CN114751974A - 牛乳乳清主要过敏原α-乳白蛋白的IgG结合表位 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乳清过敏原α‑乳白蛋白的IgG结合表位，IgG表位的氨基酸序列为：¹⁷Gly‑Tyr‑Gly‑Gly‑Val‑Ser‑Leu‑Pro‑Glu‑Trp‑Val‑Cys‑Thr²⁹。本发明的采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）筛选16份血清，最终获得12份牛乳过敏儿童患者血清。以Hitrap Protein G HP亲和层析柱纯化的高纯度牛乳特异性IgG为靶分子，对噬菌体十二肽库进行亲和淘选。利用生物信息学软件预测线性表位，最后获乳清过敏原α‑乳白蛋白的IgG表位信息。本发明对于探明牛乳过敏发生的免疫学机制，研究表位在食物过敏反应中的作用，指导定向打断表位的低致敏乳制品的开发具有重大意义。

Description

牛乳乳清主要过敏原α-乳白蛋白的IgG结合表位

技术领域

本发明涉及分子生物学、免疫学、生物信息学领域，特别是涉及牛乳乳清主要过敏原α-乳白蛋白的IgG结合表位。

背景技术

牛乳及乳制品因含有较高的营养价值而备受广大消费者的青睐，但牛乳过敏引发的食品安全问题也被人们广泛关注。牛乳及牛乳制品是WHO/FAO认定的八大类主要过敏食物之一。牛奶蛋白过敏(cow’s milk allergy,CMA)是生命早期的一种常见疾病，患病率为2–7％，且呈现增加的趋势。据估计，欧洲国家2–3％的婴儿会出现牛乳过敏症状。在一项针对6768名中国婴儿的最新调查中，发现CMA患病率为2.69％。CMA分为免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介导、非IgE介导和混合(IgE与非IgE)介导。大约60％的CMA是IgE介导，即与体液免疫反应异常有关，尽管因研究人群和年龄的不同而略有差异。非IgE介导或两者混合介导的CMA相对少见。IgE介导的CMA发生机制是牛乳过敏原致敏机体免疫细胞并使之产生特异性IgE(specific IgE,slgE)，随后slgE与效应细胞结合使其处于致敏阶段；机体再次接触到同种过敏原会导致效应细胞脱颗粒和释放介质，如组胺等，最终导致皮肤系统、呼吸系统、胃肠道系统等出现临床症状，如湿疹、呼吸困难、腹痛、呕吐等，牛乳过敏严重时甚至会导致患者休克和死亡。

牛乳中含有三十多种蛋白质，都具有潜在致敏性。目前认为酪蛋白、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin,ALA)是主要过敏原。在20℃条件下调节脱脂乳pH至4.6，可得到两部分：其中凝固状态的酪蛋白占80％，溶液状态的乳清蛋白占20％。乳清蛋白中主要过敏原是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，分别占乳清蛋白组分的50％和25％。α-乳白蛋白是一种属于溶菌酶家族的具有123个氨基酸残基的单体球状钙结合金属蛋白，分子量为14.4kDa，带有四个二硫键和一个钙的高亲和力结合位点。研究者在牛乳和人乳的乳白蛋白之间发现了明显的同源性，其中74％的残基相同，另外6％的残基显示出化学相似性。

表位是过敏反应的物质基础，可分为线性表位和构象性表位，前者由氨基酸残基线性排列组成，后者是氨基酸残基在空间相互靠近形成的能被免疫活性物质识别的特定三维结构。表位也可以按照表位的受体可分为T细胞表位与B细胞表位，B细胞表位指的是B细胞受体或B细胞分泌的特异性抗体识别的表位，如IgE表位和IgG表位。B细胞线性表位的长度通常有8–15个氨基酸。尽管有报道称线性表位可短至5个氨基酸，但能与IgE高活性结合的表位至少含有8个氨基酸。

近年来，肽阵列、噬菌体展示、X射线晶体学等技术都已经运用于食物过敏原表位的定位。噬菌体展示技术是一种基于噬菌体表面展示的目标多肽或蛋白进行筛选的体外选择系统，能实现抗体基因型和表现型的统一，由于其便捷、特异性强、操作方便等特点，被广泛用于表位定位。虽然对牛乳过敏蛋白，包括酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳白蛋白已进行了诸多的表位定位研究，但针对中国人群特异性的牛乳乳清过敏原的表位定位极少报道。

发明内容

本发明的目的是提供乳清过敏原α-乳白蛋白的IgG结合表位，探明牛乳过敏发生的分子机制，探究表位在食物过敏中的作用。

本发明的技术内容是：

一种牛乳乳清主要过敏原α-乳白蛋白的IgG结合表位，其氨基酸序列为：¹⁷Gly-Tyr-Gly-Gly-Val-Ser-Leu-Pro-Glu-Trp-Val-Cys-Thr²⁹。。

采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)筛选16份牛乳过敏儿童患者血清。

以Hitrap Protein G HP亲和层析柱纯化的高纯度牛乳特异性抗体为靶分子，对噬菌体十二肽库进行亲和淘选。

利用生物信息学进行预测，最后获得α-乳白蛋白的表位信息。本发明的有益效果是：α-乳白蛋白IgG结合表位的发明对解析牛乳过敏发生的分子机制，指导定向打断表位的蛋白酶的筛选，以及基于表位开发低过敏性乳清蛋白制品具有重大意义。

附图说明

图1是牛乳过敏患者特异性抗体水平；×轴：来自不同过敏患者的血清，Y轴：ALA-特异性IgG结合水平的OD值；

图2中A是Protein G亲和纯化电泳图；B是纯化抗体的ELISA结果；M为蛋白Marker，泳道1为牛乳过敏患者血清池蛋白，泳道2为特异性洗脱峰收集蛋白；

图3是噬菌体克隆子的间接ELISA检测结果；

图4是α-乳白蛋白的IgG线性表位；

图5是斑点印迹验证IgG线性表位；

具体实施方法

一、牛乳过敏患者血清池的构建

1、间接ELISA筛选牛乳过敏患者血清

过敏患者血清中针对牛乳蛋白的slgE水平由ImmunoCAP检测，选择牛乳蛋白slgE水平大于等于0.35kUA/L并且年龄在3–12岁的血清进行ELISA。利用间接ELISA法测定牛乳过敏患者血清中抗α-乳白蛋白特异性免疫球蛋白G(α-lactalbumin specificimmunoglobulin G，ALA-slgG)(间接ELISA的方法参考李柳栩的论文，论文出处：李柳栩.基于ELISA方法的卵类黏蛋白IgE线性表位研究[D].天津医科大学,2020:11-16.)。

包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，洗液、封阻液、血清、二抗等均使用0.01M的PBS缓冲液稀释，洗液含有0.05％(v/v)Tween-20，封阻液含有3％明胶。α-乳白蛋白(Sigma-Aldrich)的包被浓度为1μg/mL，封阻后加入稀释倍数为2000倍的过敏患者血清。扣干后洗涤三次，加入1:5000稀释的HRP标记羊抗人IgG(Sigma-Aldrich)。取出酶标板扣干后洗涤三次，加入TMB底物溶液(欣博盛生物科技有限公司)，100μL/孔，37℃保温保湿15min。加入2mol/L H₂SO₄终止反应，50μL/孔。测定吸光度为450nm的吸光值。以P/N＞2，且P＞0.2时血清判断为阳性，其中P和N分别为样品与阴性血清的OD_450nm值。

2、血清池的构建

根据间接ELISA结果，筛选出ALA-slgG水平均呈现阳性的患者血清，取等体积血清混合得到血清池。

3、结果

3.1牛乳过敏患者α-乳白蛋白的特异性IgG水平测定

本研究中从16份牛乳过敏患者血清中筛选，对于IgG结合能力，-1、3、4、7、12、13、14、15号血清与α-乳白蛋白集合能力较强，其中7号血清对α-乳白蛋白识别能力最强。由于血清5、6、9、16特异性抗体结合能力识别较低，不作为候选血清，选取12分血清混合做血清池。

二、牛乳特异性抗体的纯化

1、Protein G HP免疫层析柱一步亲和纯化抗体

先后采用200μL活化液(1M Tris-HCl,pH 9.0)和10倍柱体积的平衡缓冲液(20mMPBS,pH 7.4)冲洗亲和柱(美国GE公司)，流速均为1mL/min。采用平衡缓冲液以1:1(v/v)的比例稀释血清后通过0.45μm水系滤膜。过滤后的血清加入亲和柱后，将亲和柱上下的盖子旋紧，37℃摇动结合1h。以平衡缓冲液和洗脱液(0.1M glycine-HCl,pH 2.7)分别对亲和柱进行非特异性和特异性洗脱，流速均为1mL/min，收集流出液200μL/管。在收集特异性洗脱峰的过程中，加入中和液(1M Tris-HCl,pH 9.0)到收集管，标准是每毫升特异性洗脱液中加入60至200μL中和液，直到pH达到7左右。特异性洗脱结束之后，分别用10倍柱体积的平衡缓冲液和20％乙醇洗涤亲和柱。收集到的非特异性洗脱液与特异性洗脱液用超滤离心管浓缩并更换缓冲液为0.01M PBS。

2、纯化抗体的纯度和浓度测定

采用还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定纯化的抗体，采用BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)鉴定浓度。将获得的抗体于-20℃冰箱保存。

3、纯化抗体的特异性评估

采用间接ELISA进行纯化抗体的IgG水平测定，做出如下调整：IgG水平测定时，样品(浓缩非特异性洗脱液与特异性洗脱液)的稀释倍数分别是20倍和200倍。

4、结果

4.1纯化抗体的纯度和浓度

经Protein G柱纯化后的IgG(泳道3)，在还原型电泳的结果中显示为两条蛋白条带，分别位于50kDa和25kDa，仅含有少量的杂蛋白，主要集中在125kDa左右。由图2A可知，未经任何处理的血清含有较多的杂蛋白(泳道1)。经过Image J软件计算，泳道3的纯度分别是95.2％。BCA测定结果表明，特异性洗脱液的浓度为1700μg/mL。

4.2纯化抗体的特异性结果

由图2B可知，特异性洗脱峰收集液中，ALA-slgG水平很高，收集用于后续表位筛选。

三、α-乳白蛋白的IgG表位的筛选

1、噬菌体展示技术筛选模拟表位

参考说明书，利用噬菌体十二肽库试剂盒(New England Biolabs公司)进行IgG模拟表位的淘选。第一轮到第四轮，包被的IgG浓度分别是100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、50μg/mL，洗液的浓度分别是0.1％、0.25％、0.5％、0.5％，噬菌体孵育结合时间分别是60min、45min、30min、30min，甘氨酸洗脱时间分别是6min、8min、10min、10min。逐步严格的淘选条件有助于选择到特异性更强的噬菌体序列。从第四轮测滴度的平板上挑取10株噬菌体送往金唯智公司进行测序，测序引物为-96III。

2、间接ELISA鉴定阳性噬菌体克隆

通过噬菌体ELISA检测所选多肽对抗体的结合。包被蛋白是2μg/mL的抗牛乳蛋白IgG，100μL/孔，包被于96孔微孔板上，4℃孵育过夜，同时包被3％BSA-PBS作阴性对照。倾去孔内液体，用含0.05％Tween-20的PBST洗涤三次。用3％的明胶封阻，300μL/孔，37℃孵育1h。洗板三次，加入经扩增纯化的噬菌体，100μL/孔，37℃孵育1h。加入的噬菌体数量有四组梯度，分别是10¹²、10¹⁰、10⁸、10⁶，阴性对照加入噬菌体量为10⁶，空白对照加PBS缓冲液。洗板六次，加入HRP标记的抗M13二抗(北京义翘神州科技股份有限公司)，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板六次，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色15min。加入2M H₂SO₄终止反应，50μL/孔，测定OD_450nm值。P/N＞2且P＞0.2时，噬菌体判断为阳性，其中P和N分别为样品与阴性对照的OD_450nm值。

3、生物信息学定位IgG表位

从NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)获取α-乳白蛋白的氨基酸序列。使用DNAStar的Editseq软件模块对插入的噬菌体外源基因序列进行翻译。使用DNAman 7.0软件进行线性表位定位。

4、斑点印迹方法验证IgG表位

将IgG表位序列进行合成，并结合到PVDF膜上，采用斑点印记检测合成的肽段和抗体IgG的结合能力。将浓度为1mg/mL的多肽点样于固定在点样器的硝酸纤维素膜上，5μL/孔，同时设置3％BSA-PBS作为阴性对照，置于37℃温箱中干燥30min。待点样孔干燥后滴加3％的明胶，于37℃烘箱中封闭1h。倾去封闭液，用含有0.05％Tween-20的PBST洗涤膜三次，每次5min。加入PBS稀释的牛乳过敏患者血清(10人混合的血清池)，羊抗人IgG二抗，50μL/孔，于37℃条件下孵育1h。洗膜5次，每次3min，加入HRP标记的二抗，50μL/孔，于37℃条件下孵育1h。洗膜5次，每次3min。最后用4-氯-1-萘酚进行显色反应。

5、结果

5.1亲和淘选到的噬菌体的测序

表1展示了淘选过程中噬菌体的富集效果，可以发现每经过一次淘选，噬菌体产出量和回收率都有所增加。在第四轮中，IgG洗脱噬菌体的产出量分别达到1.3×10⁵，表明特异性结合的噬菌体在此过程中得到了有效的富集。第四轮的平板中，在IgG组中挑选10个噬菌斑，命名为IgG1至IgG10，送往金唯智公司进行测序并获得10个12肽序列。表2展示了噬菌体外源序列。

表1儿童IgG四轮亲和淘选中噬菌体的富集

注：回收率＝回收量/文库投入量

表2噬菌体展示技术筛选的模拟表位

5.2噬菌体ELISA结果

采用间接ELISA检测所选多肽对抗体的结合能力。发现随着加入噬菌体数量的降低，吸光度也呈现降低的趋势。图3展示了噬菌体的加入量为10¹²时的OD_450nm值。所有克隆子的OD_450nm值全部高于阴性对照组(Con组)的2倍，因此10个克隆子被判断为阳性克隆。

5.3α-乳白蛋白的IgG表位定位

使用软件DNAman 7.0的多序列对比功能将噬菌体外源序列与α-乳白蛋白氨基酸序列进行对比，默认参数不变，分析肽段的识别位点与出现频率，含有连续重合三个氨基酸以上的肽序列和非连续重合五个氨基酸以上的肽序列被定义为线性表位。图4展示了α-乳白蛋白的线性表位。我们定位出α-乳白蛋白的IgG线性表位位于AA17-29。

5.4IgG线性表位AA17-29结果验证

斑点印迹的结果如图5所示。其中A图是斑点印迹的结果，P为过敏患者的血清中IgG与肽段AA17-29结合能力的测定结果，N为阴性血清IgE与肽段AA17-29结合能力的测定结果，从图中可知，肽段与过敏患者的血清结合能力明显，且不与阴性血清结合；B图是通过Image J(V1.38)分析进行量化对比，采用GraphPad Prism 8.2.1作图获得：横坐标中P为过敏患者的血清，N为阴性血清，纵坐标为肽段AA17-29与IgG结合能力。印迹结果再次证明，肽段A17-29与过敏患者的血清中IgE结合能力较强，说明是此肽段是α-乳白蛋白的线性表位。

序列表

<110> 胡巍

<120> 牛乳乳清主要过敏原α-乳白蛋白的IgG结合表位

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 牛(Bos gaurus)

<400> 1

Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr

1 5 10

Claims (1)

1.一种牛乳乳清主要过敏原α-乳白蛋白的IgG结合表位，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No：1：¹⁷Gly-Tyr-Gly-Gly-Val-Ser-Leu-Pro-Glu-Trp-Val-Cys-Thr²⁹。

Images