CN110208546A - 同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法 - Google Patents

同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110208546A
CN110208546A CN201910568538.5A CN201910568538A CN110208546A CN 110208546 A CN110208546 A CN 110208546A CN 201910568538 A CN201910568538 A CN 201910568538A CN 110208546 A CN110208546 A CN 110208546A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hole
kinds
beta lactoglobulin
detecting
anaphylactogens
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910568538.5A
Other languages
English (en)
Inventor
李书国
王佳蕊
郝雅茹
齐慧丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei University of Science and Technology
Original Assignee
Hebei University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei University of Science and Technology filed Critical Hebei University of Science and Technology
Priority to CN201910568538.5A priority Critical patent/CN110208546A/zh
Publication of CN110208546A publication Critical patent/CN110208546A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种同时检测乳制品中β‑乳球蛋白和a‑乳白蛋白两种过敏原的方法，属于生物免疫分析领域。该方法将β‑乳球蛋白和α‑乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β‑乳球蛋白抗体和α‑乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体为二抗，四甲基联苯胺(TMB)作为底物显色液，然后建立灵敏、特异性强的间接竞争ELISA，最后对结果进行数据分析。该方法不仅具有ELISA法的灵敏度高、特异性强、重复性好特点，而且最大优势在于省时省力，一次可包被两种抗原，并同时检测两种抗原性，突破以往检测单一过敏原的模式，可用于同时检测乳制品中过敏原β‑乳球蛋白和a‑乳白蛋白的总含量。

Description

同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的 方法
技术领域
本发明涉及生物免疫分析技术领域，尤其涉及一种同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法。
背景技术
乳制品富含蛋白质及多种矿物质，但其是一类容易引起过敏的食物，在儿童中发病率大约为0.3％-7.5％，食物过敏是由某种食物或食品添加剂等引起的IgE介导和非IgE介导的免疫反应，可导致消化系统或全身性的变态反应。近些年由于生活方式的改变、微生物的暴露、饮食习惯的改变等多种因素，婴幼儿的肠道免疫功能越来越低下，越来越多的婴幼儿患有牛乳蛋白过敏，这对他们的生活和家庭都带来极大的不便。
牛乳蛋白过敏(cow milk protein allergy，CMPA)是指由牛奶蛋白引起的异常或过强的免疫反应，一般情况下，特应性皮炎是婴幼儿CMPA的主要表现形式，这是一种慢性反复，伴有瘙痒的皮肤病，荨麻疹为常见的表现形式。经研究表明，CMPA主要致病原因是由乳糖中的αs1-酪蛋白(αs1-casein,αs1-CN)、α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-La)和β-乳球蛋白(β--lactoglobulin,β-Lg)作为常见过敏原而引起的，这些蛋白都含有可以被免疫系统识别的抗原表位，包括构象表位和线性表位。
人乳中不含有β-乳球蛋白，因此它被认为是最主要的牛乳过敏原之一，有研究证明，82％的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。α-乳白蛋白与人乳相比，虽有74％的氨基酸相同，但目前也是公认的引发牛乳过敏的主要过敏原之一，研究表明有75％的牛乳过敏患者血清中含有α-乳白蛋白的特异性抗体。因此，乳制品中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白都是主要过敏原。目前婴幼儿对乳制品过敏现象越来越多，因此准确检测其中过敏原尤为重要。
目前乳制品中的定量检测的方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱法，高效液相仪器价格昂贵，成本较大，酶联免疫法凭借高灵敏、快速、处理样品多等特点颇受欢迎，但目前运用酶联免疫法检测得都是单一的过敏原，但目前针对运用酶联免疫法检测多种过敏源的报道较少，同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法目前还未见报道。
发明内容
本发明针对上述技术问题，基于间接竞争酶联免疫原理，提供一种同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其优点既具备了快速、高灵敏，又能同时检测两种过敏原，达到了省时省力的效果。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，将β-乳球蛋白和α-乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β-乳球蛋白抗体和α-乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，采用间接竞争酶联免疫法同时检测两种过敏原的抗原性，其中，抗原包被的质量浓度为0.2～10.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:4000～16000。
优选地，抗原包被的质量浓度为0.5～5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:8000～12000。
更优选地，抗原包被的质量浓度为5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为12000。
优选地，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:5000～1:40000。
更优选地，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:10000。
上述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，包括以下步骤：标准曲线的建立、样品吸光值测定、以及根据标准曲线计算得到牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度。
具体地，标准曲线的建立方法为：
(1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；
(2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST震荡洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(4)竞争结合：用PBS稀释β-乳球蛋白和a-乳白蛋白混合标准品，做0.1ng/ml～1000ng/ml梯度稀释，并与所述的稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；
(7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应；
(8)吸光值测定：采用双波长测定各孔的OD450和OD620值，实际OD＝OD450-OD620；
(9)标准曲线的绘制：将混合β-乳球蛋白和a-乳白蛋白标品各浓度对应的OD值转换成B/B0的％值，抗原浓度为0时的OD值为B0，其余浓度对应的OD值为B；以B/B0％值为纵坐标，以相对应的抗原浓度的对数为横坐标，制作标准曲线；
(10)线性回归线段：选择标准曲线呈明显相关的区段，根据公式Logit((B/B0)％)＝ln(B/(B0-B))，计算各标准点的Logit((B/B0)％)，再做对应的抗原浓度的对数的Logit((B/B0％)回归分析。
样品吸光值测定的方法为：
(1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；
(2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(4)抗原抗体结合：将待测样品分别处理为所述稀释度的待测液，并与所述稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；
(7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应；
(8)吸光值测定：采用双波长测定各孔的OD450和OD620值，实际OD＝OD450-OD620。
其中，所述待测样品为牛乳、奶粉、乳清蛋白粉和水解乳清蛋白粉中的一种或多种。
待测样品的预处理方法为：
对于液体样品：
(1)脱脂：将待测样品用4层消毒纱布过滤，去除固体杂质，随后用4℃冷冻离心机2500g转速，10min脱脂，得到脱脂乳；
(2)去除酪蛋白：采用等电点沉淀法，将脱脂乳用1mol/L盐酸调其pH至4.6，10min中后使用4℃冷冻离心机2500g转速，15min收集上清液，得到乳清；
(3)去除乳糖及矿物质：将得到的乳清在70℃中预热30min，采用超滤技术截留乳糖以及矿物质成分，得到脱除乳糖的乳清，4℃以下保存待测。
对于固体样品：
取1g样品于50mlPBS溶液中，剧烈震荡5min混匀备用，待测时需稀释到一定倍数检测。
与现有技术相比，本发明的技术效果：
本发明针对β-乳球蛋白和a-乳白蛋白这两种过敏原，提供一种间接竞争酶联免疫的检测方法，突破传统仅检测单一过敏原的模式，达到同时检测两种抗原性的效果，并且检测限低可达10ng/ml，具有快速灵敏和省时省力多种特点，同时也可以在过敏原检测方面提供一种新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为β-L G和α-LA间接竞争ELISA法标准曲线；
图2为β-L G和α-LA间接竞争ELISA法的Logit回归线性拟合曲线。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。
(1)主要试剂与材料
β-乳球蛋白(β-L G，Sigma，L3908)、α-乳白蛋白(α-LA，Sigma，L5385)、Anti-Lactoglobulin beta抗体(abcam，ab112893)、Anti-alpha Lactalbumin抗体(abcam，ab112972)、HRP标记的羊抗兔Ig G(Solarbio，SE134)、牛血清白蛋白BSA(A500023-0005，Songon Biotech)、四甲基联苯胺双组分显色液(TMB，Solarbio，PR1210)、牛奶(市内某超市购买)。
(2)主要仪器
酶标仪(Multiskan FC型)，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；96孔酶标板(42592)，美国康宁；冷冻离心机(FRESCO21)，美国赛默飞世尔公司。
(3)缓冲液及其他溶液的配置
a.磷酸盐缓冲液(0.01M，PBS，pH7.4)：称取8.00gNaCl，3.58gNa2HPO4·12H2O，0.24gKH2PO4，0.20gKCl，超纯水定容至1000ml；
b.洗涤液(PBST，pH7.4)：称取8.00gNaCl，3.58gNa2HPO4·12H2O，0.24gKH2PO4，0.20gKCl，0.5ml tween-20，超纯水定容至1000ml；
c.包被液(0.05mol/L磷酸盐缓冲液，pH9.6)：称取1.59gNa2CO3，2.93gNaHCO3，超纯水定容至1000ml；
d.封闭液(1％BSA)：1.00g溶于100mlPBS；
e.终止液：2mol/LH2SO4。
实施例1最佳包被抗原浓度与抗血清稀释度的确定
①抗原包被：用包被液将混合的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白稀释为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg/mL6个梯度，分别纵向加入酶标板，每孔100μL，37℃包被2h，随后倾倒，用PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
②封闭：用PBS缓冲液将BSA配为1g/100ml，每孔100μL加入酶标板，37℃温育1h，倾倒用PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
③竞争反应：用PBS缓冲液将混合抗β-乳球蛋白和抗α-乳白蛋白抗体稀释为1:2000、1:4000、1:8000、1:12000、1:16000和1:20000，分别横向加入酶标板，每孔100μL，37℃温育1.5h，倾倒用PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
④加酶标二抗：将羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体用PBS稀释为1:10000，以每孔100μL加入酶标板，37℃温育1h，倾倒用PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
⑤显色：将TMB双组分显色液等量混合在一起，现用现配，每孔100μL加入酶标板，37℃温育10min，取出；
⑥终止并读数：每孔加入50μL2mol/L的浓硫酸，酶标仪读取OD450和OD620值，OD＝OD450-OD620；
最佳包被抗原浓度与抗血清稀释度的确定采用方阵滴定法，一般来讲，选取OD值在1.0左右的作为最理想工作浓度，结果见表1。抗原和一抗的浓度过高过低都会影响反应的灵敏度，因此最终确定最佳抗原包被浓度为5.0μg/ml，混合抗血清最佳稀释度为1:12000。
表1β-LG和α-LA抗原质量浓度和抗血清稀释倍数的确定(OD值)
实施例2酶标二抗稀释度的确定
选取确定的最佳抗原包被浓度和混合抗血清稀释度，进行抗原包被、封闭、竞争结合等步骤，加酶标二抗时，将二抗用PBS稀释为1:5000、1:10000、1:20000、1:30000、1:40000，以每列一个稀释度做3个平行，37℃温育1h，倾倒用PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液，随后进行显色、终止和读数，最终选取OD值在1.0左右的作为最理想的酶标二抗稀释度，结果见表2。
表2酶标二抗稀释度选择
实施例3标准曲线的建立及线性范围的确定
①抗原包被：选取混合包被抗原浓度为5μg/ml，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；
②洗涤：次日倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
③封闭：按每孔100μL加入配好的BSA封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
④竞争结合：用PBS稀释β-乳球蛋白和a-乳白蛋白混合标准品，做梯度稀释(0.1ng/ml～1000ng/ml)，并与1:12000稀释度的一抗预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
⑤加酶标二抗：加入1:10000稀释度的羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
⑥显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；
⑦终止并读数：每孔加入50μL2mol/L的浓硫酸，酶标仪读取OD450和OD620值，OD＝OD450-OD620；
⑧标准曲线的绘制：将混合β-乳球蛋白和a-乳白蛋白标品各浓度对应的OD值转换成(B/B0)的％值，抗原浓度为0时的OD值为B0，其余浓度对应的OD值为B；以(B/B0)％值为纵坐标，以相对应的抗原浓度的对数为横坐标，制作标准曲线；
⑨线性回归线段：选择标准曲线呈明显相关的区段，根据公式Logit((B/B0)％)＝ln(B/(B0-B))，计算各标准点的Logit((B/B0)％)，再做对应的抗原浓度的对数的Logit((B/B0％)回归分析。
采用上述确定的最佳工作条件进行间接竞争ELISA法，得到对应浓度的OD值，以抗原浓度的对数(lg[β-LG+α-LA])为横坐标，以(B/B0)％值为纵坐标，作图得标准曲线，见附图1，选择标准曲线呈明显相关的区段做线性回归，见附图2。拟合的线性回归方程为y＝1.94998-0.52119X，R2＝0.99121，符合线性关系的判断标准，其中x为lg[β-LG+α-LA]，y为Logit((B/B0％)，具体计算方法如上，该方法的最佳检测范围在10ng/ml～200ng/ml，最低检测限可达10ng/ml，说明此方法灵敏度较高。
实施例4样品测定
选取市售新鲜牛乳，首先对样品进行前处理：
①脱脂:将牛奶用4层消毒纱布过滤，去除固体杂质，随后用4℃冷冻离心机(2500g转速，10min)脱脂，得到脱脂乳；
②去除酪蛋白:采用等电点沉淀法，将脱脂乳用1mol/L盐酸调其pH至4.6，10min中后使用4℃冷冻离心机(2500g转速，15min)收集上清液，得到乳清；
③去除乳糖及矿物质：将得到的乳清在70℃中预热30min，采用超滤技术截留乳糖以及一些矿物质成分，得到脱除乳糖的乳清，采用间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的含量，待测。
样品检测：
①抗原包被：选取混合包被抗原浓度为5μg/ml，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；
②洗涤：次日倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
③封闭：按每孔100μL加入配好的BSA封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
④竞争结合：将预处理得到的乳清用PBS稀释到一定工作浓度，并与1:12000稀释度的一抗预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
⑤加酶标二抗：加入1:10000稀释度的羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，每次3min，垂直甩干板内洗涤液；
⑥显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；
⑦终止并读数：每孔加入50μL2mol/L的浓硫酸，酶标仪读取OD450和OD620值，OD＝OD450-OD620；
⑧得到的OD值按线性回归方程式计算得到牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度，其浓度为44.02ng/ml，检测中将牛奶稀释了10000倍，故实际浓度为0.4402mg/ml。
实施例5样品测定
取乳清蛋白粉用PBS配成浓度为25mg/ml溶液，震荡混匀备用，采用间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的含量，方法步骤同实施例4，只需将④中牛乳换成水解乳清蛋白溶液即可。
得到的OD值按线性回归方程式计算得到牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度，其浓度为124.63ng/ml，检测中将乳清蛋白粉稀释了10000倍，故实际浓度为1.2463mg/ml。
实施例6样品测定
取水解乳清蛋白粉用PBS配成浓度为25mg/ml溶液，震荡混匀备用，采用间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的含量，方法步骤同实施例4，只需将④中牛乳换成水解乳清蛋白溶液即可。
得到的OD值按线性回归方程式计算得到牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度，其浓度为13.53ng/ml，检测中将水解乳清蛋白粉稀释了5000倍，故实际浓度为0.0677mg/ml。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (10)

1.同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，将β-乳球蛋白和α-乳白蛋白标准品等量混合作为包被抗原，抗β-乳球蛋白抗体和α-乳白蛋白抗体等量混合成混合抗血清作为一抗，采用间接竞争酶联免疫法同时检测两种过敏原的抗原性，其中，抗原包被的质量浓度为0.2～10.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:4000～16000。
2.根据权利要求1所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，抗原包被的质量浓度为0.5～5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为1:8000～12000。
3.根据权利要求2所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，抗原包被的质量浓度为5.0μg/ml，混合抗血清的稀释度为12000。
4.根据权利要求1所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:5000～1:40000。
5.根据权利要求4所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，酶标二抗采用羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，其稀释浓度为1:10000。
6.根据权利要求1-5任一项所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，包括以下步骤：标准曲线的建立、样品吸光值测定、以及根据标准曲线计算得到牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的浓度。
7.根据权利要求6所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，标准曲线的建立方法为：
(1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；
(2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST震荡洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(4)竞争结合：用PBS稀释β-乳球蛋白和a-乳白蛋白混合标准品，做0.1ng/ml～1000ng/ml梯度稀释，并与所述的稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；
(7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应；
(8)吸光值测定：采用双波长测定各孔的OD450和OD620值，实际OD＝OD450-OD620；
(9)标准曲线的绘制：将β-乳球蛋白和a-乳白蛋白混合标品各浓度对应的OD值转换成B/B0的％值，抗原浓度为0时的OD值为B0，其余浓度对应的OD值为B；以B/B0％值为纵坐标，以相对应的抗原浓度的对数为横坐标，制作标准曲线；
(10)线性回归线段：选择标准曲线呈明显相关的区段，计算各标准点的Logit((B/B0)％)，再做对应的抗原浓度的对数的Logit((B/B0％)回归分析。
8.根据权利要求6所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，样品吸光值测定的方法为：
(1)抗原包被：将包被抗原稀释到所述的质量浓度，每孔100μL包被酶标板，37℃包被2h；
(2)洗涤：倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(3)封闭：按每孔100μL加入封闭液，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(4)抗原抗体结合：将待测样品分别处理为所述稀释度的待测液，并与所述稀释度的混合抗血清预混，预混液每孔100μL，37℃反应1.5h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(5)加酶标二抗：加入羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记抗体，每孔100μL，37℃反应1h，倾倒孔内液体，PBST洗涤4次，垂直甩干板内洗涤液；
(6)显色：加入新鲜预混的TMB双组分显色液，每孔100μL，37℃反应10min；
(7)终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应；
(8)吸光值测定：采用双波长测定各孔的OD450和OD620值，实际OD＝OD450-OD620。
9.根据权利要求8所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，所述待测样品为牛乳、奶粉、乳清蛋白粉和水解乳清蛋白粉中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法，其特征在于，待测样品的预处理方法为：
对于液体样品：
(1)脱脂：将待测样品用4层消毒纱布过滤，去除固体杂质，随后用4℃冷冻离心机2500g转速，10min脱脂，得到脱脂乳；
(2)去除酪蛋白：采用等电点沉淀法，将脱脂乳用1mol/L盐酸调其pH至4.6，10min中后使用4℃冷冻离心机2500g转速，15min收集上清液，得到乳清；
(3)去除乳糖及矿物质：将得到的乳清在70℃中预热30min，采用超滤技术截留乳糖以及矿物质成分，得到脱除乳糖的乳清，4℃以下保存待测。
对于固体样品：
取1g样品于50mlPBS溶液中，剧烈震荡5min混匀备用，待测时需稀释到一定倍数检测。
CN201910568538.5A 2019-06-27 2019-06-27 同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法 Pending CN110208546A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910568538.5A CN110208546A (zh) 2019-06-27 2019-06-27 同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910568538.5A CN110208546A (zh) 2019-06-27 2019-06-27 同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110208546A true CN110208546A (zh) 2019-09-06

Family

ID=67795072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910568538.5A Pending CN110208546A (zh) 2019-06-27 2019-06-27 同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110208546A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112748248A (zh) * 2020-12-23 2021-05-04 郑州安图生物工程股份有限公司 一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒
CN114075565A (zh) * 2022-01-19 2022-02-22 中国农业大学 一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器
CN116794296A (zh) * 2023-08-15 2023-09-22 美维仕(北京)健康管理有限公司 检测水解配方食品致敏性的方法和试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102636650A (zh) * 2012-03-23 2012-08-15 沃克(天津)生物科技有限公司 牛奶过敏原检测板及其制备方法
CN108051580A (zh) * 2017-12-04 2018-05-18 南京祥中生物科技有限公司 一种同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法
US20180164297A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 General Mills, Inc. Detection of allergens using surface-enhanced raman scattering

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102636650A (zh) * 2012-03-23 2012-08-15 沃克(天津)生物科技有限公司 牛奶过敏原检测板及其制备方法
US20180164297A1 (en) * 2016-12-09 2018-06-14 General Mills, Inc. Detection of allergens using surface-enhanced raman scattering
CN108051580A (zh) * 2017-12-04 2018-05-18 南京祥中生物科技有限公司 一种同时检测α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白含量的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANK C MAO 等: "Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for Bovine α-Lactalbumin and β-Lactoglobulin in Serum and Tissue Culture Media", 《JOURNAL OF DAIRY SCIENCE》 *
常艳敏 等: "牛奶过敏患者血清特异性抗体检测方法构建", 《天津医药》 *
张忠华: "牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)——医药卫生科技辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112748248A (zh) * 2020-12-23 2021-05-04 郑州安图生物工程股份有限公司 一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒
CN112748248B (zh) * 2020-12-23 2022-06-14 郑州安图生物工程股份有限公司 一种牛奶过敏原特异性IgE检测试剂盒
CN114075565A (zh) * 2022-01-19 2022-02-22 中国农业大学 一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器
CN114075565B (zh) * 2022-01-19 2022-04-19 中国农业大学 一种用于检测β-乳球蛋白的双功能G-四链体变构生物传感器
CN116794296A (zh) * 2023-08-15 2023-09-22 美维仕(北京)健康管理有限公司 检测水解配方食品致敏性的方法和试剂盒
CN116794296B (zh) * 2023-08-15 2024-03-08 美维仕(北京)健康管理有限公司 检测水解配方食品致敏性的方法和试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110208546A (zh) 同时检测乳制品中β-乳球蛋白和a-乳白蛋白两种过敏原的方法
Bernard et al. Specificity of the human IgE response to the different purified caseins in allergy to cow’s milk proteins
CN111072774B (zh) 抗非洲猪瘟p30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒
BRPI0612217B1 (pt) DIAGNOSTIC KIT FOR SIMULTANEOUS MEASUREMENT OF DIFFERENT CLASS ANTIBIOTICS, DIAGNOSTIC KIT FOR SIMULTANEOUS MEASUREMENT OF ANALYZES CORRESPONDING TO DIFFERENT CLASS ANTIBIOTICS, DIAGNOSTIC KIT FOR SIMULTANEOUS MEASUREMENT OF ß-LACTAMAS, TETRACYCLINES AND SULFAMIDES AND METHOD FOR IMPLEMENTING THE DIAGNOSTIC KIT
CN108226513A (zh) 一种检测水牛乳和羊乳中掺伪牛乳的酶联免疫试剂盒
CN105324669B (zh) 用于检测rsv的免疫层析装置
CN108152512A (zh) 肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法
CN101561433B (zh) 一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒
CN104655847A (zh) 检测阿德呋啉的酶联免疫试剂盒及其检测方法
Indyk et al. Determination of immunoglobulin G in bovine colostrum and milk by direct biosensor SPR-immunoassay
CN105067815A (zh) 一种测定人血清中胃蛋白酶原i/ii含量的试剂盒
CN102043058A (zh) 用于预测肿瘤的乙酰金刚烷胺的检测试剂盒
CN106596958B (zh) 布鲁氏菌病cf-elisa抗体检测试剂盒
CN101315372A (zh) 一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测方法
CN108535486A (zh) 一种基于铕标记的氯霉素免疫荧光测定方法
CN101666802A (zh) 定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素b的胶体金免疫层析方法以及胶体金免疫检测试纸条
Oh et al. Use of biosensor technology in analysing milk and dairy components: A review
Chand et al. Comparison of milk-ELISA and serum-ELISA for the diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep
Tomassetti et al. Comparison of three immunosensor methods (surface plasmon resonance, screen-printed and classical amperometric immunosensors) for immunoglobulin G determination in human serum and animal or powdered milks
US20080038760A1 (en) Method for Detecting Anti-Transglutaminase Antibodies
CN101445551A (zh) BiP蛋白抗原表位多肽及其筛选方法与应用
Layton et al. The quantitation of IgG4 antibodies to three common food allergens by ELISA with monoclonal anti-IgG4
CN105785047A (zh) 一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法
CN108333367A (zh) 一种食品过敏原特异性IgE检测试剂盒及其应用
Rodríguez et al. Sandwich ELISA for detection of goats’ milk in ewes’ milk and cheese

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190906