JP2009128297A - 微粒子を形成する方法およびこの微粒子を利用した生体物質の検査法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微粒子を単層固定させる基板表面に金を所定の厚さで蒸着する。一方、1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride(通称EDC)、NaCl、あるいは、KCl等の微粒子間の静電反発力を抑制するための材料を利用した粒子固定液を作製し、これに微粒子を混合した粒子懸濁液として上記基板上に塗布することにより、金を所定の厚さで蒸着された基板表面に微粒子を単層固定させる。また、単層固定された微粒子表面に遷移金属、金属または半導体を蒸着させて修飾微粒子を形成する。基板から修飾微粒子剥離させるには、超音波洗浄装置等を利用して、基板に超音波を作用させて、剥離を促進する。修飾微粒子を生体機能分子によって修飾して生体物質の検査のための標識として利用する場合、修飾微粒子からの反射電子を利用する。
【選択図】図8
Description
所定の直径のポリスチレン製微粒子、SiO2製微粒子、または、TiO2製微粒子、適量の純水、および、前記微粒子間の静電反発力を抑制するための材料を混合して、前記基板上で前記微粒子が高密度に分布できる濃度となるように懸濁した微粒子懸濁液を準備する工程、
前記微粒子懸濁液を前記基板の上に滴下して前記基板上に前記微粒子を高密度に分布させる工程、
基板上に吸着していない過剰量の微粒子を洗浄除去し、基板上に分布された微粒子を乾燥させる工程、
前記基板上に分布された前記微粒子に遷移金属、金属または半導体を少なくとも1層蒸着させる工程、
前記遷移金属、金属または半導体を少なくとも1層蒸着された前記微粒子に、蒸着または昇華によりSiO2を1層形成させる工程、
前記基板上に固定され、前記蒸着を済ませた前記微粒子上に、微量の純水、または、該純水にタンパク質として牛血清アルブミン(bovine serum albumin (BSA))、緩衝液としてクエン酸バッファー(standard sodium citrate (SSC))もしくはリン酸塩バッファー(phosphate buffer)、および界面活性剤として硫酸ドデシルナトリウム(sodium dodecyl sulfate (SDS))もしくはタンニン酸(tannic acid)を加えた微量の液体を滴下する工程、ならびに
前記基板の他面に超音波を作用させながら、前記微粒子が固定された前記一面側に平坦な底面を有する素材を該底面に若干加重が加わる様に載置して、該素材を任意の方向に移動させることにより前記微粒子を前記基板から剥離させる工程、
を含む、遷移金属、金属または半導体で修飾された微粒子の製作方法。
(2)前記微粒子間の静電反発力を抑制するための材料が1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride、NaCl、または、KClである上記(1)記載の微粒子の製作方法。
(3)前記遷移金属、金属または半導体が、周期律表で原子番号43番を除く79番までの遷移金属、原子番号13,31,32,33,49,50,51,81,82,もしくは83番の金属、または原子番号14,34,もしくは52番の半導体のいずれかである上記(1)記載の微粒子の製作方法。
(4)前記微粒子を基板から剥離させる工程によって得られた微粒子懸濁液に0.01%から10%以下の3-aminopropyl trimethoxy silane、3-aminopropyl triethoxy silane、または、3-aminopropyl diethoxy methyl silaneのシランカップリング剤を加えることにより、前記微粒子表面にアミノ基を導入する上記(1)記載の微粒子の製作方法。
(5)前記微粒子を基板から剥離させる工程によって得られた微粒子懸濁液に0.01%から10%以下の3-mercaptopropyl trimethoxy silaneのシランカップリング剤を加えることにより、前記微粒子表面にチオール基を導入する上記(1)記載の微粒子の製作方法。
(6)一面に金の薄膜を形成された基板、シリコン基板、または、ガラス基板を準備する工程、
所定の直径のポリスチレン製微粒子、SiO2製微粒子、または、TiO2製微粒子、適量の純水、および、前記微粒子間の静電反発力を抑制するための材料を混合して、前記基板上で前記微粒子が高密度に分布できる濃度となるように懸濁した微粒子懸濁液を準備する工程、
前記微粒子懸濁液を前記基板の上に滴下して前記基板上に前記微粒子を高密度に分布させる工程、
前記基板上に分布された前記微粒子に遷移金属、金属または半導体を少なくとも1層蒸着させる工程、
前記遷移金属、金属または半導体を少なくとも1層蒸着された前記微粒子を有する前記基板の周辺に3-aminoprophyl trimethoxy silane、3-aminoprophyl triethoxy silane、または、3-aminoprophyl diethoxy methyl silaneのシランカップリング剤の液滴を滴下し、窒素またはアルゴン雰囲気容器内に密封し、気相中でシランカップリング剤分子を前記微粒子表面に吸着させることにより前記微粒子の表面にアミノ基を導入する工程、
前記基板上に単層固定され、蒸着を済ませた前記微粒子上に微量の純水を滴下した後、前記基板の他面に超音波を作用させながら、前記単層固定された前記微粒子の上の面に平坦な底面を有する素材を該底面に加重がかかる様に載置して任意の方向に移動させることにより前記微粒子を基板から剥離させる工程、
を含む、遷移金属、金属または半導体で修飾された微粒子の製作方法。
(7)前記3-aminoprophyl trimethoxy silane、3-aminoprophyl triethoxy silane、または、3-aminoprophyl diethoxy methyl silaneのシランカップリング剤に代えて3-mercaptopropyl trimethoxy silaneのシランカップリング剤の液滴を滴下し、窒素またはアルゴン雰囲気容器内に密封し、気相中でシランカップリング剤分子を微粒子表面に吸着させることにより前記微粒子表面にチオール基を導入する上記(6)記載の微粒子の製作方法。
(8)前記微粒子の表面にアミノ基を導入した後、0.1mg〜1g/mLのSulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP)、あるいは、Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC)等のアミノ基とチオール基を架橋させる2架性架橋剤を用いて活性化した後、3’もしくは5’いずれかの末端にチオール基を導入したDNAもしくはRNA、チオール基を有する抗体等のタンパク質を反応させて前記微粒子表面に生体機能分子を固定化する上記(1)記載の微粒子の製作方法。
(9)前記微粒子の表面にチオール基を導入した後、0.1mg〜1g/mLのSulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP)、あるいは、Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC)等のチオール基とアミノ基を架橋させる2架性架橋剤を用いて活性化した後、3’もしくは5’いずれかの末端にアミノ基を導入したDNAもしくはRNA、アミノ基を有する抗体等のタンパク質を反応させて微粒子表面に生体機能分子を固定化する上記(1)記載の微粒子の製作方法。
(10)前記2架性架橋剤が先に生体機能分子と反応させた後に前記微粒子と反応させられる上記(8)または(9)記載の微粒子の製作方法。
(11)前記微粒子の表面にアミノ基を導入した後、0.1mg〜1g/mLのSulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP)、あるいは、Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC)等のアミノ基とチオール基を架橋させる2架性架橋剤を用いて活性化した後、3’もしくは5’いずれかの末端にチオール基を導入したDNAもしくはRNA、チオール基を有する抗体等のタンパク質を反応させて前記微粒子表面に生体機能分子を固定化する上記(6)記載の微粒子の製作方法。
(12)前記微粒子の表面にチオール基を導入した後、0.1mg〜1g/mLのSulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP)、あるいは、Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC)等のチオール基とアミノ基を架橋させる2架性架橋剤を用いて活性化した後、3’もしくは5’いずれかの末端にアミノ基を導入したDNAもしくはRNA、アミノ基を有する抗体等のタンパク質を反応させて微粒子表面に生体機能分子を固定化する上記(7)記載の微粒子の製作方法。
(13)前記2架性架橋剤が先に生体機能分子と反応させた後に前記微粒子と反応させられる上記(11)または(12)記載の微粒子の製作方法。
(14)所定の直径のポリスチレン製微粒子、SiO2製微粒子、または、TiO2製微粒子の表面が遷移金属、金属または半導体で修飾される微粒子を利用するとともに、観察対象のチップ表面のプローブ固定領域に固着されている多数のプローブにDNA、mRNA、またはタンパク質を含む標的分子が結合し、該標的分子を前記微粒子表面の生体機能分子を介して標識している前記微粒子、および、前記観察対象のチップのプローブ固定領域の表面とは分離された位置に設けられた比較用の前記微粒子とを、同時に電子線で走査して得られる前記微粒子の電子線走査による反射電子線画像を得ること、
前記標識している前記微粒子の反射電子線画像の明るさから、前記微粒子表面を修飾している素材を決定して前記DNA、mRNA、またはタンパク質を含む標的分子を特定することを特徴とする生体物質の検査法。
(15)前記比較用の前記微粒子の反射電子線画像と前記標識している前記微粒子の反射電子線画像との対比によって前記微粒子表面を修飾している素材を決定して前記DNA、mRNA、またはタンパク質を含む標的分子を特定する上記(14)記載の生体物質の検査法。
(16)前記電子線で走査して得られる前記微粒子の電子線走査による反射電子線画像に加えて、電子線で走査して得られる2次電子から2次電子線画像を得て、反射電子線画像の前記微粒子の位置を特定する上記(14)記載の生体物質の検査法。
(17)前記電子線で走査して得られる前記微粒子の電子線走査による反射電子線画像、電子線で走査して得られる2次電子から2次電子線画像に加えて、電子線で走査して得られる前記微粒子の表面を修飾している素材の元素スペクトル像を得て、前記微粒子の組成元素を特定する上記(14)記載の生体物質の検査法。
(18)前記電子線で走査して得られる前記微粒子の表面を修飾している素材の元素スペクトル像に代えて、前記微粒子の表面を修飾している素材の元素マッピング像を得て、前記微粒子の組成元素を特定する上記(14)記載の生体物質の検査法。
(1)原子番号43番を除く79番までの遷移金属、
(2)原子番号13,31,32,33,49,50,51,81,82,83番の金属、および
(3)原子番号14,34,52番の半導体
である。
Claims (18)
- 一面に金の薄膜を形成された基板、シリコン基板、または、ガラス基板を準備する工程、
所定の直径のポリスチレン製微粒子、SiO2製微粒子、または、TiO2製微粒子、適量の純水、および、前記微粒子間の静電反発力を抑制するための材料を混合して、前記基板上で前記微粒子が高密度に分布できる濃度となるように懸濁した微粒子懸濁液を準備する工程、
前記微粒子懸濁液を前記基板の上に滴下して前記基板上に前記微粒子を高密度に分布させる工程、
基板上に吸着していない過剰量の微粒子を洗浄除去し、基板上に分布された微粒子を乾燥させる工程、
前記基板上に分布された前記微粒子に遷移金属、金属または半導体を少なくとも1層蒸着させる工程、
前記遷移金属、金属または半導体を少なくとも1層蒸着された前記微粒子に、蒸着または昇華によりSiO2を1層形成させる工程、
前記基板上に固定され、前記蒸着を済ませた前記微粒子上に、微量の純水、または、該純水にタンパク質として牛血清アルブミン(bovine serum albumin (BSA))、緩衝液としてクエン酸バッファー(standard sodium citrate (SSC))もしくはリン酸塩バッファー(phosphate buffer)、および界面活性剤として硫酸ドデシルナトリウム(sodium dodecyl sulfate (SDS))もしくはタンニン酸(tannic acid)を加えた微量の液体を滴下する工程、ならびに
前記基板の他面に超音波を作用させながら、前記微粒子が固定された前記一面側に平坦な底面を有する素材を該底面に若干加重が加わる様に載置して、該素材を任意の方向に移動させることにより前記微粒子を前記基板から剥離させる工程、
を含む、遷移金属、金属または半導体で修飾された微粒子の製作方法。 - 前記微粒子間の静電反発力を抑制するための材料が1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride、NaCl、または、KClである請求項1記載の微粒子の製作方法。
- 前記遷移金属、金属または半導体が、周期律表で原子番号43番を除く79番までの遷移金属、原子番号13,31,32,33,49,50,51,81,82,もしくは83番の金属、または原子番号14,34,もしくは52番の半導体のいずれかである請求項1記載の微粒子の製作方法。
- 前記微粒子を基板から剥離させる工程によって得られた微粒子懸濁液に0.01%から10%以下の3-aminopropyl trimethoxy silane、3-aminopropyl triethoxy silane、または、3-aminopropyl diethoxy methyl silaneのシランカップリング剤を加えることにより、前記微粒子表面にアミノ基を導入する請求項1記載の微粒子の製作方法。
- 前記微粒子を基板から剥離させる工程によって得られた微粒子懸濁液に0.01%から10%以下の3-mercaptopropyl trimethoxy silaneのシランカップリング剤を加えることにより、前記微粒子表面にチオール基を導入する請求項1記載の微粒子の製作方法。
- 一面に金の薄膜を形成された基板、シリコン基板、または、ガラス基板を準備する工程、
所定の直径のポリスチレン製微粒子、SiO2製微粒子、または、TiO2製微粒子、適量の純水、および、前記微粒子間の静電反発力を抑制するための材料を混合して、前記基板上で前記微粒子が高密度に分布できる濃度となるように懸濁した微粒子懸濁液を準備する工程、
前記微粒子懸濁液を前記基板の上に滴下して前記基板上に前記微粒子を高密度に分布させる工程、
前記基板上に分布された前記微粒子に遷移金属、金属または半導体を少なくとも1層蒸着させる工程、
前記遷移金属、金属または半導体を少なくとも1層蒸着された前記微粒子を有する前記基板の周辺に3-aminoprophyl trimethoxy silane、3-aminoprophyl triethoxy silane、または、3-aminoprophyl diethoxy methyl silaneのシランカップリング剤の液滴を滴下し、窒素またはアルゴン雰囲気容器内に密封し、気相中でシランカップリング剤分子を前記微粒子表面に吸着させることにより前記微粒子の表面にアミノ基を導入する工程、
前記基板上に単層固定され、蒸着を済ませた前記微粒子上に微量の純水を滴下した後、前記基板の他面に超音波を作用させながら、前記単層固定された前記微粒子の上の面に平坦な底面を有する素材を該底面に加重がかかる様に載置して任意の方向に移動させることにより前記微粒子を基板から剥離させる工程、
を含む、遷移金属、金属または半導体で修飾された微粒子の製作方法。 - 前記3-aminoprophyl trimethoxy silane、3-aminoprophyl triethoxy silane、または、3-aminoprophyl diethoxy methyl silaneのシランカップリング剤に代えて3-mercaptopropyl trimethoxy silaneのシランカップリング剤の液滴を滴下し、窒素またはアルゴン雰囲気容器内に密封し、気相中でシランカップリング剤分子を微粒子表面に吸着させることにより前記微粒子表面にチオール基を導入する請求項6記載の微粒子の製作方法。
- 前記微粒子の表面にアミノ基を導入した後、0.1mg〜1g/mLのSulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP)、あるいは、Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC)等のアミノ基とチオール基を架橋させる2架性架橋剤を用いて活性化した後、3’もしくは5’いずれかの末端にチオール基を導入したDNAもしくはRNA、チオール基を有する抗体等のタンパク質を反応させて前記微粒子表面に生体機能分子を固定化する請求項1記載の微粒子の製作方法。
- 前記微粒子の表面にチオール基を導入した後、0.1mg〜1g/mLのSulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP)、あるいは、Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC)等のチオール基とアミノ基を架橋させる2架性架橋剤を用いて活性化した後、3’もしくは5’いずれかの末端にアミノ基を導入したDNAもしくはRNA、アミノ基を有する抗体等のタンパク質を反応させて微粒子表面に生体機能分子を固定化する請求項1記載の微粒子の製作方法。
- 前記2架性架橋剤が先に生体機能分子と反応させた後に前記微粒子と反応させられる請求項8または9記載の微粒子の製作方法。
- 前記微粒子の表面にアミノ基を導入した後、0.1mg〜1g/mLのSulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP)、あるいは、Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC)等のアミノ基とチオール基を架橋させる2架性架橋剤を用いて活性化した後、3’もしくは5’いずれかの末端にチオール基を導入したDNAもしくはRNA、チオール基を有する抗体等のタンパク質を反応させて前記微粒子表面に生体機能分子を固定化する請求項6記載の微粒子の製作方法。
- 前記微粒子の表面にチオール基を導入した後、0.1mg〜1g/mLのSulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido) hexanoate (Sulfo-LC-SPDP)、あるいは、Sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC)等のチオール基とアミノ基を架橋させる2架性架橋剤を用いて活性化した後、3’もしくは5’いずれかの末端にアミノ基を導入したDNAもしくはRNA、アミノ基を有する抗体等のタンパク質を反応させて微粒子表面に生体機能分子を固定化する請求項7記載の微粒子の製作方法。
- 前記2架性架橋剤が先に生体機能分子と反応させた後に前記微粒子と反応させられる請求項11または12記載の微粒子の製作方法。
- 所定の直径のポリスチレン製微粒子、SiO2製微粒子、または、TiO2製微粒子の表面が遷移金属、金属または半導体で修飾される微粒子を利用するとともに、観察対象のチップ表面のプローブ固定領域に固着されている多数のプローブにDNA、mRNA、またはタンパク質を含む標的分子が結合し、該標的分子を前記微粒子表面の生体機能分子を介して標識している前記微粒子、および、前記観察対象のチップのプローブ固定領域の表面とは分離された位置に設けられた比較用の前記微粒子とを、同時に電子線で走査して得られる前記微粒子の電子線走査による反射電子線画像を得ること、
前記標識している前記微粒子の反射電子線画像の明るさから、前記微粒子表面を修飾している素材を決定して前記DNA、mRNA、またはタンパク質を含む標的分子を特定することを特徴とする生体物質の検査法。 - 前記比較用の前記微粒子の反射電子線画像と前記標識している前記微粒子の反射電子線画像との対比によって前記微粒子表面を修飾している素材を決定して前記DNA、mRNA、またはタンパク質を含む標的分子を特定する請求項14記載の生体物質の検査法。
- 前記電子線で走査して得られる前記微粒子の電子線走査による反射電子線画像に加えて、電子線で走査して得られる2次電子から2次電子線画像を得て、反射電子線画像の前記微粒子の位置を特定する請求項14記載の生体物質の検査法。
- 前記電子線で走査して得られる前記微粒子の電子線走査による反射電子線画像、電子線で走査して得られる2次電子から2次電子線画像に加えて、電子線で走査して得られる前記微粒子の表面を修飾している素材の元素スペクトル像を得て、前記微粒子の組成元素を特定する請求項14記載の生体物質の検査法。
- 前記電子線で走査して得られる前記微粒子の表面を修飾している素材の元素スペクトル像に代えて、前記微粒子の表面を修飾している素材の元素マッピング像を得て、前記微粒子の組成元素を特定する請求項14記載の生体物質の検査法。
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