CN116794296A - 检测水解配方食品致敏性的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测水解配方食品致敏性的方法和试剂盒。所述方法使用竞争ELISA方法检测选自如下之一的β‑乳球蛋白表位肽：具有氨基酸序列CAQKKIIAEKTKIPAVFKIDA的表位肽、具有氨基酸序列KALKALPMHIRLSFN的表位肽。本发明可以准确地、定性或定量地检测各种水解配方食品例如不同水解程度的配方食品致敏性，能够检测出低达μg/g含量、甚至更低的极低含量的β‑乳球蛋白表位肽含量。

Description

检测水解配方食品致敏性的方法和试剂盒
技术领域
本发明总体上涉及食品检测领域。具体地，本发明涉及检测水解配方食品致敏性的方法和试剂盒。
背景技术
据报道，目前有0.6-3%的6岁以下儿童及婴幼儿患有牛奶过敏。牛奶过敏不仅导致婴幼儿没有充足的营养供应，影响身体发育，而且极易引发各种慢性疾病如哮喘等，严重影响婴幼儿的健康成长。由于婴幼儿没有其它更多的营养来源，而牛奶过敏在医学上尚没有安全有效的根治手段，鉴于婴幼儿较高的牛乳蛋白过敏症状发生率和少年儿童由于日益增长的牛乳摄入而引发的牛乳过敏问题，研发低敏性的奶粉，保障牛奶过敏婴幼儿的营养需求，具有重要的经济价值和社会意义。
利用水解蛋白是获得低敏配方的最好方法，即对蛋白结构进行修饰从而大大减少具有抗原活性物质的量。目前，根据水解的程度，水解蛋白配方分为两种，一种是适度水解蛋白配方(Partially Hydrolyzed Formula，PHF)，又称为部分水解配方；另外一种是完全水解蛋白配方(Extensively Hydrolyzed Formula，EHF)，又称为深度水解配方。完全水解配方是将牛乳蛋白通过加热、超滤、水解等特殊工艺降低蛋白质成分的抗原性，使其终产物大多为二肽、三肽和少量的游离氨基酸。过敏原独特型表位的空间构象和序列大大减少，显著降低了抗原性。完全水解配方已显示能有效地降低牛乳蛋白过敏的发生，并被推荐用于牛乳蛋白过敏婴儿的治疗。研究证明完全水解配方与氨基酸配方对特应性皮炎的治疗效果相似，完全水解蛋白配方与氨基酸配方都能支持婴儿正常的生长发育。
同时在产品开发过程中，最重要的工作之一是如何对源头产品原料、低敏产品进行致敏性检测。目前市场上常见的牛奶蛋白过敏原检测方法是以试剂盒进行检测，然而由于不是从婴儿过敏原表位出发进行研制，导致其检出限值很高，无法准确进行过敏原检测；并且深度水解配方由于残留的过敏原表位肽段较小，受空间位阻影响无法同时与两种抗体结合，因此需要开发只使用一种抗体的竞争酶联免疫方法进行检测。
发明内容
鉴于现有技术中的以上问题，本发明的一个目的是提供一种通过只使用一种抗体的竞争酶联免疫方法来检测水解配方食品致敏性的方法。
本发明的另一目的是提供一种检测深度水解配方食品致敏性的试剂盒。
发明人发现，水解配方食品、例如部分水解配方食品或深度水解配方食品、尤其是深度水解配方奶粉、特别是婴幼儿配方奶粉中残留的过敏原主要包括β-乳球蛋白表位肽段，不同的制备工艺将导致残留的β-乳球蛋白表位肽段不同。发明人还发现，虽然不同的水解配方食品的制备工艺不同，但是在所得到的水解配方食品中源自β-乳球蛋白的一些特定表位肽段由于其稳定性较高而残留。即，通过不同的制备工艺制备的水解配方食品中会含有相同的β-乳球蛋白表位肽段。通过采用竞争ELISA (酶联免疫吸附测定)检测这些特定表位肽段，可以准确地、定性或定量地检测各种水解配方食品例如不同水解程度的配方食品致敏性，能够检测出低达μg/g含量、甚至更低的极低含量的β-乳球蛋白表位肽含量。
特别地，本发明通过如下实现：
1. 检测水解配方食品致敏性的方法，其中使用竞争ELISA方法检测选自如下之一的β-乳球蛋白表位肽：
具有氨基酸序列KPTPEGDLEILLQK的表位肽，称作BLG-2，
具有氨基酸序列CAQKKIIAEKTKIPAVFKIDA的表位肽，称作BLG-3，
具有氨基酸序列KALKALPMHIRLSFN的表位肽，称作BLG-4。
2. 如条目1所述的方法，其中所述β-乳球蛋白表位肽为BLG-3。
3. 如条目1-2任一项所述的方法，其中所述水解配方食品为部分水解配方食品或深度水解配方食品，例如配方奶粉、例如婴幼儿配方奶粉。
4. 如条目1-3任一项所述的方法，其中所述检测包括：
1)使用β-乳球蛋白包被酶标板，洗板，封闭，洗板，
2)将作为一抗的能特异性结合所述表位肽的抗体与待检测样品混合作为竞争体系并预孵育，加入所述酶标板中，孵育，洗板，
3)将能与所述抗体结合的酶标二抗加入所述酶标板中，孵育，洗板，
4)加入显色液进行显色反应，
5)加入终止液终止反应，测定波长450 nm和630 nm的吸光度(OD)值，
6)根据测得的吸光度值和标准曲线计算样品中的表位肽浓度。
5. 如条目4所述的方法，其中所述标准曲线通过如下建立：
1’)使用β-乳球蛋白包被酶标板，洗板，封闭，洗板，
2’)将作为一抗的所述能特异性结合所述表位肽的抗体与所述表位肽的标准品混合并预孵育，加入所述酶标板中，孵育，洗板，
3’)将能与所述抗体结合的所述酶标二抗加入所述酶标板中，孵育，洗板，
4’)加入显色液进行显色反应，
5’)加入终止液终止反应，测定波长450 nm和630 nm的吸光度(OD)值，
6’)计算竞争抑制率B/B0，其中B0为未加入竞争物时，即竞争物浓度为 0 μg/mL时的吸光度值，B为不同竞争物浓度下测得的吸光度值；以B/B0为纵坐标，相应表位肽标准品的浓度为横坐标，制作标准曲线。
6. 如条目4-5任一项所述的方法，其中所述能特异性结合所述表位肽的抗体是通过以所述表位肽为抗原，进行动物免疫制备多克隆抗血清而获得的。
7. 如条目6所述的方法，其中所述动物为小鼠例如Balb/c小鼠、或者兔。
8. 如条目4-5任一项所述的方法，其中所述酶标二抗为HRP-羊抗鼠IgG抗体、或者HRP-羊抗兔IgG抗体，优选HRP-羊抗鼠IgG抗体。
9. 如条目4-5任一项所述的方法，其中：
在步骤1)和1’)中，β-乳球蛋白以浓度为5-10μg/mL的包被溶液包被；和
在步骤2)和2’)中，
对于BLG-2，抗体稀释倍数为1250-5000、例如2500-5000并且酶标二抗稀释倍数为5000-20000、例如10000-20000；
对于BLG-3，抗体稀释倍数为40000-160000、例如40000-80000并且酶标二抗稀释倍数为2500-10000、例如5000-10000；
对于BLG-4，抗体稀释倍数为625-2500、例如1250-2500并且酶标二抗稀释倍数为5000-20000、例如10000-20000。
10. 如条目4-5任一项所述的方法，其中：
在步骤1)和1’)中，β-乳球蛋白以浓度为5μg/mL的包被溶液包被；和
在步骤2)和2’)中，
对于BLG-2，抗体稀释倍数为2500并且酶标二抗稀释倍数为10000；
对于BLG-3，抗体稀释倍数为80000并且酶标二抗稀释倍数为5000；
对于BLG-4，抗体稀释倍数为1250并且酶标二抗稀释倍数为10000。
11. 检测水解配方食品致敏性的试剂盒，该检测经由竞争ELISA方法进行，其中该试剂盒包括：
已经用β-乳球蛋白包被的酶标板；
选自如下的一种或多种的表位肽标准品：具有氨基酸序列KPTPEGDLEILLQK的表位肽，称作BLG-2；具有氨基酸序列CAQKKIIAEKTKIPAVFKIDA的表位肽；称作BLG-3；具有氨基酸序列KALKALPMHIRLSFN的表位肽，称作BLG-4；
相应的作为一抗的能特异性结合所述表位肽的检测抗体：
酶标二抗；
洗涤液；
提取液；
显色液；和
终止液。
12. 如条目11所述的试剂盒，其中所述竞争ELISA方法如条目2-10任一项中所定义。
附图说明
图1显示β-乳球蛋白的分子动力学模拟结果。
图2A-2D分别显示所合成的BLG-1、BLG-2、BLG-3和BLG-4表位肽段的质谱图。
图3A-3D分别显示β-乳球蛋白表位肽BLG-1、BLG-2、BLG-3和BLG-4的抗血清效价评估。
图4显示纯化抗体电泳图谱，其中各符号的含义如下：M：marker；1：BLG-1纯化抗体；2：BLG-2纯化抗体；3：BLG-3纯化抗体。
图5-7显示不同物种乳清蛋白SDS-PAGE结果和免疫印迹结果，其中A、C、E均表示5种乳清蛋白SDS-PAGE图，其中图中的各符号的含义如下：泳道M：Marker；泳道1：牛奶乳清蛋白；泳道2：羊奶乳清蛋白；泳道3：马奶乳清蛋白；泳道4：驴奶乳清蛋白；泳道5：驼奶乳清蛋白；泳道6：β-乳球蛋白；泳道7：α-乳白蛋白；B、D和F分别表示BLG-2、BLG-3和BLG-4对5种蛋白免疫印迹。
图8A-8C分别显示对于表位肽BLG-2、BLG-3和BLG-4建立的竞争ELISA标准曲线。
具体实施方式
如无特殊说明，本说明书中的科技术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
如本文所用，下列术语具有如下含义。
术语“婴儿”是指0～6月龄的人。
术语“较大婴儿”是指6～12月龄的人。
术语“幼儿”是指12～36月龄的人。
术语“婴幼儿”是指0-36个月龄的人。
术语“儿童”是指3-6岁年龄的人。
术语“少年”是指7-17岁年龄的人。
术语“成人”是指18岁年龄以上的人。
术语“青年人”是指18-40岁年龄的人。
术语“青少年”是指7-40岁年龄的人。
术语“中年人”是指41-65岁年龄的人。
术语“老人”或“老年人”指的是65岁年龄以上的人。
本文中使用的术语“婴幼儿配方食品”涵盖婴儿配方食品、较大婴儿配方食品和幼儿配方食品。通常，婴儿配方食品从婴儿出生起作为母乳替代品，较大婴儿配方食品是从婴儿出生后的6-12个月作为母乳替代品，幼儿配方食品指从婴儿出生后的12-36个月作为母乳替代品。
术语“婴儿配方食品”是指以乳类及乳蛋白制品或大豆及大豆蛋白制品为主要原料，加入适量维生素、矿物质和/或其它成分，仅用物理方法生产加工制成的液态或粉状产品。适用于正常婴儿食用，其能量和营养成分能够满足0-6个月婴儿的正常营养需要。
术语“较大婴儿配方食品”是指以乳类及乳蛋白制品或大豆及大豆蛋白制品为主要原料，加入适量维生素、矿物质和/或其它成分，仅用物理方法生产加工制成的液态或粉状产品。适用于较大婴儿食用，其能量和营养成分能够满足6-12个月正常较大婴儿的部分营养需要。
术语“幼儿配方食品”是指以乳类及乳蛋白制品或大豆及大豆蛋白制品为主要原料，加入适量维生素、矿物质和/或其它成分，仅用物理方法生产加工制成的液态或粉状产品。适用于幼儿食用，其能量和营养成分能够满足12-36个月正常幼儿的部分营养需要。
术语“母乳”应理解为母亲的母乳或初乳。
术语“完全用母乳喂养的婴儿或幼儿”具有通常的含义，指绝大部分营养物质和/或能量源于人类母乳的婴儿。
术语“主要用婴幼儿配方食品喂养的婴儿/较大婴儿/幼儿”具有通常的含义，指营养物质和/或能量的营养源主要源于物理方法生产加工制成的婴幼儿配方食品、较大婴儿乳或成长乳的婴儿或幼儿。术语“主要”是指至少50％、例如至少75％的那些营养物质和/或能量。
术语“乳蛋白水解配方奶粉”或“水解配方奶粉”：在我国乳蛋白水解配方奶粉分为三种：部分水解配方、深度水解配方和氨基酸配方。这三种配方奶粉都是属于特殊医学用途婴儿配方食品。
术语“部分水解配方食品”指的是将牛奶蛋白经过加热和(或)酶水解为易消化的小分子乳蛋白、肽段和氨基酸，以降低大分子牛奶蛋白的致敏性，提高消化率。
术语“深度水解配方”指的是通过加热、超滤、水解等一定的特殊工艺将易引起过敏反应的大分子乳蛋白水解成二肽、三肽等短肽及游离氨基酸，降低蛋白质成分的抗原性。
术语“氨基酸配方食品”是直接由单体氨基酸代替蛋白质。
术语“特殊医学用途婴儿配方食品”是专门针对患有特殊紊乱、疾病或医疗状况等特殊医学状况婴儿的营养需求而设计制成的配方食品。我国特殊医学用途婴儿配方食品的食品安全标准规定，其配方要以医学和营养学的研究结果为依据，其安全性、营养充足性以及临床效果均需要经过科学证实。
另外，在本发明的上下文中，术语“包含”或“包括”不排除其它可能的要素。本发明的组合物(包括本文所述的多个实施方式)可包含下列要素、由下列要素组成或基本上由下列要素组成：本文所述的本发明的基本要素和必要限制，以及本文所述的或另外视需求而定的任何其它或任选的成分、组分或限制。
本发明所述个体适用于正常人类，可以是婴儿和/或较大婴儿、和/或幼儿、和/或儿童、和/或青年人、和/或中年人、和/或老年人。
除非另外指明，否则所有百分比均按质量计。
现在开始更详细描述本发明。应当注意，本申请描述的各个方面、特征、实施方式、实施例以及其优点可以相容和/或可以组合在一起。
本发明涉及检测水解配方食品致敏性的方法以及试剂盒。
以下将对本发明进行具体说明。
检测水解配方食品致敏性的方法
在一个方面中，本发明涉及检测水解配方食品致敏性的方法，其中使用竞争ELISA方法检测选自如下之一的β-乳球蛋白表位肽：
具有氨基酸序列KPTPEGDLEILLQK的表位肽，称作BLG-2，
具有氨基酸序列CAQKKIIAEKTKIPAVFKIDA的表位肽，称作BLG-3，
具有氨基酸序列KALKALPMHIRLSFN的表位肽，称作BLG-4。
在一种实施方式中，所述β-乳球蛋白表位肽为BLG-3。
如无特别说明，本申请中对于氨基酸序列所使用的英文字符具有本领域中的常用含义，该对应关系示于下文中。
在一种实施方式中，所述水解配方食品为部分水解配方食品或深度水解配方食品。
在一种实施方式中，所述水解配方食品为深度水解配方食品。
在一种实施方式中，所述水解配方食品为(水解)配方奶粉、例如(水解)婴幼儿配方奶粉(例如婴儿配方奶粉、幼儿配方奶粉)。因此，在一种优选实施方式中，所述水解配方食品为深度水解婴幼儿配方奶粉。
在一种实施方式中，所述方法包括通过如下检测水解配方食品中过敏原含量：
1)使用β-乳球蛋白包被酶标板，洗板，封闭，洗板，
2)将能特异性结合所述表位肽的抗体与待检测样品混合作为竞争体系并预孵育，加入所述酶标板中，孵育，洗板，
3)将能与所述抗体结合的酶标二抗加入所述酶标板中，孵育，洗板，
4)加入显色液进行显色反应，
5)加入终止液终止反应，测定波长450 nm和630 nm的吸光度(OD)值，
6)根据测得的吸光度值和标准曲线计算样品中的表位肽浓度。
在一种实施方式中，所述标准曲线通过如下建立：
1’)使用β-乳球蛋白包被酶标板，洗板，封闭，洗板，
2’)将所述能特异性结合所述表位肽的抗体与所述表位肽的标准品混合并预孵育，加入所述酶标板中，孵育，洗板，
3’)将能与所述抗体结合的所述酶标二抗加入所述酶标板中，孵育，洗板，
4’)加入显色液进行显色反应，
5’)加入终止液终止反应，测定波长450 nm和630 nm的吸光度(OD)值，
6’)计算竞争抑制率B/B0，其中B0为未加入竞争物时，即竞争物浓度为 0 μg/mL时的吸光度值，B为不同竞争物浓度下测得的吸光度值；以B/B0为纵坐标，相应表位肽标准品的浓度为横坐标，制作标准曲线。
在一种实施方式中，在步骤1)和1’)中，将β-乳球蛋白使用合适的缓冲液例如CBS缓冲液配置成β-乳球蛋白溶液来包被。
在一种实施方式中，在步骤1)和1’)中，β-乳球蛋白溶液的包被浓度(工作浓度)可以由本领域技术人员合理地确定，例如可以各自独立地设置为(相同或不同的)1-20、例如5-10μg/mL，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/mL、或者由其任意两者所限定的范围。
在一种实施方式中，在步骤1)和1’)中，所述酶标板可以各自独立地为(相同或不同的)本领域中常用的任何酶标板，例如聚苯乙烯材料的酶标板。
在一种实施方式中，以上各步骤中的洗板操作可各自独立地使用(相同或不同的)合适的缓冲液例如PBST缓冲液进行，并且可进行一次或多次，例如3-5次。
在一种实施方式中，以上各步骤中的封闭操作可各自独立地使用(相同或不同的)合适的封闭剂例如OVA (卵清蛋白)，例如含有合适的封闭剂例如OVA (卵清蛋白)的缓冲液例如PBST缓冲液进行。
在一种实施方式中，在步骤2)和2’)中，所述能特异性结合所述表位肽的抗体是通过分别以各表位肽作为抗原，进行动物免疫来制备多克隆抗血清而获得的。例如，可通过分别将各表位肽与载体蛋白例如常用的载体蛋白例如KLH (血蓝蛋白)、BSA (牛血清白蛋白)、OVA (卵清蛋白)等偶联制备成完全抗原，然后进行动物免疫来制备多克隆抗血清而获得。所述动物可以为例如小鼠例如Balb/c小鼠、兔等常用动物。所获得的抗血清可通过常用的分离纯化方法例如采用亲和层析柱进行分离而获得纯化的抗体。
在一种实施方式中，在以上步骤2)中，所述待检测样品可通过对水解配方食品用合适的提取液(例如CBS缓冲液)在能够有效地提取出水解配方食品中的抗原表位肽的条件下进行提取而制备。
在一种实施方式中，在以上步骤2’)中，所述表位肽标准品可为常规合成方法合成的，或者可商购获得的。
在一种实施方式中，在以上步骤2)和2’)中，所述抗体可以合适的稀释倍数使用。例如，BLG-2抗体稀释倍数可以选择为1250-20000，例如1250、2500、5000、10000、20000、或者由其任意两者所限定的范围，例如1250-5000、2500-5000例如2500；BLG-3抗体稀释倍数可以选择为20000-160000，例如20000、40000、80000、160000、或者由其任意两者所限定的范围，例如40000-160000、例如40000-80000、例如80000；BLG-4抗体稀释倍数可以选择为625-10000，例如625、1250、2500、5000、10000或者由其任意两者所限定的范围，例如625-2500、例如1250-2500、例如1250。
在一种实施方式中，在以上步骤3)和3’)中，分别对于各表位肽，酶标二抗稀释倍数可以选择为2500-40000，例如2500、5000、10000、20000、40000或者由其任意两者所限定的范围。例如，对于BLG-2，酶标二抗稀释倍数可以选择为5000-20000、例如10000-20000、例如10000；对于BLG-3，酶标二抗稀释倍数可以选择为2500-10000、例如5000-10000、例如5000；对于BLG-4，酶标二抗稀释倍数可以选择为5000-20000、例如10000-20000、例如10000。
在一种实施方式中，在步骤2)和2’)中，竞争体系可以以表位肽抗体：抗原或表位肽标准品各自独立地为2:1-10:1例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，例如4:1的体积比使用。
在一种实施方式中，以上各步骤中的预孵育操作和孵育操作可各自独立地在本领域中常用的孵育操作条件下进行。所述条件包括例如采用合适的温度例如37℃。
在一种实施方式中，在以上步骤3)和3’)中，所述酶标二抗中的酶可以为本领域中常用的任何标记酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)。
在一种实施方式中，所述酶标二抗可以为酶标羊抗鼠IgG抗体、或酶标羊抗兔IgG抗体等。
在一种实施方式中，所述酶标二抗可为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(HRP-羊抗鼠IgG抗体)、或者HRP标记的羊抗兔IgG抗体(HRP-羊抗兔IgG抗体)，优选HRP-羊抗鼠IgG抗体。
在一种实施方式中，在以上步骤4)和4’)中，所加入的显色液可根据所采用的酶标二抗中的酶而选择。例如，当标记酶为HRP时，可以采用TMB作为显色液。
显色反应可以在本领域中常用的条件下进行，条件是保证反应完全。
反应完成后加入终止液终止反应。所述终止液可根据所进行的显色反应而适当地选择并且没有特别限制。例如所述终止液可以为浓度1-2M H2SO4溶液。
根据所获得的吸光度值以及标准曲线获得目标分析物例如表位肽的浓度，这是本领域中的常用手段并且完全在本领域普通技术人员的能力范围内，在此不进行赘述。
在一种实施方式中，所述标准曲线是在包被蛋白的工作浓度、一抗的工作浓度和酶标二抗的最佳工作浓度下建立的。
在一种实施方式中，通过间接ELISA确定包被蛋白的工作浓度(包被浓度)、表位肽抗体的工作浓度(稀释倍数)和酶标二抗的工作浓度(稀释倍数)。包被蛋白的工作浓度、表位肽抗体的工作浓度和酶标二抗的工作浓度可以(例如在以上提及的范围内)适当地选择，而没有特别限制，条件是其使得最终测得的吸光度值在1.3附近(即，约1.3，例如，可以为1.3*(100%±20%)、1.3*(100%±15%)、或1.3*(100%±10%))。
例如，在一种实施方式中，包被蛋白的工作浓度为5μg/mL；BLG-2表位肽抗体稀释倍数为2500并且酶标二抗例如HRP-羊抗鼠二抗稀释倍数为10000，BLG-3表位肽抗体稀释倍数为80000并且酶标二抗例如HRP-羊抗鼠二抗稀释倍数为5000，BLG-3表位肽抗体稀释倍数为80000并且酶标二抗例如HRP-羊抗鼠二抗稀释倍数为5000。
申请人发现，本发明的检测方法适用于检测各种水解配方食品例如不同水解程度的配方食品(由β-乳球蛋白导致的)致敏性，并且能够检测出极低含量的β-乳球蛋白表位肽(例如BLG-2、BLG-3、和/或BLG-4)含量，其能够准确地检测出低达μg/g含量、甚至更低的β-乳球蛋白表位肽(例如BLG-2、BLG-3、和/或BLG-4)含量。
试剂盒
在另一方面中，本发明还涉及检测水解配方食品致敏性的试剂盒，该检测经由竞争ELISA方法进行，其中该试剂盒包括：
已经用β-乳球蛋白包被的酶标板，
选自如下的一种或多种的表位肽标准品：具有氨基酸序列KPTPEGDLEILLQK的表位肽，称作BLG-2；具有氨基酸序列CAQKKIIAEKTKIPAVFKIDA的表位肽；称作BLG-3；具有氨基酸序列KALKALPMHIRLSFN的表位肽，称作BLG-4；
相应的作为一抗的能特异性结合所述表位肽的检测抗体；
酶标二抗；
洗涤液；
提取液；
显色液；和
终止液。
以上关于方法的所有描述也均适用于此。
本发明的试剂盒适用于进行本发明的方法。本发明的试剂盒适用于检测各种水解配方食品例如不同水解程度的配方食品(由β-乳球蛋白导致的)致敏性，并且能够检测出极低含量的β-乳球蛋白表位肽(例如BLG-2、BLG-3、和/或BLG-4)含量，其能够准确地检测出低达μg/g含量、甚至更低的β-乳球蛋白表位肽(例如BLG-2、BLG-3、和/或BLG-4)含量。
实施例
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规的试剂、方法和设备。
实验试剂
KLH (血蓝蛋白)：北京索莱宝科技有限公司
CBS缓冲液，其通过如下配制：称量 0.575 g Na2CO3、1.46 g NaHCO3粉末，充分溶解于 450 mL 去离子水中，使用 6 M NaOH将酸碱度调至 9.6，定容至 500 mL。
α-乳白蛋白：美国Sigma-Aldrich公司(货号：L5385)
β-乳球蛋白：美国Sigma-Aldrich公司(货号：L3908)
PBS缓冲液(0.01 M，pH 7.4)，其通过如下配制：称取0.20 g KH2PO4、0.20 g KCl、2.90 g Na2HPO4·12H2O和 8.00 g NaCl溶于800 mL去离子水中，混合均匀后使用 6 M 盐酸将酸碱度调至7.4，定容至1000 mL。
PBST缓冲液，其通过如下配制：于上述PBS缓冲液中加入0.05%质量的 Tween-20充分溶解
OVA：北京索莱宝科技有限公司(货号：A8040)
抗体稀释液：洛阳佰奥通实验材料中心(货号：C060215)
HRP-羊抗鼠IgG二抗：北京索莱宝科技有限公司(货号：SE131)
TMB显色液：北京索莱宝科技有限公司(货号：PR1200)
2 M H2SO4：北京北方伟业计量技术研究院有限公司(货号：BWZ8118-2016)
结合缓冲液(buffer) (含0.15 M NaCl、20 mM Na2HPO4，pH 7.0)，其通过如下配制：称取8.78 g NaCl、2.84 g Na2HPO4溶于800 mL去离子水中，混合均匀后使用 6 M 盐酸将酸碱度调至7.0，定容至1000 mL。
0.1 M甘氨酸(pH 3.0)的缓冲液，其通过如下配制：称取7.51g 甘氨酸溶于800 mL去离子水中，混合均匀后使用 6 M 盐酸将酸碱度调至7.0，定容至1000 mL。
BCA试剂盒：北京索莱宝科技有限公司(货号：PC0020)
5 mg/mL的标品BSA：北京索莱宝科技有限公司(货号：PC0001)
聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：美国Thermo Fisher公司(货号：IB24002)
电泳染色液，其通过如下配制：于850 mL去离子水中加入100 mL乙酸、50 mL甲醇及 1 g考马斯亮蓝G-250，超声40 min左右使其完全溶解。
电泳脱色液，其通过如下配制：将超纯水、甲醇和乙酸以体积比为8：1：1的比例混合均匀。
Pierce ECL Western Blotting Substrate：美国Thermo Fisher公司(货号：32106)
实验设备
96孔ELISA板：美国Corning公司(货号：42592)
酶标仪：型号：Multiskcan MK3，生产厂家：芬兰Labsystems公司
Protein A/G亲和层析柱：北京索莱宝科技有限公司(货号：R8281)
SDS-PAGE电泳设备：型号：PHS-3C，生产厂家：美国Biorad公司
转膜仪：型号：iBlot 2，生产厂家：美国Thermo Fisher公司
凝胶成像仪：型号：Tanon-4200SF，生产厂家：上海天能科技有限公司
实验动物：
Balb/c小鼠：购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号 SCXK20190003
1. 乳清蛋白主要过敏原稳定性的分子动力学模拟
通过IEDB数据库结合文献中报导的表位，对乳清蛋白主要过敏原β-乳球蛋白的表位进行整理汇总，结果见表1。
在加工生产中，配方奶粉生产工艺主要包括：原料乳清粉验收→备料→酶解→加热灭酶→配料→均质→杀菌浓缩→喷雾干燥→流化床→筛粉→包装贴标→装箱入库。生产工艺中均质、杀菌浓缩以及喷雾干燥可能对蛋白质及其表位产生影响，主要影响因素为温度和压强。
因此，考察了温度和压强对β-乳球蛋白稳定性的影响，其中通过分子动力学模拟研究了β-乳球蛋白在工业上常用的不同加工温度和压力条件下进行加工(即热加工以及高压加工)后氨基酸变化情况。结果表明，经热加工以及高压加工后，β-乳球蛋白仍保持稳定的区域主要为LIVTQTMKGLDIQKV (记作BLG-1)、KPTPEGDLEILLQK (记作BLG-2)、CAQKKIIAEKTKIPAVFKIDA (记作BLG-3)、KALKALPMHIRLSFN (记作BLG-4)，结果见表2以及图1，其中图1显示β-乳球蛋白稳定性的分子动力学模拟结果。
其中表2中各氨基酸序列中所使用的英文字符含义如上文在“检测水解配方食品致敏性的方法”中所述。
2. 表位肽的合成及验证
通过F-moc固相合成上述的稳定表位肽，即β-乳球蛋白表位肽BLG-1、BLG-2、BLG-3、BLG-4。即将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸N端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，合成目的肽链，并在末端链接上一个半胱氨酸残基用于载体偶联，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得含半胱氨酸的目标多肽。
对合成的表位肽进行质谱分析，结果见图2A-图2D，其中图2A-2D分别显示β-乳球蛋白表位肽BLG-1、BLG-2、BLG-3和BLG-4的质谱图。质谱结果显示，合成的各表位肽和理论分子量符合，且质谱图显示无杂峰，合成肽的纯度大于95%。
3. 抗表位肽抗鼠血清的制备与效价评估
3.1 抗血清的制备
用m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)活化10 mg血蓝蛋白(KLH)，形成MBS/KLH连接物，然后在中性pH环境下，MBS/KLH与含半胱氨酸的BLG-1至BLG-4交联，形成多肽-KLH共价复合物，即将合成的多肽BLG-1至BLG-4分别偶联至KLH上，进行小鼠免疫。选用6周龄左右的Balb/c小鼠，首次免疫为背部皮内多点注射，加强免疫为腹腔注射方式，免疫剂量均为50 μg/100 μL。在第0天进行首次免疫，第28天、42天、47天、54天共进行四次加强免疫，第64天终取血，由此获得各表位肽的多克隆抗血清。
3.2 抗血清的效价评估
通过间接ELISA法对鼠多克隆抗血清的效价评估。用CBS缓冲液配制5 μg/mL β-乳球蛋白溶液，于96孔ELISA板中每孔加入100 μL，于4 ℃下过夜包被，取出后用PBST缓冲液以300 μL每孔洗涤 3 次，5 min/次(每次孵育后都要洗板3次，不再重复)。每孔加入150 μl含1% OVA的PBST缓冲液封闭，于37 ℃下孵育2 h，取出后洗板1次。将β-乳球蛋白鼠多克隆抗血清用抗体稀释液稀释50000倍，然后以2倍梯度向下稀释；阴性孔加最小稀释倍数的阴性血清；空白孔加抗体稀释液。以每孔100 μL加入96孔酶标板，于37 ℃条件下孵育1.5 h，取出后洗板5次。洗板后每孔加入100 μL稀释10000倍的HRP-羊抗鼠IgG二抗，于37 ℃下孵育40 min后，取出洗板5次。洗板后每孔加入100 μL TMB显色液，37℃避光孵育10 min；取出后立刻在每孔加入50 μL 2 M H2SO4终止反应，利用酶标仪测定波长450 nm下的吸光值。阳性与阴性吸光值之比大于2.1的最大稀释倍数的倒数，即为该抗血清的效价。
β-乳球蛋白表位肽BLG-1至BLG-4的鼠抗血清效价的测定结果见图3A-3D。图3A-3D表明，BLG-1的5只鼠血清的效价最高为400，其效价太低无法满足建立检测方法的需求，另外三个表位肽(BLG-2、BLG-3、BLG-4)鼠抗血清效价较高，均达到了106，因此后期选用BLG-2、BLG-3、BLG-4抗血清纯化得到的IgG抗体建立检测方法。其中BLG-2鼠抗血清效价最高达到160w，选用效价最高的4号鼠血清纯化备用；BLG-3鼠抗血清效价最高效价大于640w，选用效价最高的1号鼠血清纯化备用; BLG-4鼠抗血清效价最高达到160w，选用效价最高的4号鼠血清纯化备用。
4. 表位肽多克隆抗体的纯化及表征
4.1 血清(抗体)的纯化
血清中含有很多复杂的成分，可能会影响后续实验的结果，因此需采用ProteinA/G亲和层析柱对血清进行纯化。将少量的血清与等体积的结合缓冲液(0.15 M NaCl，20mM Na2HPO4，pH 7.0)混合，于亲和层析柱上上样。该亲和层析柱须预先用结合缓冲液平衡好。之后依次用 0.15 M NaCl，20 mM Na2HPO4的缓冲液(pH 7.0)流洗，0.1 M甘氨酸的缓冲液(pH 3.0)洗脱。使用PBS缓冲液(0.01 M，pH 7.4)在4 ℃条件下过夜透析洗脱液，混匀后分装冻于-80 ℃长期保存，最终获得纯化后的鼠表位肽BLG-2、BLG-3、BLG-4各自的IgG抗体。
4.2抗体纯度评估
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法对纯化后抗体的纯度进行评估。将抗体配制为1 mg/mL浓度并与4×变性电泳上样缓冲液(含DTT)以3：1(v/v)混合，将混合物在100 ℃下煮沸 7 min。采用分离度为12%的SurePAGE蛋白电泳预制胶(金斯瑞生物科技股份有限公司，货号：M00668)进行电泳，每个样品分别上样10 μL。整个电泳过程在120 V下进行，持续1 h左右。当蛋白Marker迁移至距离胶底部0.5 cm处时，关掉仪器，将胶剥离出来后用去离子水洗净。使用电泳染色液对凝胶染色，先放入微波炉中加热1 min(高火)，之后于室温下晃动5 min。染色完成后，倒掉染色液，用去离子水将胶洗净，用配制好的脱色液反复进行脱色，直至背景透明后使用凝胶成像仪捕获图像。
得到的SDS-PAGE结果如图4所示。结果表明，各表位肽的纯化的IgG的分子量为150kDa左右，由重链(H链)和轻链(L链)组成，其中重链约50 kDa，轻链约25 kDa。由电泳结果可以看出，对血清纯化后，表位肽多克隆抗体的纯度是很高的，完全符合之后ELISA实验的要求。
4.3 抗体保存浓度测定
将纯化后的抗体用甘油1：1稀释，之后可于-20 ℃长期保存。
使用BCA试剂盒测定纯化抗体的浓度。
采用试剂盒配套的PBS缓冲液将5 mg/mL的标品BSA稀释成终浓度为0.5 mg/mL的标准品，并配制0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL标准曲线各浓度点所需溶液，分别加入到96孔板中，每个浓度点设置3个平行。
将待测样品溶液作不同梯度稀释，分别加入到96孔板中(3个平行)。以BCA工作液：Cu试剂(试剂盒自带)为50：1的体积比配制显色液，每孔加入200 μL显色液后37 ℃孵育20min后，采用酶标仪检测562 nm处的吸光度值，计算3个平行的平均值。以标准品浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线，代入标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。BCA试剂盒测定纯化后BLG-2、BLG-3和BLG-4甘油保存抗体的蛋白浓度分别为0.96 mg/mL、0.39 mg/mL、0.73 mg/mL。
4.4 抗体的特异性评估
通过蛋白质免疫印迹实验(即WB实验)评估三株纯化抗体对于β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的特异性，同时评估与其它不同物种乳清蛋白(牛奶乳清蛋白、羊奶乳清蛋白、马奶乳清蛋白、驴奶乳清蛋白、驼奶乳清蛋白)的交叉反应性。
将牛奶乳清蛋白、羊奶乳清蛋白、马奶乳清蛋白、驴奶乳清蛋白、驼奶乳清蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白分别通过SDS-PAGE进行电泳，在电泳完成后将蛋白凝胶放到 iBlot2转膜仪上，设置转膜条件为20 V，1.5 min，可以将电泳凝胶中的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转膜完成后将其置于孵育盒中，加入封闭液(OVA质量比例为1%的PBST溶液)，于常温摇床中孵育2 h；用PBST缓冲液清洗3次后，加入30 mL稀释的表位肽抗体(BLG-2抗体稀释500倍，BLG-3稀释10000倍，BLG-4稀释250倍)室温摇床孵育1 h，PBST缓冲液洗涤，加入30 mL稀释1万倍的羊抗鼠IgG-HRP二抗，室温摇床孵育1 h，PBST缓冲液洗涤5次，避光1：1配制(TMB)显色液，均匀浸润整张PVDF膜，暗处孵育1 min，使用凝胶成像仪进行图像采集，曝光10 s~600 s，收集100张图像进行分析。
结果见图5-7。图5-7显示SDS-PAGE结果和免疫印迹结果，其中A、C、E均表示5种乳清蛋白SDS-PAGE图，其中各符号的含义如下：泳道M：Marker；泳道1：牛奶乳清蛋白；泳道2：羊奶乳清蛋白；泳道3：马奶乳清蛋白；泳道4：驴奶乳清蛋白；泳道5：驼奶乳清蛋白；泳道6：β-乳球蛋白；泳道7：α-乳白蛋白；B、D和F分别表示BLG-2、BLG-3和BLG-4对5种蛋白免疫印迹。
结果表明，纯化的抗体与牛奶β-乳球蛋白有着较高的结合力，只有BLG-3抗体与羊奶乳清蛋白有微弱结合，与其它物种不结合。
5. 竞争ELISA法检测水解产品中过敏原含量结果
5.1 竞争ELISA基本检测程序的确定
用CBS缓冲液配制一定浓度的β-乳球蛋白溶液，于96孔酶标板中每孔加入100 μL，于4℃下过夜包被后用PBST缓冲液以每孔300 μL洗涤 3 次，(之后的洗涤步骤与此步骤完全相同)。每孔加入150 μl 含1% OVA的PBST缓冲液封闭，于37 ℃下孵育2 h，取出后洗板1次。板外竞争体系以表位肽抗体：抗原为4：1的体积比例进行预孵育20 min，然后将反应后的竞争体系以每孔100 μL加入β-乳球蛋白预包板中，于37 ℃条件下孵育1.5 h，取出后洗板3次。洗板后每孔加入100 μL稀释一定倍数的HRP-羊抗鼠IgG二抗，于37 ℃下孵育40 min后，取出洗板3次。洗板后每孔加入100 μL TMB显色液，37℃避光孵育10 min；取出后立刻每孔加入50 μL 2 M H2SO4终止反应，利用酶标仪测定波长 450 nm和630 nm的吸光值(450nm的波长用于测定吸光度，630nm用来矫正空白吸收)。计算竞争抑制率B/B0，其中B0为未加入竞争物时，即竞争物浓度为0 μg/mL时的吸光度值，B为不同竞争物浓度下测得的吸光度值。以B/B0为纵坐标，竞争物浓度为横坐标，绘制抑制回归曲线和计算样品中表位肽含量。
5.2 最佳检测条件的选择
用间接ELISA确定包被蛋白浓度、表位肽抗体和酶标二抗合适的工作浓度。
具体地，采用棋盘法对包被抗原(β-乳球蛋白)、一抗(纯化表位肽多克隆抗体)和二抗(HRP 标记羊抗鼠 IgG)的工作浓度进行优化，β-乳球蛋白包被浓度设置为5μg/mL、10μg/mL；BLG-2抗体稀释倍数为2500、5000、10000、20000；BLG-3抗体稀释倍数为20000、40000、80000、160000；BLG-4抗体稀释倍数为1250、2500、5000、10000；羊抗鼠二抗稀释倍数为5000、10000、20000、40000。选择吸光度值在 1.3 附近且空白值较低的参数为最终工作浓度。结果见表3-5。
首先确定β-乳球蛋白的包被浓度。从表3-5可以看出，当抗原浓度为5 μg/mL和10μg/mL时，OD值无显著性差异，说明抗原浓度为5 μg/mL时，已经达到饱和，因此确定包被抗原的浓度为5 μg/mL。
用浓度为5 μg/mL的β-乳球蛋白进行包被，来确定表位肽抗体(BLG-2、BLG-3、BLG-4)和羊抗鼠酶标二抗的工作浓度。从表3-5可以看出，最终确定BLG-2表位肽抗体稀释倍数为2500，酶标二抗稀释倍数为10000；BLG-3表位肽抗体稀释倍数为80000，酶标二抗稀释倍数为5000；BLG-4表位肽抗体稀释倍数为1250，酶标二抗稀释倍数为10000。
采用以上确定的包被蛋白浓度、表位肽抗体和酶标二抗合适的工作浓度建立基于表位肽抗体检测的竞争ELISA标准曲线。
5.3 竞争ELISA方法标准曲线的建立
在之前确定的合适蛋白包被浓度、一抗和二抗工作浓度下，建立基于表位肽抗体检测的竞争ELISA检测标准曲线，具体步骤如下：
(1)抗原包被：CBS配制一定浓度的β-乳球蛋白溶液，以100 μL每孔加入96孔酶标板中，于4 ℃过夜包被后，用PBST缓冲液以每孔300 μL洗涤 3 次；
(2)封闭：每孔加入150 μl 含1% OVA的PBST缓冲液封闭，于37 ℃下孵育2 h，取出后洗板1次；
(3)竞争体系：以表位肽标准品(BLG-2、BLG-3、BLG-4)作为竞争物，将肽标准品稀释成不同浓度(BLG-2：80-50000 ng/mL ；BLG-3：1-10000 ng/mL；BLG-4：1-15000 ng/mL)，以表位肽抗体：肽标准品为4：1的体积比例进行预孵育20 min，然后将竞争体系加入β-乳球蛋白预包板中于37 ℃条件下孵育1.5 h后，用PBST缓冲液以每孔300 μL洗涤 3 次；
(4)在96孔ELISA板中每孔加入100 μL稀释一定倍数的HRP-羊抗鼠IgG二抗(BLG-2、BLG-3、BLG-4检测方法的二抗分别稀释10000倍、5000倍、10000倍)，于37 ℃下孵育40min后，取出洗板3次。
(5)洗板后每孔加入100 μL TMB显色液，37℃避光孵育10 min；取出后立刻每孔加入50 μL 2 M H2SO4终止反应，利用酶标仪测定波长 450 nm和630 nm的吸光值。
(6)计算竞争抑制率B/B0，其中B0为未加入竞争物时，即竞争物浓度为0 μg/mL时的吸光度值，B为不同竞争物浓度下测得的吸光度值；以B/B0为纵坐标，相应表位肽标准品的浓度为横坐标，以Logistic5函数为模板，进行四参数拟合，绘制抑制回归曲线(即标准曲线)。
所得到的表位肽BLG-2、BLG-3和BLG-4的标准曲线见图8A-8C，依据公式LOD=B0-3SD计算检测限(SD为空白对照的标准偏差，LOD为检测限)。
从结果来看，基于BLG-2表位肽抗体的竞争ELISA方法检测范围为80-50000 ng/mL，对含BLG-2表位肽产品最低检测限为419 ng/mL；基于BLG-3表位肽抗体的竞争ELISA方法检测范围为1-10000 ng/mL，对含BLG-3表位肽产品最低检测限为3.12 ng/mL；基于BLG-4表位肽抗体的竞争ELISA方法检测范围为1-15000 ng/mL，对含BLG-4表位肽产品最低检测限为561 ng/mL)。
5.4 竞争ELISA检测水解产品中过敏原含量结果
使用与“竞争ELISA方法标准曲线的建立”中类似的方式对样品进行检测。首先将提取液(含0.1%吐温-20的50 mM，pH 9.6 CBS) 60 ℃预热，然后以样品：提取液为1：10的比例(w/v)混合，在60 ℃加热条件下对样品中的β-乳球蛋白提取20 min，每5 min摇匀一次。加热结束后等样品提取液冷却，1000 rpm条件下离心5 min，取样品上清液来代替肽标准品，检测步骤同标准曲线建立步骤。
根据样品所检测到的吸光度值，根据标准曲线计算抗原浓度，结果见下表6。
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结果显示，在对水解乳清蛋白配方奶粉的检测中，竞争ELISA 方法检测到了乳清蛋白过敏原β-乳球蛋白表位肽的存在。
检测结果表明，随着样品水解度的增大，其过敏原含量越低，潜在致敏性也会降低。这可能是因为水解牛奶蛋白会导致某些蛋白抗原性的降低，在水解过程中大分子蛋白发生降解，对过敏原的表位造成破坏。
总结来说，对于深度水解、加工条件比较剧烈的奶粉制品来说，竞争 ELISA方法可以克服因残留过敏原表位肽段小、空间位阻大的问题。本发明通过采用竞争ELISA (酶联免疫吸附测定)检测这些特定表位肽段，可以准确地、定性或定量地检测各种水解配方食品例如不同水解程度的配方食品致敏性，能够检测其中牛奶过敏原的含量，能够检测出产品中低达μg/g含量、甚至更低的极低含量的β-乳球蛋白表位肽含量。
6. 竞争ELISA试剂盒成本核算
基于以上检测方法，提供了相应试剂盒。本试剂盒包括预包被板、抗原标准品、表位肽检测抗体、羊抗鼠IgG-HRP二抗、TMB显色液、终止液、20×洗涤液、20×提取液等组分，各组分的成本价如下表所示，共计600元。
本发明建立了基于β-乳球蛋白表位肽抗体的竞争ELISA检测方法，其中最终确定包被浓度均为5μg/mL，BLG-2表位肽抗体稀释倍数为2500，HRP-羊抗鼠二抗稀释倍数为10000时，基于BLG-2表位肽抗体的竞争ELISA方法检测范围为80-50000 ng/mL，最低检测限为419 ng/mL；BLG-3表位肽抗体稀释倍数为80000，HRP-羊抗鼠二抗稀释倍数为5000，基于BLG-3表位肽抗体的竞争ELISA方法检测范围为1-10000 ng/mL，最低检测限为3.12 ng/mL；BLG-4表位肽抗体稀释倍数为1250，HRP-羊抗鼠二抗稀释倍数为10000，基于BLG-4表位肽抗体的竞争ELISA方法检测范围为1-15000 ng/mL，最低检测限为561 ng/mL，可用于检测水解产品中的β-乳球蛋白水解肽段。
以上所述的仅是本发明的示例性实施方式。在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以对本发明做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。

Claims (16)

1.检测水解配方食品致敏性的方法，其特征在于使用竞争ELISA方法检测选自如下之一的β-乳球蛋白表位肽：
具有氨基酸序列CAQKKIIAEKTKIPAVFKIDA的表位肽，称作BLG-3，
具有氨基酸序列KALKALPMHIRLSFN的表位肽，称作BLG-4。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述β-乳球蛋白表位肽为BLG-3。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述水解配方食品为部分水解配方食品或深度水解配方食品。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述水解配方食品为配方奶粉。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述水解配方食品为婴幼儿配方奶粉。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测包括：
1)使用β-乳球蛋白包被酶标板，洗板，封闭，洗板，
2)将作为一抗的能特异性结合所述表位肽的抗体与待检测样品混合作为竞争体系并预孵育，加入所述酶标板中，孵育，洗板，
3)将能与所述抗体结合的酶标二抗加入所述酶标板中，孵育，洗板，
4)加入显色液进行显色反应，
5)加入终止液终止反应，测定波长450 nm和630 nm的吸光度值，
6)根据测得的吸光度值和标准曲线计算样品中的表位肽浓度。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述标准曲线通过如下建立：
1’)使用β-乳球蛋白包被酶标板，洗板，封闭，洗板，
2’)将作为一抗的所述能特异性结合所述表位肽的抗体与所述表位肽的标准品混合并预孵育，加入所述酶标板中，孵育，洗板，
3’)将能与所述抗体结合的所述酶标二抗加入所述酶标板中，孵育，洗板，
4’)加入显色液进行显色反应，
5’)加入终止液终止反应，测定波长450 nm和630 nm的吸光度值，
6’)计算竞争抑制率B/B0，其中B0为未加入竞争物时，即竞争物浓度为 0 μg/mL时的吸光度值，B为不同竞争物浓度下测得的吸光度值；以B/B0为纵坐标，相应表位肽标准品的浓度为横坐标，制作标准曲线。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述能特异性结合所述表位肽的抗体是通过以所述表位肽为抗原，进行动物免疫制备多克隆抗血清而获得的。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述动物为小鼠。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述动物为Balb/c小鼠。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述酶标二抗为HRP-羊抗鼠IgG抗体、或者HRP-羊抗兔IgG抗体。
12. 如权利要求7所述的方法，其特征在于：
在步骤1)和1’)中，β-乳球蛋白以浓度为5-10μg/mL的包被溶液包被；和
在步骤2)和2’)中，
对于BLG-3，抗体稀释倍数为40000-160000并且酶标二抗稀释倍数为2500-10000；
对于BLG-4，抗体稀释倍数为625-2500并且酶标二抗稀释倍数为5000-20000。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于：
在步骤2)和2’)中，
对于BLG-3，抗体稀释倍数为40000-80000并且酶标二抗稀释倍数为5000-10000；
对于BLG-4，抗体稀释倍数为1250-2500并且酶标二抗稀释倍数为10000-20000。
14. 如权利要求12所述的方法，其特征在于：
在步骤1)和1’)中，β-乳球蛋白以浓度为5 μg/mL的包被溶液包被；和
在步骤2)和2’)中，
对于BLG-3，抗体稀释倍数为80000并且酶标二抗稀释倍数为5000；
对于BLG-4，抗体稀释倍数为1250并且酶标二抗稀释倍数为10000。
15.检测水解配方食品致敏性的试剂盒，该检测经由竞争ELISA方法进行，其特征在于该试剂盒包括：
已经用β-乳球蛋白包被的酶标板；
选自如下的一种或多种的表位肽标准品：具有氨基酸序列CAQKKIIAEKTKIPAVFKIDA的表位肽；称作BLG-3；具有氨基酸序列KALKALPMHIRLSFN的表位肽，称作BLG-4；
相应的作为一抗的能特异性结合所述表位肽的检测抗体：
酶标二抗；
洗涤液；
提取液；
显色液；和
终止液。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于所述竞争ELISA方法如权利要求2-14任一项中所定义。
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