CN105785047A - 一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法，通过重组表达技术制备β‑乳球蛋白IgE表位串联体蛋白，再分别以串联体蛋白及β‑乳球蛋白为抗原，按常规技术制备相应多克隆抗体，再经亲和纯化制备特异性抗体。以β‑乳球蛋白多克隆抗体为捕获抗体，生物素化串联体多克隆抗体为检测抗体建立夹心ELISA法，经酶标仪检测吸光值，通过建立标准曲线，实现对食品中过敏原β‑乳球蛋白及其致敏性残基的定量检测。本发明建立的方法具有操作简单、灵敏度高、特异性好等优点，为高通量分析检测多种食品中相关过敏原及其致敏性残基提供了一种有效的方法，具有良好的推广和应用前景。

Description

一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法
技术领域
本发明属于食品分析技术领域，涉及一种食物过敏原及其致敏性残基含量的检测方法。
背景技术
牛乳是人们日常生活中经常摄入的营养物质，同时牛乳作为八大类过敏食物之一，牛乳过敏在人群中的发病率为0.3%～7.5%，而在儿童中的发病率达0.1～7.5%。美国食品药品管理局（FDA）规定食品标签中必须列出各类致敏成分，其中就包括牛乳及乳制品。食物过敏原的检测是食物过敏管理的关键环节，以便对过敏食物进行风险评估、生产和标示。牛乳中过敏原成分复杂，其中β-乳球蛋白约占牛乳蛋白含量的10%，约占乳清蛋白总量的50%，且IgE介导的牛奶过敏中82%的病人是对β-乳球蛋白过敏。因此，开展β-乳球蛋白的检测，是保护牛乳过敏人群合法权益的关键举措，也有利于生产低致敏食品，从而提高牛乳过敏患者的生活质量。
目前，食物过敏原的检测技术有免疫学技术、聚合酶链式反应技术、高效液相色谱技术、液相/质谱联用技术等，其中免疫学技术最成熟、最常用。抗体在免疫学方法检测食物过敏原中起着关键作用。抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，其中单克隆抗体只能识别一个表位，在检测过敏原肽段时存在明显不足，且抗体制备技术要求较高、价格昂贵，且一次性难以获得多株识别不同表位的细胞株。而多克隆抗体能识别多个表位，其制备方法简单、经济，能很好的弥补单克隆抗体在抗体制备及检测过敏原肽段方面的不足。
蛋白质的结构决定其功能，作为食物过敏原的蛋白，过敏原表位是引起过敏反应的物质基础，包括线性表位和构象性表位。食品在加工及工业应用中常常会经过加热、发酵、酶解等处理，这使过敏原构象性表位易被破坏，但线性表位则相对稳定，不易被破坏。利用表位疫苗原理，构建β-乳球蛋白IgE线性表位串联体，通过原核表达制备表位串联体蛋白，再根据免疫学方法制备β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体。通过基于β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体的ELISA方法可以检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性表位肽段的含量，可评价食物样品致敏性的强弱，评估食品安全风险的高低，也为食品过敏原标示提供更可靠的检测方法。目前，在我国，利用过敏原IgE线性表位抗体对食品中过敏原的定量检测还是空白。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于IgE线性表位识别检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法。该方法准确、灵敏度高、特异性好、回收率高。
本发明是通过以下技术方案实现的。
1、β-乳球蛋白多克隆抗体的制备。
以牛乳β-乳球蛋白为抗原，通过常规方法获得β-乳球蛋白多克隆抗体。
2、β-乳球蛋白多克隆抗体的纯化。
首先，CNBr-Sepharose4B柱材与β-乳球蛋白偶联，制备免疫亲和柱。抗血清与等体积的PBS混合，将血清缓慢加入Sepharose4B亲和柱中，室温下孵育30min，再循环上样一次；用20倍柱体积的PBS进行非特异性洗脱，再用10倍柱体积的3MMgCl2进行特异性洗脱得到β-乳球蛋白特异性多克隆抗体。纯化后，用截留分子量为3kDa的超滤管对抗体进行除盐，并浓缩至合适的体积。
3、β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体的制备。
表位疫苗是以抗原表位为基础制备的疫苗，由B细胞表位、T细胞表位及间隔序列组成。B细胞表位用来定向诱导宿主的体液免疫应答，而通过选择特异性的T细胞表位使机体的细胞免疫应答向特定类型定向发展，间隔序列具有保存表位独立的免疫原性，同时避免产生新的表位。
基于表位疫苗设计原理，以β-乳球蛋白IgE线性表位（B：AA1~8、AA31~48、AA47~60、AA67~78、AA75~86、AA127~144和AA141~152）、T细胞表位（T：AA77~97）及间隔序列（KK与G）为基础。通过DNAStar软件对不同组合串联体的抗原性、表面可及性及亲水性进行分析，使每个表位的抗原性和亲水性大于0，同时表面可及性大于1；再利用网络服务器SOMPA对不同组合的串联体二级结构进行分析，使表位形成β转角和无规则卷曲结构。通过以上生物信息学方法对表位串联体的分析，最终得到的串联体组合为：T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4。再合成串联体基因，并通过原核表达制备出β-乳球蛋白表位串联体重组蛋白。最后，以串联体蛋白为抗原，通过常规方法获得β-乳球蛋白IgE线性表位串联体蛋白多克隆抗体。
4、β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体的生物素化。
首先，按步骤2对β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体进行纯化。再把纯化得到的β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体与长链生物素按1：20的摩尔比混合，冰浴2h，接着用脱盐柱除去多余的生物素。
5、β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体对表位肽的识别。
因为实际样品中被检测的β-乳球蛋白致敏性肽段所包含的氨基酸数通常要大于表位本身的氨基酸数。因此，为了分析所制备的β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体对表位的识别能力，我们设计了表位阻断肽，即在每个IgE表位两端各添加一个氨基酸，并合成这7个IgE表位肽及其阻断肽。采用间接竞争ELISA法分析β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体对表位肽及阻断肽的识别能力。将β-乳球蛋白标准品用碳酸盐缓冲液稀释后，100μL/孔（板A），4℃包被过夜，PBST洗三次，每次3min扣干。另取一块酶标板（板B），板A与板B中每孔加入250μL的3%明胶溶液37℃封阻。板B封阻1h后清洗，每孔加入β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体和浓度梯度的多肽（PBS为对照）各60μL，37℃孵育1h。板A用PBST清洗3次，从板B中取100μL抗体与多肽的反应液加入到板A中，37℃孵育1h后清洗，每孔加入100μLOPD显色液，37℃避光孵育15min后，每孔加入50μL2M的H2SO4终止反应，然后立即用酶标仪测吸光值。根据吸光值计算不同浓度肽的抑制率，根据抑制率高低可以反映串联体多克隆抗体对不同表位肽和阻断肽识别能力的强弱。
6、夹心ELISA法检测β-乳球蛋白标准曲线的绘制。
以β-乳球蛋白多克隆抗体为捕获抗体，生物素化β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体为检测抗体，β-乳球蛋白为检测抗原，采用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度。酶标板中每孔加入100μL碳酸盐稀释的捕获抗体，4℃包被过夜，PBST洗三次，每次3min扣干，每孔加入250μL的4%明胶溶液37℃封阻1.5h。清洗后，每孔加入100μL已知浓度梯度的β-乳球蛋白，37℃孵育1.5h。清洗后，每孔加入100μL检测抗体，37℃孵育0.5h。清洗后，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃孵育1h。清洗后，每孔加入100μLOPD溶液，37℃避光孵育20min后，每孔加入50μL2M的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，根据吸光值和抗原浓度的关系绘制β-乳球蛋白标准曲线。
7、样品预处理。
（1）液态乳制品：取一定量的液态乳制品于离心管中，用低温离心机10,000g，4℃离心15min，去除脂肪层和沉淀，取样用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品。
（2）粉状乳制品：称一定量的样品用PBS稀释，溶解后离心，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品。
8、样品检测。
将所需检测的食品进行预处理，制备检测样。根据上述方法包被捕获抗体、封闭清洗后，每孔加入预处理的样品，孵育清洗后，按步骤6依次加入检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、OPD溶液，经H2SO4终止反应后，用酶标仪检测吸光值，把吸光值带入标准曲线计算出被检样品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量。
本发明的优点是：1、本发明利用β-乳球蛋白IgE线性表位串联体为抗原制备多克隆抗体，具有特异性识别β-乳球蛋白IgE表位的优点；2、基于表位抗体定量检测乳产品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的夹心ELISA方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性好等优点，便于高通量检测；3、本发明所建立的方法将为高通量分析检测多种食品中相关过敏原及其致敏性残基提供了一种有效的方法，具有良好的推广和应用前景。
附图说明
图1为本发明β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体对表位肽及阻断肽的识别能力。B1-B7：表位肽；b1-b7：阻断肽。
图2为本发明所建夹心ELISA法检测β-乳球蛋白的标准曲线。
具体实施方式
本发明将通过以下具体实例作进一步说明。
实施例1。定量检测阳光纯牛奶中过敏原β-乳球蛋白含量。
1.样品预处理。
取1mL阳光纯牛奶10,000×g，4℃离心15min。去除脂肪，上清用封阻液稀释20,000倍后作为检测样。
2.样品检测。
（1）包被：用包被液将β-乳球蛋白多克隆抗体稀释至1μg/mL，每孔加100μL，4℃包被过夜。
（2）洗涤：用PBST（含0.1%吐温-20）洗涤3次，每次3min，扣干。
（3）封阻：用PBS配4%明胶（含0.1%吐温-20）封阻液，每孔加250μL，37℃孵育1.5h。封阻结束后，用PBST洗涤3次，每次3min，扣干。
（4）加抗原：用封阻液将β-乳球蛋白标准品在31.25–8,000ng/mL范围内梯度稀释，每孔加入100μL标准品/样品，一式三份，37℃孵育1.5h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3min，扣干。
（5）加检测抗体：用封阻液将生物素化β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体稀释至1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育0.5h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3min，扣干。
（6）加HRP标记的链霉亲和素：用封阻液将HRP标记的链霉亲和素稀释60倍，每孔加100μL，37℃孵育1h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3min，扣干。
（7）加显色液：每孔加100μLOPD溶液，37℃避光孵育20min。
（8）测吸光值：孵育结束后，每孔加入50μL2M的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，吸收波长为490nm，根据吸光值绘制标准曲线，根据线性回归方程和抗样品吸光值计算样品中β-乳球蛋白的含量，三次检测的平均值为最终检测含量。
3.结果。
检测标准曲线方程为y=0.6413x-0.5284，r2=0.9928，灵敏度为1.96ng/mL。阳光纯牛奶中β-乳球蛋白的含量为3.48mg/mL，而牛乳中β-乳球蛋白的含量约为3-4mg/mL，说明所建立的检测方法是可行的。
实施例2。定量检测雀巢瑞铂能恩部分水解婴幼儿奶粉中β-乳球蛋白致敏性残基含量。
1.样品预处理。
称取0.2g雀巢瑞铂能恩部分水解婴幼儿奶粉，加入封阻液并充分溶解，使蛋白浓度为5mg/mL。10,000g4℃离心15min，去除脂肪和沉淀，用封阻液将上清稀释至250μg/mL,50μg/mL及10μg/mL，作为检测样。
2.样品检测。
（1）包被：用包被液将β-乳球蛋白多克隆抗体稀释至1μg/mL，每孔加100μL，4℃包被过夜。
（2）洗涤：用PBST（含0.1%吐温-20）洗涤3次，每次3min，扣干。
（3）封阻：用PBS配4%明胶（含0.1%吐温-20）封阻液，每孔加250μL，37℃孵育1.5h。封阻结束后，用PBST洗涤3次，每次3min，扣干。
（4）加抗原：用封阻液将β-乳球蛋白标准品在31.25–8,000ng/mL范围内梯度稀释，每孔加入100μL标准品/样品，一式三份，37℃孵育1.5h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3min，扣干。
（5）加检测抗体：用封阻液将生物素化β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体稀释至1μg/mL，每孔加100μL，37℃孵育0.5h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3min，扣干。
（6）加HRP标记的链霉亲和素：用封阻液将HRP标记的链霉亲和素稀释60倍，每孔加100μL，37℃孵育1h。孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3min，扣干。
（7）加显色液：每孔加100μLOPD溶液，37℃避光孵育20min。
（8）测吸光值：孵育结束后，每孔加入50μL2M的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，吸收波长为490nm，根据吸光值绘制标准曲线，根据线性回归方程和抗样品吸光值计算样品中β-乳球蛋白的含量，三次检测的平均值为最终检测含量。
3.结果。
检测标准曲线方程为y=0.6413x-0.5284，r2=0.9928，灵敏度为1.96ng/mL。雀巢瑞铂能恩部分水解婴幼儿奶粉中β-乳球蛋白的含量为518.75mg/kg。

Claims (1)

1.一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法，其特征是按以下步骤：
（1）以牛乳β-乳球蛋白为抗原，通过常规方法获得β-乳球蛋白多克隆抗体；
（2）CNBr-Sepharose4B柱材与β-乳球蛋白偶联，制备免疫亲和柱；抗血清与等体积的PBS混合，将血清缓慢加入Sepharose4B亲和柱中，室温下孵育30min，再循环上样一次；用20倍柱体积的PBS进行非特异性洗脱，再用10倍柱体积的3MMgCl2进行特异性洗脱得到β-乳球蛋白特异性多克隆抗体；纯化后，用截留分子量为3kDa的超滤管对抗体进行除盐，并浓缩至合适的体积；
（3）以β-乳球蛋白肽段AA1~8、AA31~48、AA47~60、AA67~78、AA75~86、AA127~144和AA141~152为B细胞表位，并依次编号B1、B2、B3、B4、B5、B6和B7，以β-乳球蛋白肽段AA77~97为T细胞表位，T细胞表位位于串联体N端，B细胞表位位于串联体C端，用两个赖氨酸连接T细胞表位与B细胞表位，用一个甘氨酸连接相邻的两个B细胞表位；通过DNAStar软件对不同组合串联体的抗原性、表面可及性及亲水性进行分析，使每个表位的抗原性和亲水性大于0，同时表面可及性大于1；再利用网络服务器SOMPA对不同组合的串联体二级结构进行分析，使表位形成β转角和无规则卷曲结构；通过以上生物信息学方法对表位串联体的分析，最终得到的串联体组合为：T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4；再合成串联体基因，并通过原核表达制备β-乳球蛋白表位串联体重组蛋白；最后，以串联体蛋白为抗原，通过常规方法获得β-乳球蛋白IgE线性表位串联体蛋白多克隆抗体；
（4）按步骤（2）对β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体进行纯化；再把纯化得到的β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体与长链生物素按1：20的摩尔比混合，冰浴2h，接着用脱盐柱除去多余的生物素；
（5）在表位肽两端各加入一个氨基酸作为阻断肽，合成这7个表位肽及其阻断肽，采用间接竞争ELISA法分析β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体对表位肽及阻断肽的识别能力；将β-乳球蛋白标准品用碳酸盐缓冲液稀释后，100μL/孔加入板A，4°C包被过夜，PBST洗三次，每次3min扣干；另取一块酶标板B，板A与板B中每孔加入250μL的3%明胶溶液37°C封阻；板B封阻1h后清洗，每孔加入β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体和浓度梯度的多肽各60μL，PBS为对照，37°C孵育1h；板A用PBST清洗3次，从板B中取100μL抗体与多肽的反应液加入到板A中，37°C孵育1h后清洗，每孔加入100μLOPD显色液，37°C避光孵育15min后，每孔加入50μL2M的H2SO4终止反应，然后立即用酶标仪测吸光值；根据吸光值计算不同浓度肽的抑制率，根据抑制率高低可以反映串联体多克隆抗体对不同表位肽和阻断肽识别能力的强弱；
（6）以β-乳球蛋白多克隆抗体为捕获抗体，生物素化β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体为检测抗体，β-乳球蛋白为检测抗原，采用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度；酶标板每孔加入100μL碳酸盐稀释的捕获抗体，4°C包被过夜，PBST洗三次，每次3min扣干，每孔加入250μL的4%明胶溶液37°C封阻1.5h；清洗后，每孔加入100μL已知浓度梯度的β-乳球蛋白，37°C孵育1.5h；清洗后，每孔加入100μL检测抗体，37°C孵育0.5h；清洗后，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37°C孵育1h；清洗后，每孔加入100μLOPD溶液，37°C避光孵育20min后，每孔加入50μL2M的H2SO4终止反应，然后用酶标仪测吸光值，根据吸光值和抗原浓度的关系绘制β-乳球蛋白标准曲线；
（7）液态乳制品：取一定量的液态乳制品于离心管中，用低温离心机10,000g，4°C离心15min，去除脂肪层和沉淀，取样用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品;粉状乳制品：称一定量的样品用PBS稀释，溶解后离心，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品；
（8）将所需检测的食品进行预处理，制备检测样，根据上述方法包被捕获抗体、封闭清洗后，每孔加入预处理的样品，孵育清洗后，按步骤（6）依次加入检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、OPD溶液，经H2SO4终止反应后，用酶标仪检测吸光值，把吸光值带入标准曲线计算出被检样品中β-乳球蛋白及其致敏性残基的含量。
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