CN113549141B - 一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳球蛋白残留量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种β‑乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β‑乳球蛋白残留量的方法。抗原表位肽的氨基酸序列为CGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYS。测定β‑乳球蛋白残留量的方法为：S1：合成β‑乳球蛋白作用表位肽。S2：将β‑乳球蛋白作用表位肽制备为完全抗原。S3：制备单抗或多抗。S4：以步骤S3的单抗或多抗为一抗，采用间接竞争ELISA方法检测不同蛋白酶水解β‑乳球蛋白的水解液中β‑乳球蛋白残留量。本发明通过间接竞争ELISA方法实现β‑乳球蛋白的测定，以β‑乳球蛋白的AA12～37抗原表位肽作为免疫原，利用该免疫原制备测定所需的抗体。制备的抗体对β‑乳球蛋白水解物中残留的含有作用表位的肽段有极高的特异性，检测更加准确。

Description

一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳 球蛋白残留量的方法
技术领域
本发明属于生物技术和食品技术领域，具体涉及一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳球蛋白残留量的方法。
背景技术
牛乳是非常优质的蛋白来源，也是常见的过敏物质之一，其致敏性对婴幼儿的身体健康造成了严重的影响。牛乳蛋白过敏通常在婴儿期更为严重，会引起包括皮肤、胃肠道、呼吸道等的反应，甚至更严重的系统过敏反应或休克。
牛乳中蛋白含量丰富，每升牛乳含有约30-35克蛋白质，含有超过25种不同的蛋白质，从理论上讲，任何一种蛋白质都有潜在致敏性。目前普遍认为酪蛋白、β-乳球蛋白及α-乳白蛋白是牛乳中主要的过敏原。而乳清中最重要的过敏原是β-乳球蛋白，占总乳蛋白的10％，以及α-乳白蛋白，占总乳蛋白的5％。
通过限制或改变饮食来预防婴儿过敏性疾病早已被提出。但是，牛乳蛋白往往作为配料被添加到各种食品中，难以从饮食中消除。另外，对于处于骨骼生长期的儿童，牛乳是钙的重要来源。为此，现有技术选择向牛乳蛋白中添加蛋白酶，对致敏蛋白进行作用表位的水解。蛋白酶水解后的牛乳蛋白，其结构被破坏，成为分子量较小的多肽。然而，不同种类的蛋白酶对β-乳球蛋白的水解能力不同，仍然存在水解位点特异性不强，过敏原残留量较高，水解物苦味较重等问题。因此，对水解后的牛乳进行抗原残留量检测必不可少。
目前牛乳中β-乳球蛋白的检测方法包括聚合酶链反应(PCR)检测方法、色谱检测方法以及免疫学检测方法。
PCR检测方法具有高特异性和敏感性，但是存在一些不足，特别是在食品中添加蛋白质时，很难将核酸检测结果准确换算成蛋白质含量，这使得PCR的方法不适用于过敏原的评估和管理。此外，PCR检测方法主要用于检测核酸含量高的食品，然而，牛奶并中没有与过敏原相关的DNA。
色谱学检测方法包括高效液相色谱法、超高效液相色谱法及液相色谱-质谱联用法，但是色谱质谱的仪器价格高昂，前处理复杂繁琐，成本高昂。
ELISA是食品工业和政府食品检测机构最常用的方法，具有特异性强、灵敏度高、成本低、操作简单、高通量、速度快等优点。根据ELISA检测的类型，可分为间接竞争型ELISA和三明治型ELISA，其中间接竞争型ELISA更适合于检测分子或小分子。当β-乳球蛋白被水解破坏成小片段后，间接竞争型ELISA的检测结果更为准确。但是，对于存在交叉过敏反应的过敏原，即对于存在相似作用表位的过敏原间，ELISA法常出现假阳性。
因此，需要提供一种能够精准、快速检测牛乳过敏原残留量的检测方法，以筛选出能够有效降低过敏原致敏性的蛋白酶，降低牛乳中过敏原的含量。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术中存在的水解后的牛乳中β-乳球蛋白抗原的残留检测困难的问题，本发明提供一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳球蛋白残留量的方法。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种β-乳球蛋白的抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为CGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYS。
第二方面，本发明提供一种上述抗原表位肽和牛血清蛋白偶联得到的完全抗原。
如上所述的完全抗原，所述完全抗原通过戊二醛法偶联制备。
第三方面，本发明提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体以上述的完全抗原免疫小鼠制备得到。
第四方面，本发明还提供一种多克隆抗体，所述多克隆抗体以上述完全抗原为抗原经过免疫兔或羊制备得到。
第五方面，本发明提供一种测定β-乳球蛋白残留量的方法，包括如下步骤：
S1：合成β-乳球蛋白作用表位肽，所述β-乳球蛋白作用表位肽的氨基酸序列为CGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYS；
S2：将步骤S1合成的β-乳球蛋白作用表位肽与牛血清蛋白进行偶联，制备得到完全抗原；
S3：以步骤S2制备的完全抗原为抗原，制备得到单克隆抗体；或者：
以β-乳球蛋白的完全蛋白为抗原，制备得到单克隆抗体；
或者：
以步骤S2制备的完全抗原为抗原，制备得到多克隆抗体；
S4：以步骤S3制备得到的单克隆抗体或者多克隆抗体为一抗，采用间接竞争ELISA方法检测不同蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解液中β-乳球蛋白残留量。
如上所述的方法，步骤S4中，采用间接竞争ELISA方法检测时，
如果以作用表位的完全抗原免疫制备的单抗为测定用的一抗，其稀释倍数为5000-10000倍；酶标二抗的稀释倍数为500-2000倍；
如果以β-乳球蛋白免疫制备的单克隆抗体为测定用的一抗，其稀释倍数为2500-5000倍；酶标二抗的稀释倍数为500-2000倍；
如果以完全抗原免疫制备的多克隆抗体为测定用的一抗，其稀释倍数为200-300倍；酶标二抗的稀释倍数为500-2000倍。
如上所述的方法，步骤S3中，
所述酶标二抗为HRP-羊抗鼠IgG或者HRP-羊抗兔IgG。
优选地，步骤S4中采用间接竞争ELISA方法检测不同蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解物中残留β-乳球蛋白时，以作用表位完全抗原免疫制备的单抗作为测定用一抗，其检出限为14.80ng/mL，检出限最低，灵敏度最高。
第六方面，本发明还提供一种低苦味值的β-乳球蛋白水解物的制备方法，该方法采用木瓜蛋白酶或Protease M酶对β-乳球蛋白进行一次水解，得到一次水解产物，然后向一次水解产物中添加风味蛋白酶，得到低苦味值的β-乳球蛋白水解物。
优选地，一次水解过程中，木瓜蛋白酶或Protease M酶的添加量为4000-6000U/g。
优选地，二次水解过程中，风味蛋白酶的添加量为9-10LAPU/g。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明选择了β-乳球蛋白的一个显性表位，即AA12～37抗原表位肽作为免疫原，该抗原表位肽的完全抗原免疫制备的单克隆抗体只识别一个表位，具有很高的特异性，能够更加准确地检测酶解后的乳制品中的β-乳球蛋白及其致敏性残基。
本发明通过间接竞争ELISA方法实现对乳制品中β-乳球蛋白的定量检测和分析，以β-乳球蛋白的AA12～37显性表位抗原表位肽完全抗原作为免疫原，并利用该抗原表位肽完全抗原制备单克隆抗体。该单克隆抗体在ELISA检测方法中作为一抗，只识别一个表位，对水解物中残留的含有作用表位的肽段有极高的特异性，因此，本发明的测量方法对水解过敏原的检测更加准确。
另外，本发明的测量β-乳球蛋白残留量的方法可以用于探究不同特性的蛋白酶水解β-乳球蛋白作用表位的规律，筛选出能够有效降低过敏原作用表位的蛋白酶，确定降低抗原性最适宜的酶，进而制备出低致敏性牛乳制品，解决目前市售的添加乳蛋白水解物的婴幼儿低过敏配方粉由于作用表位水解不彻底造成的致敏问题。
附图说明
图1为实施例1中β-乳球蛋白B细胞作用表位AA12-37的HPLC图谱；
图2为实施例1中β-乳球蛋白B细胞作用表位AA12-37的MS图谱；
图3为实施例3中β-乳球蛋白、脱脂牛乳的SDS-PAGE电泳图谱；
图4为图3转印后的PVDF膜氨基黑染色图；
图5为实施例3中的抗原表位单抗的免疫印迹图；
图6为实施例4中β-乳球蛋白单抗免疫印迹图；
图7为对比例1中未被免疫小鼠的血清免疫印迹图；
图8为实施例5中完全抗原多抗的免疫印迹图
图9为对比例2中未被免疫的新西兰白兔阴性血清的免疫印迹图；
图10为实施例9中完全抗原单抗的间接竞争ELISA抑制曲线；
图11为实施例9中β-乳球蛋白单抗的间接竞争ELISA抑制曲线；
图12为实施例9中完全抗原多抗的间接竞争ELISA抑制曲线；
图13为实施例11中完全抗原单抗测定不同蛋白酶以及不同酶添加量下水解液中抗原残留量变化图；
图14为实施例12中β-乳球蛋白单抗测定的不同蛋白酶以及不同酶添加量下水解液抗原残留量变化图；
图15为实施例13中完全抗原多抗测定的不同蛋白酶以及不同酶添加量下水解液抗原残留量变化图；
图16为实施例14中不同种类蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解度对比图；
图17为实施例14中酶添加量为4000U/g时Protease M和木瓜蛋白酶水解液分子量分布图；
图18为实施例14中不同种类蛋白酶水解β-乳球蛋白后水解液的苦味值比较图；
图19实施例14中为两步水解产物的分子量分布图；
图20为实施例14中Protease M和木瓜蛋白酶两步水解产物的苦味值变化图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例提供一种β-乳球蛋白B细胞作用表位AA12～37的半抗原，该作用表位肽的氨基酸序列为CGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYS。
第二方面，本实施例提供一种上述作用表位肽的合成方法，具体地，采用固相合成法连接C-末端氨基酸和Wang树脂，并逐步进行缩合冷凝。合成后，用强酸从固相载体上切断序列，将合成后的作用表位多肽经高效液相色谱进行纯化，冻干以备后续使用。
如图1所示，合成后的作用表位多肽经高效液相色谱进行纯化，纯度达92.750％。用质谱法测定作用表位肽的相对分子质量，得到图2，即序列CGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYS的MS图谱，由图2可知，多肽的相对分子质量为2782.8，表明合成了正确的作用表位肽。
实施例2
本实施例提供一种完全抗原的合成方法，具体地，将实施例1中纯化后的作用表位肽与牛血清白蛋白(BSA)采用戊二醛法偶联，最终得到完全抗原。牛血清蛋白理化性质稳定，不易改变，免疫活性好，价廉易得，而且含有许多游离氨基，在不同pH值、离子强度和有机溶剂中具有良好的溶解性。
对完全抗原进行鉴定，具体地，将合成作用表位BSA和完全抗原分别在190-1100nm全波长下进行光谱扫描，载体蛋白BSA和合成多肽分别在210nm和200nm处有最大吸收峰。完全抗原在190-1100nm处存在两者的特征的吸收峰而且存在一定的光谱叠加现象。因此可以判定，作用表位肽与牛血清白蛋白初步偶联成功。
实施例3
本实施例提供一种单克隆抗体。
本实施例利用实施例2制备得到的完全抗原免疫BALB/c小鼠，经过4次免疫后，经细胞融合，细胞筛选，然后亚克隆多次，把活性高的这些细胞注射到BALB/c小鼠的腹腔内，进行培养，随后进行腹水收集，取单抗并进行纯化。
得到上述单克隆抗体后，本实施例采用间接酶联免疫(ELISA)方法测定单抗的效价。
抗原包被浓度均为5μg/mL，单克隆抗体依次按1:5000，1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000，1:320000，1:640000，1:1280000的倍数稀释。
单抗的效价的具体测定方法如下：
①抗原包被：将稀释过的抗原加入到酶标板中，每孔加入100μL，4℃下孵育12小时。
②洗涤：取出酶标板，每孔加入200μL的PBST，洗板3次，每次5min，洗涤完毕后将酶标板甩干。
③封闭：向酶标板的每个孔内加入100μL封闭液进行封闭，37℃下静置1h。
④加样：分别将不同稀释度的单克隆抗体以100μl/孔的量加入酶标板内，于37℃孵育2h，洗板。
⑤加酶标二抗：以100μl/孔的量将封闭液稀释后的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG加入到酶标板中，37℃下静置1h，洗板。
⑥显色：将新鲜配置的底物应用液以100μL/孔加到酶标板，常温下避光暗处反应20min，反应结束后每孔加入50μL浓度为2mol/L的硫酸以终止反应。
⑦比色：采用酶标仪在单波长450nm处测定各孔的吸光度值，计算溶液的OD值。
具体地，上述单抗的效价测定方法中，间接ELISA反应所需试剂的浓度以及成分如下：
PBS：pH7.4的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。
PBST：含0.05％吐温-20的PBS。
封闭液：含1％BSA的PBST。
抗原稀释液：pH9.6的50mmol/L的碳酸盐溶液。
用间接ELISA法测定完全抗原对应单抗的效价，结果如表1所示，P表示抗体的OD值，N表示未被免疫的小鼠血清的OD值。检测时以P/N值>2.1判定检测结果为阳性，P/N值<2.1判定检测结果为阴性。在抗体稀释倍数大于等于640000时，P/N值大于2.1，但当稀释度为1280000时，P/N值小于2.1，因此，完全抗原免疫得到的单抗效价可达到640000，抗体效价较高。
表1作用表位单克隆抗体效价的OD值
Figure GDA0004048724000000081
如图3所示，其为β-乳球蛋白，脱脂牛乳的SDS-PAGE电泳图谱。其中泳道1为Marker，泳道2为脱脂牛乳，泳道3为β-乳球蛋白，条带从下至上分别为α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、κ-酪蛋白、β-酪蛋白、α-酪蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白和乳铁传递蛋白。
凝胶上的蛋白条带通过电转印被转印到PVDF膜上，然后用氨基黑染色观察到清晰的图谱，表明蛋白完全转印到膜上，得到图4。
本实施例通过免疫印迹实验对完全抗原的单克隆抗体的特异性进行鉴定，结果见图5，其中，1表示β-乳球蛋白，2表示脱脂牛乳，完全抗原免疫制备的单克隆抗体与β-乳球蛋白和脱脂牛乳中的β-乳球蛋白均发生了特异性免疫反应，该抗体特异性良好，可以用于建立间接竞争ELISA方法。
使用小鼠IgE、IgG2a、IgG2、IgG1四种ELISA试剂盒对本实施例的单克隆抗体亚型进行鉴定，按照试剂盒上的使用说明书进行试验操作。经过鉴定，本实施例的单抗的亚型为IgG1。
实施例4
本实施例提供一种单克隆抗体，该单克隆抗体的制备方法与实施例3的制备方法相同，区别在于，本实施例制备的单克隆抗体以β-乳球蛋白的完全蛋白免疫BALB/c小鼠。
同样采用间接酶联免疫(ELISA)方法测定单抗的效价，结果如表2所示。表2中，P表示抗体的OD值，N表示未被免疫的小鼠血清的OD值。检测时以P/N值>2.1判定检测结果为阳性，P/N值<2.1判定检测结果为阴性。在抗体稀释倍数大于等于640000时，P/N值大于2.1，但当稀释度为1280000时，P/N值小于2.1，因此β-乳球蛋白单抗的效价可达到640000，效价较高。
表2β-乳球蛋白单克隆抗体效价的OD值
Figure GDA0004048724000000091
Figure GDA0004048724000000101
本实施例还通过免疫印迹实验对β-乳球蛋白对应的单克隆抗体的特异性进行鉴定，结果见图6，作用表位的完全抗原免疫制备的单克隆抗体与β-乳球蛋白和脱脂牛乳中的β-乳球蛋白均发生了特异性免疫反应，该抗体特异性良好，可以用于建立间接竞争ELISA方法。
使用小鼠IgE、IgG2a、IgG2、IgG1四种ELISA试剂盒对本实施例的单克隆抗体亚型进行鉴定，按照试剂盒上的使用说明书进行试验操作。经过鉴定，本实施例的单抗的亚型为IgG1。
对比例1
本对比例采用小鼠阴性血清进行免疫印迹试验，结果如图7所示，阴性小鼠血清与β-乳球蛋白、脱脂牛乳均不发生反应。因此，实施例3与实施例4中的单抗在用于建立间接竞争ELISA方法时可以排除假阳性反应。
实施例5
本实施例提供一种多克隆抗体。
在清洁级的动物实验室购入一只新西兰的白兔，重量约为2-2,5kg，适宜生长环境下监测1-2周，当它的身体和生存的状态最佳时可用于后续试验。
用实施例2制备得到的完全抗原免疫新西兰白兔，制备上述多克隆抗体。具体地，该抗体的制备方法如下：
①在第一次免疫中(第1天)，将1mL的佐剂和抗原进行乳化，直到他们的混合物乳化完全，以放于水中不会存在扩散现象为准，分别在白兔的后脚以及背部的皮下组织进行6至8处的体内免疫。
②在第二次免疫中(第22天)，将0.5ml佐剂和抗原进行乳化，知道二者的混合物乳化完全，以放于水中不发生扩散现象为准，然后在白兔的后背部选取4至6个点进行皮下接种。
③第三次免疫(第36天)，将0.5ml抗原注射于家兔背部皮下4-6个点。
④家兔耳缘静脉取1ml血(第50天)，离心分离血清检测其效价。
⑤第4次免疫(第50天)，将1ml抗原注射于家兔背部皮下4-6个点。
⑥取全血(第60天)，家兔颈动脉插管放血至死亡，于37℃温箱中放置30分钟后，于室温放置3小时，10000转/分钟进行离心，持续10分钟，最后将血清分离，备用。
得到上述多克隆抗体后，本实施例采用间接酶联免疫(ELISA)方法测定多抗的效价。
抗原包被浓度均为5μg/mL，单克隆抗体依次按1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200的倍数稀释。
多抗的效价的具体测定方法与实施例3相同，区别在于本实施例的效价测定中，一抗为上述方法制备得到的多克隆抗体，二抗为羊抗兔IgG。
同样采用间接ELISA法测定完全抗原多抗的效价，结果如表3所示，P表示抗体的OD值，N表示未被免疫的小鼠血清的OD值。检测时以P/N值>2.1判定检测结果为阳性，P/N值<2.1判定检测结果为阴性。在抗体稀释倍数大于等于1600时，P/N值大于2.1，但当稀释度为3200时，P/N值<2.1，因此由完全抗原制备的多克隆抗体效价为1：1600，效价较高。
表3完全抗原多克隆抗体效价的OD值
Figure GDA0004048724000000121
本实施例还通过免疫印迹实验对完全抗原免疫制备的多克隆抗体的特异性进行鉴定，结果见图8，完全抗原免疫制备的多克隆抗体与β-乳球蛋白和脱脂牛乳中的β-乳球蛋白均发生了特异性免疫反应，该抗体特异性良好，可以用于建立间接竞争ELISA方法。
对比例2
本对比例采用新西兰白兔阴性血清进行了免疫印迹试验，结果如图9所示，阴性小鼠血清与β-乳球蛋白、脱脂牛乳均不发生反应。因此，实施例5中的多抗在用于建立间接竞争ELISA方法时可以排除假阳性反应。
实施例6
本实施例提供一种测定乳制品中β-乳球蛋白残留量的方法，包括如下步骤：
采用间接竞争ELISA方法检测蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解液中β-乳球蛋白的残留量。
具体包括：
S1、抗原包被：以水解液中残留的β-乳球蛋白为抗原，将水解液以包被液稀释后加入酶标板，每孔加入100μL，4℃下孵育12小时。次日取出酶标板，每孔加入200μL的PBST，洗板3次。洗涤完成后甩干酶标板，向酶标板的每个孔内加入100μL封闭液，37℃下静置1h。
S2、加入一抗：将实施例3制备得到的单克隆抗体稀释后加入酶标板，每孔加入100μL稀释液，于37℃孵育2小时，然后洗板4次，每次5min，甩干。
S3、加入酶标二抗：将稀释后的HRP-羊抗鼠IgG作为二抗加入酶标板，每孔加入100μL稀释液，将酶标板于37℃下放置1h，然后洗板4次，每次5min。
S4、显色：将新鲜配置的底物应用液以100μL/孔加到酶标板，常温下避光暗处反应20min，每孔加入合适浓度的硫酸以终止反应。
S5、比色：利用酶标仪双波长检测，测定各个反应孔中的溶液在450nm与630nm处的OD值。
本实施例中，抗原包被浓度可以选择2.5μg/mL、5.0μg/mL或者10.0μg/mL。
进一步地，本实施例中，一抗的稀释倍数为2500倍。
本实施例中，酶标二抗的稀释倍数为500-2000倍。
OD值越接近1，对应的一抗、二抗以及抗原包被浓度越适宜。对上述不同抗原包被浓度下的各孔进行OD值测定，计算一列酶标板孔的平均值，结果如表4所示。
表4不同抗原包被浓度下同一稀释浓度酶标板孔的OD值
Figure GDA0004048724000000131
表4中的OD值都较接近1.0，因此本实施例中，2.5μg/mL、5.0μg/mL或者10.0μg/mL为较佳的抗原浓度，5000-10000倍为较佳的一抗稀释倍数。最佳的到完全抗原单抗的稀释倍数是10000倍，同时最佳的抗原孵育浓度是5μg/mL
对上述二抗稀释倍数下的酶标板各孔中的溶液进行OD值测定，计算一列酶标板孔中的平均值，结果如表5所示。
表5不同酶标二抗稀释浓度下的酶标板孔中溶液的OD值
Figure GDA0004048724000000141
表5中的OD值都较接近1.0，因此本实施例中，500、1000以及2000倍为较佳的二抗稀释倍数，最适的二抗的稀释倍数为2000倍。
对比例3-9
对比例3-9与实施例6的区别在于单抗的稀释倍数分别为2500、20000、40000、80000、160000、320000倍，另外，还设置未添加单抗的空白对照。
对上述不同浓度以及不同一抗稀释浓度下的酶标板各孔中的溶液进行OD值测定，计算一列酶标板孔的平均值，结果如表6所示。
表6不同抗原包被浓度与完全抗原的单抗稀释浓度下的OD值
Figure GDA0004048724000000142
比较表6中的OD值可知，当单抗稀释倍数为2500、20000、40000、80000、160000、320000以及未添加单抗时，测得的OD值与1.0相差较大。
对比例10-12
对比例10-12与实施例6的区别在于二抗的稀释倍数分别为4000、8000以及16000倍。
对上述二抗稀释倍数的OD值进行测定，结果如表7所示。
表7不同酶标二抗稀释浓度下的酶标板孔的OD值
Figure GDA0004048724000000151
比较表7中的OD值可知，当二抗稀释倍数为4000、8000以及16000时，测得的OD值与1.0相差较大。
实施例7
本实施例提供一种测定乳制品中β-乳球蛋白残留量的方法，包括如下步骤：
采用间接竞争ELISA方法检测蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解液中β-乳球蛋白的残留量。
具体包括：
S1、抗原包被：以水解液中残留的β-乳球蛋白为抗原，将水解液以包被液稀释后加入酶标板，每孔加入100μL，4℃下孵育12h。次日取出酶标板，每孔加入200μL的PBST，洗板3次，每次5min。洗涤完成后甩干酶标板，向酶标板的每个孔内加入100μL封闭液，37℃下静置1h。
S2、加入一抗：将实施例4制备得到的单克隆抗体稀释后加入酶标板，每孔加入100μL稀释液，于37℃孵育12h，然后洗板4次，每次5min，甩干。
S3、加入酶标二抗：将稀释后的HRP-羊抗鼠IgG作为二抗加入酶标板，每孔加入100μL稀释液，将酶标板于37℃下放置1h，然后洗板4次，每次5min。
S4、显色：将新鲜配置的底物应用液以100μL/孔加到酶标板，常温下避光暗处反应20min，每孔加入合适浓度的硫酸以终止反应。
S5、比色：利用酶标仪双波长检测，测定各个反应孔中的溶液在450nm与630nm处的OD值。
本实施例中，抗原包被浓度可以选择2.5μg/mL、5.0μg/mL或者10.0μg/mL。
进一步地，本实施例中，一抗的稀释倍数为2500-5000倍。
本实施例中，酶标二抗的稀释倍数为500-1000倍。
对上述不同抗原浓度下的各孔进行OD值测定，计算一列酶标板孔中溶液的平均OD值，结果如表8所示。
表8不同抗原包被浓度和不同β-乳球蛋白的单克隆抗体稀释浓度下酶标板各孔中溶液的OD值
Figure GDA0004048724000000161
表8中的OD值，都较接近1.0，因此本实施例中，2.5μg/mL、5.0μg/mL或者10.0μg/mL为较佳的抗原浓度，2500-10000倍为较佳的一抗稀释倍数。最佳的β-乳球蛋白单抗的稀释倍数是5000倍，同时最佳的抗原孵育浓度是5μg/mL。
对上述二抗稀释倍数下的酶标板各孔中的溶液进行OD值测定，计算一列酶标板孔中的平均值，结果如表9所示。
表9与β-乳球蛋白单抗反应的酶标二抗的最适工作浓度
Figure GDA0004048724000000171
表9中的OD值都较接近1.0，因此本实施例中，500、1000以及2000倍为较佳的二抗稀释倍数，最适的二抗的稀释倍数是1000倍。
对比例13-18
对比例13-18与实施例7的区别在于单抗的稀释倍数分别为20000、40000、80000、160000、320000倍，另外，还设置未添加单抗的空白对照。
对上述不同浓度以及不同一抗稀释浓度下的各孔进行OD值测定，计算一列酶标板孔的平均值，结果如表10所示。
表10不同抗原包被浓度和不同β-乳球蛋白的单克隆抗体稀释浓度下酶标板各孔中溶液的OD值
Figure GDA0004048724000000172
比较表10中的OD值可知，当单抗稀释倍数为20000、40000、80000、160000、320000以及未添加单抗时，测得的OD值与1.0相差较大。
对比例19-21
对比例19-21与实施例7的区别在于二抗的稀释倍数分别为4000、8000以及16000倍。
对上述二抗稀释倍数下酶标板各孔中溶液的OD值进行测定，结果如表11所示。
表11与β-乳球蛋白单抗反应的酶标二抗的最适工作浓度
Figure GDA0004048724000000181
比较表11中的OD值可知，当二抗稀释倍数为4000、8000以及16000时，测得的OD值与1.0相差较大。
实施例8
本实施例提供一种测定乳制品中β-乳球蛋白残留量的方法，包括如下步骤：
采用间接竞争ELISA方法检测蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解液中β-乳球蛋白的残留量。
具体包括：
S1、抗原包被：以水解液中残留的β-乳球蛋白为抗原，将水解液以包被液稀释后加入酶标板，每孔加入100μL，4℃下孵育12h。次日取出酶标板，每孔加入200μL的PBST，洗板3次，每次5min。洗涤完成后甩干酶标板，向酶标板的每个孔内加入100μL封闭液，37℃下静置1h。
S2、加入一抗：将实施例5制备得到的多克隆抗体稀释后加入酶标板，每孔加入100μL稀释液，于37℃孵育2h，然后洗板4次，每次5min，甩干。
S3、加入酶标二抗：将稀释后的HRP-羊抗兔IgG作为二抗加入酶标板，每孔加入100μL稀释液，将酶标板于37℃下放置1h，然后洗板4次，每次5min。
S4、显色：将新鲜配置的底物应用液以100μL/孔加到酶标板，常温下避光暗处反应20-30min，每孔加入合适浓度的硫酸以终止反应。
S5、比色：利用酶标仪双波长检测，测定各个反应孔中的溶液在450nm与630nm处的OD值。
本实施例中，抗原包被浓度可以选择2.5μg/mL、5.0μg/mL或者10.0μg/mL。
进一步地，本实施例中，多抗的稀释倍数为200-300倍。
本实施例中，酶标二抗的稀释倍数为150-300倍。
对上述不同抗原浓度以及不同多抗稀释浓度下的各孔进行OD值测定，计算一列酶标板孔的平均值，结果如表12所示。
表12抗原包被浓度和完全抗原的多克隆抗体工作浓度的确定
Figure GDA0004048724000000191
表12中，当抗原包被浓度为20.0μg/mL时OD值较接近1.0，因此本实施例中，20.0μg/mL为较佳的抗原浓度，250倍为较佳的一抗稀释倍数。
对上述二抗稀释倍数下的各孔进行OD值测定，计算一列酶标板孔中的平均值，结果如表13所示。
表13与完全抗原多抗反应的酶标二抗的最适工作浓度
Figure GDA0004048724000000192
上述表13中的OD值较接近1.0，因此本实施例中，250倍为较佳的二抗稀释倍数。
对比例20-24
对比例20-24与实施例8的区别在于多抗的稀释倍数分别为125、500、1000、2000倍，另外，还设置未添加多抗的空白对照。
对上述不同浓度以及不同多抗稀释浓度下的各孔进行OD值测定，计算一列酶标板孔的平均值，结果如表14所示。
表14抗原包被浓度和完全抗原的多克隆抗体工作浓度的确定
Figure GDA0004048724000000201
比较表10中的OD值可知，当单抗稀释倍数为20000、40000、80000、160000、320000以及未添加单抗时，测得的OD值与1.0相差较大。
对比例25-29
对比例25-29与实施例8的区别在于二抗的稀释倍数分别为125、500、1000、2000以及4000倍。
对上述二抗稀释倍数下酶标板各孔中溶液的OD值进行测定，结果如表15所示。
表15与完全抗原多抗反应的酶标二抗的最适工作浓度
Figure GDA0004048724000000202
Figure GDA0004048724000000211
比较表15中的OD值可知，当二抗稀释倍数为125、500、1000、2000以及4000时，测得的OD值与1.0相差较大。
实施例9
本实施例判定实施例6、实施例7以及实施例8中的测量方法的检出限。
具体地，分别以β-乳球蛋白质量浓度的常用对数和竞争抑制率为横坐标和纵坐标，作出间接竞争ELISA抑制曲线，得到图10-12。
竞争抑制率通过OD值来计算，具体参见公式1。
竞争抑制率(％)＝B/B0 1
公式1中，B为各相应浓度的β-乳球蛋白竞争抑制时的OD值，B0为无β-乳球蛋白竞争抑制时的OD值。
检出限的计算方法：随机选择10个酶标板孔进行零标准品间接竞争ELISA检测，计算D450值的标准差(SD)和平均值(D0)，按公式2计算LOD。
LOD＝(D0-3SD)/D0×100％ 2
由标准曲线可计算出对应的抗原质量浓度即为此方法的检测下限LOD。
实施例6中，当作用表位的完全抗原的单抗为一抗时，抗原浓度在10～1280ng/mL时，标准曲线线性关系较好，如图10所示，线性回归方程为y＝-15.385x+112.86(R2＝0.9958)，检出限为14.80ng/mL。
实施例7中，当一抗为β-乳球蛋白的单抗时，抗原浓度为10～640ng/mL时，标准曲线线性关系较好，如图11所示，线性回归方程为y＝-24.704x+119.89(R2＝0.9876)，检出限为52.48ng/mL。
实施例8中，当一抗为完全抗原的多抗时，抗原浓度为0～1280ng/mL时，标准曲线线性关系较好，如图12所示，线性回归方程为y＝-19.526x+112.56(R2＝0.9924)，检出限为75.96ng/mL。
因此，实施例6、实施例7、实施例8分别以作用表位的完全抗原单抗、β-乳球蛋白单抗以及完全抗原的多抗作为一抗，对β-乳球蛋白建立间接竞争ELISA，线性检测范围分别为10～1280ng/mL，10～640ng/mL，10～1280ng/mL。检出限分别为14.80ng/mL、52.48ng/mL以及75.96ng/mL。
并且，以作用表位肽完全抗原的单抗作为一抗建立的间接竞争ELISA法，检出限更低，灵敏度更高。
实施例10
本实施例对实施例6、实施例7以及实施例8中的测量方法的精确性和可重复性进行评价。
具体地，本实施例以批间误差和批内误差来评价实施例6、实施例7以及实施例8中的间接竞争ELISA法的可重复性和精确度。
实施例6中，以完全抗原的单抗作为一抗时，将β-乳球蛋白设计5个稀释梯度浓度，每个浓度作3次平行，3次重复，控制试验的反应条件、检测设备和所用的试剂都在完全相同的条件下进行，计算标准差，以其孔间变异系数表示批内误差，经过计算，变异系数在2.152％～5.385％范围内，说明方法精确性良好。
另外，用不同酶标板在不同的时间重复3次。将标准差和变异系数计算出来，以其批间变异系数来表示批间误差。经过计算，变异系数在4.119％～6.439％范围内，说明方法重复性良好。
实施例7中，以β-乳球蛋白的单抗作为一抗时，将β-乳球蛋白准备为5个梯度稀释浓度，所有浓度做3次平行，3次重复，ELISA试验在检测设备、所用试剂和反应条件完全相同的条件下进行，计算标准差，并以其孔间变异系数表示批内误差，经过计算，变异系数在1.119％～5.398％范围内，说明方法精确性良好。
使用不同酶标板在不同时间重复3次。将标准差和变异系数计算出来，以批间变异系数来表示批间误差。价格计算，变异系数在3.356％～6.397％范围内，说明方法重复性良好。
实施例8中，以完全抗原的多抗作为一抗时，将β-乳球蛋白准备5个梯度稀释浓度，所有浓度作3次平行，3次重复，ELISA试验在检测设备、所用试剂和反应条件完全相同的条件下进行，经过计算，批内误差以其孔间变异系数表示，经过计算，变异系数在1.472％～6.306％范围内，说明方法精确性良好。
使用不同酶标板在不同时间重复3次。将标准差和变异系数计算出，以批间变异系数来表示批间误差。经过计算，变异系数在0.780％～6.480％范围内，说明方法重复性良好。
因此，实施例6、实施例7以及实施例8中的测量方法的板内误差和板间误差的变异系数在正常范围内，该方法精确性高，重复性好。
实施例11
本实施例分别将实施例6的测量方法应用于蛋白酶筛选。
具体地，取30份相同的牛乳制品，平均分为6组，每组5份。向每组乳制品中分别加入2000U/g、3000U/g、4000U/g、5000U/g、6000U/g的胃蛋白酶(Pepsin)、木瓜蛋白酶(Papain)、碱性蛋白酶-地衣芽孢杆菌(Alcalase)、中性蛋白酶-枯草芽孢杆菌、Neutrase)、复合蛋白酶-枯草杆菌(Protamex)以及蛋白酶Protease M，进行β-乳球蛋白的水解，得到水解液，制备成冻干粉。
向上述不同的β-乳球蛋白的酶解物冻干粉加入抗原稀释液，稀释到合适浓度，即抗原浓度在建立的间接竞争ELISA抑制曲线的范围之内以及检出限范围内。按照实施例6的间接竞争ELISA法程序，利用间接竞争ELISA抑制曲线，以完全抗原单抗作为一抗，对不同种类酶及不同酶添加量的水解液的抗原残留量进行检测。
将每组中乳制品中β-乳球蛋白的残留量绘制成折线，然后将6条折线汇总在同一附图中，6种β-乳球蛋白酶解液中抗原残留量随酶添加量的增加而减少的情况如图13所示。由图13可知，木瓜蛋白酶解液的抗原残留量在相同加酶量时小于其他酶类，最终木瓜蛋白酶的实验测定结果在0.252mg/mL-7.551mg/mL的范围之间。当酶添加量分别为为2000U/g、3000U/g、4000U/g、5000U/g、6000U/g时，木瓜蛋白酶的水解液抗原降低率分别为91.53％，93.21％，98.85％，99.20％，99.72％。
在相同的蛋白酶添加量时，Protease M酶解液抗原残留量低于复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶。Protease M的水解液的残留的抗原的量随加酶量增加而逐渐减少，最终的实验测定结果在2.075mg/mL-10.568mg/mL范围之间。
胃蛋白酶在相同的蛋白酶添加量时，其水解液中抗原残留量显著低于碱性蛋白酶。胃蛋白酶的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在4.977mg/mL-18.967mg/mL范围之间。
复合蛋白酶的酶解液在相同酶添加量时，其水解液中抗原残留量均高于其他5种酶解液，抗原残留量最大。复合蛋白酶酶解液抗原残留量在19.953～54.450mg/mL之间，当酶添加量为2000-4000U/g时随加酶量增加而显著降低，在4000-6000U/g时，残留量减少不显著。
碱性蛋白酶的水解液中残留的抗原的量显著的高于Protease M酶。其水解液残留的抗原的量的最终的实验测定结果在9.057mg/mL-53.703mg/mL之间。
中性蛋白酶的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在1.729-0.310mg/mL范围之间。
实施例12
本实施例分别将实施例7的测量方法应用于蛋白酶筛选。
本实施例与实施例11的区别在于，向不同的β-乳球蛋白的酶解物水解液添加β-乳球蛋白对应的单抗作为一抗，对不同种类酶及不同酶添加量的水解液的抗原残留量进行检测。
6种β-乳球蛋白酶解液中抗原残留量随添加量的增加而减少的情况如图14所示。木瓜蛋白酶解液的抗原残留量在相同加酶量时在六种酶中最低，其随加酶量增加而减少，在13.122-11.891ng/mL之间。木瓜蛋白酶水解液抗原降低率，即(未水解抗原残留量-测定水解物残留量)/未水解抗原残留量，其在酶添加量为2000U/g-6000U/g时，抗原降低率分别为75.682％，75.962％，76.884％，77.544％，77.963％。
Protease M的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在19.687ng/mL17.032ng/mL范围之间。
胃蛋白酶的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在24.571ng/mL22.030 ng/mL范围之间。
复合蛋白酶的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在33.261ng/mL-23.425ng/mL范围之间。
相同的加酶的量时，碱性蛋白酶的水解液的残留的抗原的量在时大于木ProteaseM，尤其是酶添加量在2000-5000U/g时，差异显著。碱性蛋白酶水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在31.985ng/mL-22.624ng/mL范围之间。
中性蛋白酶的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在20.370ng/mL-31.261ng/mL范围之间。
实施例13
本实施例分别将实施例8的测量方法应用于蛋白酶筛选。
本实施例与实施例11的区别在于，向不同的β-乳球蛋白的酶解物水解液添加完全抗原对应的多抗作为一抗，对不同种类酶及不同酶添加量的水解液的抗原残留量进行检测。
6种β-乳球蛋白酶解液中抗原残留量随添加量的增加而减少的情况如图15所示。木瓜蛋白酶解液的抗原残留量酶添加量为4000-6000U/g时相比其他酶类最小，其随加酶量增加而减少，在0.350-1.375mg/mL之间。木瓜蛋白酶水解液抗原降低率，即(未水解抗原残留量-测定水解物残留量)/未水解抗原残留量，其在酶添加量为2000U/g-6000U/g时，抗原降低率分别为93.89％，96.36％，97.83％，98.20％，98.44％。
在相同的蛋白酶的添加的量的情况下，Protease M的水解液的残留的抗原的量低于其他四种酶，其中显著性低于胃蛋白酶，其水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在0.447mg/mL～1.259mg/mL范围之间。
在蛋白酶的添加的量一样时，胃蛋白酶的水解液中残留的抗原的量最高，残留的抗原的量与酶添加量呈现负相关关系，2000-4000U/g时，差异表现出显著性，而在4000-6000U/g差异表现出不显著性。其水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在3.614mg/mL～13.182mg/mL范围之间。
复合蛋白酶的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在0.719-2.254mg/mL范围之间。
碱性蛋白酶的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在0.640mg/mL-3.006mg/mL范围之间。
在一样的蛋白酶的加酶量时，中性蛋白酶的水解液中残留的抗原的量显著低于胃蛋白酶的水解液。中性蛋白酶的水解液的残留的抗原的量的最终的实验测定结果在2.432-5.433mg/mL之间。在2000-6000U/g时，抗原残留量减少整体呈现平缓趋势。
通过上述实施例11-13可知：
以完全抗原的单抗、β-乳球蛋白单抗和完全抗原的多克隆抗体作为一抗所测的各酶解液中抗原残留量的减少效果排序不同。当完全抗原单抗为一抗，酶的添加的量分别为2000U/g、3000U/g时，残留的抗原的量由低到高依次为木瓜蛋白酶<Protease M<胃蛋白酶<中性蛋白酶<碱性蛋白酶<复合蛋白酶。但是当酶的添加的量分别为4000U/g、5000U/g、6000U/g时，残留的抗原的量与2000U/g和3000U/g的差别在于中性蛋白酶<胃蛋白酶。
当β-乳球蛋白的单抗为一抗时，残留的抗原的量从大到小依次为胃蛋白酶>Protease M>木瓜蛋白酶，其他三种酶类无明显的大小排序情况。
当完全抗原的多克隆抗体为一抗，在相同的酶添加量时，抗原残留量从低到高为木瓜蛋白酶<Protease M<复合蛋白酶<碱性蛋白酶<中性蛋白酶<胃蛋白酶。
因此，通过实施例11-13可知，实施例6-8的测量β-乳球蛋白残留量的方法可以用于探究不同特性的蛋白酶水解β-乳球蛋白作用表位的规律，确定降低抗原性最适宜的酶筛选出能够有效降低过敏原作用表位的蛋白酶，确定降低抗原性最适宜的酶，进而制备出低致敏性牛乳制品，解决目前市售的添加乳蛋白水解物的婴幼儿低过敏配方粉由于作用表位水解不彻底造成的致敏问题。
实施例14
本实施例对不同蛋白酶水解β-乳球蛋白后水解液的水解度、苦味值以及分子量进行测量，并且提供一种低苦味值的β-乳球蛋白水解物的制备方法。
取36份相同的向乳制品，平均分为6组，每组6份。向每组乳制品中分别加入0U/g、2000U/g、3000U/g、4000U/g、5000U/g、6000U/g的胃蛋白酶(Pepsin)、木瓜蛋白酶(Papain)、碱性蛋白酶-地衣芽孢杆菌(Alcalase)、中性蛋白酶-枯草芽孢杆菌、Neutrase)、复合蛋白酶-枯草杆菌(Protamex)以及蛋白酶Protease M，对乳制品中的β-乳球蛋白进行水解，得到水解液。
使用OPA法测定水解液的水解度，将不同浓度下每种蛋白酶的水解度绘制成折线，然后将折线汇总于同一附图中，得到图16的不同种类蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解度对比图。
由图16可知，木瓜蛋白酶和Protease M水解活力最高，当酶添加量相同时，该两种酶的水解度显著高于其他酶，且水解度分布在21％-30％之间。当Protease M的加酶量在2000-4000U/g时，水解度显著增加，但在4000-6000U/g时，水解度增加但不显著。水解后的蛋白质溶液的水解程度通常用水解度来表示，水解度定义为蛋白质分子水解时被打断的肽键占蛋白质分子中肽键总数的比例。目前认为，蛋白酶水解产物的水解度在10％以下为轻度水解，水解度在10％-20％之间为中度水解，水解度在20％以上为深度水解。
在加酶量为2000-3000U/g时，木瓜蛋白酶水解液的水解度略高于Protease M，在加酶量为3000-6000U/g时水解度略低于Protease M，随加酶量的提高水解度的升高不显著，水解度在24％～36％之间。
碱性蛋白酶的水解度的最终的实验的测定的结果在11％-16％的范围之间。
中性蛋白酶的水解液的水解度的最终的实验的测定的结果在10％-14％的范围之间。
胃蛋白酶在酶添加的量为2000-5000U/g时，水解度稍微高于复合蛋白酶，在9-12％范围之间。只有在酶添加的量是6000U/g时水解度稍微低于复合蛋白酶的水解物的水解度。
复合蛋白酶的水解液的水解度最终的实验的测定的结果在3％-14％的范围之间。
总的来说，酸性蛋白酶中水解度最低的是胃蛋白酶，属于轻度水解。碱性蛋白酶Alcalase的水解度偏低，属于轻中度水解。在较大加酶量时，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶Neutrase和复合蛋白酶，木瓜蛋白酶水解度最大，其次是复合蛋白酶、中性蛋白酶，都属于中度水解，但加酶量在2000-4000U/g范围时，复合蛋白酶的水解度小于10％，属于轻度水解，而木瓜蛋白酶，中性蛋白酶Neutrase在酶添加量为2000-4000U/g范围时均为中度水解，他们都是中性蛋白酶。Protease M水解度较高，达到深度水解。
基于以上水解度的测定结果，本实施例测定残留量较低的两种水解物，即在酶添加量为4000U/g时测量木瓜蛋白酶和Protease M水解液分子量分布情况。采用液相色谱与质谱联用的方法对上述两种水解物的分子量进行测定，得到图17的Protease M和木瓜蛋白酶水解液分子量分布图。
由图17可知，Protease M水解物中分子量为330Da-550Da的组分占95.3210％，分子量为550Da-680Da的组分占2.5289％，分子量为680Da-790Da的组分占1.1559％，分子量为790Da-940Da的组分占0.6684％，分子量为940Da-1960Da的组分占0.3180％，分子量为>1960Da的组分占0.0078％。
木瓜蛋白酶水解物中分子量为330Da-550Da的组分占93.7741％，分子量为550Da-680Da的组分占3.9822％，分子量为680Da-790Da的组分占1.3407％，分子量为790Da-940Da的组分占0.6739％，分子量为940Da-1960Da的组分占0.2290％，分子量为>1960Da的组分占0.0001％。
使用感官评价法评定各蛋白酶水解液的苦味值，结果如图18所示。
由图18可知，Protease M酶解物的苦味值高于其他酶类，苦味值在6.6-7.0之间。随着加酶的量的增加，苦味值没有显著性的增加。
复合蛋白酶的水解物的苦味值的最终的实验的测定的结果在6.2-6.5范围之间。
胃蛋白酶和碱性蛋白酶的水解液的苦味值没有显著性差异，苦味值在5.5-6.0之间，随着加酶的量的增加苦味值没有显著变化。
中性蛋白酶的水解物的苦味值的最终的实验的测定的结果在5.1-5.4范围之间。
木瓜蛋白酶的水解物的苦味值显著低于其他5种酶水解物，苦味值在4.2-4.4之间，随加酶的量的增加苦味值没有显著变化。
六种蛋白酶水解产物的苦味值从低到高依次为木瓜蛋白酶<中性蛋白酶<碱性蛋白酶Alcalase<胃蛋白酶<复合蛋白酶<Protease M，其中苦味值最低的是木瓜蛋白酶水解物。
由上述内容可知，木瓜蛋白酶和Protease M两种酶的水解活力最高，因此最适合用于制备β-乳球蛋白残留量较低的乳制品。然而Protease M水解后的水解液苦味最高。
为了解决Protease M水解后的水解液风味差的问题，本实施例提供一种低苦味值的β-乳球蛋白水解物的制备方法，该方法采用木瓜蛋白酶或Protease M酶对β-乳球蛋白进行一次水解，得到一次水解产物，然后向一次水解产物中添加风味蛋白酶，得到低苦味值的β-乳球蛋白水解物。
优选地，一次水解过程中，木瓜蛋白酶或Protease M酶的添加量为4000-6000U/g。
优选地，二次水解过程中，风味蛋白酶的添加量为9-10LAPU/g。
对上述经过两步水解的水解产物进行分子量分布及苦味值的测定：两步水解产物的分子量分布如图19所示，由图19可知，与一步水解酶添加量4000U/g ProteaseM的水解物相比，分子量为330-550Da的组分占比从95.3210％上升到96.2906％，分子量为550Da-680Da的组分2.5289％下降到2.4511％，分子量为680Da-790Da的组分1.1559％下降到0.7548％，分子量为790Da-940Da的组分0.6684％下降到0.3617％，分子量为940Da-1960Da的组分0.3180％下降到0.1401％，分子量为>1960Da的组分0.0078％下降到0.0017％。
与一步水解酶添加量4000U/g木瓜蛋白酶的水解物相比，分子量为330-550Da的组分占比从93.7741％上升到97.2499％，分子量为550Da-680Da的组分3.9822％下降到1.9589％，分子量为680Da-790Da的组分1.3407％下降到0.5378％，分子量为790Da-940Da的组分0.6739％下降到0.2014％，分子量为940Da-1960Da的组分0.2290％下降到0.0519％，分子量为>1960Da的组分下降了10-6％。总的来说，经过风味蛋白酶二次水解后，整体水解物的分子量有所减小。
两步水解产物的苦味评价结果如图20所示。由图20可知，随着风味蛋白酶添加量的增加，水解物的苦味值逐渐下降。与一步水解物的苦味值相比，添加风味蛋白酶水解后苦味显著降低，表明风味蛋白酶能够有效地降低水解物的苦味，原因在于风味蛋白酶将水解物中的苦味肽水解成了更小的肽，降低了水解物的苦味值。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 一种β-乳球蛋白的抗原表位肽、完全抗原、抗体以及测定β-乳球蛋白残留量的方法
<141> 2021-05-31
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Cys Gly Ala Gln Ala Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp
1 5 10 15
Ile Gln Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser
20 25

Claims (7)

1.一种β-乳球蛋白的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列为CGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYS。
2.一种根据权利要求1所述的抗原表位肽和牛血清蛋白偶联得到的完全抗原。
3.根据权利要求2所述的完全抗原，其特征在于，所述完全抗原通过戊二醛法偶联制备。
4.一种多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体以权利要求2或权利要求3所述的完全抗原为抗原经过免疫兔或羊制备得到。
5.一种测定β-乳球蛋白残留量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：合成β-乳球蛋白作用表位肽，所述β-乳球蛋白作用表位肽的氨基酸序列为CGAQALIVTQTMKGLDIQKVAGTWYS；
S2：将步骤S1合成的β-乳球蛋白作用表位肽与牛血清蛋白进行偶联，制备得到完全抗原；
S3：以步骤S2制备的完全抗原为抗原，制备得到单克隆抗体；
或者：
以步骤S2制备的完全抗原为抗原，制备得到多克隆抗体；
S4：以步骤S3制备得到的单克隆抗体或者多克隆抗体为一抗，采用间接竞争ELISA方法检测不同蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解液中β-乳球蛋白残留量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S4中，采用间接竞争ELISA方法检测时，
如果以作用表位的完全抗原免疫制备的单抗为测定用的一抗，其稀释倍数为5000-10000倍；酶标二抗的稀释倍数为500-2000倍；
如果以作用表位的完全抗原免疫制备的多克隆抗体为测定用的一抗，其稀释倍数为200-300倍；酶标二抗的稀释倍数为500-2000倍。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S4中，
所述酶标二抗为HRP-羊抗鼠IgG或者HRP-羊抗兔IgG。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874310B (zh) * 2022-06-15 2024-03-26 澳优乳业（中国）有限公司 乳清过敏原β-乳球蛋白的IgG表位肽
CN114891085B (zh) * 2022-06-15 2024-03-26 澳优乳业（中国）有限公司 乳清过敏原β-乳球蛋白的IgE表位肽
CN116794296B (zh) * 2023-08-15 2024-03-08 美维仕(北京)健康管理有限公司 检测水解配方食品致敏性的方法和试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07285999A (ja) * 1993-03-30 1995-10-31 Prima Meat Packers Ltd Ｅｌｉｓａを用いた食品中の乳蛋白質含量の定量分析方法及びその分析用に選別されたモノクローナル抗体及びそのモノクローナル抗体の選別方法
CN104931710A (zh) * 2015-06-17 2015-09-23 深圳大学 一种定量检测牛乳β-乳球蛋白的双抗体夹心法
CN106248956A (zh) * 2016-07-18 2016-12-21 南昌大学 一种基于胶体金探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07285999A (ja) * 1993-03-30 1995-10-31 Prima Meat Packers Ltd Ｅｌｉｓａを用いた食品中の乳蛋白質含量の定量分析方法及びその分析用に選別されたモノクローナル抗体及びそのモノクローナル抗体の選別方法
CN104931710A (zh) * 2015-06-17 2015-09-23 深圳大学 一种定量检测牛乳β-乳球蛋白的双抗体夹心法
CN106248956A (zh) * 2016-07-18 2016-12-21 南昌大学 一种基于胶体金探针检测牛乳β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
牛奶过敏原β-乳球蛋白抗体的制备及免疫检测方法的建立;李亚璞等;《现代食品科技》;20180905(第10期);第225-230页 *
牛奶过敏原β-乳球蛋白的单克隆抗体制备及其双抗体夹心法的建立;陈献雄;《食品安全质量检测学报》;20151130;第6卷(第11期);第4545-4550页 *

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