KR20230042355A - 마이크로 구조체 및 분자 검출 방법 - Google Patents

마이크로 구조체 및 분자 검출 방법 Download PDF

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다이 가토
치카시 나카무라
구만복
조철민
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고쿠리츠켄큐카이하츠호진 상교기쥬츠 소고켄큐쇼
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Abstract

세포 집단을 구성하는 개별 세포에서 발현 또는 분비되는 마커 분자를 선택적으로 검출하는 메커니즘을 구비한 마이크로 구조체, 상기 마이크로 구조체의 제조방법, 및 이를 이용하여 검출 대상 분자를 검출하고 식별하는 구체적인 솔루션을 제공하기 위해, 본 발명은 생체분자를 검출하는 프로브가 고정되는 물질 표면이 내면에 배치되고 소정의 두께와 크기를 갖는 박막으로 형성된 반구형 쉘 형태의 마이크로 구조체를 제조하는 방법, 및 이러한 박막을 이용하여 생체분자를 검출하는 방법을 제공한다.

Description

마이크로 구조체 및 분자 검출 방법
본 발명은 내면과 외면에 서로 다른 물질을 갖는 2 이상의 박막이 적층된 재료로 이루어진 반구형 쉘(hemispherical shell) 또는 반타원형 쉘(semi-elliptical shell) 구조의 마이크로 구조체 및 이를 이용한 물질 검출 방법에 관한 것이다.
마이크로 입자 등과 같은 마이크로 구조체는 신규 물성을 갖는 재료를 개발하기 위한 소재로서, 생명과학 분야에서는 표적 단백질이나 DNA를 시각화하는 표지로서 널리 이용되고 있다. 일반적으로 제작이 용이한 구형 마이크로 입자가 널리 사용되고 있으나, 타원형이나 다각형 등과 같이 복잡한 형상으로 형성된 마이크로 입자도 광학적 이방성 특성을 가지므로 응용분야가 넓고, 이에 대한 제조방법도 활발히 개발되고 있다. 　
일본 공개특허공보 제2011-101941호(“중공 마이크로 입자 및 그 제조방법")(특허문헌 1)에는 그릇 형상의 반구형 쉘 마이크로 입자의 제조방법이 개시되어 있으며, 일본 공개특허공보 제2011-101941호(“자기 나노입자") (특허문헌 2)에는 반구형 쉘 형태의 마이크로 입자를 제조하고 이를 세포 정제 기술에 적용하는 방법이 개시되어 있다.
일본 공개특허공보 제2011-101941호(특허문헌 1)는 평평한 기판 상에 배열된 폴리스티렌(polystyrene) 입자 위에 진공 증착 또는 스퍼터링 방식으로 금속 박막을 형성한 다음에, 화학 처리나 가열 등을 통해 폴리스티렌 입자를 제거하여 반구형 쉘 형태의 마이크로 입자를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 이렇게 제작된 마이크로 입자를 생명과학 분야에서 구체적으로 응용하는 예, 특히 의료용 진단에서 중요한 단백질이나 DNA 등의 생체분자를 검출하는 방식에 대해서는 아무런 개시가 없다.
WO2013/069732(특허문헌 2)는 상기 일본 특허공개공보 제2011-101941호(특허 문헌 1)의 방법을 응용하는 것으로서, 니켈이나 철 등의 자성체를 이용하여 세포와 동일한 크기(직경 약 10㎛)를 가지는 반구형 쉘 형상의 마이크로 입자를 제조하고, 마이크로 입자의 오목한 내부에 크기에 따라 선택적으로 세포를 포획하여 정제 회수하는 방법을 개시하고 있다. 반구형 쉘 입자를 제조하기 위해서, 자성 박막들 사이에 절연층을 배치하여 초상자성 입자를 제조하는 방법도 개시하고 있다. 그러나 세포 회수 이외에, 회수된 세포의 표면에 발현된 생체분자를 검출함으로써 세포의 유형이나 특성을 식별하는 방법을 제시하지는 않는다.
생체분자 중 세포에서 분비되는 분비물은 최근 "메시지 물질"로 주목받고 있으며, 분비물의 종류와 양은 그 세포의 "개별 특성"을 반영하는 중요한 지표가 된다. 세포는 분비물을 통해 주변 세포와 상호작용하여 자신에게 가장 적합한 환경을 구축하거나 주변 환경에 적응한다. 예를 들어, 종양 조직에서 암세포는 분비물을 통해 주변의 정상세포에 영향을 미침으로써 자신의 증식에 유리한 미세환경을 구축하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세포 집단 내 개별 세포에서 분비되는 물질을 세포 단위로 정확하게 측정하는 것은 질병의 기전 규명과 신규 치료 표적 발굴에 있어 중요하다.
단일 세포에서 분비물을 측정하기 위한 몇 가지 기술이 있는데, Jun Arita, "Analysis of the Secretion from Single Anterior Pituitary Cells by Cell Immunoblot Assay", Endocrine Journal, Vol. 40, 1, 1-15 (1993) (비특허문헌 1)에서는 분비물을 포획하는 고정 항체 시트에 세포를 배양하고, 세포로부터 방출되어 항체에 포획된 분비물을 나중에 염색하여 가시화한다. 특허 공개공보 제2014-233208호(“종합 세포 분비액 분석 장치 및 방법”)(특허문헌 3)에서는 수십 미크론의 매우 작은 챔버 내에 각각의 세포를 포획하고, 각 세포로부터 방출되어 챔버 내에 축적되고 농축된 분비물을 검출함으로써 세포 각각의 분비량을 측정한다. 그러나 두 방법 모두 인접한 세포가 서로 분리되어 완전히 고립된 개별 세포의 분비물을 측정하는 방법만을 개시하고 있으며, 네트워크를 구축하고 상호작용하는 세포 집단에서 개별 세포의 분비물을 측정하는 수단을 개시하지는 않는다.
한편, 특정 생체분자를 검출하기 위해서는, 생체분자가 존재하지 않을 때에는 아무런 반응을 일으키지 않고, 생체분자가 존재할 때에만 신호(예를 들어, 형광)을 발생시키는 프로브 스위치를 사용하는 것이 유용하다. 이를 위해, 앱타머 분자(aptamer molecules)가 자주 사용되고 있다. Ueno et al., "Molecular design for enhanced sensitivity of a FRET aptasensor built on the graphene oxide surface", Chem. Commun., 49, 10346-10348, (2013)(비특허문헌 2)에는 형광염료로 변형된(modified) 앱타머 프로브 및 그래핀 멤브레인을 이용한 생체분자 검출법이 개시되어 있다. 평평한 그래핀 표면에 형광 앱타머를 고정시키면 앱타머가 그래핀 표면에 흡착되므로 형광염료와 그래핀 표면 사이의 거리가 가까워져, 형광염료와 그래핀 사이의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)로 인해 형광 소광(fluorescence quenching)이 발생한다. 즉, 표적 생체분자의 존재를 형광 발생으로 검출하는 센싱 기술이 개시되어 있다. 그러나 그래핀은 원자 레벨에서 초평탄(ultra-flat)이기 때문에, 곡면 상에 연속적인 대면적의 박막을 형성하기 어렵다. 또한, 비특허문헌 2에는 센싱 기술을 미세유체 장치에 탑재하여 용액 내 생체분자를 검출하는 방법을 기재하고 있으나, 개별 세포에서 발현되는 생체분자나 개별 세포에서 방출된 분비물을 검출하는 방법에 대해서는 아무런 언급이 없다.
일본 특허공개공보 제2011-101941호 WO2013/069732　　 일본 특허공개공보 제2014-233208호
따라서, 세포 집단을 구성하는 개별 세포에서 발현 또는 분비되는 마커 분자를 선택적으로 검출하는 메커니즘을 구비한 마이크로 구조체, 상기 마이크로 구조체의 제조방법, 및 이를 이용하여 검출 대상 분자를 검출하고 식별하는 구체적인 솔루션을 제공하고자 한다
본 발명은 내면에 생체분자를 검출하는 프로브를 고정할 수 있는 소재 표면이 배치되고, 소정의 두께 및 직경의 박막으로 형성된 반구형 쉘 형태의 마이크로 구조체 제조방법, 및 이를 이용한 표적 생체분자 검출방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 외면이 자성체로 구성되고 외부 자기장의 인가에 의해 배향(orientation)이 제어되는 마이크로 구조체 제조방법 및 제어방법, 분자 고정 및 형광 FRET 발생이 가능한 SP2 혼성 오비탈(hybrid orbital)을 갖는 박막 구조체 또는 금속 박막 구조체로 내면이 형성된 마이크로 구조체 제조방법, 및 상기 마이크로 구조체에 생체분자 또는 세포를 포획한 후 내면에 고정된 분자 구조의 변화에 의해 형광을 발생시키는, 단백질, 펩티드, 또는 핵산 분자와 표적 생체분자의 선택적 반응을 통해 표적분자를 형광 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로 본 발명은 제[1] 내지 [21]항을 포함한다.
[1] 자성 물질을 포함하는 제1 물질로 구성되고, 실질적으로 마이크로 반구형 쉘 형상으로 형성된 제1 박막층, 및
상기 마이크로 반구형 쉘 형상의 내면에 배치되고, 제2 물질로 구성되되, 상기 제2 물질은 형광색소 표지 프로브를 제거 가능하게 고정하고, 상기 형광색소와의 사이에 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 발생시키는 제2 박막층을 포함하고,
상기 제2 박막층에 의해 형성되는 중공 공간은 적어도 하나의 표적세포 또는 상기 표적세포의 일부를 상기 중공 공간에 포획할 수 있는 크기를 가지며,
상기 프로브는 표적분자에 특이적으로 결합하는 분자이고, 상기 표적분자에 대한 상기 결합이 상기 프로브의 구조를 변화시켜, 상기 형광색소의 방출/소광의 변화를 야기하는 표적분자 검출용 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[2] 제[1]항에 있어서, 상기 제1 물질은 니켈, 철, 코발트, 가돌리늄, 루테늄, 산화철, 산화크롬, 페라이트 및 네오디뮴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자성 물질인 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[3] 제[1] 또는 [2]항에 있어서, 상기 제2 물질은 SP2 혼성 오비탈을 갖는 원소(element), SP2 결합영역과 SP3 결합영역이 혼재된 원소 또는 금속을 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[4] 제[3]항에 있어서, 상기 제2 물질은 나노카본, 나노그래핀 또는 금을 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[5] 제[4]항에 있어서, 상기 제2 박막층은 표면에 아미노기를 구비하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[6] 제[1] 내지 [5]항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 단백질, 펩티드 또는 핵산 분자인 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[7] 제[6]항에 있어서, 상기 프로브는 일단이 형광색소로 변형되고(modified), 타단이 피렌(pyrene) 분자 또는 티올기(thiol group)로 변형된 핵산 분자인 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[8] 제[1]항 내지 [7]항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적분자는 단백질, 펩티드, 핵산, 세포 표면 분자(cell surface molecule) 또는 세포 분비 소포(cell secretory vesicle)를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[9] 제[1] 내지 [8]항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 박막층은 막 두께가 0.1nm 내지 1mm의 범위인 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
[10] 제[1] 내지 [9]항 중 어느 한 항에 따른 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 어레이.
[11] 제[1] 내지 [10]항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 박막층의 표면에 제거 가능하게 고정된 상기 프로브를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이.
[12] 제[11]항에 있어서, 상기 프로브는 스페이서 분자를 통해 제2 박막층의 표면에 제거 가능하게 고정되고, 또는 상기 형광색소가 상기 스페이서 분자를 통해 상기 프로브에 결합되는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이.
[13] a) 소정의 크기를 가지고, 기판 상에 단층으로 배열되며, 소정의 제거 공정을 통해 제거 가능한 물질로 구성된 주형 마이크로 입자를 준비하는 단계,
b) 기판 상에 배열된 상기 주형 마이크로 입자에 단일층으로 제2 물질을 코팅하는 단계,
c) 상기 제2 물질이 코팅된 상기 주형 마이크로 입자에 제1 물질을 추가 코팅하는 단계, 및
d) 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체가 형성되도록, 상기 소정의 제거 공정으로 상기 주형 마이크로 입자를 제거하는 단계를 포함하는 제[1] 내지 [12]항 중 어느 한 항에 따른 표적분자 검출용 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이 제조방법.
[14] 제[13]항에 있어서, 상기 b) 단계와 상기 c) 단계 사이에 추가 물질을 코팅하는 단계를 적어도 하나 이상 더 포함하는 방법.
[15] 제[13] 또는 [14]항에 있어서, 상기 d) 단계 이후에 상기 기판의 표면에서 접착제의 표면으로 상기 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체를 전사하고, 또는 프로브를 제2 박막층에 제거 가능하게 고정하는 단계를 더 포함하는 방법.
[16] 제[14]항에 있어서, 상기 추가 물질은 상기 제1 물질 또는 상기 제2 물질과 상이한 원소 또는 원소 합금을 포함하는 물질을 포함하는 방법.
[17] 제[15]항에 있어서, 상기 접착제는 가용성 접착제(soluble adhesive)인 방법.
[18] 제[17]항에 있어서, 상기 가용성 접착제는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)으로, 상기 접착제를 용매에 용해시키는 단계를 포함하는 방법.
[19] a) 표적분자를 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 용액 내에 제2 박막층에 제거 가능하게 고정된 프로브를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이를 배치하는 단계 및
b) 상기 프로브의 형광색소의 형광 발광을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 형광 발광을 검출함으로써 상기 표적분자와 상기 프로브 사이의 결합이 추정되며, 상기 용액 내의 상기 표적분자의 존재가 결정되는 제[11] 또는 [12]항에 따른 적어도 하나의 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이 또는 제[15], [17] 또는 [18]항에 따른 제조방법에 의해 제조된 적어도 하나의 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이를 이용하는 표적분자 검출방법.
[20] 제[19]항에 있어서, 상기 a) 단계에서 외부 자기장을 인가하여 상기 용액에 분산된 상기 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체의 배향(orientation)을 제어하는 단계를 포함하는 방법.
[21] 제[19] 또는 [20]항에 있어서, 상기 표적분자는 세포의 분비물이고, 상기 a) 단계와 상기 b) 단계 사이에 상기 반구형 쉘 형태의 다층 마이크로 구조체의 중공 공간에 상기 세포 또는 상기 세포의 일부를 포획하는 단계를 포함하는 방법.
종전에는 세포의 네트워크에서 개별적으로 단일 세포의 분비물을 측정할 수 있는 기술이 없었다. 본 발명에 따르면, 세포 집단을 구성하는 개별 세포에서 분비되는 물질의 종류 및 양을 확인할 수 있다. 예를 들어, 질병이 의심이 있는 경우에 시행하는 생검에서, 조직의 일부를 채취하여 개별 세포의 특성을 검사하는데, 본 발명은 분비물을 지표로 하여 질병 세포 등을 확인하는 간단한 검사 방법이 될 수 있다. 즉, 분비물로 암세포와 다른 세포를 구별하는 기술 개발로 이어질 것으로 기대된다. 또한, 본 발명은 질병 검사에 한정되지 않고, 환경 내 특정 물질이나 미생물 검출에도 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 2층 구조의 마이크로 구조체를 도시한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 측면에 따른 마이크로 구조체의 제조방법을 도시한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 측면에 따른 내면이 나노카본 막인 마이크로 구조체의 내면에 고정된 형광 앱타머(aptamer)를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법을 도시한 모식도이다. 도 3-1은 형광색소가 부착된 DNA 앱타머를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법의 일례를 나타낸다. 도 3-2는 형광색소와 피렌기(pyrene group)가 부착된 DNA 앱타머를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법의 일례를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 측면에 따른 마이크로 구조체의 내면에 고정되는 형광색소가 부착된 DNA 앱타머 또는 형광색소와 피렌기가 부착된 DNA 앱타머를 이용하여 검출한 표적분자 베스핀(vaspin)의 대표적인 형광 현미경 이미지 및 그 이미지 기반의 형광 강도 변화를 비교한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예로서 마이크로 구조체의 내면에 고정된 형광 앱타머를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법의 다른 예를 도시한 모식도이다. 도 5-1은 내면이 금(Au)인 마이크로 구조체의 내면에 고정된 형광 앱타머를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법의 일례를 나타낸다. 도 5-2는 내면에 나노그래핀(nanographene)이 고정된 마이크로 구조체에 형광 앱타머를 흡착시켜 표적분자를 검출하는 방법의 일례를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 측면에 따른 내면에 형광 앱타머가 고정된 마이크로 구조체를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법을 도시한 모식도이다. 도 6-1은 기판 상에 어레이 형태로 정렬된 마이크로 구조체를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법의 일례를 나타낸다. 도 6-2는 미세 캔틸레버(microscopic cantilever)의 말단에 부착된 마이크로 구조체를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법의 일례를 나타낸다. 도 6-3은 용액에 분산된 자성 마이크로 구조체를 세포에 부착시켜 표적분자를 검출하는 방법의 일례를 나타낸다.
1. 표적분자 검출용 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체
일 측면에서, 본 발명은 표적분자의 검출에 사용되는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체(이하, 간단히 "마이크로 구조체"라고 함)를 제공한다. 본 발명의 마이크로 구조체는 자성 물질을 포함하는 제1 물질을 포함하고, 실질적으로 마이크로 반구형 쉘 형상으로 형성된 제1 박막층 및 상기 마이크로 반구형 쉘 형상의 내면에 배치되고, 형광염료로 표지된 프로브를 제거 가능하게 고정하며, 상기 형광색소와의 사이에 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 발생시키는 제2 물질을 포함하는 제2 박막층을 포함한다.
전형적으로, 본 발명에 따른 마이크로 구조체는 적어도 하나의 대상 세포 또는 그 일부를 포획할 수 있는 크기의 중공 공간을 구비하며, 제2 박막층에 배치되는 상기 프로브는 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 표적분자와의 결합에 의해 구조가 변화되어 형광염료의 방출/소광 변화를 일으킬 수 있는 분자이다.
도 1은 본 발명에 따른 마이크로 구조체(6)의 일례를 도시한다. 본 실시예에서는 자성 금속 박막을 제1 박막층(1)으로, 나노카본(nanocarbon) 박막을 제2 박막층(2)으로 포함하는 2층 구조의 반구형 쉘 형태의 마이크로 구조체(6)를 도시하고 있으나, 그 층수(number of layers)가 2층에 한정되지는 것은 아니고, 상이한 원소(element) 또는 원소 합금(elemental alloy)의 박막층이 중간층으로서 다중층 사이에 삽입될 수도 있다. 형광 ON/OFF 스위치에 의해 표적분자를 검출하는 경우에, 내면(제2 박막층)은 분자를 고정하고 또한 형광 FRET을 발생시킬 수 있는 SP2 혼성 오비탈을 갖는 원소(element), SP2 결합영역과 SP3 결합영역이 혼재된 원소 또는 금속(즉, 제2 물질)을 포함하는 박막 구조체일 수 있으나, 다른 경우 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
제1 박막층에 포함되는 제1 물질은 니켈, 철, 코발트, 가돌리늄 또는 루테늄과 같은 금속, 또는 금속 산화물(예를 들어, 산화철, 산화크롬 등), 페라이트 또는 네오디뮴과 같은 합금을 포함하는 자성 물질(예를 들어, 강자성체, 초상자성체)일 수 있다. 다만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 제2 물질의 예로는 나노카본, 나노그래핀 및 금(gold)을 포함한다. 제2 물질로서 금을 이용하는 경우, 후술하는 실시예와 같이, 제2 박막층을 형성하는 금에 아미노기를 첨가하여 제2 박막층의 표면이 양전하를 띠도록 할 수 있고, 이에 의해 일례로 음전하를 띤 DNA 앱타머와 제2 박막층 표면 사이의 결합을 촉진시킬 수 있다.
본 발명과 관련하여 "자성 물질(magnetic material)"을 언급하는 경우, "자성 물질"이라는 용어는 당업계에서 통용되는 의미로 사용한다. 본 발명의 목적을 위해, 본 발명에서 사용되는 "자성 물질"은 외부 자기장이 인가될 때에 그 자기장에 의해 마이크로 구조체의 배향이 제어될 수 있을 정도의 자성을 가지는 것이 바람직하다. 　
박막의 막 두께는 마이크로 구조체(6)의 구조가 유지될 수 있는 범위에서 자유롭게 선택 가능하고, 층당 막 두께는 약 0.1nm 내지 1mm, 보다 바람직하게는 약 1nm 내지 10㎛, 가장 바람직하게는 약 1nm 내지 1㎛이지만, 이 범위에 한정되지 않고 목적에 따라 적절히 결정할 수 있다. 또한, 마이크로 구조체의 형상은 마이크로 구조체 제작 시 주형(mold)의 형상에 따라 달라지고, 반구형, 원통형, 원뿔형, 타원형, 각진형 등일 수 있으나, 이 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 반구형 쉘 형태의 마이크로 구조체(6)를 제조하는데 사용되는 주형 마이크로 입자 자체는 반드시 반구형일 필요는 없고, 구 형상일 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 “실질적인 반구형(substantially hemispherical)”, “실질적인 반구형 쉘 형태(substantially hemispherical shell-shaped)”, 또는 “실질적인 구형(substantially spherical)” 쉘이라는 용어는 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 예시하는 형상 또는 그의 쉘 형상을 모두 포함하며, 실제 제조 환경에서 허용되는 정도의 형상 왜곡이 있는 경우도 포함한다. 마이크로 구조체의 크기(직경)도 제작 시 주형의 형상에 따라 달라질 수 있고, 약 1nm 내지 약 1cm, 바람직하게는 약 1nm 내지 약 500μm, 보다 바람직하게는 약 5nm 내지 약 100㎛, 가장 바람직하게는 약 10nm 내지 약 50㎛이다. 본 발명의 마이크로 구조체의 반구형 쉘 형태의 구조체의 중공부(오목면측 공동부)의 크기(직경)도 주형의 형상에 따라 자유자재로 형성할 수 있으며, 약 1nm 내지 약 1cm, 바람직하게는 약 1nm 내지 약 500μm, 보다 바람직하게는 약 5nm 내지 약 100μm, 가장 바람직하게는 약 10nm 내지 약 50μm이다. 이러한 공동의 크기는 적어도 단일 세포 또는 그 일부를 수용할 수 있는 크기(직경)일 수 있다.
본 발명과 관련하여, "대상 세포(cells of interest)"는 일반적으로 인간을 포함하는 포유동물(예를 들어, 인간, 소, 돼지, 염소, 양, 원숭이, 개, 고양이, 생쥐, 쥐 등)로부터 취득한 세포이지만, 이에 한정되지 않고 조류, 파충류, 양서류, 곤충, 미생물, 식물 등의 세포도 포함할 수 있다. 　
2. 표적분자 검출용 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 제조방법
본 발명은 또한 다른 측면에서 본 발명에 따른 마이크로 구조체의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 제조방법은,
(a) 기판 상에 단일층으로 배치된 원하는 크기의 주형 입자를 준비하는 단계,
(b) 상기 기판 상에 배치된 주형 입자에 단일층으로 제2 물질을 코팅하는 단계;
(c) 상기 제2 물질이 코팅된 주형 입자에 제1 물질을 추가 코팅하는 단계, 및
(d) 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체가 형성되도록, 소정의 제거 공정으로 상기 주형 입자를 제거하는 단계를 포함한다.
예시적으로 상기 주형 입자는 소정의 제거 공정에 의해 제거될 수 있는 물질을 포함한다. 선택적으로, 상기 b) 단계와 상기 c) 단계 사이에 다른 물질을 코팅하는 적어도 하나의 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 d) 단계 이후에 접착제를 이용하여 상기 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체를 상기 기판의 표면에서 상기 접착제의 표면으로 전사하는 단계, 및/또는 프로브를 제2 박막층에 제거 가능하게 고정하는 단계를 포함할 수 있다.
제1 물질, 제2 물질, 및 프로브에 대한 예시적인 요건은 마이크로 구조체에 관한 상기 섹션 1에 기재된 바와 같다.
도 2는 본 발명에 따른 마이크로 구조체(6)의 제조방법에 관한 일례를 도시한다. 먼저, 평평한 기판(3) 상에 주형 역할을 하는 마이크로 입자(4)를 단일층으로 배치한다. 평평한 기판(3)의 소재로는 유리, 실리콘, 플라스틱 등일 수 있으나, 주형 입자(4)의 크기보다 표면 평탄도(surface flatness)가 작기만 하면, 이에 한정되지 않고, 목적에 따라 어떠한 기판을 사용하여도 무방하다. 주형 입자(4)는 폴리스티렌 입자, 셀룰로오스, 유리 입자 등일 수 있으나, 마이크로 구조체와 크기 및 형상이 동일하기만 하면 이에 한정되지 않는다. 또한, 주형 입자(4)의 크기는 제조하고자 하는 마이크로 구조체의 크기에 따라서, 약 1nm 내지 약 1cm, 전형적으로는 약 1nm 내지 약 500㎛, 보다 전형적으로는 약 5nm 내지 약 100㎛, 가장 전형적으로는 약 10nm 내지 약 50μm일 수 있다. 주형 입자(4)가 적재된 평평한 기판은 마이크로 구조체(6) 내측에 박막 물질을 형성할 수 있는 박막 형성 장치(5)의 시료 챔버(sample chamber) 내에 배치된다.
박막 형성 장치(5)는 스퍼터링 장치(sputtering apparatus), 저항 가열 진공 증착 장치(resistance heating vacuum evaporator), 화학 기상 증착 장치(chemical vapor deposition apparatus) 등일 수 있으나, 주형 입자 크기보다 크지 않은 약 0.1nm 내지 1mm의 박 두께를 갖는 박막을 형성할 수 있는 장치이기만 하면 이에 한정되지 않는다.
나노카본 박막의 경우, SP2 및 SP3 결합영역이 혼재된 카본 박막을 형성할 수 있는 불균형 마그네트론 스퍼터링 시스템(unbalanced magnetron sputtering system) 등이 사용된다. SP2 및 SP3 결합영역 사이의 비율은 스퍼터링 조건에 따라 자유롭게 조정할 수 있다.
시료실(sample room)에 설치된 시료에 대하여, 박막 형성 장치(5)의 사용 순서에 따라 임의 두께의 내부 물질용 박막을 제조함으로써 평평한 기판(3) 상의 주형 입자(4)의 상부에 내부 물질 박막을 형성한다. 다음으로, 마이크로 구조체 외측에 자성 금속 박막을 형성할 수 있는 박막 형성 장치(5)의 시료 챔버에 상기 시료를 넣고, 내부 박막과 동일한 방식으로 박막을 형성한다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 주형 입자(4) 위에 2층 구조의 박막이 형성된다. 박막의 층수를 3층 이상으로 늘리고자 하는 경우에는 상기 과정을 반복한다. 상기 과정에 따라 주형 입자(4)의 상부에 다층 구조의 박막을 형성한 후, 주형 입자(4)를 제거함으로써, 도 1과 같은 마이크로 구조체(6)를 얻을 수 있다.
주형 입자(4) 제거 방법은 고온 가열, 유기용매 처리, 활성산소 처리 방법 등을 포함할 수 있다. 일례로, 주형 폴리스티렌 입자를 500℃에서, 1시간 동안 가열하여 주형 폴리스티렌 입자를 제거할 수 있으나, 주형 입자(4)는 제거되되 박막층은 제거되지 않는 방법이기만 하면 이에 한정되지 않는다. 자성 마이크로 구조체를 제작하는 경우에는 자기 모멘트(magnetic moment)를 유지하기 위해 농도가 15% 이하의 산소 분위기 하에서 주형 입자를 제거할 수 있다.
3. 본 발명의 마이크로 구조체를 이용한 표적분자의 검출방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 마이크로 구조체 또는 그 어레이, 또는 본 발명에 따른 마이크로 구조체 제조방법에 의해 제조된 적어도 하나의 마이크로 구조체 또는 그 어레이를 이용하여 표적분자를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 표적분자 검출방법은, 전형적으로
(a) 표적분자를 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 용액 내에 제2 박막층에 제거 가능하게 고정된 프로브를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이를 배치하는 단계, 및
(b) 상기 프로브의 형광색소의 형광 발광을 측정하는 단계를 포함한다.
전형적으로 상기 형광 방출을 검출함으로써, 표적분자와 프로브의 결합을 추정하고 용액 내 표적분자의 존재를 확인한다. 　
제2 박막층 및 프로브에 대한 예시적인 요구 사항은 상기 섹션 1의 본 발명에 따른 마이크로 구조체의 설명에 기재된 바와 같다. 또한, "어레이"라는 용어는 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 의미로 사용되며, 본 발명과 관련하여 "마이크로 구조체 어레이"라는 용어의 경우에는 2개 이상의 마이크로 구조체가 1차원 또는 2차원으로 배열된 마이크로 구조체의 집단을 의미한다(예를 들어, 도 2, 4, 6-1, 6-3 등 참조).
도 3은 프로브인 단백질, 펩티드 또는 핵산 분자와 표적분자 사이의 선택적 반응에 의해 표적분자를 검출하는 방법의 일례를 나타낸다. 여기서, 비한정적인 예로서, 형광염료로 변형된(modified) DNA 앱타머를 프로브로, 나노카본 막을 제2 박막층으로 사용한다. 본 명세서에서 사용되는 "앱타머"라는 용어는 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미로서, 특정 분자에 결합할 수 있는 펩티드 또는 핵산 분자를 총칭한다.
도 3-1은 일단에 형광염료 분자(7)가 변형된 DNA 앱타머(8)와 내면 박막(제2 박막층)(2)이 나노카본 박막인 마이크로 구조체(6)를 사용하는 비제한적인 예를 나타낸다. DNA 앱타머(8)의 길이는 목적에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 전형적으로 약 80 내지 100개의 뉴클레오티드이지만 이 범위에 한정되지 않고, 하한값의 비제한적인 예로서 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80개의 뉴클레오티드, 상한값의 비제한적인 예로서 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 뉴클레오티드 또는 이 이상일 수 있고, 최적 범위는 이들 하한값과 상한값의 조합으로부터 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다.
도 3-1에 도시된 본 발명의 비제한적인 예에서, 앱타머(8)를 마이크로 구조체(6)에 혼합하면, 앱타머(8)의 DNA 주 가닥(main strand)이 나노카본 박막(2)의 표면에 대해 친화력을 가지므로 앱타머(8)가 나노카본 박막(2) 표면에 흡착되고, 그 결과 형광염료(7)가 나노카본 박막(2)의 표면에 접근함에 따라 형광 공명 에너지 전이(FRET)가 발생하여, 형광염료(7)로부터 형광이 나타나지 않게 된다. 표적분자(9)가 앱타머(8)에 결합할 때에는, 표적분자(9)와 앱타머 DNA 주 가닥 사이의 결합이 나노카본 박막(2)에서 앱타머(8)를 해리시키고, 형광염료 분자(7)도 나노 카본 박막(2)의 표면에서 해리되어, FRET가 해소되고 형광이 발생한다. 즉, 표적분자(9)가 존재하는 전극 마이크로 구조체(6)의 내부에서 생성되는 형광에 의해 표적분자(9)의 존재를 검출할 수 있다.
도 3-2는 일단이 고리형 구조를 가지는 피렌(pyrene) 분자(10)로 변형되고 타단이 형광염료 분자(7)로 변형된 DNA 앱타머(8) 및 내면 박막(2)이 나노카본 박막인 마이크로 구조체(6)를 사용한 비제한적인 예를 나타낸다. 상기 앱타머(8)와 상기 마이크로 구조체(6)를 혼합하면, 나노카본 박막(2)의 SP2 결합영역과 피렌 분자(10)가 π-π 상호작용에 의해 결합되어 앱타머(8)가 마이크로 구조체(6)의 내측에 고정될 수 있다. 또한, 앱타머(8)의 DNA 주 가닥은 나노카본 박막(2) 표면에 대한 친화성을 가지므로 앱타머(8)가 나노카본 박막(2) 표면에 흡착되고(분자가 눕는 상태), 그 결과 형광염료(7)가 나노카본 박막(2) 표면에 근접해져 형광 FRET가 발생하고 형광염료(7)에서 형광이 생성되지 않는다. 앱타머(8)와 표적분자(9)가 결합하게 되면, 표적 분자(9)와 앱타머 DNA 주 가닥의 결합에 의해 앱타머(8)의 구조가 바뀌고(분자가 일어서는 상태), 형광염료(7)가 나노카본 박막(2) 표면으로부터 멀어지므로 FRET 가 해소되어 형광이 발생하게 된다. 즉, 전극 마이크로 구조체(6)의 내면으로부터 생성된 형광에 의해 표적분자(9)의 존재를 검출할 수 있다.
앱타머에 결합할 수 있는 임의의 분자는 단백질, 펩티드, 핵산, 세포 표면 분자, 세포 분비 소포를 포함하지만, 이에 한정되지 않고 검출될 수 있다. 또한, 표적분자는 앱타머뿐만 아니라 표적분자와 선택적으로 결합할 수 있고 분자 구조의 변화에 의해 형광을 방출하거나 소광하는 분자에 의해서도 동일한 원리로 검출될 수 있다. 도 3-2에서는, 피렌 분자를 통해 나노카본 박막 표면에 앱타머가 고정되었으나, 6원 탄소 고리 구조(carbon-six-membered ring structures)의 개수는 피렌 분자와 같이 4개로 제한되지 않고, π-π 결합에 의해 앱타머를 고정시킬 수 있는 한 2개, 3개 또는 4개 이상이어도 무방하다. 고정 가능한 6원 탄소 고리 구조의 최소 개수는 앱타머 분자의 크기에 따라 결정되는데, 예를 들어 DNA 앱타머의 염기수가 80이면 4개(피렌 분자)로 충분히 고정될 수 있다.
도 3-1과 도 3-2의 차이점과 관련하여, 도 3-1에서는 표적분자(9)의 결합으로 인해 앱타머(8)가 마이크로 구조체(6) 표면에서 해리되기 때문에, 표적분자(9)가 결합할수록 마이크로 구조체(6) 표면에 흡착된 앱타머(8) 분자수가 감소하게 된다. 한편, 형광염료(7)가 마이크로 구조체(6) 표면으로부터 충분히 떨어져 있어서, 형광 방출 및 소광의 변화가 도 3-2의 경우보다 명확해지고, 피렌 분자(10)를 앱타머(8)에 도입할 필요가 없으므로 저렴하고 용이하게 분자를 제조할 수 있다. 한편, 도 3-2에서는, 도 3-1과 비교하여 형광염료 분자(7)가 마이크로 구조체(6) 표면으로부터 떨어지는 거리가 제한되지만, 그 해결방법으로서 형광염료(7)와 DNA 앱타머(8) 사이 또는 DNA 앱타머(8)와 피렌 분자(10) 사이에 스페이서를 도입할 수 있다. 이러한 방법으로, 표적분자(9)가 결합하여 앱타머(8)의 구조가 변화될 때에, 형광염료 분자(7)와 마이크로 구조체(6) 표면 사이의 해리 거리를 증가시킬 수 있다. 스페이서 분자로는 폴리에틸렌글리콜과 같은 고분자 폴리펩티드, DNA, RNA 등과 같은 가닥 분자(stranded molecules)가 사용될 수 있다. 스페이서 길이는 약 0.1nm 내지 약 30μm, 전형적으로는 약 0.1nm 내지 약 1μm일 수 있지만, 고분자, 폴리펩티드, 핵산 분자 등으로 실현 가능하다면 이에 한정되지 않는다.
도 4는 도 3에 도시된 형광 DNA 앱타머를 이용한 생체분자 검출의 비한정적인 예로서, 생체분자 중 하나인 베스핀(vaspin)을 검출하는 예를 나타낸다. 도 3-1 및 도 3-2에 도시된 바와 같이, 형광염료(7)와 앱타머(8)의 복합체인 형광 DNA 앱타머, 도 3-2의 경우에는 피렌 분자(10)가 더 연결된 복합체로서의 형광 DNA 앱타머를, 직경이 15㎛이고, 내면이 나노카본 박막이며, 외면이 니켈제인 마이크로 구조체(6) 내면에 고정시키고, 여기에 베스핀(vaspin) 용액을 첨가하여 베스핀(vaspin) 반응 전후 형광 강도를 비교하였다. 표적분자(9)로서 베스핀(vaspin)이 첨가될 때에, 도 3-1 및 도 3-2 모두에서 형광 강도가 반응 전에 비해 상승했다. 또한, 대조군으로서 소혈청알부민(BSA)을 첨가한 경우에는 반응 전후에 형광 강도의 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 형광 DNA 앱타머를 이용하여 형광 강도의 변화로써 표적분자의 유무를 선택적으로 검출할 수 있음을 입증한다.
도 5는 도 3에 도시된 나노카본 막 이외의 박막 내면에서 표적 생체분자를 검출하는 방법의 비한정적인 예를 나타낸다. 도 5-1은 금(Au) 표면(14)에서 생체분자를 검출하는 일례로서, 티올기(thiol group, S)가 일단에 형광염료(12)가 타단에 부착된 DNA 앱타머(13)가 내면이 Au인 마이크로 구조체(6)와 혼합되고, 여기서 티올기(S)를 통해 DNA 앱타머(13)가 마이크로 구조체(6) 내면의 Au 표면(14)에 고정된다. DNA 염기는 Au 표면에 대하여 친화성을 가지므로, DNA 앱타머(13)가 Au 표면(14)에 흡착되어 형광을 소멸(소광)시키는 FRET를 발생시킨다. 여기에 표적분자(9)가 결합하면, 도 3-2와 같이 DNA 앱타머(13)의 구조가 변하면서 형광이 발생하므로 표적분자(9)의 존재를 검출할 수 있다. 또한, Au 표면(14)에 아미노기를 부착하는 등의 표면 처리를 통해 Au 표면(14)에 양전하를 띠게 할 수 있고, 이로써 음전하를 띤 DNA 앱타머(13)가 정전기적 상호작용에 의해 Au 표면(14)에 흡착되어 FRET가 발생할 수 있다. Au 표면(14)에 아미노기를 부착하는 경우, 일단에 아미노기를 갖고 타단에 티올기를 갖는 알킬 사슬(alkyl chain)을 준비하고, DNA 앱타머(13)를 내면이 Au인 마이크로 구조체(6)에 고정시키는 방법과 동일하게 혼합할 수 있다. DNA 앱타머(13)와 아미노기 및 티올기가 부착된 알킬 사슬을 임의의 비율로 미리 혼합하고, 내면이 Au인 마이크로 구조체(6)와 혼합하여 고정시킴으로써 DNA 앱타머(13) 및 이에 부착된 아미노기를 갖는 알킬 사슬을 Au 표면(14)에 임의의 비율로 고정시킬 수 있다. 알킬 사슬 길이는 FRET가 발생하는 효율을 고려하여 약 0.1nm 내지 약 20nm, 전형적으로 약 0.1nm 내지 약 5nm 범위일 수 있다.
도 5-2는 나노 크기의 그래핀 막인 나노그래핀(20)을 마이크로 구조체(6) 내면의 아미노기에 고정시켜 표적분자(9)를 검출하는 방법의 비제한적인 일례를 나타낸다. 이 경우, 형광 앱타머(12, 13)는 예를 들어 공유 결합에 의해 나노그래핀(20)에 강하게 고정되지 않고, 나노그래핀(20) 표면에 앱타머(13)가 흡착된다. 도 3-1과 같이 표적분자(9)의 결합에 의해 앱타머(13)는 구조가 바뀌고 나노그래핀(20)의 표면으로부터 해리되며, 그 결과 형광을 발생시킨다. 이 예에서 앱타머(13)는 해리되지만 도 4에 도시된 바와 같이 고감도로 표적분자(9)를 검출할 수 있다. 마이크로 구조체(6) 내면에 아미노기를 도입하는 방법은 마이크로 구조체(6) 내면의 물질을 이산화규소 등 수산기(hydroxyl group)를 가지는 물질로 하고 여기에 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane) 등의 실란 커플링제를 반응시키거나, 또는 전술한 아미노기를 갖는 알킬 사슬을 Au 표면에 고정시키는 방법 등으로 구현할 수 있다. 도 5-2에서, 아미노기를 갖는 알킬 사슬을 이용하여 아미노기를 도입하는 경우, FRET 형성의 효율성을 고려할 필요가 없기 때문에 알킬 사슬 길이는 약 0.1nm 내지 약 30㎛, 전형적으로 약 0.1nm 내지 약 1μm의 범위일 수 있다. 또한, 아미노기와 티올기를 더 연결하는 사슬 부분의 물질은 알킬 사슬 외에 고분자, 폴리펩티드, 핵산 분자 등일 수 있다.
도 6은 특정 생체분자 검출의 비한정적인 예로서, 형광 앱타머가 고정된 마이크로 구조체를 이용해 세포가 분비하는 분비물을 검출하는 방법을 나타낸다. 이 예에서, 표적분자를 분비하지 않는 일반 세포(15)와 표적분자를 분비하는 표적 세포(16)의 혼합물에 대해서 표적 세포(16)를 포획한 반구형 쉘 형태의 마이크로 구조체(6)에서만 형광이 나타난다. 도 6에는 3개의 실시예가 도시되어 있다.
도 6-1은 기판(3) 상의 마이크로 구조체(6) 어레이에서 각각의 마이크로 구조체(6) 내에 세포가 포획되고 검출되는 과정을 도시한다. 어레이 형태로 마이크로 구조체(6)를 배열하는 것은 도 2의 과정에 따라 제작된 기판(3) 상의 마이크로 구조체(6) 위에 접착제(17)를 도포하고 박리하여, 접착제(17)에 마이크로 구조체(6)를 전사함으로써 구현할 수 있다.
도 6-2는 미세 캔틸레버(microscopic cantilever)의 말단에 마이크로 구조체(6)를 부착하고, 마이크로 구조체(6)를 기판(3)에 부착된 세포 위에 덮어서 검출하는 형태를 나타낸다. 소형 캔틸레버 빔(cantilever beam)으로서, 예를 들어 원자력 현미경(atomic force microscope)의 캔틸레버(18)가 사용될 수 있다.
도 6-3은 자성을 갖는 마이크로 구조체(6)를 용액 안에 분산시킨 후 자기장을 인가함으로써 기판에 부착된 세포에 마이크로 구조체(6)를 부착시켜 분비물(19)을 검출하는 형태를 나타낸다. 이 경우, 기판(3)에 접착되는 세포의 돌기부(직경 약 5㎛)와 동일한 크기의 마이크로 구조체(6)를 제작하고, 용액 안에 마이크로 구조체(6)를 분산시킨 후, 세포가 부착된 기판(3)의 뒷면에 자석을 갖다 대어 세포 방향으로 마이크로 구조체(6)를 적층시켜 마이크로 구조체(6)에 세포를 부착시킨다. 마이크로 구조체(6)가 세포 표면 전체를 커버하지 않기 때문에, 커버되지 않은 세포 표면은 다른 세포로부터 분비물(19)을 받을 수 있어 주변 환경의 자극에 대한 세포의 반응을 측정할 수 있다.
도 6-1 내지 도 6-3에서 사용된 마이크로 구조체(6)의 내면에는 표적분자(19)를 검출하기 위한 형광 앱타머 등의 프로브 분자가 미리 고정되어 있다.
도 2에서 제작된 마이크로 구조체(6)를 용액에 분산시키는 경우, 기판(3)에 원하는 용액을 떨어뜨리고, 기판(3)의 뒷면에서 초음파를 가하여 마이크로 구조체(6)를 기판(3)에서 분리시켜 마이크로 구조체(6)를 용액에 분산시키는 방법이 효과적이지만, 일부의 마이크로 구조체(6)가 초음파에 의해 손상되는 문제가 발생할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위한 수단이 도 2에서 제작된 기판(3) 상의 마이크로 구조체(6) 위에 가용화 가능한 접착제(solubilizable adhesive, 17)를 도포하고 박리하는 것이다. 도 6-1에 도시된 바와 같이 접착제(17) 표면에 마이크로 구조체(6)를 전사한 후, 접착제(17)를 튜브에 넣어 가용화 처리를 하고 접착제(17)를 용해시켜 용액 분산형 마이크로 구조체(6)를 얻을 수 있다. 예를 들어, 도 2의 기판(3)에 폴리디메틸실록산(PDMS)을 부착시킨 후 박리하면 PDMS 표면에 마이크로 구조체(6)가 전사된다. 이러한 PDMS를 튜브에 넣고 이소프로판올(isopropanol)을 그 튜브에 첨가하면 PDMS 표면이 가용화되고 마이크로 구조체(6)가 이소프로판올에 분산된다. 이를 회수하고 임의의 용액으로 대체함으로써 손상 없이 용액에 분산된 마이크로 구조체(6)를 얻을 수 있다. 접착제의 “가용성(solubility)”에 대해서는 상기에서 유기용매에 대한 가용성을 설명했지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 마이크로 구조체, 그 마이크로 구조체에 부착된 생체분자(형광염료 등으로 변형된 것을 포함), 및 이들의 조합, 및 이들의 제조방법, 제어방법 및 사용방법 등은 다양한 분야에 적용 가능하고, 특히 환경에 존재하는 물질 및 미생물 검출과 같은 환경검사 칩 분야, 다수의 세포 내 특정 세포 검출과 같은 세포진단 분야, 혈액 내 특정 세포를 검출하는 등의 혈액 액체생검 분야 등에서 유용하다.
본 발명의 기술적 범위는 상술한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 범위 및 균등 범위 내에서 다양한 변형이 가능하며, 이들 변형도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
1: 제1 박막층, 2: 제2 박막층, 3: 평평한 기판, 4: 주형 입자, 5: 박막 형성 장치, 6: 마이크로 구조체, 7: 형광염료, 8: DNA앱타머, 9: 표적분자, 10: 피렌 분자, 11: 티올기, 12: 형광염료, 13: DNA앱타머, 14: Au박막, 15: 표적분자를 분비하지 않는 일반 세포, 16: 표적분자를 분비하는 표적 세포, 17: 접착제, 18: 원자력 현미경의 캔틸레버, 19: 분비물, 20: 나노그래핀

Claims (21)

  1. 자성 물질을 포함하는 제1 물질로 구성되고, 실질적으로 마이크로 반구형 쉘 형상으로 형성된 제1 박막층, 및
    상기 마이크로 반구형 쉘 형상의 내면에 배치되고, 제2 물질로 구성되되, 상기 제2 물질은 형광색소 표지 프로브를 제거 가능하게 고정하고, 상기 형광색소와의 사이에 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 발생시키는 제2 박막층을 포함하고,
    상기 제2 박막층에 의해 형성되는 중공 공간은 적어도 하나의 표적세포 또는 상기 표적세포의 일부를 상기 중공 공간에 포획할 수 있는 크기를 가지며,
    상기 프로브는 표적분자에 특이적으로 결합하는 분자이고, 상기 표적분자에 대한 상기 결합이 상기 프로브의 구조를 변화시켜, 상기 형광색소의 방출/소광의 변화를 야기하는 표적분자 검출용 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 물질은 니켈, 철, 코발트, 가돌리늄, 루테늄, 산화철, 산화크롬, 페라이트 및 네오디뮴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자성 물질인 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 물질은 SP2 혼성 오비탈을 갖는 원소, SP2 결합영역과 SP3 결합영역이 혼재된 원소 또는 금속을 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제2 물질은 나노카본, 나노그래핀 또는 금을 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제2 박막층은 표면에 아미노기를 가지는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로브는 단백질, 펩티드 또는 핵산 분자인 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 프로브는 일단이 형광색소로 변형되고(modified), 타단이 피렌(pyrene) 분자 또는 티올기(thiol group)로 변형된 핵산 분자인 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적분자는 단백질, 펩티드, 핵산, 세포 표면 분자(cell surface molecule) 또는 세포 분비 소포(cell secretory vesicle)를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 상기 박막층은 막 두께가 0.1nm 내지 1mm의 범위인 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 어레이.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 박막층의 표면에 제거 가능하게 고정된 상기 프로브를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 프로브는 스페이서 분자를 통해 제2 박막층의 표면에 제거 가능하게 고정되고, 또는 상기 형광색소가 상기 스페이서 분자를 통해 상기 프로브에 결합되는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이.
  13. a) 소정의 크기를 가지고, 기판 상에 단층으로 배열되며, 소정의 제거 공정을 통해 제거 가능한 물질로 구성된 주형 마이크로 입자를 준비하는 단계,
    b) 상기 기판 상에 배열된 상기 주형 마이크로 입자에 단일층으로 제2 물질을 코팅하는 단계,
    c) 상기 제2 물질이 코팅된 상기 주형 마이크로 입자에 제1 물질을 추가 코팅하는 단계, 및
    d) 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체가 형성되도록, 상기 소정의 제거 공정으로 상기 주형 마이크로 입자를 제거하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 표적분자 검출용 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 b) 단계와 상기 c) 단계 사이에 추가 물질을 코팅하는 단계를 적어도 하나 이상 더 포함하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 d) 단계 이후에 상기 기판의 표면에서 접착제의 표면으로 상기 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체를 전사하고, 또는 상기 프로브를 상기 제2 박막층에 제거 가능하게 고정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 추가 물질은 제1 물질 또는 제2 물질과 상이한 원소 또는 원소 합금을 포함하는 물질을 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 접착제는 가용성 접착제(soluble adhesive)인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 가용성 접착제는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane)으로, 상기 접착제를 용매에 용해시키는 단계를 포함하는 방법.
  19. a) 표적분자를 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 용액 내에 제2 박막층에 제거 가능하게 고정된 프로브를 포함하는 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이를 배치하는 단계 및
    b) 상기 프로브의 형광색소의 형광 발광을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 형광 발광을 검출함으로써 상기 표적분자와 상기 프로브 사이의 결합이 추정되며, 상기 용액 내의 상기 표적분자의 존재가 결정되는 제11항 또는 제12항에 따른 적어도 하나의 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이 또는 제15항, 제17항 또는 제18항에 따른 제조방법에 의해 제조된 적어도 하나의 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체 또는 그 어레이를 이용하는 표적분자 검출방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 a) 단계에서 외부 자기장을 인가하여 상기 용액에 분산된 상기 반구형 쉘 형태의 중공 다층 마이크로 구조체의 배향(orientation)을 제어하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 표적분자는 세포의 분비물이고, 상기 a) 단계와 상기 b) 단계 사이에 상기 반구형 쉘 형태의 다층 마이크로 구조체의 중공 공간에 상기 세포 또는 상기 세포의 일부를 포획하는 단계를 포함하는 방법.
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