JP7291422B2

JP7291422B2 - 微小構造体、その作製方法およびそれを利用した分子検出方法

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Publication number: JP7291422B2
Application number: JP2021502306A
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Inventors: 賢徹金; 大加藤; 直小島; 昌平山村; 智之鎌田
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Description

本発明は、金属薄膜と導電性電極薄膜の接合材料で構成された、半球殻や半楕円球殻などの構造を有する微小構造体と、それらを利用した物質検出方法に関する。

微粒子などの微小構造体は、新規物性を有する材料開発の素材として、また、生命科学分野では標的となるタンパク質やDNAを可視化する標識物として、広く利用されている。微粒子は一般的に作製が容易な球状のものが広く用いられるが、楕円や多角形といった複雑な形状を持つ微粒子は光学特性などにおいて異方性を有することから応用用途が広く、作製法の開発が盛んに進められている。

特開2011-101941号公報「中空微小体およびその作製方法」（特許文献１）では、お椀のような形状をした半球殻微粒子の作製方法が、WO2013/069732「磁気ナノ粒子」（特許文献２）では、この半球殻微粒子を磁性体で作製し、細胞精製技術に応用する方法が、それぞれ開示されている。

特開2011-101941号公報（特許文献１）では、平坦基板上に整列配置させたポリスチレン粒子の上に、真空蒸着もしくはスパッタにより金属薄膜を構成し、薬剤処理や加熱等によりポリスチレン粒子を取り除くことで半球殻微粒子を作製する方法が開示されている。しかし、この作製した微粒子の生命科学分野での具体的な用途、特に医療診断で重要となる、タンパク質やDNAなどの生体分子を検出する応用用途については、示されていない。

WO2013/069732（特許文献２）では、上記特開2011-101941号公報（特許文献１）のひとつの応用用途として、細胞と同等サイズ（直径約10μm）の半球殻状微粒子を、ニッケルや鉄などの磁性体材料を用いて作製し、微粒子の内側窪み部分に細胞をサイズ選択的に捕捉して精製回収する方法が開示されている。半球殻状微粒子を作製する際、磁性体薄膜の間に絶縁層を挟んで複層構造とすることで、磁気微粒子の物性を超常磁性とする作製方法も開示されている。しかし、細胞回収以外の用途、特に回収した細胞の表面に発現している生体分子を検出することで、細胞の種類や性質を特定する方法は示されていない。

生体分子の検出方法は蛍光、発光、電気計測など様々な方法が開発されているが、その中で電気化学発光（Electrochemiluminescence, ECL）は励起光が不要であることから背景光ノイズを極限まで抑えられ、高感度計測に適していることで注目されている（低親和性抗体で検出感度約4nM、ELISA法の約47倍、SPR法の約8倍、Liang et al., Assay Drug Dev. Technol., 5, 655, 2007（非特許文献１））。ECLは基質となるルテニウム錯体（Ru）などのECLプローブと、トリプロピルアミン（TPA）などの共反応物が電極近傍数nmに共在した際に電極へ電圧を印加すると発光する現象であり、電極近傍でのみ発光が生じるため背景発光を抑えられることからも、高感度化が達成されている。一方、ECLは電極近傍数nmのみで生じる発光現象のため、細胞のようなミクロンオーダーの大きな物体に対して相性が悪く、細胞を計測対象とした研究例はこれまでに無い。

電極の材料としては金や銀など様々な素材が用いられるが、原子間の結合様式で導電特性が様々に変化する炭素（カーボン）を素材とした電極材料が注目されている。グラフェンは炭素原子がsp²結合により2次元平面状に配列したシート状の素材で、極めて高い導電性を有することから電極材料としても注目を集めている。しかし、グラフェンは原子レベルで平坦なため、曲率を有する湾曲した微小構造体にグラフェン膜を構成することは、技術的な革新が必要となる。

グラフェン様の構造を持つカーボン薄膜素材として、ナノカーボン薄膜が開発されている。ナノカーボン薄膜は、アンバランスドマグネトロンスパッタ法で作製した、sp²結合とsp³結合領域が混在した薄膜で、通常のダイヤモンド様カーボン膜より高湿度・高温中でも安定で、高い導電性（sp²由来）とダイヤモンド並の硬度（sp³由来）を併せ持つ薄膜材料である（特開2006-90875号公報（特許文献３）；Niwa et al., J. Am. Chem. Soc., 128, 7144, 2006（非特許文献２）; Jia et al., Anal. Chem., 79, 98, 2007（非特許文献３））。ナノカーボン薄膜表面は原子レベルで平坦であり、電極としては電位窓が広く低ノイズで、電気化学分析、センサ用電極として他のカーボン材料に比べ優位性が高い。実際にナノカーボン薄膜を電極として使用すると、従来電極では検出が困難であった、酸化電位が高くかつ低濃度の全核酸塩基やグリア伝達物質を、極めて再現性良く測定できることが確認されている（Kato et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 3716, 2008（非特許文献４）; Kato et al., Angew. Chem. Int. Ed., 47, 6681, 2008（非特許文献５）; Yamamura et al., Br. J. Pharmacol., 168 1088, 2013（非特許文献６））。このナノカーボン成膜技術は、シリコンやガラスなどの平坦基板上で実施した実績はあるが、半球殻微小構造体のような立体的素材へ成膜した例はこれまでに無い。

特開2011-101941号公報 WO2013/069732 特開2006-90875号公報

Liang et al., Assay Drug Dev. Technol., 5, 655, 2007 Niwa et al., J. Am. Chem. Soc., 128, 7144, 2006 Jia et al., Anal. Chem., 79, 98, 2007 Kato et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 3716, 2008 Kato et al., Angew. Chem. Int. Ed., 47, 6681, 2008 Yamamura et al., Br. J. Pharmacol., 168 1088, 2013

したがって、標的となる細胞が発現しているマーカー分子や、特定の生体分子を選択的に検出する機構を備えた微小構造体、その作製方法、およびその微小構造体を用いて検出対象となる分子を検出・特定する、具体的解決手段の提供が望まれる。

本発明は上記状況に鑑み、以下の微小構造体、それを利用した分子検出方法およびその作製方法を提供する。
［１］分子の検出に使用するための微小構造体であって、
第１の導電性材料からなるほぼ半球殻状構造体と、
上記ほぼ半球殻状構造体の凹面側に配置された、第２の導電性材料からなる電極層とを備え、
上記第１の導電性材料が、磁性体材料を含み、
上記第２の導電性材料が、電極材料を含み、
上記ほぼ半球殻状構造体の上記凹面側の上記電極層に囲まれた空洞部のサイズ（直径）が、約１０ｎｍ～約５０μｍの範囲にある、微小構造体。
［２］上記空洞部が、少なくとも単一細胞を受容することができるサイズ（直径）を有し、上記微小構造体が、上記細胞の表面に発現する生体分子の検出に使用される、上記［１］に記載の微小構造体。
［３］上記生体分子が、がん細胞表面に発現することが知られている分子であり、がん細胞を同定するために使用される、上記［２］に記載の微小構造体。
［４］上記磁性体材料が、ニッケル、鉄、またはコバルトを含む、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の微小構造体。
［５］上記電極材料が、ナノカーボンを含む、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の微小構造体。
［６］上記微小構造体が磁性を有する、上記［１］～［５］のいずれか一項に記載の微小構造体。
［７］電極表面に対して上記微小構造体の凸面を接して配向配置された複数の上記微小構造体を含む、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の微小構造体のアレイ。
［８］上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の微小構造体または上記［７］に記載の微小構造体のアレイを用いて興味のある分子の検出を行う方法であって、
ａ）上記興味のある分子を含むと疑われる被検分子を含む試料と電気化学発光プローブとを接触させ、上記興味のある分子を上記電気化学発光プローブで特異的に修飾する、ステップ、
ｂ）上記ステップａ）後の上記試料と上記微小構造体とを接触させ、上記微小構造体の上記凹面側の上記電極層に囲まれた上記空洞部に上記被検分子を受容させる、ステップ、
ｃ）上記被検分子を受容した上記微小構造体に電圧を印加し、上記電気化学発光プローブからの発光を観測する、ステップ、および
ｄ）上記発光の検出により上記興味のある分子を同定するステップを含む、方法。
［９］上記興味のある分子を上記電気化学発光プローブで特異的に修飾することが、上記興味のある分子に特異的に結合する抗体を上記興味のある分子に特異的に結合させることを含み、上記抗体が上記電気化学発光プローブで標識されている、上記［８］に記載の方法。
［１０］上記興味のある分子が、がん細胞表面に特異的に発現することが知られている分子であり、上記試料ががん細胞を含むと疑われる被検細胞を含む試料溶液である、上記［８］または［９］に記載の方法。
［１１］上記微小構造体が磁性を有し、
ステップｂ）とステップｃ）との間に、上記微小構造体に外部磁場を掛けることによって、上記磁場により上記微小構造体の配向を制御するステップをさらに含む、上記［８］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］上記磁場により上記微小構造体の配向を制御するステップが、電極表面上に上記微小構造体の凸面が接するように配向配置することを含む、上記［１１］に記載の方法。
［１３］ステップａ）とステップｂ）との間に、上記微小構造体の凸面を原子間電子顕微鏡のカンチレバーに付着させるステップを含む、上記［８］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］ほぼ半球殻状の微小構造体の製造方法であって、
ａ）基板上に単層で配置された所望のサイズのほぼ球状の鋳型微粒子を準備するステップであって、上記鋳型微粒子が、所定の除去プロセスにより除去可能な材料からなる、ステップ、
ｂ）上記単層で上記基板上に配置された上記鋳型微粒子を第２の導電性材料で被覆するステップ、
ｃ）上記第２の導電性材料で被覆された上記鋳型微粒子をさらに第１の導電性材料で被覆するステップ、および
ｄ）上記鋳型微粒子を上記所定の除去プロセスにより除去して、上記第１の導電性材料からなるほぼ半球殻状構造体と、上記ほぼ半球殻状構造体の凹面側に配置された、上記第２の導電性材料からなる電極層とを備える微小構造体を得る、ステップを含み、
上記第１の導電性材料が磁性体材料を含み、
上記第２の導電性材料が電極材料を含み、
上記鋳型微粒子のサイズ（直径）が、約１０ｎｍ～約５０μｍの範囲にある、ほぼ半球殻状の微小構造体の製造方法。
［１５］ステップｂ）とステップｃ）の間に、上記第２の導電性材料で被覆された上記鋳型微粒子をさらに第３の導電性材料で被覆するステップをさらに含み、ステップｃ）において、上記第３の導電性材料で被覆された上記鋳型微粒子をさらに上記第１の導電性材料で被覆する、上記［１４］に記載の方法。
［１６］上記第１、第２または第３の導電性材料で上記鋳型微粒子を被覆するステップが、スパッタ装置、抵抗加熱型真空蒸着装置、および化学気相蒸着装置からなる群から選択される薄膜形成装置を用いて上記鋳型微粒子を被覆することを含む、上記［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］上記磁性体材料が、ニッケル、鉄、またはコバルトを含む、上記［１４］～［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］上記電極材料がナノカーボンを含み、上記第２の導電性材料により被覆するステップにおいて形成された薄膜が、ｓｐ^２結合領域とｓｐ^３結合領域とが混在したナノカーボン薄膜を含む、上記［１４］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］上記鋳型微粒子を形成する材料が、ポリスチレン、ポリプロピレン、セルロース、およびガラスからなる群から選択される材料を含む、上記［１４］～［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］上記所定の除去プロセスが、上記鋳型微粒子を高温加熱すること、有機溶媒で処理すること、および活性酸素で処理することからなる群から選択されるプロセスによって上記鋳型微粒子を除去することを含む、上記［１４］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］上記所定の除去プロセスが、酸素濃度約１５％以下の雰囲気下で高温加熱することを含む、上記［２０］に記載の方法。
［２２］上記ほぼ半球殻状構造体の上記凹面の上記電極層に囲まれた空洞部が、少なくとも単一細胞を受容することができるサイズ（直径）を有する、上記［１４］～［２１］のいずれか一項に記載の方法。
［２３］上記鋳型微粒子を上記第１、第２、または第３の導電性材料により被覆するステップにおいて形成された各薄膜層の厚さが、約０．１ｎｍ～約１ｍｍの範囲にある、上記［１４］～［２２］のいずれか一項に記載の方法。

すなわち、本発明は、凹面側に電極が配置されていることを特徴とし、作製を望む厚さ・直径の金属薄膜で作製した、半球殻状の微小構造体の作製方法、ならびにそれを利用した標的生体分子の検出方法を提供する。また、本発明は、上記電極微小構造体の外面が磁性体で構成されており、外部磁場の印加により配向を制御することが可能な微小構造体の作製方法と制御方法、上記磁性を有する微小構造体を作製する際に、酸素濃度が低い環境下（例えば、約15%以下）で鋳型微粒子除去反応を行うことで、磁場応答性が高い微小体を作製する方法、上記電極微小構造体の電極素材が、sp²結合領域とsp³結合領域が混在しており、湾曲面に形成可能な薄膜状ナノカーボンである、微小体の作製方法、上記電極微小構造体を平坦基板上に配向配置し、微小構造体内部に生体分子や細胞を捕捉する方法、上記電極微小構造体を溶液中に分散させ、構造体内部に生体分子や細胞を捕捉し、外部磁場印加により微小構造体の配向を制御する方法、を提供する。

さらに、上記電極微小構造体に捕捉した生体分子や細胞に対して、電圧を印加し、電気化学発光反応により標的となる分子を検出する方法を提供する。

本発明の微小構造体は、生体分子の検出のために電気化学発光を用いることができることから、励起光を不要として、背景光ノイズを抑えることができ、高感度計測ができる利点を有する。

本発明の微小構造体を用いてその凹面側の空洞部に細胞または生体分子を受容して、生体分子の検出を行う場合、従来の平坦基板上に配置された電極を用いる場合と比較して、細胞表面のより大きな面積に対して電極が接する形で電極を配置することができ、また、細胞表面に発現する生体分子に結合した電気化学発光プローブにより近接した形で電極を配置できることから、プローブからのシグナル検出感度を顕著に高めることができる。特に、半球形、半楕円球形のような曲面を有する凹面を有する本発明の微小構造体を細胞表面の生体分子の検出に用いる場合には、細胞表面の曲面により良く沿う形になることから、その効果がより増強され得る。

本発明の微小構造体を用いて細胞表面の生体分子の検出を行うことにより、以前には細胞自体の立体構造が障害になって（遮蔽されて）検出が困難だった細胞表面上の生体分子からのシグナルの検出がより容易になる。

本発明の磁性を有する微小構造体に、外部磁場を掛けることにより微小構造体の配向の制御（例えば、配向配置）がより容易になり、その結果、まずは溶液相で微小構造体の凹面側に細胞を捕捉できるため、微小構造体への細胞捕捉率が顕著に向上することが期待され、さらに、溶液相で細胞を捕捉した後の微小構造体を電極表面に付着させることがより容易になることから、当該微小構造体への電圧の印加がより容易になり、ひいては当該微小構造体の凹面に受容された細胞または生体分子のプローブ標識を用いた検出がより容易になる。

図1は、2層構造の電極微小構造体の例を示す模式図である。図2は、電極微小構造体の作製方法の例を示す概略図である。図3は、鋳型微粒子除去時の酸素濃度と磁場応答性（磁場印加により回収される微小構造体の割合）の関係を示すグラフである。図4は、電極微小構造体を用いて細胞表面の標的分子を電気化学発光（ECL）により検出する方法の例を示す。図4-1は、アレイ状に配置した電極微小構造体でECL計測を行う方法の例を示す模式図である。図4-2は、微細な針の先に電極微小構造体を取り付けてECL計測を行う方法の例を示す模式図である。図4-3は、電極微小構造体を導電性チューブ中の溶媒中に分散させ、溶媒中の標的細胞や標的分子を捕捉する方法(a)、導電性チューブの外から磁場を印加した後にECL計測を行う方法(b)、チューブ中の溶液を電極基板に滴下してECL計測を行う方法(c)の例を示す模式図、およびチューブ中の溶液を電極基板に滴下してECL計測を行う方法を実施した実験結果の顕微鏡写真(d)である。図5は、細胞表面の標的分子をECLプローブ標識抗体で標識し、ECL計測を行う方法の概要を示す模式図である。図6は、導電性粘着材（銀）の上に内面がナノカーボン薄膜、外面がニッケルの2層構造の、直径15μmの半球殻状電極微小構造体をアレイ状に配置し、ルテニウム標識抗体でEpCAM高発現がん細胞であるMCF-7細胞表面のEpCAM分子を標識した後、微小構造体内に捕捉して電圧を印加し、ECL計測を行った実験の結果を示す顕微鏡写真およびグラフ(a)、同様にEpCAM低発現がん細胞であるMDA-MB-231細胞表面のEpCAM分子を標識した後、微小構造体内に捕捉して電圧を印加し、ECL計測を行った実験の結果を示す顕微鏡写真(b)、比較として、ルテニウム標識した、細胞表面に発現しないGAPDHに対する抗体をMDA-MB-231細胞と反応させて同様にECL計測を行った実験の結果を示す顕微鏡写真(c)、(b)および(c)のECL計測での輝点数を比較した結果を示すグラフ(d)である。図7は、導電性粘着材（銀）の上に内面がナノカーボン薄膜、外面がニッケルの2層構造の、直径15μmの半球殻状電極微小構造体をアレイ状に配置し、1mM濃度のトリプロピルアミン存在下で2nM、2μM、2mMのルテニウム錯体を溶媒中に添加しECL計測を行った結果を示す蛍光顕微鏡写真およびグラフである。

１．分子の検出に使用するための微小構造体
本発明は、１つの局面において、分子の検出に使用するための微小構造体（本明細書中、「本発明の微小構造体」、または「電極微小構造体」、「半球殻状微小構造体」等ということもある。）を提供する。本発明の微小構造体は、第１の導電性材料からなるほぼ半球殻状構造体と、ほぼ半球殻状構造体の凹面側に配置された、第２の導電性材料からなる電極層とを備える。１つの典型的な実施形態では、第１の導電性材料は、磁性体材料を含み、第２の導電性材料は、電極材料を含む。

第１の導電性材料の例としては、ニッケル、鉄、コバルトなどの金属、酸化鉄、酸化クロムなどの酸化物、またはフェライト、ネオジウムなどの合金のような磁性体材料が含まれるが、これらに限定されない。

本発明に関して、「磁性体材料」という場合、用語「磁性体」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。本発明の目的のためには、少なくとも本発明において用いられる「磁性体材料」は、外部磁場を印加した際に、その磁場により微小構造体の配向が制御可能な程度に磁性を有することが望ましい。

本明細書中、「分子」には、溶媒中に分散している特定の標的分子および細胞表面に発現している生体分子のいずれも含まれる。細胞表面に発現している生体分子の非限定的な例としては、EpCAM、上皮成長因子受容体（EGFR）、プログラム細胞死リガンド-1（PD-L1）、カドヘリン等のがん細胞表面に発現する分子が挙げられる。

また、「細胞」は、典型的には、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラットなど）から取得された細胞であるが、これらに限定されず、鳥類、は虫類、両生類、昆虫、微生物、植物等の細胞も含み得る。

図1は、本発明の電極微小構造体の例を示す。この例では、第1の導電性材料としての金属薄膜1と第2の導電性材料としての電極薄膜2からなる2層構造の半球殻状微小構造体6を示しているが、層数は2層にとらわれず、中間層として異なる元素あるいは元素アロイの薄膜層を複層挟んでいても良い。薄膜元素の種類は、電気化学発光にて計測を行う場合は金属などの導電性元素である必要があるが、その他の場合においてはこの範疇にとらわれない。薄膜の膜厚は、微小構造体の構造が保持できる範囲で自在に選択可能であり、一層あたりの膜厚は約0.1nm～1mm、最も好ましくは1nm～1μmの範囲である。また、微小体の形状は本微小体作製時の鋳型の形状に応じて自在に作製可能で、半球形、円柱形、円錐形、半楕円球形、角柱形、角錐形などがあり得るが、この範囲に限定されない。なお、例えば、半球殻状の微小構造体6を作成するための鋳型微粒子自体は、必ずしも半球状である必要はなく、球状であってもよいことは本明細書の記載から理解されうるであろう。本明細書中、「ほぼ半球形」、「ほぼ半球殻状」、または「ほぼ球状」という場合には、特に断らない限り、ここに例示した形状またはその殻形状を全て含むものとし、また、実際の製造の場面で許容されうる形状の歪みを有するものも含まれるものとする。本微小体の半球殻状構造の凹面側空洞部のサイズ（直径）もまた、鋳型の形状に応じて自在に作製することができ、約1nm～約1cmの範囲にあり、好ましくは約1nm～約500μm、より好ましくは約5nm～約100μm、最も好ましくは約10nm～約50μmである。典型的には、この空洞部のサイズは、少なくとも単一細胞を受容することができるサイズ（直径）にすることができる。

２．分子の検出に使用するための微小構造体の製造方法

本発明はまた、別の局面において、本発明の微小構造体の製造方法を提供する。この製造方法は、
ａ）基板上に単層で配置された所望のサイズのほぼ球状の鋳型微粒子を準備するステップ、
ｂ）上記単層で上記基板上に配置された上記鋳型微粒子を第２の導電性材料で被覆するステップ、
ｃ）上記第２の導電性材料で被覆された上記鋳型微粒子をさらに第１の導電性材料で被覆するステップ、および
ｄ）上記鋳型微粒子を上記所定の除去プロセスにより除去して、上記第１の導電性材料からなるほぼ半球殻状構造体と、上記ほぼ半球殻状構造体の凹面側に配置された、上記第２の導電性材料からなる電極層とを備える微小構造体を得る、ステップを含む。

典型的には、上記鋳型微粒子が、所定の除去プロセスにより除去可能な材料からなる。

なお、第１の導電性材料および第２の導電性材料の典型的な要件、および鋳型微粒子または半球殻状構造の凹面側空洞部の典型的なサイズについては、上記セクション１で本発明の微小構造体に関して既に記載した。

図2は、本発明の電極微小構造体6の具体的な作製方法の例を示す。はじめに、平坦基板3の上に鋳型となる微粒子4を単層配置する。平坦基板の素材としては、ガラス、シリコン、プラスチックなどがあり得るが、鋳型微粒子のサイズより小さな表面平坦性を備えた基板であれば、この範囲に限定されずどのような基板でも利用可能である。鋳型微粒子についても、ポリスチレン粒子、ポリプロピレン粒子、セルロース粒子、ガラス粒子などがあり得るが、作製を望む電極微小構造体と同等のサイズ、形状の微粒子であればこの範囲に限定されない。例えば直径10μmのポリスチレン粒子をスライドガラス基板の表面に単層配置する場合は、100μL程度の市販ポリスチレン粒子分散液をチューブに入れて1,500xG、5分程度の遠心操作を行い粒子を沈殿させた後、上清を捨てて水やエタノールなど揮発性の高い溶媒をチューブに添加して粒子を再分散させた後、清浄なスライドガラス基板上に粒子分散液を滴下して乾燥させればよい。

図1の電極微小構造体6の内側電極薄膜2（第2の導電性材料からなる）を形成するために、鋳型微粒子を載せた平坦基板を、薄膜形成装置5の試料室内に設置し、薄膜形成装置の使用手順に従い、電極素材となる薄膜を任意の膜厚で作製する。これにより、平坦基板上に単層配置された鋳型微粒子の上に、電極素材の薄膜が形成される。電極素材（または電極材料）としては、カーボン、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、酸化インジウムスズ（ITO）等の透明導電材料、PEDOT等の導電性ポリマー等が含まれるが、電気抵抗率が1Ω・cm以下程度の材料であればこれらに限定されない。例えばガラス基板上に配置したポリスチレン粒子に上記手順で薄膜を形成した場合は、粒子全体が薄膜で被覆されるのではなく、薄膜形成装置の元素素材の方向を向いた（基板方向を向いていない）半球部分のみが薄膜で被覆されることとなる。薄膜形成装置としては、スパッタ装置、抵抗加熱型真空蒸着装置、化学気相蒸着装置などがあり得るが、鋳型微粒子サイズと同程度以下の、膜厚約0.1nm～約1mmの内でいずれかの範囲の薄膜を形成可能な装置であればこの範囲に限定されない。また、電極薄膜材料としてナノカーボン薄膜を用いる場合は、sp²結合とsp³結合領域が混在したカーボン薄膜を形成可能な、アンバランスドマグネトロンスパッタ装置などを用いる。

ナノカーボン薄膜はsp²結合とsp³結合領域が混在したカーボン薄膜で、sp²結合領域でπ-π結合相互作用によりピレンやナノグラフェン、DNAのような環状構造を有する分子を結合させることができ、またsp³結合領域が存在するため、半球殻状の微小構造体のような曲面にも連続膜を形成可能である。sp²結合とsp³結合領域との比は、スパッタ条件により自在に調整可能であり、例えばポリスチレン粒子（例えば、粒径約10nm～50μmのサイズの）のような曲率を持つ微小体の上にナノカーボン薄膜を形成する場合は、sp²:sp³の比率を8:2程度となるようスパッタ条件を設定すれば、表面の平坦性を維持したまま曲率を持つ微小体の上に比較的柔らかい組成のナノカーボン薄膜を形成できる。

次に、図1の電極微小構造体6の外側面の金属薄膜1（第１の導電性材料からなる）を形成するために、この試料を薄膜形成装置5の試料室内に設置し、電極薄膜形成時と全く同様に薄膜を形成する。一例として、ガラス基板上に単層配置してナノカーボン薄膜を形成したポリスチレン粒子の場合は、真空蒸着装置を用いてナノカーボン薄膜のさらに上からニッケル薄膜を100nm成膜する。これにより、2層構造の薄膜が鋳型微粒子の半球部分に形成される。薄膜の層数を3層以上とする場合は、この手順を繰り返して層数を増やす。

以上の手順で鋳型微粒子の上に複層構造の薄膜を形成した後、鋳型微粒子を除去すると、図1のような電極微小構造体6を得る。鋳型微粒子の除去方法は、高温加熱、有機溶媒処理、活性酸素処理などの方法があり得る。例えば、ガラス基板上に単層配置してナノカーボン薄膜とニッケル薄膜を形成した場合は、ガラス基板の上に配置されたままのポリスチレン粒子を電気炉庫内に設置し、500℃、1時間加熱処理すると、鋳型ポリスチレン粒子が除去され、ナノカーボン薄膜とニッケル薄膜で構成された2層構造の半球殻状微小構造体が、開口部をガラス基板側に向けた状態でガラス基板上に作製される。ここでは電気炉を用いた加熱処理を例としたが、鋳型微粒子が除去され、かつ薄膜層は除去されない方法であれば、この範囲に限らない。例えばガラス微粒子を鋳型として用いる場合は、ポリエチレンやテフロン製の基板の上にガラス微粒子を配置した後に電極および金属薄膜を形成し、フッ化水素処理を行いガラス微粒子を除去すればよい。

また、磁性を有する微小体の作製を望む場合、図3に示すように酸素濃度が低い（典型的には、約15%以下の）雰囲気中で鋳型微粒子の除去を行うと磁場応答性が維持されるため、該雰囲気中で鋳型微粒子の除去工程を行うのがよい。例えば、ガラス基板上に単層配置してナノカーボン薄膜とニッケル薄膜を形成したポリスチレン粒子に対して、ニッケル薄膜の磁気モーメントを維持したままポリスチレン粒子を加熱除去する場合は、グローブボックスなど雰囲気置換可能な箱の中に小型電気炉を入れ、箱の中に窒素ガスを導入するなどして箱内の酸素濃度を低く、例えば、約15%またはそれより小さい濃度（例えば、約14％、約13％、約12％、約11％、約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、もしくはそれより小さい濃度）にした上で電気炉の加熱処理を開始することで、磁気モーメントが維持された磁性微小構造体を作製することができる。使用され得る最適な酸素濃度は、使用する環境、装置、材料等によっても変わり得るが、当業者であれば、本明細書中の教示および当該分野の技術常識に基づいて、微小体に磁気モーメントを維持させるのに最適な酸素濃度を決定できるであろう。そのような酸素濃度としては、例えば、約0％、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、および約20％からなる群から選択される任意の濃度、または任意の2つの濃度の組合せの間の濃度範囲であり得る。

３．本発明の微小構造体を用いた分子の検出方法

本発明は、さらに別の局面において、少なくとも本発明の微小構造体もしくはそのアレイ、または本発明の微小構造体の製造方法により製造された少なくとも１つの本発明の微小構造体もしくはそのアレイを用いて興味のある分子の検出を行う方法を提供する。この方法は、典型的には、
ａ）上記興味のある分子を含むと疑われる被検分子を含む試料と電気化学発光プローブとを接触させ、上記興味のある分子を上記電気化学発光プローブで特異的に修飾する、ステップ、
ｂ）上記ステップａ）後の上記試料と上記微小構造体とを接触させ、上記微小構造体の上記凹面側の上記電極層に囲まれた上記空洞部に上記被検分子を受容させる、ステップ、
ｃ）上記被検分子を受容した上記微小構造体に電圧を印加し、上記電気化学発光プローブからの発光を観測する、ステップ、および
ｄ）上記発光の検出により上記興味のある分子を同定するステップを含む。

本明細書中、「アレイ」は、当該分野で通常使用される意味で使用され、本発明に関して「微小構造体のアレイ」という場合、２つ以上の微小構造体が一次元または二次元に配列された微小構造体の集団を意味する（例えば、図4-1を参照）。

作製した電極微小構造体を電気化学発光（electrochemiluminescence, ECL）法による生体分子検出に用いるためには、3つの利用形態が考えられる。

一つ目の利用形態は、図4-1に示すように、電極微小構造体6を導電性の平坦基板の上に、開口部を露出した状態でアレイ状に配置し、微小構造体開口部内の電極部分に生体分子を接近させた後、微小構造体と溶媒間に電圧を印加することで検出する方法である。ここでは、がん細胞表面の受容体分子を検出対象として、内面がナノカーボン薄膜、外面がニッケルの2層構造で半球殻カップ形状の微小構造体（以下、「電極カップ」と表記）を用いて、正常細胞9とがん細胞10の混合物から、がん細胞10のみをECLにより検出する方法を具体例として解説する。

はじめに、加熱処理により開口部をガラス基板側に向けた状態で作製された電極カップに対して、図4-1に示すように上から導電性の粘着材7を貼って剥がすと、電極カップ6をガラス基板3から剥離して粘着材7の上に転写することができる。導電性粘着材としては、カーボン、金、銀、銅、アルミなどのテープや、PEDOT等の光硬化性透明導電性ポリマーなどを用いるとよい。この上から、がん細胞を含む細胞懸濁液を滴下すると、個々の細胞が電極カップの凹面窪み部分に捕捉される。細胞と電極カップの接触面積が大きいほどECL計測時のシグナル量が増大するため、電極カップ直径は細胞（直径約10μm）とほぼ同等であることが好ましく、本例では典型的には直径10-15μmである。また、がん細胞をECL計測により検出するため、がん細胞を含む細胞懸濁液は予めECLプローブ分子で修飾を行っているが、その具体的手順は後述する。以上の手順で各細胞を電極カップ凹面に捕捉した後、電極カップと導通している導電性粘着材と、細胞懸濁液の間に電圧を印加すると、ECLプローブ分子で標識されたがん細胞を捕捉した電極カップからECL発光が観測され、それによりがん細胞の存在が特定される仕組みである。印加する電圧については、典型的には0-2V程度の範囲で掃引を行う。また、がん細胞を含む細胞懸濁液の具体的な例としては、がん患者の血液等が考えられ、血中循環がん細胞を検出する診断などの用途への応用が考えられる。

二つ目の利用形態は、図4-2に示すように、微細な針の先に電極微小構造体6を取り付けて基板上の細胞の上に電極微小構造体6をアプローチさせる方法である。ここでは具体的な例として、電極カップを先端に取り付けた原子間力顕微鏡（atomic force microscope, AFM）のカンチレバーを用いてECL計測を行う方法について説明する。

表面が金属コートされた導電性カンチレバー、導電性接着剤、基板から剥離した電極カップを、それぞれマイクロマニピュレータを備えた実体顕微鏡の下に配置する。導電性カンチレバーについては、金などがコートされた市販AFMカンチレバーを用いるとよい。導電性接着剤としては、市販の銀ペースト接着剤などを用いる。また、電極カップを基板から剥離する場合は、加熱処理により開口部をガラス基板側に向けた状態で作製された基板上の電極カップに対して、水やエタノールなどの溶媒を100μL程度滴下し、基板底面側から超音波を当てることで、カップを滴下した溶媒中に分散させることができる。超音波を当てる方法は、電極カップをガラス基板ごとシャーレ内に設置し、シャーレ底面を超音波洗浄器の水面に当てた上で超音波洗浄器を稼働させればよい。実体顕微鏡で観察を行いつつ、マイクロマニピュレータのガラス針先端を導電性接着剤に触れさせると、ガラス針先端に接着剤が付着する。このガラス針をさらにAFMカンチレバー先端に触れさせると、カンチレバー先端にごく微量の導電性接着剤が付着する。次に、新しいガラス針を用意し、電極カップに触れると、静電的相互作用などにより電極カップ一粒がマイクロマニピュレータのガラス針先端に付着する。それを、AFMカンチレバー先端の接着剤が付着した部分に触れさせると、電極カップ一粒が接着剤を介してカンチレバー先端に付着する。この、電極カップを付着させた導電性AFMカンチレバーをAFM装置に設置する。計測対象の細胞は、がん細胞を予めECLプローブ標識しておく。電極カップを付着させた導電性AFMカンチレバーを、AFM通常アプローチ動作と同様に細胞表面に付着させ、AFMカンチレバーと溶媒間に電圧を印加すると、ECLプローブ標識されたがん細胞に電極カップ付きAFMカンチレバーがアプローチした場合のみ、ECL発光が観察される仕組みである。

三つ目の利用形態は、図4-3に示すように、電極微小構造体6を溶媒中に分散させ、溶媒中の標的細胞や標的分子を捕捉した上でECL計測を行う利用形態である。ここでは、磁性を有する電極カップを細胞懸濁液と混合し、がん細胞を検出する方法を具体例として説明する。

加熱処理により開口部をガラス基板側に向けた状態で作製された基板上の電極カップに対して、細胞培養培地などの溶媒を100μL程度滴下し、基板底面側から超音波を当てることで、カップを滴下した溶媒中に分散させる。このカップ分散液と、がん細胞を含む細胞懸濁液を、図4-3(a)に示すように導電性の壁面で構成された器に移して混合し、30分から1時間程度回転もしくは振とう反応することで、細胞が電極カップの凹面窪み部分に捕捉される。がん細胞は予めECLプローブ分子で標識しておき、また、導電性の壁面で構成された器としては、内面を金属コートした市販チューブなどを用いるとよい。細胞が電極カップ凹面窪みに十分に捕捉された後、図4-3(b)に示すように器の外側から磁場を印加すると、電極カップが磁性を有するため、細胞を捕捉した電極カップが器の内壁面に付着した状態となる。導電性の器内壁面と溶媒の間に電圧を印加すると、ECLプローブ標識されたがん細胞からECL発光が観測される仕組みである。

もしくは、図4-3(c)に示すように、細胞が電極カップ凹面窪みに十分に捕捉された後、チューブ内の溶液を電極基板14の上に滴下し、電極基板の裏側から磁場を印加すると、電極カップが磁性を有するため、細胞を捕捉した電極カップが電極基板の上に集積する。電極基板と溶媒の間に電圧を印加すると、ECLプローブ標識されたがん細胞からECL発光が観測される仕組みである。この方法を用いる場合は、チューブが導電性を有する必要はない。電極基板は導電性を有する基板であれば如何なるものでもよく、金、銀、銅、アルミなどの金属や、ITOなどの透明電極素材などが例として考えられる。

図4-3(d)は、図4-3(c)に示した例を実施した実験例である。ここではがん細胞を、後述のECL基質が付いた上皮細胞接着分子に対する抗体で予め標識し、直径15μmのカップ形状電極微小構造体と混合した後、カップに捕捉された細胞が入った溶液を銀電極基板上に滴下し、電極裏側からネオジウム磁石を当てることで電極上に細胞を捕捉したカップを集積させた後、電圧を印加してECL計測を行っている。ECL像中の個々の起点が、がん細胞を捕捉した個々のカップからのECL発光である。

細胞表面の標的分子をECLプローブ標識して検出する方法としては、図5に示すように標的分子と選択的に結合する抗体15を用いる方法がある。ここでは、がん細胞表面に発現する上皮細胞接着分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）を検出標的分子、ルテニウム錯体（ruthenium complex, Ru）をECLプローブ、トリプロピルアミン（tripropylamine, TPA）をECL計測時の共反応物とし、電極カップを用いてがん細胞をECL計測により検出する方法を具体的な例として説明する。電極近傍数nmの領域にECLプローブのRuと共反応物のTPAが共在した状態で、電極と溶媒間に電圧を印加すると、ECL発光が観測される。

Ru標識された抗EpCAM抗体とがん細胞を含む細胞懸濁液を混合し、30分から1時間程度回転もしくは振とう反応することで、がん細胞表面のEpCAMにRu標識抗EpCAM抗体が結合し、その結果、がん細胞表面がRu標識される。抗体へのRu標識は、アミノ基と反応するN-ヒドロキシコハク酸イミド（N-hydroxysuccinimide, NHS）を分子内に持つRuが市販されており、本試薬と抗体を混合することで抗体のアミノ基とRuが結合し、その結果Ru標識抗体が得られる。Ru標識されたがん細胞を含む細胞懸濁液に対して、さらにTPAを溶媒中に添加し、先述の3つの利用形態いずれかの方法により細胞を電極カップ内へ捕捉した後、電極カップと溶媒間に電圧を印加する。Ru標識抗EpCAM抗体で標識されたがん細胞を捕捉した電極カップ内では、カップ凹面のナノカーボン電極近傍にRuと（溶媒中に存在する）TPAが共在することになるため、電圧を印加するとECL発光が観測される。一方、EpCAMを発現していない白血球などの正常細胞を捕捉した電極カップ内では、TPAは存在するがRuが存在しないためECL発光が生じない。この結果、がん細胞を捕捉した電極カップ内からのみECL発光が観測され、がん細胞の検出へと至る。図6は、上記がん細胞のECL計測の例を実践した例であり、がん細胞の存在がECL発光として確認されている。図6(b)では、蛍光検出が困難であると知られているMDA-MB-231細胞に対してECL計測を行った結果である。蛍光検出が困難であるがん細胞の検出にも本手法では成功していることから、本手法の検出感度の高さが実証されている。このように、本発明を用いるとこれまで困難であった、細胞表面標的分子のECL計測による高感度検出を実現できる。

溶媒へのTPA添加が、細胞活性に影響を与える等の事象が懸念される場合は、Ruに対してNHSと共にTPAを共有結合で連結させた試薬を化学合成により作製することが可能である。この場合、同試薬と抗EpCAM抗体を反応させると、RuとTPAの両方で標識された、Ru-TPA標識抗EpCAM抗体が得られる。この抗体とがん細胞を反応させると、がん細胞表面がRuとTPAの両方で標識される。先述の3つの利用形態いずれかの方法により、このがん細胞を電極カップ内へ捕捉した後、電極カップと溶媒間に電圧を印加すると、ECL発光が観測される。この場合、溶媒へのTPA添加は不要であり、任意の溶媒を利用可能である。

上記の例では、がん細胞表面に発現する分子として、EpCAMを具体的に例示したが、がん細胞表面に発現する分子として知られる他の分子も上記と同様に検出可能なことは当業者には明らかであろう。そのような他の分子の例としては、上皮成長因子受容体（EGFR）、プログラム細胞死リガンド-1（PD-L1）、カドヘリン等が挙げられるが、これらに限定されない。

EpCAMなどの細胞表面分子でなく、溶媒中に分散している特定の標的分子を検出する場合は、細胞表面の計測と同様に、標的分子と結合するECLプローブ分子を溶媒中に混合して、標的分子とECLプローブ分子を結合させた後、未反応のECLプローブ分子をカラム精製などで除去し、標的分子とECLプローブ分子の結合体が分散した溶液を電極微小構造体6に滴下してECL計測を行えばよい。例えば、タンパク質の一種であるアビジンを検出する場合は、アビジンに対して強い結合能を有するビオチンをRuなどのECLプローブで標識した後、Ru標識ビオチンをアビジンと混合して結合させ、ECL計測を行うか、あるいはアビジン自体がアミノ基を有するため、アビジンをECLプローブで直接標識して電極微小構造体6に滴下し、ECL計測を行えばよい。Ru自身を検出標的分子として、1mM濃度のTPAが存在する溶媒を電極カップに滴下し、そこに2nMから2mM濃度のRuをさらに溶媒中に加えた後、電極カップと溶媒間に電圧を印加してECL計測を行った例が図7である。図7に示すように、2μM濃度のRuが各電極カップからのECL発光として検出されることを確認している。

以上の例では、半球殻状の電極カップや検出標的としてがん細胞表面のEpCAM、ECLプローブ分子としてRu、共反応物としてTPAを用いた場合を具体例として示したが、電極微小構造体6の形状や検出対象の分子、利用するECLプローブ分子や共反応物の種類などが異なる場合でも計測方法が同様であることは当業者には容易に想定できる。検出対象の分子としては、タンパク質、ペプチド、核酸、細胞分泌小胞等の生体分子が対象として想定されるが、ECLプローブで標識可能な分子であればどのような分子でも本計測方法で検出可能である。

以上、本発明について具体例を用いて説明したが、本発明の技術的範囲はこれらの具体的に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載される発明およびその等価物の技術的範囲内で種々のバリエーションが可能であり、それらバリエーションも、本発明の技術的範囲に含まれる。

血液中のマーカー分子やマーカー細胞を検出するリキッドバイオプシーの分野で利用するために、本発明技術で正常血球細胞は発現しておらずがん細胞のみが発現するマーカー分子を検出する診断装置や診断チップを開発することで、血中循環がん細胞診断に応用することができる。本発明の微小構造体を基板上に配置したチップを作製し、そこに血液を滴下することで、血中循環がん細胞検出チップとして利用できる。

また、本発明の微小構造体は、環境中の特定の物質や微生物の検出にも応用できる。上記血中循環がん細胞検出チップと同様に、本発明の電極微小構造体を基板上に配置し、ウィルスや特定化学物質を検出することで、簡便な環境検査チップとして利用できる。

また、本発明の微小構造体は溶液中に分散させること、分散後に外部磁場印加により溶液中での集積や配向が可能なことから、新規導電性材料や磁性材料の作製用途にも利用できる。

1・・・金属薄膜、2・・・電極薄膜、3・・・平坦基板、4・・・鋳型微粒子、5・・・薄膜形成装置、6・・・電極微小構造体、7・・・導電性粘着材、8・・・参照電極、9・・・正常細胞、10・・・がん細胞、11・・・原子間力顕微鏡カンチレバー、12・・・チューブ、13・・・磁石、14・・・電極基板、15・・・抗体、16・・・ルテニウム等のECLプローブ、17・・・トリプロピルアミン等の共反応物、18・・・細胞表面標的分子、19・・・ECLプローブ修飾抗体。

Claims

微小構造体または前記微小構造体のアレイを用いて興味のある分子の検出を行う方法であって、
前記微小構造体が、
第１の導電性材料からなるほぼ半球殻状構造体と、
前記ほぼ半球殻状構造体の凹面側に配置された、第２の導電性材料からなる電極層とを備え、
前記第１の導電性材料が、磁性体材料を含み、
前記第２の導電性材料が、電極材料を含み、
前記ほぼ半球殻状構造体の前記凹面側の前記電極層に囲まれた空洞部のサイズ（直径）が、約１０ｎｍ～約５０μｍの範囲にあり、
前記方法が、
ａ）前記興味のある分子を含むと疑われる被検分子を含む試料と電気化学発光プローブとを接触させ、前記興味のある分子を前記電気化学発光プローブで特異的に修飾する、ステップ、
ｂ）前記ステップａ）後の前記試料と前記微小構造体とを接触させ、前記微小構造体の前記凹面側の前記電極層に囲まれた前記空洞部に前記被検分子を受容させる、ステップ、
ｃ）前記被検分子を受容した前記微小構造体に電圧を印加し、前記電気化学発光プローブからの発光を観測する、ステップ、および
ｄ）前記発光の検出により前記興味のある分子を同定するステップを含む、方法。
前記空洞部が、少なくとも単一細胞を受容することができるサイズ（直径）を有し、前記微小構造体が、前記細胞の表面に発現する生体分子の検出に使用される、請求項１に記載の方法。
前記生体分子が、がん細胞表面に発現することが知られている分子であり、がん細胞を同定するために使用される、請求項２に記載の方法。
前記磁性体材料が、ニッケル、鉄、またはコバルトを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記電極材料が、ナノカーボンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記微小構造体が磁性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記微小構造体のアレイが、電極表面に対して前記微小構造体の凸面を接して配向配置された複数の前記微小構造体を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記興味のある分子を前記電気化学発光プローブで特異的に修飾することが、前記興味のある分子に特異的に結合する抗体を前記興味のある分子に特異的に結合させることを含み、前記抗体が前記電気化学発光プローブで標識されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記興味のある分子が、がん細胞表面に特異的に発現することが知られている分子であり、前記試料ががん細胞を含むと疑われる被検細胞を含む試料溶液である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記微小構造体が磁性を有し、
ステップｂ）とステップｃ）との間に、前記微小構造体に外部磁場を掛けることによって、前記磁場により前記微小構造体の配向を制御するステップをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記磁場により前記微小構造体の配向を制御するステップが、電極表面上に前記微小構造体の凸面が接するように配向配置することを含む、請求項１０に記載の方法。
ステップａ）とステップｂ）との間に、前記微小構造体の凸面を原子間電子顕微鏡のカンチレバーに付着させるステップを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
ほぼ半球殻状の微小構造体の製造方法であって、
ａ）基板上に単層で配置された所望のサイズのほぼ球状の鋳型微粒子を準備するステップであって、前記鋳型微粒子が、所定の除去プロセスにより除去可能な材料からなる、ステップ、
ｂ）前記単層で前記基板上に配置された前記鋳型微粒子を第２の導電性材料で被覆するステップ、
ｃ）前記第２の導電性材料で被覆された前記鋳型微粒子をさらに第１の導電性材料で被覆するステップ、および
ｄ）前記鋳型微粒子を前記所定の除去プロセスにより除去して、前記第１の導電性材料からなるほぼ半球殻状構造体と、前記ほぼ半球殻状構造体の凹面側に配置された、前記第２の導電性材料からなる電極層とを備える微小構造体を得る、ステップを含み、
前記所定の除去プロセスが、前記鋳型微粒子を酸素濃度約１５％以下の雰囲気下で高温加熱することによって前記鋳型微粒子を除去することを含み、
前記第１の導電性材料が磁性体材料を含み、
前記第２の導電性材料が電極材料を含み、
前記鋳型微粒子のサイズ（直径）が、約１０ｎｍ～約５０μｍの範囲にある、ほぼ半球殻状の微小構造体の製造方法。
前記ステップｃ）が、前記第２の導電性材料で被覆された前記鋳型微粒子をさらに第３の導電性材料で被覆すること、および、前記第３の導電性材料で被覆された前記鋳型微粒子をさらに第１の導電性材料で被覆することを含む、請求項１３に記載の方法。
前記第１、第２または第３の導電性材料で前記鋳型微粒子を被覆するステップが、スパッタ装置、抵抗加熱型真空蒸着装置、および化学気相蒸着装置からなる群から選択される薄膜形成装置を用いて前記鋳型微粒子を被覆することを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
前記磁性体材料が、ニッケル、鉄、またはコバルトを含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記電極材料がナノカーボンを含み、前記第２の導電性材料により被覆するステップにおいて形成された薄膜が、ｓｐ^２結合領域とｓｐ^３結合領域とが混在したナノカーボン薄膜を含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記鋳型微粒子を形成する材料が、ポリスチレン、ポリプロピレン、セルロース、およびガラスからなる群から選択される材料を含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
前記ほぼ半球殻状構造体の前記凹面の前記電極層に囲まれた空洞部が、少なくとも単一細胞を受容することができるサイズ（直径）を有する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
前記鋳型微粒子を前記第１、第２、または第３の導電性材料により被覆するステップにおいて形成された各薄膜層の厚さが、約０．１ｎｍ～約１ｍｍの範囲にある、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。