CN105734118A - 基于飞行时间质谱法联合特异Tags序列进行SNP分型方法的建立(MS-SSTA) - Google Patents

Abstract

本发明是基于飞行时间质谱法联合特异的Tags序列和寡核苷酸连接反应建立的SNP分型方法，主要是利用位点特异性的Tags序列和寡核苷酸连接反应，经过PCR、限制性内切酶酶切反应，通过MALDI–TOF质谱检测连接Tags一段序列的分子量大小，通过Tags序列所对应的碱基类型，实现对SNP位点的分型。与现有的方法相比，通过检测不同Tags的分子量差异实现SNP分型，提高了质谱检测的范围，同时提高了检测的灵敏度。另外，可同时对多个SNP位点进行检测，具有操作简单，成本低的特点。

Description

基于飞行时间质谱法联合特异Tags序列进行SNP分型方法的建立(MS-SSTA)

技术领域

本方法MS-SSTA(MSBasedSiteSpecificTagsAssay)涉及到使用飞行时间质谱分析生物核酸分子中单核苷酸多态性（SNP，SingleNucleotidePolymorphisms）。具体来说，是引入一段特异性的Tags序列，经过一系列的寡核苷酸连接反应、PCR反应、限制性酶切反应等，然后使用飞行时间质谱对基因组的单核苷酸多态性进行检测。

背景技术

SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入等变化，且在群体中的发生频率不小于1%，它与许多疾病的易感性和药物反应差异有关。SNP具有数量多、分布广、遗传稳定等特点，在人类基因组中大概每1000个碱基平均就有一个SNP，人类基因组上的SNP总数大概是300万个，存在于基因组的编码区和非编码区，可以全面地反映遗传及变异情况，也可以挑选感兴趣基因的位点来解释不同群体或个体对疾病、药物和环境的差异，从而为遗传性疾病的研究提供基础。另外，很多物种SNP是两种等位基因，即只有两种碱基组成，只需要通过某种方法检测出这两种碱基即可完成基因分型。

随着SNP发现数目的增加，需要找到一种准确、高通量、低成本的方法对SNP分型并评估对遗传变异的生物学影响，传统SangerDNA测序被认为是SNP分型的金标准，但是该方法依赖于gel琼脂糖电泳，会产生大量的信息，并且耗时，繁琐【1】。随后一些非gel依赖的分型方法也被逐渐完善，包括allele特异的杂交，allele特异的引物延伸，allele特异的寡核苷酸连接，allele特异的探针切割等，并通过荧光信号强度、质谱等检测方法进行SNP分型。

目前基于引物延伸原理的质谱法得到了广泛的应用，尤其是飞行时间质谱在SNP分型检测市场上得到了广泛的应用，较成熟的方法包括：MassExtendassay，iPLEXassay，PinPointassay，GOODassay等【2】，他们有一个共同点，都是通过精确测量延伸产物的分子量，从而判断样品中SNP位点的碱基。例如SequenomiPLEXassay基本原理是：先设计特异性引物，经多重PCR扩增含有待测SNP位点的DNA片段，然后针对待测SNP位点设计延伸引物，并在反应体系中加入ddNTP和DNA聚合酶，使得PCR退火时，引物3^/端的碱基刚好与待测SNP位点的碱基互补结合，即引物延伸到多态性位点，链延伸终止。通过飞行时间质谱检测引物及延伸产物两个峰，两者的m/Z差值，即为该引物延伸碱基的分子量，从而判断SNP位点的碱基类型【3】。

但基于引物延伸的质谱检测方法，在其应用过程中也存在一定的缺陷。

采用了两步PCR，首先通过PCR将感兴趣的区段进行扩增富集SNP位点的拷贝数，然后再进行单碱基延伸反应，为了避免PCR反应剩余的dNTPs和引物影响单碱基延伸的效率，在PCR反应结束后使用虾碱性磷酸酶（ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP）将PCR产物中的剩余引物和dNTP降解掉，这种方法的缺点是对样品要求高，纯化结果不好，会影响到后续的单碱基延伸反应。

质谱仪的检测效果与延伸物的分子量紧密相关，分子量越小，区分效果越好。而SequenomiPLEXassay没有对含SNP位点的寡核苷酸片段进行限制性酶切【2】或用磷酸二酯酶切割（GOODassay），片段较大，使得检测范围偏大（4000-9000Da），从而影响了MALDI–TOF分辨率。在延伸引物和产物在高分子量范围，信号强度也会降低，或许是解吸附效率不高或者检测元件对于高分子量的分子检测敏感度下降【4】。

在多重PCR反应中离子竞争和PCR效率的差异也会造成不一致的延伸信号。因此降低背景噪音和优化引物浓度使得因无信号不被延伸信号所遮盖，是非常感关键的。在多重PCR反应中，低分子量引物高信号强度会一定程度上导致高分子量产物弱信号【5】。

基于上述分析，需要开发一种操作简单、成本低、分辨率高的质谱检测方法进行SNP分型。

发明内容

本发明的技术解决方案：一种基于飞行时间质谱法快速进行SNP分型的方法。本发明的具体步骤是：（1）寡核苷酸连接反应，即等位基因特异的Oligonucletideligationassay（OLA）反应。针对SNP位点所在的靶序列设计3条寡核苷酸探针，第一条和第二条探针的3^/端为预先选定SNP位点的两个等位基因型，即等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specificoligos，ASO），第三条探针与所选定位点的靶序列下游互补，且位于选定SNP位点的下游，即位点特异性寡核苷酸探针（locus-specificoligo，LSO）。并将ASOs和LSOs探针进行相应的修饰。（2）当与目标序列完全匹配时，在TaqDNA连接酶的作用下，连接修饰后的等位基因特异寡核苷酸片段和位点特异性寡核苷酸片段。（3）采用通用PCR反应来扩增连接产物，其中Tags序列5^/端经过生物素修饰，这样PCR产物中有一条链是生物素标记的，便于后续纯化。（4）使用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，并使用链霉亲和素包被的beads进行纯化。（5）将纯化产物移至384孔芯片上，使用飞行时间质谱分析，检测酶切片段所携带不同Tags片段的分子量大小，并根据其不同分子量的差异来确定SNP的基因型。

本发明与以往技术相比，具有以下优点：（1）操作简单。仅需要1步PCR反应，经过酶切，纯化就可以通过飞行时间质谱进行SNP位点分型。（2）成本较低。省去了单碱基延伸步骤，限制性内切酶用量较低，从而降低了检测成本。（3）分辨率高。用于质谱检测的Tags片段大小可以达到10个bp（平均分子量可达3000Da），提高了质谱的检测分辨率。（4）快捷、通量高。本发明在一次实验可以对多个SNP位点设计探针，进行OLA反应，实现高通量的SNP检测。（5）对实验室要求不高。本发明所需的试剂都是常规分子生物学的要求，只需要飞行时间质谱仪就可实现SNP分型的检测。（6）本发明无需多重PCR反应，从而避免了多重PCR反应中离子竞争和PCR效率的差异造成延伸信号不一致的情况。

附图说明

图1本发明的实验流程图

图2本发明的检测原理图

图3实施例中四个SNP位点的探针序列及理论分子量

图4实施例中四个SNP位点的质谱图。图中垂直的虚线所在的位置分别为含特异Tags片段所对应的质谱峰图，按着从左到右的顺序，其对应的分子量大小分别为：5310.06Da，5349.07Da，5391.21Da，5425.04Da，5458.03Da，5472.21Da，5503.15Da，5566.87Da。

具体实施方式

参照本发明的实验流程图（附图1）和本发明的方法原理图（附图2），说明本发明具体实施方式。

制备寡核苷酸连接反应的探针池，这是该发明重要的一个环节。针对SNP位点所在的靶序列设计3条寡核苷酸探针（2条ASO+1条LSO），两条ASO探针的3^/端分别与预先选定SNP位点的两个等位基因型互补，LSO探针与所选定位点的靶序列下游互补，且位于选定SNP位点的下游，并将5^/端进行磷酸化修饰。ASO和LSO探针设计的主要过程包括：A.从1000Genomes网站得到感兴趣SNP位点的上下游侧翼序列；B.通过筛选人基因组SNP位点的上下游序列，去除在基因组中存在重复序列或者在靶SNP位点存在其它SNP位点以及存在一个或多个低复杂性序列的SNP位点，从而提高反应的特异性和成功率。C.通过探针池中的探针与探针之间的交叉反应，模板的模糊连接等分析去除对探针池有干扰的探针。D.对于每个SNP位点的两条ASO探针分别对应特定的Tags序列，Tags序列的5^/端进行生物素修饰，且上下游均有限制性内切酶的识别序列，在5^/端加入PCR扩增的通用序列。在LSO探针5^/端也加入通用序列，用于PCR扩增。根据一定比例，制备寡核苷酸连接反应的探针池。

选取一段寡核苷酸序列，根据不同SNP位点，使得每个ASO探针分别对应特异的Tags序列。

UniversalPCR引物的合成。该引物可以扩增出对同一个探针池的所有连接产物。Forwardprimer(5^/-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3^/)

Reverseprimer(5^/-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3^/)。

修饰过的ASO探针和LSO探针合成。ASO探针：5^/-通用序列+限制性内切酶识别序列+biotin修饰的特异Tags序列+限制性内切酶识别序列+位点特异性序列-3^/；LSO探针：5^/-（磷酸化修饰）位点特异性序列+通用序列-3^/。在下面具体的实施例中，对于n条SNP位点，设计了2n条ASO探针和n条LSO探针，并分别加入相应的通用引物序列以及Tags序列。实验中所用的限制性内切酶为DpnI，具体如下：

ASO1:5^/-GACGTTGTAAAACGATC+biotin修饰的Tag1+GATC等位基因特异序列-3^/

ASO2:5^/-GACGTTGTAAAACGATC+biotin修饰的Tag2+GATC等位基因特异序列-3^/

LSO:5^/-（磷酸化修饰）位点特异序列CCTGTGTGAAATTG-3^/。

连接产物的扩增。采用通用PCR引物扩增连接产物，其中Tag序列5^/端经过生物素修饰，这样PCR产物中有一条链是生物素标记的，便于后续纯化、识别。

使用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，并使用链霉亲和素包被的beads进行纯化。

将纯化产物移至384孔芯片上，使用飞行时间质谱分析，检测携带不同Tags片段的分子量大小，并根据其分子量的差异来确定SNP的基因型。

实施例一设计4个与2型糖尿病发生风险相关的探针

2型糖尿病（type2diabetes,T2D）是一种多基因遗传疾病，其临床诊断主要通过糖化血红蛋白、空腹血糖和糖耐量的相应指标来评估，但T2D发病早期上述指标变化不明显，导致大部分糖尿病患者不能被尽早的发现和诊断，从而影响误了早期干预和治疗，给患者带来了更大的痛苦和经济损失。如果根据发病的病因结合个性化分子检测相结合，可实现对T2D的早期诊断，结合国内外全基因组关联和候选基因方法已经报道的T2D单核苷酸多态位点和在中国人群中比较高的发生频率，选取了4个与T2D易感性高度相关的SNP位点，分别为：rs2237892，rs5015480，rs5219，rs10886471。然后，对这4个SNP从1000Genomes网站得到其上下游侧翼序列，并根据具体实施方式中提到的B、C、D内容进行筛选和修饰得到相应的探针序列，具体如附图3。然后分别将上述ASO和LSO探针配置成各自的混合物，并配成1μM的工作液。

实施例二寡核苷酸连接反应（OLA）和连接产物的富集

首先将样品基因组DNA进行片断化。用1×TE(10mMTris-HCLPH8.0，0.1mMEDTA)将样品基因组DNA浓度调整到100ng/μl，取出15μl，99°C6min，使得DNA片段分布在2-7kb之间。同时，配置OLA反应体系为0.3μlOLAbuffer（10×），0.3μlDTT（25mM），0.04μlTaqDNALigase(40U/μl)，0.03μlASOOligoMix，0.03μlLSOOligoMix，2.3μlddH₂O。并取3μl上述反应体系到已经加有片段化样品的离心管中，进行寡核苷酸连接反应。反应条件为：95°C变性5min，（95°C30s和50°C25min）3个循环，4°C保存。接着，使用通用PCR引物Forward-(5^/-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3^/)，Reverse(5^/-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3^/)，对上述连接产物进行扩增，PCR反应体系为：Amplificationbuffer（10×）1.5μl，eachdNTP(25mM)0.03μl，TaqDNApolymerase0.30μl，Forwardprimer（100μM）0.15μl，Reverseprimer（100μM）0.15μl，ddH₂O9.87μl。反应条件为：94°C变性4min，（94°C25s，58°C35sand72°C35s）35个循环，4°C保存。

实施例三酶切反应及酶切产物的纯化

根据不同的限制性内切酶，其反应体系和反应条件会有不同。在本实施例中，将DpnI限制性内切酶及相应的buffer加入到上述PCR产物中进行酶切，酶切体系为：PCR产物15μl，Buffer（10×）2μl，DpnI1μl，ddH₂O4μl。在37°C酶切4h后，PCR产物将会被切割成多个酶切片段，其中携带Tags的片段具有生物素标记，因此可使用链霉亲和素包被的beads进行纯化，保留被生物素修饰的Tags序列。取等体积的酶切产物加入重悬的链霉亲和素磁珠，摇匀后，室温轻摇30min，将离心管放入磁力架上，吸附约30s，弃去上清液。将离心管从磁力架上取下，加入1ml的清洗液，摇匀后，再次放到磁力架，弃上清，重复2次。取下离心管，加入等体积的洗脱液，摇匀后，37°C10min，放入磁力架，将上清转入新的离心管，即为纯化后携带Tags的片段。

实施例四飞行时间质谱检测SNP位点分型结果

在384孔板芯片上首先加入0.5μl基质，待基质结晶后，再点上1μl的上述纯化后带有Tags片段的样品上清液，让其在自然状态下结晶。基质组成为：200mol2,4,6-三羟苯乙酮（Trihydroxyacetophenone，THAP)。然后进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析，得到酶切后片段所携带不同Tags的质谱图（附图4），并对应到探针设计时的理论分子量，从而判断得到相应位点的SNP分型结果。实施例中四个SNP位点的分型结果如下：rs2237892位点经质谱分析后有两个明显的质谱峰，其所在的分子量大小为5310.06和5349.07，与理论分子量5308.42和5348.45相差不到1.65Da（属于可接受的误差范围），该位点的分型结果为CC（见附图4）；rs5015480位点经质谱分析后有两个明显的质谱峰，其所在的分子量大小为5391.21和5425.04，与理论分子量5391.49和5425.51不到0.6Da（属于可接受的误差范围），该位点的分型结果为CC（见附图4）；rs5219位点经质谱分析后有两个明显质谱峰，其所在的分子量大小为5458.03和5472.21，与理论分子量5458.51和5471.51不到0.7Da（属于可接受的误差范围），该位点的分型结果为CT（见附图4）；rs10886471位点经质谱分析后有两个质谱峰，其所在的分子量大小为5503.15和5566.87，与理论分子量5505.53和5565.54不到1.4Da（属于可接受的误差范围），该位点的分型结果为CT（见附图4）。

参考文献

【1】HeyiYang,etal.Multiplexsingle-nucleotidepolymorphismgenotypingbymatrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry.AnalyticalBiochemistry.2003(314)54–62.

【2】DorisLechner,etal.Large-scalegenotypingbymassspectrometry:experience,advancesandobstacles.CurrentOpinioninChemicalBiology.2001,6:31–38.

【3】LiJ,etal.Singlenucleotidepolymorphismdeterminationusingprimerextensionandtimeflightmassspectrometry.Electrophoresis.1999,20:1258-1265.

【4】SobinKim,etal.SNPGenotyping:TechnologiesandBiomedicalApplications.Annu.Rev.Biomed.Eng.2007,9:289–320.

【5】MollyS.Bray,etal.High-ThroughputMultiplexSNPGenotypingWithMALDI-TOFMassSpectrometry:Practice,ProblemsandPromise.HumanMutation.2001,17:296-304.

Claims (7)

1.基于飞行时间质谱法联合特异Tags序列进行SNP分型的方法包括以下几个步骤：（1）针对SNP位点，设计3条寡核苷酸探针，第一条和第二条探针的3^/端分别是预先选定SNP位点的两个等位基因型，即等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specificoligos，ASO），第三条探针与所选定位点的靶序列下游互补，且位于选定SNP位点的下游，即位点特异性寡核苷酸探针（locus-specificoligo，LSO）；（2）对三条寡核苷酸探针进行相应的修饰，然后将经过修饰的多个SNP位点的探针混合，形成探针池；（3）当与目标序列完全匹配时，在TaqDNA连接酶的作用下，经过修饰的等位基因特异性寡核苷酸片段和位点特异性寡核苷酸探针进行连接，得到连接产物；（5）采用通用PCR引物扩增连接产物，其中Tags序列5^/端需要进行生物素修饰，这样PCR产物中有一条链是生物素标记的，便于后续纯化；（6）使用限制性内切酶将PCR产物进行酶切，并使用链霉亲和素包被的beads进行纯化；（7）将纯化产物移至384孔芯片上，使用飞行时间质谱分析，检测携带特异Tags片段分子量的大小，并根据其分子量的差异来确定样品中该SNP位点的基因型。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于SNP位点的2n条探针ASO探针和n条LSO探针的修饰：ASO探针的上游引入相应的限制性酶切识别序列和特异Tags序列及通用序列；LSO探针的5^/端进行磷酸化修饰，并引入相应的通用序列。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于限制性内切酶为稀有位点限制性内切酶，且为回文结构，如DpnI、AluI。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于特异Tags序列以及对其5^/端进行生物素修饰。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于在进行质谱检测之前，需要对酶切产物使用链霉亲和素包被的beads进性纯化，一方面减少对质谱检测结果的干扰，另一方面将带有生物素修饰的特异Tags片段纯化出来，以便进行后续质谱检测。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于纯化方法为链酶亲和素包被的beads纯化。

7.权利要求1所述的方法，其特征在于通过飞行时间质谱仪检测携带特异Tags片段的分子量大小。