット及びそれを用いるバレイショ品種の識別方法 |
-
2009
- 2009-10-16 RU RU2009138182/10A patent/RU2413774C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040021215A (ko) * | 2002-09-03 | 2004-03-10 | 대한민국(관리부서:농촌진흥청) | 감자 특이 ｄｎａ를 증폭하는 단일 ｐｃｒ 프라이머 및이를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 ｐｃｒ 판별방법 |
| CN1420182A (zh) * | 2002-10-11 | 2003-05-28 | 覃文 | 用于转基因马铃薯实时荧光pcr检测的探针序列和试剂盒 |
| RU2270254C2 (ru) * | 2004-04-30 | 2006-02-20 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа |
| RU2265668C1 (ru) * | 2004-09-15 | 2005-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью Инновационная Корпорация "БИОЗАЩИТА" | Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа |
| JP2009000071A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Kirin Holdings Co Ltd | バレイショ品種識別用プライマーセット及びそれを用いるバレイショ品種の識別方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2539756C1 (ru) * | 2013-09-30 | 2015-01-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук | Высокоспецифичный днк-маркер, используемый в качестве эндогенного референсного контроля для обнаружения геномной днк картофеля в растительном материале и пищевых продуктах, в том числе при идентификации гмо |
| RU2758718C2 (ru) * | 2015-12-16 | 2021-11-01 | Зингента Партисипейшнс Аг | Участки генов и гены, ассоциированные с повышенной урожайностью у растений |
| RU2823809C1 (ru) * | 2023-09-02 | 2024-07-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С.М. Кирова" | BpCW1 - молекулярный маркер для выявления генотипов карельской березы на ранних стадиях развития |
| RU2830866C1 (ru) * | 2023-12-22 | 2024-11-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Уфимский федеральный исследовательский центр Российской академии наук | Тест-система для идентификации, оценки генетического полиморфизма и генетической паспортизации сортов и линий тимофеевки луговой Phleum pratense L. |
| CN119491061A (zh) * | 2024-08-05 | 2025-02-21 | 云南师范大学 | 用于马铃薯Chr5同源染色体分型鉴定的SSR标记检测引物及用途 |
| CN119082343A (zh) * | 2024-08-26 | 2024-12-06 | 青海省农林科学院 | 一种用于鉴定马铃薯块茎薯肉颜色的snp位点及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kalendar et al. | Analysis of plant diversity with retrotransposon-based molecular markers | |
| Kovarik et al. | Rapid concerted evolution of nuclear ribosomal DNA in two Tragopogon allopolyploids of recent and recurrent origin | |
| US10337072B2 (en) | Copy number detection and methods | |
| CN101323878B (zh) | 利用水稻dna插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法 | |
| Rocha et al. | Genetic diversity of ‘Uba’mango tree using ISSR markers | |
| US20210040552A1 (en) | Development of simple sequence repeat (ssr) core primer group based on whole genome sequence of pomegranate and application thereof | |
| Sakamoto et al. | Single-seed PCR-RFLP analysis for the identification of S haplotypes in commercial F1 hybrid cultivars of broccoli and cabbage | |
| RU2413774C1 (ru) | Биологический днк маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля | |
| CN112176091A (zh) | 一种与茄子萼片颜色性状基因紧密连锁的caps分子标记及制备方法 | |
| da Silva et al. | Genome size, cytogenetic data and transferability of EST-SSRs markers in wild and cultivated species of the genus Theobroma L.(Byttnerioideae, Malvaceae) | |
| KR20160082292A (ko) | 무 유전자원 분석을 위한 분자표지 및 이의 용도 | |
| KR101878539B1 (ko) | 콩의 싸리수염진딧물 저항성 염기다형성 마커 및 이의 용도 | |
| Rahman et al. | Microsatellite based DNA fingerprinting of 28 local rice (Oryza sativa L.) varieties of Bangladesh | |
| Li et al. | Development of microsatellite markers in canary seed (Phalaris canariensis L.) | |
| CN118186135B (zh) | 一组与陆地棉耐高温性状相关的qtl、分子标记及其应用 | |
| KR100842434B1 (ko) | 인삼에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도 | |
| Fountain et al. | A note on development of a low-cost and high-throughput SSR-based genotyping method in peanut (Arachis hypogaea L.) | |
| CN109468404B (zh) | 一种鉴定水稻香味表型的方法及其所用引物对 | |
| Yakovlev et al. | Genetic differentiation of pedunculate oak Quercus robur L. in the European part of Russia based on RAPD markers | |
| CN110484629A (zh) | 一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记、其引物及应用 | |
| CN102471802B (zh) | 用于鉴定甘蔗属植物品种/品系的标记物及其用途 | |
| KR20180098508A (ko) | 무 유전자원 분석을 위한 분자표지 및 이의 용도 | |
| Zhao et al. | Inheritance of AFLP markers and their use for genetic diversity analysis in wild and farmed scallop (Chlamys farreri) | |
| Ioannides et al. | Analysis of PrP genotypes in relation to reproductive and production traits in Chios sheep | |
| KR100901817B1 (ko) | 한우 생산이력체계 구축용 프라이머 세트 및 이를 이용한한우 개체 판별방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180921 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201017 |