ES2373044T3 - Procedimientos y composiciones para predecir la respuesta a warfarina. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para determinar una dosis de warfarina óptima para un sujeto humano, comprendiendo dicho procedimiento: determinar, en una molécula de ácido nucleico correspondiente a la SEQ ID NO: 1, que es de una muestra obtenida de un sujeto humano, el genotipo en las posiciones de nucleótidos 381 y/o 3673; e identificar la dosis de warfarina óptima para el sujeto basándose en dicha determinación.

Description

Procedimientos y composiciones para predecir la respuesta a warfarina
Esta solicitud fue respaldada en parte por la beca del Program for Genomic Applications (PGA) del NHLBI (U01 HL66682), la beca del Program for Genomic Applications (PGA) U01 HL66682, la beca NIII General Medical Sciences GM068797 y la beca del Center for Ecogenetics and Environmental Health patrocinada por UW NIEHS, NIEHS P30ES07033. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para predecir respuestas a fármacos. En particular, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para determinar dosis individualizadas de warfarina basándose en la presencia o ausencia de polimorfismos en el gen VKORC1. La presente invención proporciona además procedimientos y composiciones para determinar dosificaciones individuales de warfarina basándose en el nivel de expresión del gen VKORC1.
Antecedentes de la invención
Cada año se extienden más de 3.000 millones de recetas sólo en Estados Unidos, evitando o tratando eficazmente enfermedades en cientos de miles de personas. Pero las medicaciones con receta también pueden provocar efectos tóxicos potentes en un paciente. Estos efectos se llaman reacciones adversas a fármacos (RAF). Las reacciones adversas a fármacos pueden provocar daños graves y/o incluso la muerte. Las diferencias en las formas en que los individuos utilizan y eliminan los fármacos de sus organismos son una de las causas más importantes de las RAF. Las diferencias en el metabolismo también hacen que las dosis de fármacos sean menos eficaces de lo deseado en algunos individuos.
Más de 106.000 estadounidenses mueren -tres veces los que mueren en accidentes de coche -y otros 2,1 millones sufren daños graves cada año debido a reacciones adversas a fármacos. Las RAF son la cuarta causa principal de muerte para los estadounidenses. Sólo las enfermedades cardiacas, el cáncer y la apoplejía causan más muertes cada año. El siete por ciento de todos los pacientes hospitalarios se ven afectados RAF graves o fatales. Más de dos tercios de todas las RAF se producen fuera de los hospitales. Las reacciones adversas a fármacos son una causa de muerte, discapacidad y consumo de recursos grave, común y cada vez más frecuente.
Se calcula que las anomalías relacionadas con fármacos suponen casi el 10 por ciento de todos los ingresos hospitalarios. Se estima que la morbilidad y mortalidad en EE. UU. cuesta de 76.600 a 136.000 millones de dólares estadounidenses anualmente.
La mayoría de los fármacos con receta se prescriben actualmente en dosis estándar en un procedimiento "de talla única". No obstante, este procedimiento "de talla única" no considera importantes las diferencias genéticas que dan a los distintos individuos capacidades totalmente distintas para metabolizar y obtener beneficios de un fármaco concreto. Las diferencias genéticas pueden estar influenciadas por la raza o la etnia, pero también pueden ser muy impredecibles sin identificar la genómica correlacionada. Lo que se necesita son procedimientos mejorados para predecir la respuesta de un individuo a un fármaco dado o una dosificación en particular de un fármaco.
Sumario
La presente divulgación se refiere a procedimientos y composiciones para predecir respuestas a fármacos. En particular, la presente divulgación proporciona procedimientos y composiciones para determinar dosificaciones individualizadas de warfarina basándose en la presencia o ausencia de polimorfismos en el gen VKORC1. La presente divulgación proporciona además procedimientos y composiciones para determinar dosificaciones individuales de warfarina basándose en el nivel de expresión del gen VKORC1.
En consecuencia, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones, kits y procedimientos para determinar el nivel de la presencia de polimorfismos y/o expresión génica de VKORC1 (por ejemplo, midiendo la expresión del ARNm o la proteína de VKORC1) y correlacionando los niveles de expresión y/o polimorfismos con las dosificaciones de warfarina. En consecuencia, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento que comprende las etapas de: proporcionar una muestra de un sujeto; y determinar el haplotipo VKORC1 del sujeto, el genotipo PNS, o PNS en desequilibrio de ligamiento con cualquier PNS de diagnóstico. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de determinar la dosis óptima de warfarina para el sujeto basándose en el haplotipo VKORC1 del sujeto (por ejemplo, haplotipos H1, H2, H7, H8 o H9). En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de determinar el genotipo CYP2C9 del sujeto. En algunas realizaciones, determinar el genotipo VKORC1 del sujeto comprende el uso de un ensayo de detección a base de ácidos nucleicos (por ejemplo, un ensayo de secuenciación o un ensayo de hibridación). En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de determinar el tipo de clado del sujeto (por ejemplo, tipos de clado AA, AB o BB).
En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento que comprende las etapas de
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proporcionar una muestra de un sujeto; detectar el genotipo de un polimorfismo de nucleótido simple en una o más posiciones de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, las posiciones 381, 3673, 5808, 6484, 6853, 7566 y 9041 o cualquier polimorfismo en desequilibrio de ligamiento con estos sitios); y determinar la dosificación óptima de warfarina para el sujeto basándose en dicho genotipo del polimorfismo de nucleótido simple. En algunas realizaciones, determinar el genotipo VKORC1 del sujeto comprende el uso de un ensayo de detección basado en ácidos nucleicos (por ejemplo, un ensayo de secuenciación o un ensayo de hibridación).
La presente divulgación proporciona además un kit para determinar la dosis óptima para un sujeto para un fármaco coagulante de la sangre (por ejemplo, warfarina), que comprende: un ensayo de detección, donde el ensayo de detección es capaz de detectar específicamente el haplotipo VKORC1 del sujeto (por ejemplo, haplotipos H1, H2, H7, H8, o H9); e instrucciones para determinar la dosificación óptima de warfarina para el sujeto. En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para determinar el genotipo CYP2C9 del sujeto. En algunas realizaciones, el ensayo de detección es un ensayo de detección basado en ácidos nucleicos (por ejemplo, un ensayo de secuenciación o un ensayo de hibridación). En algunas realizaciones, el kit comprende además instrucciones para determinar el tipo de clado del sujeto (por ejemplo, tipos de clado AA, AB o BB).
En realizaciones adicionales, la presente divulgación proporciona un procedimiento que comprende:
proporcionar una muestra de un sujeto; y determinar el nivel de expresión de VKORC1 del sujeto para determinar su capacidad de respuesta al tratamiento con warfarina. En algunas realizaciones, el procedimiento comprendía además la etapa de determinar la dosis óptima de warfarina para el sujeto basándose en el nivel de expresión de VKORC1 del sujeto. En determinadas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de determinar el genotipo CYP2C9 de dicho sujeto. En algunas realizaciones determinar el nivel de expresión de VKORC1 del sujeto comprende determinar la cantidad de ARNm de VKORC1 expresada por dicho sujeto (por ejemplo, usando un ensayo de RT-PCR cuantitativa o un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos). En otras realizaciones, determinar el nivel de expresión de VKORC1 del sujeto comprende determinar la cantidad de polipéptido de VKORC1 expresada por el sujeto (por ejemplo, exponiendo la muestra a un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido de VKORC1).
La presente divulgación proporciona además un kit para determinar la dosificación óptima de warfarina, que comprende: reactivos para realizar un ensayo de detección, donde el ensayo de detección está configurado para detectar específicamente el nivel de expresión de VKORC1 del sujeto; e instrucciones para determinar la dosificación óptima de warfarina para el sujeto. En algunas realizaciones, los reactivos comprenden reactivos para determinar la cantidad de ARNm de VKORC1 expresada por el sujeto (por ejemplo, reactivos para un ensayo de RT-PCR o un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos). En otras realizaciones, los reactivos comprenden reactivos para determinar la cantidad de polipéptido de VKORC1 expresada por el sujeto (por ejemplo, un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido de VKORC1). En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para determinar el genotipo CYP2C9 de dicho sujeto.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra el efecto de los clados genealógicos de VKORC1 sobre las dosis clínicas de warfarina. El panel de arriba muestra haplotipos comunes determinados a partir de VKORC1 (H1 (SEQ ID NO: 14), H2 (SEQ ID NO: 15), H7 (SEQ ID NO: 16), H8 (SEQ ID NO: 17), y H9 (SEQ ID NO: 18). El panel inferior muestra dosificaciones de warfarina para pacientes clínicos (n = 185) clasificadas en función de mutaciones funcionales conocida en el locus CYP2C9 y el clado de VKORC1 (A/A (barras blancas), A/B (barras grises) y B/B (barras negras)).
La Figura 2 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de referencia genómica extendida para el gen VKORC1 (SEQ ID NO: 1).
La Figura 3 muestra que los grupos de haplotipos VKORC1 se correlacionan con la expresión de ARNm.
Definiciones
Para facilitar la comprensión de la presente invención, se definen a continuación varios términos y expresiones:
Como se usa en el presente documento, el término "polimorfismo de nucleótido simple" o "PNS" se refiere a cualquier posición a lo largo de una secuencia de nucleótidos que tiene uno o más nucleótidos variantes. Los polimorfismos de nucleótidos simples (PNS) son la forma más común de variación de la secuencia de ADN en el genoma humano y se definen generalmente como una diferencia respecto de la secuencia de ADN de referencia que se ha producido como parte del Human Genome Project o como una diferencia encontrada entre un subconjunto de individuos apartados de la población general. Los PNS se producen en una tasa aproximada de 1 PNS/1000 pares de bases cuando se comparan dos cromosomas humanos elegidos al azar. Pueden identificarse PNS extremadamente raros que pueden estar restringidos a un individuo o familia específicos, o al contrario, puede encontrarse que son extremadamente comunes en la población general (presente en muchos individuos no relacionados). Los PNS pueden surgir debido a errores en la replicación del ADN (es decir, espontáneamente) o debido a agentes mutagénicos (es decir, a partir de un material que daña el ADN) y pueden transmitirse durante la
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reproducción de organismo a generaciones posteriores de individuos.
Como se usa en el presente documento, el término "desequilibrio de ligamiento" se refiere a polimorfismos de nucleótido simple en los que los genotipos están correlacionados entre estos polimorfismos. Pueden usarse varias medidas estadísticas para cuantificar esta referencia de relación (es decir D', r2, etc.) (Véase, por ejemplo, Devlin y Risch 1995 Sep 20;29(2):311-22). En algunas realizaciones, se considera que una pareja PNS-PNS está en desequilibrio de ligamiento si r2 > 0,5,
Como se usa en el presente documento, el término "haplotipo" se refiere a un grupo de alelos estrechamente ligados que se heredan juntos. Como se usa en el presente documento, el término "clado de haplotipos" o "clado" se refiere a cualquier grupo de haplotipos que son todos más similares unos a otros de lo que lo es cualquiera de ellos a cualquier otro haplotipo. Los clados pueden identificarse, por ejemplo, realizando análisis de grupos estadísticos.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluidos, pero sin limitarse a, seres humanos, primates no humanos, roedores y similares. Normalmente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.
Como se usa en el presente documento, la expresión "animal transgénico no humano" se refiere a un animal no humano (preferentemente un mamífero, más preferentemente un ratón) cuyo gen VKORC1 endógeno se ha inactivado (por ejemplo como resultado de un "VKORC1" o una "manipulación del VKORC1") o alterado (por ejemplo, contiene una forma polimórfica del gen VKORC1).
Como se usa en el presente documento, la expresión "animales no humanos" se refiere a todos los animales no humanos incluidos, pero sin limitarse a, vertebrados tales como roedores, primates no humanos, ovinos, bovinos, rumiantes, lagomorfos, porcinos, caprinos, equinos, caninos, felinos, aves, etc.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sistema de transferencia de genes" se refiere a cualquier medio de suministrar una composición que comprende una secuencia de ácidos nucleicos a una célula o tejido. Por ejemplo, los sistemas de transferencia de genes incluyen, pero no se limitan a, vectores (por ejemplo, retrovíricos, adenovíricos, víricos adenoasociados y otros sistemas de suministro a base de ácidos nucleicos), microinyección de ácido nucleico desnudo, sistemas de suministro a base de polímeros (por ejemplo, sistemas a base de liposomas y a base de partículas metálicas), inyección biolística y similares. Como se usa en el presente documento, la expresión "sistema de transferencia de genes víricos" se refiere a sistemas de transferencia de genes que comprenden elementos víricos (por ejemplo, virus intactos, virus modificados y componentes víricos tales como ácidos nucleicos
o proteínas) para facilitar el suministro de la muestra a una célula o tejido deseados. Como se usa en el presente documento, la expresión "sistema de transferencia de genes de adenovirus" se refiere a sistemas que comprenden virus intactos o alterados pertenecientes a la familia Adenoviridae.
Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencias diana recombinantes específicas de sitio" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que proporcionan secuencias de reconocimiento para factores de reconocimiento y el lugar en el que tiene lugar la recombinación.
Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de ácidos nucleicos" se refiere a cualquier molécula que contenga ácidos nucleicos, incluidos, pero sin limitarse a, ADN o ARN. La expresión abarca secuencias que incluyen cualquiera de las bases análogas de ADN y ARN conocidas incluidas, pero sin limitarse a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2metiladenina, 2 metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6diaminopurina.
El término "gen" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) que comprende secuencias codificantes necesarias para la producción de un polipéptido, precursor o ARN (por ejemplo, ARNr, ARNt). El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante siempre que se mantengan la actividad o propiedades funcionales deseadas (por ejemplo, actividad enzimática, unión de ligandos, transducción de señales, inmunogenicidad, etc.) de la longitud completa o fragmento. El término también abarca la región codificante de un gen estructural y las secuencias situadas adyacentes a la región codificante tanto en el extremo 5' como en el 3' a lo largo de una distancia de aproximadamente 5 kb o más en cada extremo, de forma que el gen corresponde a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias situadas en 5' de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas en 5'. Las secuencias situadas en 3' o corriente abajo de la región codificante y presentes en el ARNm se denominan secuencias no traducidas en 3'. El término "gen" abarca las formas tanto de ADNc como genómica de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no
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codificadas denominadas "intrones" o "regiones interventoras" o "secuencias interventoras". Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben a ARN nuclear (ARNhn); los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones se retiran o se "eliminan por ayuste" del transcrito nuclear o primario; los intrones, por lo tanto, están ausentes en el transcrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.
Como se usa en el presente documento, la expresión "gen heterólogo" se refiere a un gen que no está en su entorno natural. Por ejemplo, un gen heterólogo incluye un gen de una especie introducido en otra especie. Un gen heterólogo también incluye un gen originario de un organismo que ha sido alterado de algún modo (por ejemplo, mutado, añadido en varias copias, unido a secuencias reguladoras no originales, etc.). Los genes heterólogos se distinguen de los genes endógenos en que las secuencias de genes heterólogos normalmente están unidas a secuencias de ADN que no se encuentran asociadas de forma natural con las secuencias del gen en el cromosoma
o están asociadas con porciones del cromosoma que no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en loci en los que el gen no se expresa normalmente).
Como se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a un gen heterólogo que está integrado en el genoma de un organismo (por ejemplo, un animal no humano) y que se transmite a la progenie del organismo durante la reproducción sexual.
Como se usa en el presente documento, la expresión "organismo transgénico" se refiere a un organismo (por ejemplo, un animal no humano) que tiene un transgén integrado en su genoma y que transmite el transgén a su progenie durante la reproducción sexual.
Como se usa en el presente documento, la expresión "expresión génica" se refiere al proceso de conversión de información genética codificada en un gen en ARN (por ejemplo ARNm, ARNr, ARNt o ARNsn) a través de la "transcripción" del gen (es decir, mediante la acción enzimática de una polimerasa de ARN), y para genes que codifican proteínas, en proteínas a través de la "traducción" del ARNm. La expresión génica puede regularse en muchas fases del proceso. La "regulación por incremento" o "activación" se refiere a la regulación que incrementa la producción de productos de expresión génica (es decir, ARN o proteína), mientras que la "regulación por disminución" o "represión" se refiere a la regulación que reduce la producción. Las moléculas (por ejemplo, factores de transcripción) que están implicadas en la regulación por incremento o la regulación por disminución suelen denominarse "activadores" y "represores", respectivamente.
Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias situadas en los extremos tanto 5' como 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias o regiones "flanqueantes" (estas regiones flanqueantes se sitúan en 5' o 3' de las secuencias no traducidas presentes en el transcrito de ARNm). La región flanqueante en 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante en 3' puede contener secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, la escisión posttranscripcional y la poliadenilación.
El término "natural" se refiere a un gen o producto génico aislado a partir de una fuente de origen natural. Un gen "natural" es aquel que se observa más frecuentemente en una población y, por tanto, se designa arbitrariamente como la forma "normal" o "natural" del gen. En cambio, el término "modificado" o "mutante" se refiere a un gen o producto génico que presenta modificaciones en la secuencia y o en las propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando se compara con el gen o producto génico natural. Cabe señalar que los mutantes de origen natural pueden aislarse; se identifican por el hecho de que tienen características alteradas (incluidas secuencias de ácidos nucleicos alteradas) cuando se comparan con el gen o producto génico natural.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "molécula de ácido nucleico que codifica", "secuencia de ADN que codifica" y " ADN que codifica" se refieren al orden o secuencia de desoxirribonucleótidos a lo largo de una cadena de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica (proteína). La secuencia de ADN codifica, por tanto, la secuencia de aminoácidos.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un gen" y " un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un gen", quieren decir una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la región codificante de un gen o, en otras palabras, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un producto génico. La región codificante puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en forma de ADN, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de cadena sencilla (es decir, la cadena sentido) o de doble cadena. Elementos de control adecuados tales como potenciadores/promotores, uniones de ayuste, señales de poliadenilación, etc. pueden situarse muy próximos a la región codificante del gen si fuera necesario para permitir la iniciación adecuada de la transcripción y/o el procesamiento adecuado del transcrito primario de ARN. Alternativamente, la región codificante utilizada en los vectores de expresión de la presente divulgación puede contener potenciadores/promotores endógenos, uniones de ayuste, secuencias interventoras, señales de poliadenilación, etc. o una combinación de elementos de control tanto endógenos como exógenos.
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Como se usa en el presente documento, el término "oligonucleótido" se refiere a una longitud corta de cadena polinucleotídica de cadena sencilla. Los oligonucleótidos normalmente tiene una longitud de menos de 200 residuos (por ejemplo, entre 15 y 100), no obstante, como se usa en el presente documento, se pretende que el término también abarque cadenas polinucleotídicas más largas. Frecuentemente se hace referencia a los oligonucleótidos por su longitud. Por ejemplo un oligonucleótido de 24 residuos se denomina "24-mero". Los oligonucleótidos pueden formar estructuras secundarias y terciarias autohibridando o hibridando con otros polinucleótidos. Tales estructuras pueden incluir, pero no se limitan a, dúplex, horquillas, cruciformes, codos y tríplex.
Como se usa en el presente documento, los términos "complementario" o "complementariedad" se usan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "5'-A-G-T-3'" es complementaria a la secuencia "3'-T-C-A-5'". La complementariedad puede ser "parcial", en la que sólo parte de las bases de los ácidos nucleicos se aparean de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. O puede existir complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y la fuerza de la hibridación entre cadenas de ácidos nucleicos. Esto es de especial importancia en reacciones de amplificación, así como en procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.
El término "homología" se refiere a un grado de complementariedad. Puede existir homología parcial u homología completa (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria es una molécula de ácido nucleico que impide, al menos parcialmente, que una molécula de ácido nucleico completamente complementaria hibride con un ácido nucleico diana que es "sustancialmente homólogo". La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria a la secuencia diana puede examinarse usando un ensayo de hibridación (bandas de Southern o northern, hibridación de soluciones y similares) bajo condiciones poco rigurosas. Una secuencia o sonda sustancialmente homóloga competirá con e impedirá la unión (es decir, la hibridación) de una molécula de ácido nucleico completamente homóloga a una diana bajo condiciones poco rigurosas. Esto no quiere decir que las condiciones poco rigurosas sean tales que permitan la unión no específica; las condiciones poco rigurosas requieren que la unión de dos secuencia entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión no específica puede ensayarse mediante el uso de una segunda diana que sea sustancialmente no complementaria (por ejemplo, identidad de menos de aproximadamente el 30 %); en presencia de unión no específica, la sonda no hibridará con la segunda diana no complementaria.
Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácidos nucleicos de doble cadena tal como un ADNc o un clon genómico, la expresión "sustancialmente homóloga" se refiere a cualquier sonda que pueda hibridar con cualquiera de las dos cadenas de la secuencia de ácidos nucleicos de doble cadena bajo condiciones poco rigurosas como se describe anteriormente.
Un gen puede producir varias especies de ARN que se generan por ayuste diferencial del transcrito primario de ARN. Los ADNc que son variantes de ayuste del mismo gen contendrán regiones con identidad de secuencia u homología completa (que representan la presencia del mismo exón o una porción del mismo exón en ambos ADNc) y regiones de no identidad completa (por ejemplo, que representan la presencia del exón "A" en el ADNc 2, en lugar del cual el ADNc 2 contiene el exón "B"). Debido a que los dos ADNc contienen regiones de identidad de secuencia, ambas hibridarán con una sonda derivada del gen entero o porciones del gen que contienen secuencias encontradas en ambos ADNc; las dos variantes de ayuste son, por lo tanto, sustancialmente homólogas a una sonda tal y entre sí.
Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácidos nucleicos de cadena sencilla, la expresión "sustancialmente homóloga" se refiere a cualquier sonda que pueda hibridar (es decir, es complementaria a) con la secuencia de ácidos nucleicos de cadena sencilla bajo condiciones poco rigurosas como se describe anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el término "hibridación" se usa en referencia al apareamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) están condicionadas por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la rigurosidad de las condiciones implicadas, la Tm del híbrido formado y la relación G:C dentro de los ácidos nucleicos. Se dice que una molécula sencilla que contenga apareamientos de ácidos nucleicos complementarios dentro de su estructura está "autohibridada".
Como se usa en el presente documento, el término "Tm" se usa en referencia a la "temperatura de fusión". La temperatura de fusión es la temperatura a la que una población de moléculas de ácido nucleico de doble cadena se semidisocia en cadenas sencillas. La ecuación para calcular la Tm de ácidos nucleicos es bien conocida en la técnica. Como indican las referencias estándar, una estimación sencilla del valor de la Tm puede calcularse con la ecuación: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C), cuando un ácido nucleico está en solución acuosa con 1M de NaCl (Véase, por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridization in Nucleic Acid Hybridization [1985]). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados que tienen en cuenta características estructurales, así como características de secuencia para el cálculo de Tm.
Como se usa en el presente documento, el término "riguroso" se usa en referencia a las condiciones de temperatura,
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fuerza iónica y la presencia de otros compuestos tales como disolventes orgánicos, bajo las cuales se realizan las hibridaciones de ácidos nucleicos. Bajo "condiciones poco rigurosas" una secuencia de ácidos nucleicos de interés hibridará con su complementario exacto, secuencias con emparejamiento inadecuado de bases sueltas, secuencias muy relacionadas (por ejemplo, secuencias con una homología del 90 % o superior) y secuencias que tengan homología sólo parcial (por ejemplo, secuencias con una homología del 50-90 %). Bajo "condiciones moderadamente rigurosas", una secuencia de ácidos nucleicos de interés hibridará sólo con su complementario exacto, secuencias con emparejamiento inadecuado de bases sueltas y secuencias muy relacionadas (por ejemplo, homología del 90 % o superior). Bajo "condiciones muy rigurosas" una secuencia de ácidos nucleicos de interés hibridará sólo con su complementario exacto y (dependiendo de condiciones tales como la temperatura) secuencias con emparejamiento inadecuado de bases sueltas. En otras palabras, bajo condiciones muy rigurosas también puede elevarse la temperatura con el fin de excluir la hibridación con secuencias con emparejamiento inadecuado de bases sueltas.
"Condiciones muy rigurosas" cuando se usa en referencia a hibridación de ácidos nucleicos comprende condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución consistente en SSPE 5 X (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4·H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), SDS al 0,5 %, reactivo de Denhardt 5 X y 100 μ/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguida de lavado en una solución que comprende SSPE 0,1 X, SDS al 1,0 % a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.
"Condiciones moderadamente rigurosas" cuando se usa en referencia a hibridación de ácidos nucleicos comprende condiciones equivalente a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución consistente en SSPE 5 X (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4·H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), SDS al 0,5 %, reactivo de Denhardt 5 X y 100 μ/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguida de lavado en una solución que comprende SSPE 1,0 X, SDS al 1,0 % a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.
"Condiciones poco rigurosas" comprende condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución consistente en SSPE 5 X (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4·H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), SDS al 0,1 %, reactivo de Denhardt 5 X [el reactivo de Denhardt 50 X contiene por 500 ml: 5 g de Ficoll (Tipo 400, Pharamcia), 5 g de BSA (Fracción V; Sigma)] y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguida de lavado en una solución que comprende SSPE 5 X, SDS al 0,1 % a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.
Es bien sabido en la técnica que pueden emplearse numerosas condiciones equivalentes para comprender las condiciones poco rigurosas; se tienen en consideración factores tales como la longitud y naturaleza (ADN, ARN, composición de bases) de la sonda y la naturaleza de la diana (ADN, ARN, composición de bases, presente en disolución o inmovilizada, etc.) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol) y puede variarse la solución de hibridación para generar condiciones de hibridación poco rigurosa diferentes, pero equivalentes a las condiciones enumeradas anteriormente. Además, en la técnica se conocen condiciones que promueven la hibridación bajo condiciones muy rigurosas (por ejemplo, incrementar la temperatura de las etapas de hibridación y/o lavado, el uso de formamida en la solución de hibridación, etc.) (véase la definición anterior de "riguroso").
Como se usa en el presente documento, la expresión "ensayo de detección" se refiere a un ensayo para detectar la presencia o ausencia de secuencias variantes de ácidos nucleicos (por ejemplo, polimorfismo o mutaciones) en un alelo dado de un gen concreto (por ejemplo, el gen VKORC1).
El término "aislado" cuando se usa en relación con un ácido nucleico, como en "un oligonucleótido aislado" o "un polinucleótido aislado" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se identifica y se separa de al menos un componente o contaminante con el que está asociado normalmente en su fuente natural. El ácido nucleico está presente, por tanto, en una forma o configuración que es diferente de aquella en la que se encuentra en la naturaleza. En cambio, los ácidos nucleicos no aislados son ácidos nucleicos tales como ADN o ARN que se encuentran en el estado en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de ADN dada (por ejemplo, un gen) se encuentra en el cromosoma de la célula huésped próxima a sus genes vecinos; las secuencias de ARN, tales como una secuencia de ARNm específica que codifica una proteína específica, se encuentran en la célula como una mezcla con numerosos otros ARNm que codifican multitud de proteínas. Sin embargo, los ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína incluyen, a modo de ejemplo, tales ácidos nucleicos en células que normalmente expresan la proteína dada donde el ácido nucleico está en una posición cromosómica diferente de la de células naturales o, de otro modo, está flanqueada por una secuencia de ácidos nucleicos diferente de la que se encuentra en la naturaleza. El ácido nucleico, oligonucleótido o polinucleótido aislado puede estar presente en forma de cadena sencilla o de doble cadena. Cuando un ácido nucleico, oligonucleótido o polinucleótido aislado se va a utilizar para expresar una proteína, el oligonucleótido o polinucleótido contendrá como mínimo la hebra sentido o codificante (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de cadena sencilla), pero puede contener las cadenas tanto sentido como antisentido (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de doble cadena).
Como se usa en el presente documento, el término "purificado" o "purificar" se refiere a la retirada de componentes (por ejemplo, contaminantes) de una muestra. Por ejemplo, los anticuerpos se purifican mediante la retirada de proteínas no inmunoglobulinas contaminantes; también se purifican mediante la retirada de inmunoglobulinas que no
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se unen a la molécula diana. La retirada de proteínas no inmunoglobulinas y/o la retirada de inmunoglobulinas que no se unen a la molécula diana da como resultado un incremento en el porcentaje de inmunoglobulinas reactivas con la diana en la muestra. En otro ejemplo, se expresan polipéptidos no glucosilados en células huésped bacterianas y se purifican los polipéptidos mediante la retirada de proteínas de la célula huésped; el porcentaje de polipéptidos recombinantes se incrementa de este modo en la muestra.
"Secuencia de aminoácidos" y términos tales como "polipéptido" o "proteína" no tienen la intención de limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos original, completa, asociada con la molécula de proteína mencionada.
La expresión "proteína nativa" como se usa en el presente documento indica que una proteína no contiene residuos de aminoácido codificados por secuencias de vector; esto es, la proteína nativa sólo contiene aquellos aminoácidos que se encuentra en la proteína tal y como aparece en la naturaleza. Una proteína nativa puede producirse por medios recombinantes o puede aislarse a partir de una fuente de origen natural.
Como se usa en el presente documento, el término "porción" cuando hace referencia a una proteína (como en "una porción de una proteína dada") se refiere a fragmentos de esa proteína. El tamaño de los fragmentos puede variar de cuatro residuos de aminoácido a la secuencia de aminoácidos entera menos un aminoácido.
Como se usa en el presente documento, el término "vector" se usa en referencia a moléculas de ácido nucleico que transfieren segmento(s) de ADN de una célula a otra. El término "transportador" a veces se usa de forma intercambiable con "vector". Los vectores derivan frecuentemente de plásmidos, bacteriófagos o virus de plantes o animales.
La expresión "vector de expresión" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de ácidos nucleicos apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida de forma operable en un organismo huésped concreto. Las secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la expresión en procariotas suelen incluir un promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión a ribosoma, frecuentemente junto con otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación.
Los términos "sobreexpresión" y "que sobreexpresa" y equivalentes gramaticales, se usan en referencia a los niveles de ARNm para indicar un nivel de expresión aproximadamente 3 veces mayor (o más) que el observado en un tejido dado en un animal control o no transgénico. Los niveles de ARNm se miden usando una cualquiera de diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica incluido, pero sin limitarse a, el análisis de bandas de northern. Los controles adecuados están incluidos en las bandas de northern para controlar las diferencias en la cantidad de ARN que se carga de cada tejido analizado (por ejemplo, puede usarse la cantidad de ARNr 28S, un transcrito de ARN abundante presente esencialmente en la misma cantidad en todos los tejidos, presente en cada muestra como medio para normalizar o estandarizar la señal específica de ARNm observada en las bandas de northern). Se cuantifica la cantidad de ARNm presente en la banda que corresponde en tamaño al ARN del transgén ayustado correctamente; otras especies secundarias de ARN que hibridan con la sonda del transgén no se consideran en la cuantificación de la expresión del ARNm transgénico.
El término "transfección" como se usa en el presente documento se refiere a la introducción de ADN exógeno en células eucariotas. La transfección puede llevarse a cabo por una variedad de medios conocidos en la técnica, incluidos la co-precipitación de ADN con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transfección mediada por polibreno, la electroporación, la microinyección, la fusión de liposomas, la lipofección, la fusión de protoplastos, la infección retrovírica y la biolística.
La expresión "transfección estable" o "transfectado de forma estable" se refiere a la introducción e integración de ADN exógeno en el genoma de la célula transfectada. La expresión "transfectante estable" se refiere a una célula que ha integrado de forma estable ADN exógeno en el ADN genómico.
La expresión "transfección transitoria" o "transfectado de forma transitoria" se refiere a la introducción de ADN exógeno en una célula en la que el ADN exógeno no consigue integrarse en el genoma de la célula transfectada. El ADN exógeno permanece en el núcleo de la célula transfectada durante varios días. Durante este tiempo el ADN exógeno está sujeto a los controles reguladores que gobiernan la expresión de los genes endógenos de los cromosomas. La expresión "transfectante transitorio" se refiere a células que han incorporado ADN exógeno pero que no han conseguido integrar este ADN.
Como se usa, el término "eucariota" se refiere a organismos distinguibles de "procariotas". Se pretende que el término abarque todos los organismos con células que muestren las características habituales de los eucariotas, tales como la presencia de un núcleo verdadero delimitado por una membrana nuclear, dentro del cual están los cromosomas, la presencia de orgánulos delimitados por membranas y otras características observadas habitualmente en organismos eucariotas. Por tanto, el término incluye, pero no se limita a, organismos tales como hongos, protozoos y animales (por ejemplo, humanos).
Como se usa en el presente documento, la expresión "in vitro" se refiere a un entorno artificial y a procesos o 8
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reacciones que ocurren en un entorno artificial. Los entornos in vitro pueden consistir en, pero no se limitan a, tubos de ensayo y cultivos celulares. La expresión "in vivo" se refiere al entorno natural (por ejemplo, un animal o una célula) y a procesos y reacciones que ocurren en un entorno natural.
Las expresiones "compuesto de ensayo" y "compuesto candidato" se refieren a cualquier entidad química, compuesto farmacéutico, fármaco y similar que sea un candidato para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad, mal, dolencia o trastorno de las funciones del organismo (por ejemplo, cáncer). Los compuestos de ensayo comprenden tanto compuestos terapéuticos conocidos como potenciales. Se puede determinar que un compuesto de ensayo es terapéutico analizándolo usando los procedimientos de análisis de la presente divulgación.
Como se usa en el presente documento, el término "muestra" se usa en su sentido más amplio. En un sentido, se pretende que incluya un espécimen o cultivo obtenido a partir de cualquier fuente, así como muestras biológicas y ambientales. Las muestras biológicas pueden obtenerse a partir de animales (incluidos los seres humanos) y abarcan fluidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen productos de la sangre, tales como plasma, suero y similares. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como materia de la superficie, suelo, agua y muestras industriales. No obstante, tales ejemplos no deben interpretarse como limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención.
Descripción detallada
Los fármacos anticoagulantes de cumarina son el tratamiento definitivo en todo el mundo para la prevención a largo plazo de episodios tromboembólicos. En 2003, se extendieron un total de 21,2 millones de recetas para el anticoagulante oral warfarina sólo en Estados Unidos. Desafortunadamente, la warfarina presenta problemas considerables de manejo de las dosis debido a multitud de factores que pueden modificar el efecto anticoagulante del fármaco: su estrecho intervalo terapéutico, diferencias étnicas específicas en las necesidades de dosis y amplia variabilidad de dosificación entre individuos. Estos retos pueden contribuir a la subutilización general del tratamiento anticoagulante, especialmente en la prevención de la apoplejía (Fang y col., Arch Intern Med 164, 55-60 (2004); Gage y col., Stroke 31, 822-7 (2000)). Las mutaciones génicas estructurales en el citocromo P450 (CYP) 2C9, la principal enzima catabólica para el enantiómero (S) de la warfarina, el más activo, son un factor de riesgo para evoluciones adversas durante el tratamiento (Higashi y col., Jama 287, 1690-8 (2002)), y las mutaciones extremadamente raras en VKROC1 subyacen a la resistencia a la warfarina (Rost y col., Nature 427, 537-41 (2004)). El documento WO 95/34679 A (21 de diciembre de 1995) divulga un procedimiento que comprende determinar el genotipo de un sujeto en la posición 472 (C>T) en CYP2C9 para determinar la capacidad de respuesta al tratamiento con warfarina. Se ha descrito la asociación de un polimorfismo sencillo de VKORC1 con la dosificación de warfarina (D'Andrea, Blood, 9 de septiembre de 2004). Sin embargo, antes de la presente invención, gran parte de la variación en la necesidad de dosis de warfarina permanecía sin explicar (Gage y col., Thromb Haemost 91, 87-94 (2004)).
La warfarina ejerce sus efectos antitrombóticos inhibiendo la regeneración de un componente esencial de la síntesis de factores coagulantes, la vitamina KH2 (vitamina K reducida), a partir del epóxido de vitamina K (Suttie, Adv Exp Med Biol 214, 3-16 (1987)). Esta actividad enzimática está determinada por el recientemente descubierto gen de la reductasa del epóxido de la vitamina K, VKORC1 (Li y col., Nature 427, 541-4 (2004); Rost y col., supra).
Experimentos realizados durante el curso del desarrollo de la presente invención demostraron una correlación entre ciertos haplotipos de VKORC1 y la dosificación de warfarina óptima. En consecuencia, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos y composiciones para determina la dosis de warfarina óptima para un sujeto, así como para fármacos relacionados (por ejemplo, fármacos que implican la misma ruta biológica).
Experimentos adicionales realizados durante el curso del desarrollo de la presente divulgación demostraron una correlación entre la expresión de VKORC1 y los haplotipos de VKORC1 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2). La asociación entre (i) el haplotipo A y la expresión reducida del ARNm y (ii) el haplotipo B y la expresión incrementada del ARNm establece un paralelismo entre el efecto de estos haplotipos sobre la dosis de warfarina, como se podría predecir mediante un modelo de inhibición enzimática no competitiva, simple, por este anticoagulante (Fasco, y col., Biochemistry 1983; 22:5655-60). La presente divulgación no se limita a un mecanismo concreto. De hecho, no es necesaria la comprensión del mecanismo para poner en práctica la presente divulgación. No obstante, se contempla que el nivel de ARNm de VKORC1 está dirigido por cada haplotipo y determina el nivel de síntesis proteica del complejo reductasa del epóxido de la vitamina K que, a su vez, es responsable de diferencias en las dosis de warfarina de mantenimiento en pacientes. Los candidatos principales de PNS que explican estos efectos son aquellos que designan la principal separación de haplotipos (sitios 381, 3673, 6484, 6853 y 7566) y predicen las dosis de warfarina de mantenimiento. Estos PNS se mapearon en regiones homólogas en especies de rata, ratón y perro para identificar secuencias no codificantes potencialmente conservadas que abarcan estos sitios. Sólo dos PNS (6484 y 6583) del grupo informativo están conservados; flanquean al exón 2 pero caen fuera de las regiones canónicas requeridas para el ayuste de exones. Se contempla que estas regiones actúan como secuencias reguladoras que se unen a sitios de unión de factores de transcripción.
Las ventajas de realizar el genotipo antes de, o al mismo tiempo que, el tratamiento que implica fármacos como la warfarina, el irinotecano y la tiopurina, cuyo efecto depende de las variantes génicas de CYP2C9 (y ahora VKORC1), UGT1A1 y TPMT, están en un punto de debate activo entre las autoridades reguladores y la comunidad médica
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(Lesko y col., Nat Rev, Drug Discov 2004; 3:763-9). Directrices publicadas recientemente sugieren una dosificación inicial de warfarina de 5 -10 mg/día 19. Sin embargo, experimentos realizados durante el curso del desarrollo de la presente divulgación sugieren que esta estrategia puede exponer a pacientes VKORC1 AA de dosis bajas a dosis del fármaco innecesariamente altas. En consecuencia, en algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden el análisis de la expresión y polimorfismos de VKORC1 para ayudar a la determinación de las dosificaciones de warfarina óptimas.
I. Dosificación de warfarina personalizada
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos de dosificación de warfarina personalizada que comprenden identificar el haplotipo o tipo de clado VKORC1 de un sujeto. Como se describe a continuación (véase la sección Experimentación), con experimentos realizados durante el curso del desarrollo de la presente divulgación se identificaron una serie de polimorfismos de VKORC1 asociados con dosificaciones de warfarina óptimas. Se identificaron polimorfismos en siete sitios (381, 3673, 5808, 6484, 6853, 7566, y 9041) del VKORC1. Se encontró que los polimorfismos estaban asociados con dos haplotipos (H1 y H2) de dosis baja (2,9 y 3,0 mg/d) y dos haplotipos (H7 y H9) de dosis alta (6,0 y 5,5 mg/d). Por lo tanto, la presente divulgación proporciona composiciones, procedimientos y kits para detectar tales polimorfismos y haplotipos, directamente o indirectamente, por cualquier procedimiento, para predecir la respuesta a warfarina y fármacos relacionados, seleccionar la dosificación de fármacos y realizar estudios sobre el metabolismo de los fármacos. Estos polimorfismos pueden detectarse junto con otros polimorfismos (por ejemplo, CYP2C9) para potenciar la información disponible para los investigadores y médicos.
En algunas realizaciones, los procedimientos de la presente divulgación comprenden identificar el haplotipo de un sujeto y determinar el intervalo de dosificación óptimo del sujeto. Los procedimientos de la presente divulgación permiten un uso más seguro y, por tanto, más extendido de la warfarina y fármacos relacionados. A continuación se describen procedimiento ejemplares para determinar polimorfismos de VKORC1.
1. Ensayos de secuenciación directa
En algunas realizaciones, las secuencias polimórficas de VKORC1 se detectan usando una técnica de secuenciación directa. En estos ensayos, en primer lugar se aíslan muestras de ADN a partir de un sujeto usando cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, la región de interés se clona en un vector adecuado y se amplifica por crecimiento en una célula huésped (por ejemplo, una bacteria). En otras realizaciones, el ADN de la región de interés se amplifica usando PCR.
Tras la amplificación, el ADN de la región de interés (por ejemplo, la región que contiene el PNS o la mutación de interés) se secuencia usando cualquier procedimiento adecuado, incluidas, pero sin limitarse a, la secuenciación manual usando nucleótidos marcados radioactivamente y la secuenciación automática. Los resultados de la secuenciación se presentan usando cualquier procedimiento adecuado. Se examina la secuencia y se determina la presencia o ausencia de un PNS o mutación dados.
2.
Ensayo de PCR
En algunas realizaciones, se detectan secuencias variantes usando ensayos basados en PCR. En algunas realizaciones, el ensayo de PCR comprende el uso de cebadores de oligonucleótidos que hibridan sólo con el alelo variante o con el natural (por ejemplo, con la región de polimorfismo o mutación). Ambos conjuntos de cebadores se usan para amplificar una muestra de ADN. Si sólo los cebadores mutantes dan como resultado un producto de PCR, entonces el paciente tiene el alelo mutante. Si sólo los cebadores naturales dan como resultado un producto de PCR, entonces el paciente tiene el alelo natural.
3.
Ensayos de hibridación
En realizaciones preferidas, se detectan secuencias variantes usando ensayos de hibridación. En un ensayo de hibridación, la presencia o ausencia de un PNS o mutación dados se determina basándose en la capacidad del ADN de la muestra para hibridar con una molécula de ADN complementaria (por ejemplo, una sonda de oligonucleótidos). Se dispone de una variedad de ensayos de hibridación usando una variedad de tecnologías de hibridación y detección. A continuación se proporciona una descripción de una selección de ensayos.
a. Detección directa de la hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación de una sonda con la secuencia de interés (por ejemplo, un PNS o mutación) se detecta directamente visualizando una sonda unida (por ejemplo, un ensayo de northern o Southern; véase, por ejemplo, Ausable y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY [1991]). En estos ensayos, se aísla ADN (Southern) o ARN (northern) genómico a partir de un sujeto. El ADN o ARN se escinde después con una serie de enzimas de restricción que escinden el genoma de forma poco frecuente y no cerca de los marcadores que se están ensayando. Después, se separa el ADN o ARN (por ejemplo, en un gel de agarosa) y se transfiere a una membrana. Una sonda o sondas marcadas (por ejemplo, incorporando un radionúclido) específicas para el PNS o mutación que se está detectando, pueden entrar en contacto con la membrana bajo condiciones poco,
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moderadamente o muy rigurosas. La sonda no unida se retira y la presencia de unión se detecta visualizando la sonda marcada.
b. Detección de hibridación usando ensayos de "chip de ADN"
En algunas realizaciones, se detectan secuencias variantes usando ensayos de hibridación a chip de ADN. En este ensayo, se fijan una serie de sondas de oligonucleótidos a un soporte sólido. Las sondas de oligonucleótido están diseñadas para ser exclusivas para un PNS o mutación concretos. La muestra de ADN de interés se pone en contacto con el "chip" de ADN y se detecta la hibridación.
En algunas realizaciones, el ensayo de chip de ADN es un ensayo GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.º 6.045.996, 5.925.525 y 5.858.659). La tecnología GeneChip usa conjuntos de sondas de oligonucleótidos de alta densidad, miniaturizadas, fijadas a un "chip". Los conjuntos de sondas se fabrican mediante el procedimiento de síntesis química dirigido por luz de Affymetrix, que combina síntesis química en fase sólida con técnicas de fabricación fotolitográficas empleadas en la industria de semiconductores. Usando una serie de máscaras fotolitográficas para definir los sitios de exposición del chip, seguido de etapas de síntesis química específicas, el procedimiento construye conjuntos de oligonucleótidos de alta densidad, con cada sonda en una posición predefinida en el conjunto. Se sintetizan varios conjuntos de sondas simultáneamente en una oblea de vidrio grande. Después, se cortan las obleas en cuadrado y se empaquetan los conjuntos de sondas individuales en cartuchos de plástico moldeado por inyección, que los protegen del entorno y sirven como cámara para la hibridación.
El ácido nucleico que se va a analizar se aísla, se amplifica por PCR y se marca con un grupo indicador fluorescente. El ADN marcado se incuba entonces con el conjunto usando una estación de fluidos. Se inserta entonces el conjunto en el escáner, donde se detectan los patrones de hibridación. Los datos de hibridación se recogen como luz emitida desde los grupos indicadores fluorescentes ya incorporados en la diana, que está unida al conjunto de sondas. Las sondas que se aparean perfectamente con la diana generalmente producen señales más fuertes que las que tienen apareamientos inadecuados. Dado que se conocen la secuencia y posición de cada sonda en el conjunto, puede determinarse por complementariedad la identidad del ácido nucleico diana aplicado al conjunto de sondas.
En otras realizaciones, se utiliza un microchip de ADN que contiene sondas capturadas electrónicamente (Nanogen, San Diego, CA) (Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU N.º 6.017.696, 6.068.818 y 6.051.380). A través del uso de la microelectrónica, la tecnología de Nanogen permite el movimiento activo y la concentración de moléculas cargadas hacia y desde sitios de ensayos designados en su microchip semiconductor. Las sondas de captura de ADN exclusivas para un PNS o mutación dados se colocan electrónicamente en o se "dirigen" a, sitios específicos en el microchip. Dado que el ADN tiene una carga negativa fuerte, puede moverse electrónicamente hacia una zona de carga positiva.
En primer lugar, se activa electrónicamente un sitio de ensayo o una fila de sitios de ensayo con una carga positiva. Posteriormente, se introduce una solución que contiene las sondas de ADN en el microchip. Las sondas cargadas negativamente se mueven rápidamente hacia los sitios cargados positivamente, donde se concentran y se unen químicamente a un sitio del microchip. Después, se lava el microchip y se añade otra solución de sondas de ADN distintas hasta que el conjunto de sondas de ADN unidas específicamente se completa.
Después, se analiza una muestra de ensayo para evaluar la presencia de moléculas de ADN diana determinando cuáles de las sondas de captura de ADN hibridaron con ADN complementario de la muestra de ensayo (por ejemplo, un gen de interés amplificado por PCR). También se usa una carga electrónica para mover y concentrar moléculas diana en uno o más sitios de ensayo del microchip. La concentración electrónica de ADN de la muestra en cada sitio de ensayo promueve la hibridación rápida del ADN de muestra con sondas de captura complementarias (la hibridación puede tener lugar en minutos). Para retirar todo el ADN no unido o unido inespecíficamente de cada sitio, se invierte a negativa la polaridad o carga del sitio, forzando así la vuelta de todo el ADN no unido o unido inespecíficamente a la solución alejada de las sondas de captura. Se usa un escáner de fluorescencia a base de láser para detectar la unión.
En otras realizaciones adicionales, se utiliza una tecnología de conjuntos basada en la separación de fluidos en una superficie plana (chip) por diferencias de tensión superficial (ProtoGene, Palo Alto, CA) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.º 6.001.311, 5.985.551 y 5.474.796). La tecnología de ProtoGene se basa en el hecho de que los fluidos pueden separarse en una superficie plana por diferencias de tensión superficial que se han impartido por recubrimiento químicos. Una vez separados de este modo, se sintetizan sondas de oligonucleótidos directamente sobre el chip mediante impresión por inyección de tinta de los reactivos. El conjunto junto con sus sitios de reacción definidos por tensión superficial se monta en una superficie de traslado X/Y bajo un conjunto de cuatro boquillas piezoeléctricas, una para cada una de las cuatro bases de ADN estándar. La superficie de traslado se mueve junto con cada una de las filas del conjunto y se suministra el reactivo apropiado a cada sitio de reacción. Por ejemplo, la amidita A se suministra sólo a los sitios en los que la amidita A se va a acoplar durante esa etapa de síntesis y así sucesivamente. Se suministran reactivos y baños habituales inundando toda la superficie y retirándolos después por centrifugación.
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Las sondas de ADN exclusivas para el PNS o mutación de interés se fijan al chip usando la tecnología de Protogene. Después, se pone en contacto el chip con los genes de interés amplificados por PCR. Tras la hibridación, se retira el ADN no unido y se detecta la hibridación usando cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, por activación de la fluorescencia de un grupo fluorescente incorporado).
En otras realizaciones más, se usa un "conjunto de perlas" para la detección de polimorfismos (Illumina, San Diego, CA; véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 99/67641 y WO 00/39587). Illumina usa una tecnología BEAD ARRAY que combina haces de fibra óptica y perlas que se agrupan entre sí en un conjunto. Cada haz de fibra óptica contiene de miles a millones de fibras individuales, dependiendo del diámetro del haz. Las perlas se recubren con un nucleótido específico para la detección de un PNS o mutación dados. Se combinan lotes de perlas para formar un grupo específico para el conjunto. Para realizar un ensayo, el BEAD ARRAY se pone en contacto con una muestra del sujeto preparada (por ejemplo, ADN). La hibridación se detecta usando cualquier procedimiento adecuado.
c. Detección enzimática de la hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación de una sonda unida se detecta usando un ensayo TaqMan (PR Biosystems, Foster City, CA; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.º 5.962.233 y 5.538.848). El ensayo se realiza durante la reacción de PCR. El ensayo TaqMan explota la actividad exonucleasa 5'-3' de polimerasas de ADN tales como la polimerasa de ADN AMPLITAQ. Una sonda, específica para un alelo o mutación dados, se incluye en la reacción de PCR. La sonda consiste en un oligonucleótido con un tinte indicador de 5' (por ejemplo, un tinte fluorescente) y un tinte desactivador de 3'. Durante la PCR, si la sonda está unida a su diana, la actividad nucleolítica 5'-3' de la polimerasa AMPLITAQ escinde la sonda entre el tinte indicador y el desactivador. La separación del tinte indicador del tinte desactivador da como resultado un incremento de la fluorescencia. La señal se acumula con cada ciclo de PCR y puede monitorizarse con un fluorímetro.
En otras realizaciones adicionales, los polimorfismos se detectan usando el ensayo de extensión de cebador SNP-IT (Orchid Biosciences, Princeton, NJ; véanse, por ejemplo las patentes de EE. UU. N.º 5.952.174 y 5.919.626). En este ensayo, se identifican los PNS usando un cebador de ADN sintetizado especialmente y una polimerasa de ADN para extender selectivamente la cadena de ADN en un base en la que se sospecha que es la posición del PNS. El ADN de la región de interés se amplifica y desnaturaliza. Después se realizan las reacciones de la polimerasa usando sistemas miniaturizados denominados microfluidos. La detección se lleva a cabo añadiendo un marcador al nucleótido que se sospecha que está en la posición del PNS o mutación. La incorporación del marcador en el ADN puede detectarse por cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, si el nucleótido contiene un marcador de biotina, la detección es a través de un anticuerpo marcado de forma fluorescente específico para biotina). Se conocen numerosos otros ensayos en la técnica.
4.
Otros ensayos de detección
Los ensayos de detección adicionales que son adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de escisión de apareamientos inadecuados con enzimas (por ejemplo, Variagenics, en las patentes de EE. UU. N.º 6.110.684, 5.958.692, 5.851.770); reacción en cadena de la polimerasa; procedimientos de hibridación ramificada (por ejemplo, Chiron, en las patentes de EE. UU. N.º 5.849.481, 5.710.264, 5.124.246 y 5.624.802); replicación por círculo rodador (por ejemplo, en las patentes de EE. UU N.º 6.210.884 y 6.183.960), NASBA (por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.º 5.409.818); tecnología molecular de beacon (por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.º 6.150.097); tecnología E-sensor (Motorola, en las patentes de EE. UU. N.º 6.248.229, 6.221.583, 6.013.170 y 6.063.573); ensayo INVADER, Third Wave Technologies; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.º 5.846.717, 6.090.543, 6.001.567, 5.985.557 y 5.994.069; tecnología de ciclación de sondas (por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N.º 5.403.711, 5.011.769 y 5.660.988); procedimientos de amplificación de señal Dade Behring (por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N.º 6.121.001, 6.110.677, 5.914.230, 5.882.867 y 5.792.614); reacción en cadena de la ligasa (Bamay Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 189-93 (1991)); y procedimientos de hibridación en "sándwich" (por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.º 5.288.609).
5.
Ensayo de espectroscopía de masas
En algunas realizaciones, se usa un sistema MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA) para detectar secuencias variantes (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.º 6.043.031, 5.777.324 y 5.605.798). El ADN se aísla a partir de muestras de sangre usando procedimientos estándar. Posteriormente, las regiones de ADN específicas que contienen la mutación o el PNS de interés, de aproximadamente 200 bases de longitud, se amplifican por PCR. Después, los fragmentos amplificados se unen por una cadena a una superficie sólida y las cadenas no inmovilizadas se retiran mediante desnaturalización y lavado estándar. Las cadenas sencillas inmovilizadas restantes sirven entonces como molde para reacciones enzimáticas automáticas que producen productos de diagnóstico específicos de genotipo.
Después, se transfieren cantidades muy pequeñas de los productos enzimáticos, normalmente de cinco a diez nanolitros, a un conjunto SpectroCHIP para su posterior análisis automático con el espectrómetro de masas SpectroREADER. Cada punto se carga previamente con cristales que absorben luz que forma una matriz con el producto de diagnóstico dispensado. El sistema MassARRAY usa espectrometría de masas MALDI-TOF (Matrix
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Assisted Laser Desorption Ionization -Time of Light). En un procedimiento conocido como desorción, se golpea la matriz con un pulso de un rayo láser. La energía del rayo láser se transfiere a la matriz y se evapora, dando como resultado la expulsión de una pequeña cantidad del producto de diagnóstico a un tubo de vuelo. A medida que se carga el producto de diagnóstico cuando se aplica posteriormente un pulso de campo eléctrico al tubo, se lanzan hacia abajo por el tubo de vuelo hacia un detector. El tiempo entre la aplicación del pulso de campo eléctrico y la colisión del producto de diagnóstico con el detector se denomina tiempo de vuelo. Esta es una medida muy precisa del peso molecular del producto, ya que la masa de una molécula se correlaciona directamente con el tiempo de vuelo, volando las moléculas más pequeñas más rápido que las moléculas más grandes. El ensayo entero se completa en menos de una milésima de segundo, permitiendo que las muestras se analicen en un total de 3-5 segundos incluida la recolección de datos repetitiva. Después, el programa informático SpectroTYPER calcula, registra, compara e informa de los genotipos a una velocidad de tres segundos por muestra.
6. Detección de la expresión de VKORC1
En otras realizaciones, el nivel de expresión del gen VKORC1 se usa para determinar la dosis de warfarina de un individuo. Experimentos realizados durante el curso del desarrollo de la presente divulgación (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2) demostraron una correlación entre el haplotipo VKORC1 y el nivel de expresión de VKORC1. En consecuencia, se contempla que el nivel de expresión de VKORC1 se correlaciona con la dosificación de warfarina óptima.
1. Detección de ARN
En algunas realizaciones preferidas, la detección de la expresión de VKORC1 se detecta midiendo la expresión del ARNm correspondiente en una muestra de sangre. La expresión de ARNm puede medirse por cualquier procedimiento adecuado, incluidos, pero sin limitarse a, los divulgados más adelante.
En algunas realizaciones, el ARN se detecta por análisis de bandas de northern. El análisis de bandas de northern implica la separación del ARN y la hibridación de una sonda marcada complementaria.
En otras realizaciones, la expresión de ARN se detecta por escisión enzimática de estructuras específicas (ensayo INVADER, Third Wave Technologies; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.º 5.846.717, 6.090.543, 6.001.567, 5.985.557 y 5.994.069). El ensayo INVADER detecta secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN) específicas usando enzimas específicas de estructura para escindir un complejo formado por la hibridación de sondas de oligonucleótidos que solapan.
En otras realizaciones más, el ARN (o el ADNc correspondiente) se detecta mediante hibridación con una sonda de oligonucleótidos). Se dispone de una variedad de ensayos de hibridación usando una variedad de tecnologías de hibridación y detección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se utiliza el ensayo TaqMan (PE Biosystems, Foster City, CA; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.º 5.962.233 y 5.538.848). El ensayo se realiza durante la reacción de PCR. El ensayo TaqMan explota la actividad exonucleasa 5'-3' de la polimerasa de ADN AMPLITAQ GOLD. Una sonda que consiste en un oligonucleótido con un tinte indicador de 5' (por ejemplo, un tinte fluorescente) y un tinte desactivador de 3' se incluye en la reacción de PCR. Durante la PCR, si la sonda está unida a su diana, la actividad nucleolítica 5'-3' de la polimerasa AMPLITAQ GOLD escinde la sonda entre el tinte indicador y el desactivador. La separación del tinte indicador del tinte desactivador da como resultado un incremento de la fluorescencia. La señal se acumula con cada ciclo de PCR y puede monitorizarse con un fluorímetro.
En otras realizaciones más, se usa la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar la expresión de ARN. En la RT-PCR, el ARN se convierte por medio de enzimas en ADN complementario o "ADNc" usando una enzima transcriptasa inversa. El ADNc se usa después como molde para una reacción de PCR. Los productos de PCR pueden detectarse por cualquier procedimiento adecuado, incluidas, pero sin limitarse a, la electroforesis en gel y tinción con un tinte específico para ADN o la hibridación con una sonda marcada. En algunas realizaciones, se utiliza el procedimiento de PCR con transcriptasa inversa cuantitativa con mezclas de moldes competitivos estandarizadas descrito en las patentes de EE. UU. 5.639.606, 5.643.765 y 5.876.978.
2. Detección de proteína
En otras realizaciones, la expresión génica de VKORC1 se detecta midiendo la expresión de la proteína o polipéptido correspondiente. La expresión proteica puede detectarse por cualquier procedimiento adecuado. En algunas realizaciones, las proteínas se detectan por procedimientos de inmunohistoquímica conocidos en la técnica. En otras realizaciones, las proteínas se detectan por su unión a un anticuerpo obtenido contra la proteína. La generación de anticuerpos se describe más adelante.
La unión de anticuerpos se detecta mediante técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzimas), ensayos "sándwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (por ejemplo, usando marcaje con oro coloidal, enzimas o radiosótopos), bandas de western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación, etc.), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos con proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.
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En una realización, la unión de anticuerpo se detecta detectando un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta detectando la unión de un anticuerpo o reactivo secundario al anticuerpo primario. En una realización adicional, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen muchos procedimientos en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente divulgación.
En algunas realizaciones, se utiliza un ensayo de detección automática. Los procedimientos para la automatización de inmunoensayos incluyen los descritos en las patentes de EE. UU. 5.885.530, 4.981.785, 6.159.750 y 5.358.691. En algunas realizaciones, el análisis y la presentación de resultados también está automatizada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se utilizan programas informáticos que generan un pronóstico basado en la presencia o ausencia de una serie de proteínas correspondientes a marcadores de cáncer.
En otras realizaciones, el inmunoensayo descrito en las patentes de EE. UU. 5.599.677 y 5.672.480.
II. Kits
En algunas realizaciones, se proporcionan kits para la detección de polimorfismos de VKORC1. En algunas realizaciones, los kits contienen reactivos específicos para la detección de ARNm o ADNc (por ejemplo, sondas o cebadores de oligonucleótidos). En realizaciones preferidas, los kits contienen todos los componentes necesarios para realizar un ensayo de detección, incluidos todos los controles, instrucciones para realizar los ensayos y todos los programas informáticos necesarios para el análisis y presentación de los resultados. En algunas realizaciones, se proporcionan las sondas individuales y reactivos para la detección de polimorfismos de VKORC1 como reactivos específicos de analito. En otras realizaciones, los kits se proporcionan como medios de diagnóstico in vitro.
En otras realizaciones, se proporcionan kits para determinar el nivel de expresión de ARNm o proteína de VKORC1 en un sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los kits comprenden reactivos para realizar ensayos de detección de ARNm o proteínas (por ejemplo, los descritos anteriormente).
III. Cribado de fármacos
En algunas realizaciones, se proporcionan ensayos de cribado de fármacos (por ejemplo, para cribar fármacos anticoagulantes). En algunas realizaciones, los procedimientos de cribado de la presente divulgación utilizan formas polimórficas de VKORC1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos de cribado de compuestos que alteran (por ejemplo, disminuyen) la actividad o nivel de expresión de una o más formas polimórficas de VKORC1. En otras realizaciones, los procedimientos de cribado de fármacos descritos más adelante se usan para cribar compuestos que se sabe que alteran la coagulación sanguínea con distintas formas polimórficas de VKORC1.
En un procedimiento de cribado, se evalúa la capacidad de los compuestos candidatos para alterar (por ejemplo, incrementar o disminuir) la expresión de VKORC1 poniendo en contacto un compuesto con una célula que expresa VKORC1 y ensayando después el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresión. En algunas realizaciones, el efecto de los compuestos candidatos sobre la expresión de VKORC1 se ensaya detectando el nivel de ARNm de VKORC1 expresado por la célula. La expresión de ARNm puede detectarse por cualquier procedimiento adecuado, incluidos, pero sin limitarse a, los divulgados en el presente documento.
En otras realizaciones, el efecto de los compuestos candidatos se ensaya midiendo el nivel de polipéptido de VKORC1. El nivel de polipéptido expresado puede medirse usando cualquier procedimiento adecuado, incluidos, pero sin limitarse a, los divulgados a conocer en el presente documento o monitorizando un fenotipo (por ejemplo, velocidad de coagulación).
En algunas realizaciones, se realizan cribados de fármacos in vitro usando VKORC1 natural o activo dominante purificado y compañeros de unión o compañeros de señalización. Se criba la capacidad de los compuestos para interaccionar con las proteínas VKORC1 e inhibir o potenciar la función de VKORC1 o la interacción de VKORC1 con compañeros de unión (por ejemplo, cadherina).
En aún otras realizaciones, se utilizan células o animales transgénicos que tienen genes VKORC1 alterados (por ejemplo, polimórficos) en aplicaciones de cribado de fármacos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se criba la capacidad de los compuestos para alterar la coagulación de la sangre en ratones VKORC1 con una forma polimórfica de VKORC1 concreta.
En otras realizaciones más, los sujetos (por ejemplo, un sujeto humano), se inscriben en ensayos clínicos para ensayar dosificaciones de warfarina u otros fármacos relacionados (por ejemplo, nuevas drogas). En realizaciones preferidas, se incluyen sujetos que tienen VKORC1 polimórficos en ensayos clínicos para ensayar fármacos coagulantes.
Los compuestos de ensayo de la presente divulgación pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en procedimientos de combinatoria de colecciones conocidos en la técnica, incluidas colecciones biológicas; colecciones de peptoides (colecciones de moléculas que tienen las funciones de péptidos, pero con una
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estructura no peptídica, novedosa, que son resistentes a la degradación enzimática pero que aun así permanecen biológicamente activas; véase, por ejemplo Zuckennann y col., J. Med. Chem. 37: 2678-85 [1994]); colecciones en fase sólida o en solución paralelas dirigibles en el espacio; procedimientos de colecciones sintéticas que requieren deconvolución; el procedimiento de colecciones 'una perla, un compuesto'; y procedimientos de colecciones sintéticas que usan selección por cromatografía de afinidad. Se prefieren los enfoques de colecciones biológicas y colecciones de peptoides para su uso con colecciones de péptidos, mientras que pueden aplicarse otros cuatro enfoques a colecciones compuestos peptídicos, no peptídicos, oligoméricos o moléculas pequeñas (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
Pueden encontrarse en la técnica ejemplos de procedimientos para la síntesis de librerías moleculares, por ejemplo en: DeWitt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 [1993]; Erb y col., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422 [1994]; Zuckermann y col., J. Med. Chem. 37:2678 [1994]; Cho y col., Science 261:1303 [1993]; Carrell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]; y Gallop y col., J. Med. Chem. 37:1233 [1994].
Las librerías de compuestos pueden presentarse en disolución (por ejemplo, Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]), o sobre perlas (Lam, Nature 354:82-84 [1991]), chips (Fodor, Nature 364:555-556 [1993]), bacterias o esporas (patente de EE. UU. N.º 5.223.409 ), plásmidos (Cull y col., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869 [1992])
o en fagos (Scott y Smith, Science 249:386-390 [1990]; Devlin Science 249:404-406 [1990]; Cwirla y col., Proc. NatI. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222:301 [1991]).
IV. Animales transgénicos que expresan secuencias polimórficas de VKORC1
La presente divulgación contempla la generación de animales transgénicos que comprenden un gen VKORC1 exógeno o alguno de sus mutantes y variantes (por ejemplo, polimorfismos de nucleótido simple). En realizaciones preferidas, el animal transgénico presenta un fenotipo alterado (por ejemplo, respuesta a warfarina u otros fármacos anticoagulantes) en comparación con animales naturales. Los procedimientos para analizar la presencia o ausencia de tales fenotipos incluyen, pero no se limita a, los divulgados en el presente documento.
Los animales transgénicos o variantes naturales que tienen genotipos equivalentes de la presente divulgación son útiles en cribado de fármacos (por ejemplo, anticoagulantes). En algunas realizaciones, se administran compuestos de ensayo (por ejemplo, un fármaco que se sospecha que es útil como tratamiento anticoagulante) y compuestos de control (por ejemplo, un placebo) a los animales transgénicos y los animales control y se evalúan los efectos.
Los animales transgénicos pueden generarse a través de una variedad de procedimientos. En algunas realizaciones, se usan células embrionarias en diversas fases del desarrollo para introducir transgenes para la producción de animales transgénicos. Se usan diferentes procedimientos dependiendo de la fase del desarrollo de la célula embrionaria. El cigoto es la mejor diana para la microinyección. En el ratón, el pronúcleo masculino alcanza el tamaño de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro que permite la inyección reproducible de 1-2 picolitros (pl) de solución de ADN. El uso de cigotos como diana para transferencia génica tiene una ventaja principal en que en la mayoría de los casos, el ADN inyectado se incorporará en el genoma del huésped antes de la primera escisión (Brinster y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 [1985]). Como consecuencia, todas las células del animal transgénico no humano portarán el transgén incorporado. En general, esto también se reflejará en la transmisión eficaz del transgén a la descendencia del fundador, ya que el 50 % de las células germinales alojarán el transgén. La patente de EE. UU. N.º 4.873.191 describe un procedimiento para la microinyección de cigotos; la divulgación de esta patente se incorpora en el presente documento en su totalidad.
En otras realizaciones, se usa la infección retrovírica para introducir transgenes en un animal no humano. En algunas realizaciones, el vector retrovírico se utiliza para transfectar oocitos inyectando el vector retrovírico en el espacio perivitelino del oocito (en la patente de EE. UU. N.º 6.080.912). En otras realizaciones, el embrión no humano en desarrollo puede cultivarse in vitro hasta la fase de blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser dianas para la infección retrovírica (Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260 [1976]). La infección eficaz de los blastómeros se obtiene mediante tratamiento enzimático para retirar la zona pelúcida (Hogan y col., en Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1986]). El sistema de vector vírico usado para introducir el transgén es normalmente un retrovirus de replicación defectiva que porta el transgén (Jahner y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6927 [1985]). La transfección se obtiene fácilmente y eficazmente cultivando los blastómeros sobre una monocapa de células productoras de virus (Stewart, y col., EMBO J., 6:383 [1987]). Alternativamente, la infección pueden realizarse en una fase posterior. Los virus o las células productoras de virus pueden inyectarse en el blastocele (Jahner et al., Nature 298:623 [1982]). La mayoría de los fundadores serán mosaico para el transgén, ya que la incorporación tiene lugar sólo en un subconjunto de células que forman el animal transgénico. Además, el fundador puede contener diversas inserciones retrovíricas del transgén en diferentes posiciones del genoma que generalmente se separarán en la descendencia. Además, también es posible introducir transgenes en la línea germinal, aunque con baja eficacia, por infección retrovírica intrauterina del embrión a la mitad de la gestación (Jahner y col., supra [1982]). Los medios adicionales de uso de retrovirus o vectores retrovíricos para crear animales transgénicos conocidos en la técnica implican la microinyección de partículas retrovíricas o células tratadas con mitomicina C que produzcan retrovirus en el especio perivitelino de huevos fecundados y embriones tempranos (en la solicitud internacional PCT WO 90/08832 [1990]), y Haskell y
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Bowen, Mol. Reprod. Dev., 40:386 [1995]).
En otras realizaciones, el transgén se introduce en células madre embrionarias y las células madre transfectadas se utilizan para formar un embrión. Las células ES se obtienen cultivando embriones preimplantacionales in vitro bajo condiciones apropiadas (Evans y col., Nature 292:154 [1981]; Bradley y col., Nature 309:255 [1984]; Gossler y col., Proc. Acad. Sci. USA 83:9065 [1986]; y Robertson y col., Nature 322:445 [1986]). Los transgenes pueden introducirse eficazmente en células ES mediante transfección de ADN o por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, incluidos la coprecipitación con fosfato de calcio, la fusión de protoplastos o esferoplastos, la lipofección y la transfección mediada por DEAE-dextrano. Los transgenes también pueden introducirse en células ES mediante transducción mediada por retrovirus o por microinyección. Tales células ES transfectadas pueden colonizar después un embrión tras su introducción en el blastocele de un embrión en fase de blastocisto y contribuir a la línea germinal del animal quimérico resultante (para revisión, véase, Jaenisch, Science 240:1468 [1988]). Antes de la introducción de células ES transfectadas en el blastocele, las células ES transfectadas pueden someterse a diversos protocolos de selección para un enriquecimiento en células ES que han integrado el transgén, asumiendo que el transgén proporciona un medio para tal selección. Alternativamente, la reacción en cadena de la polimerasa puede usarse para seleccionar células ES que han integrado el transgén. Esta técnica evita la necesidad de que crezcan las células ES transfectadas bajo condiciones selectivas apropiadas antes de transferirlas al blastocele.
En otras realizaciones más, se utiliza la recombinación homóloga para inactivar la función génica o crear mutantes delecionados (por ejemplo, mutantes por truncado). En la patente de EE. UU. N.º 5.614.396 se describen procedimientos para recombinación homóloga.
Experimentación
El siguiente ejemplo se proporciona con el fin de demostrar e ilustrar con más detalle ciertas realizaciones preferidas y aspectos de la presente divulgación y no deben interpretarse como limitantes de su alcance.
Ejemplo 1
Polimorfismos de VKORC1
Este ejemplo describe la asociación entre polimorfismos de VKORC1 y dosificaciones de warfarina óptimas.
A. Procedimientos
Sujetos clínicos y de control
Los pacientes clínicos americanos de origen europeo empleados en este estudio se han descrito previamente (Higashi y col., Jama 287, 1690-8 (2002)) como lo han sido la mayoría de los pacientes americanos de origen europeo del estudio de repetición (Gage y col., Thromb Haemost 91, 87-94 (2004)). Todas las muestras de población de ADN de control se compraron de las colecciones de variación humana y las muestras de estudio genealógico del CEPH en el Coriell Cell Repository. Las muestras de americanos de origen asiático consistieron en 96 individuos delgrupo HD100CHI (pueblo Han de Los Ángeles), 10 asiáticos de sudeste (HD13), 7 chinos (HD32) y 7 japoneses (del grupo HD07). Las 96 muestras de americanos de origen europeo se seleccionaron del grupo HD100CAU con los restantes 23 individuos seleccionados de la generación parental de las familias del CEPH (para más información sobre estas muestras, véase la Tabla 4). Las 96 muestras de americanos de origen africano se seleccionaron del grupo HD100AA.
Análisis de secuencias y genotipado
Todas las muestras clínicas de la primera cohorte de americanos de origen europeo se volvieron a secuenciar para descubrir PNS usando amplificación por PCR de fragmentos de ~1 kb cubriendo la región genómica entera de VKORC1 y secuenciación directa de los amplicones de PCR usando química de secuenciación ABI Big-Dye Terminator estándar y realizado en un analizador de ADN ABI 3730XL. Los PNS se identificaron usando el programa Polyphred (v. 4.2), junto con controles de calidad y la revisión de todos los PNS y polimorfismos por un analista humano. Los diez PNS identificados estaban en las posiciones 381(C/T), 861(A/C), 2653(G/C), 3673(A/G), 5808(T/G), 6009(C/T), 6484(C/T), 6853(C/G), 7566(C/T), y 9041(A/G) de la secuencia de VKORC1 de referencia (número de acceso de GenBank AY587020; SEQ ID NO: 1). Se identificó un sólo PNS no sinónimo, heterocigótico, (posición genómica 5432 (G/T) -Ala41Ser) en un paciente clínico americano de origen europeo. Este paciente tenía la dosis de warfarina de mantenimiento general más alta (15,5 mg/d) y fue excluido de todos los análisis. No se identificó ningún otro PNS no sinónimo del que se tuviera información previa (Rost y col., Nature 427, 537-41 (2004)). Todas las demás muestras de población de control se volvieron a secuenciar usando los mismos procedimientos, pero se genotiparon usando los amplicones que contenían los 10 PNS comunes identificados en la población clínica americana de origen europeo.
Para el estudio de repetición de la cohorte de americanos de origen europeo secundaria, se usaron cuatro PNS informativos (861, 5808, 6853 y 9041) para diferenciar entre los haplotipos H1, H2, H7, H8 y H9, basándose en el árbol genealógico de la Fig. 1. Para cada sitio de PNS, se diseñaron cebadores de PCR usando la versión 1.5 del
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Primer Express (ABI, Foster City, CA). Se diseñaron cebadores de pirosecuenciación usando la versión 1.01 del programa informático Pyrosequencing SNP Primer Design. La localización exclusiva de los cebadores de PCR se verificó usando NCBI Blast (disponible en la página web del NCBI). La PCR se llevó a cabo usando el Gold PCR master mix de Amplitaq (ABI, Foster City, CA), 5 pmol de cada cebador (IDT, Coralville, IA), y ADN Ing. La pirosecuenciación se llevó a cabo como se describe anteriormente (Rose y col., Methods Mol Med 85, 225-37 (2003) usando los siguientes cebadores (5' -3') para cada PNS: 861 (A/C), directo = TCTTGGAGTGAGGAAGGCAAT (SEQ ID NO: 2), inverso = biotina-GACAGGTCTGGACAACGTGG (SEQ ID NO: 3), interno = CTCAGGTGATCCA (SEQ ID NO: 4); 5808 (G/T), directo = biotina-GGATGCCAGATGATTATTCTGGAGT (SEQ ID NO: 5), inverso = TCATTATGCTAACGCCTGGCC (SEQ ID NO: 6), interno = CAACACCCCCCTTC (SEQ ID NO: 7); 6853 (G/C), directo = CTTGGTGATCCACACAGCTGA (SEQ ID NO: 8), inverso = biotina-AAAAGACTCCTGTTAGTTACCTCCCC (SEQ ID NO: 9), interno = AGCTAGCTGCTCATCAC (SEQ ID NO: 10); 9041 (A/G), directo = TACCCCCTCCTCCTGCCATA (SEQ ID NO: 11), inverso = biotina-CCAGCAGGCCCTCCACTC (SEQ ID NO: 12), interno = TCCTCCTGCCATACC (SEQ ID NO: 13). Se seleccionaron al azar muestras de cada genotipo y se repitieron para confirmar la asignación de genotipo.
Procedimientos estadísticos
Se construyeron árboles genealógicos usando el programa MEGA y basándose en el número de diferencias entre haplotipos y el procedimiento de agrupamiento UPGMA. Se estimaron los haplotipos para cada muestra individual usando el programa PHASE, versión 2.0 (Stephens y Donelly, Am J Hum Genet 73, 1162-9 (2003)), y se realizaron series independientes para cada población estudiada.
Usando la pareja de haplotipos más probable para cada paciente, se evaluó la asociación entre el número de copias de cada haplotipo de VKORC1 (codificados como 0, 1, 2) y la dosis de warfarina de mantenimiento. Se realizó una regresión lineal múltiple usando una dosis de mantenimiento transformada por logaritmos, ajustando para las covariables de edad, sexo, raza, amiodarona, losartán y genotipo CYP2C9. Las dosis de warfarina ajustada (e intervalos de confianza del 95 %) asociadas con cada copia adicional de haplotipo se estimaron por exponenciación de los valores medios y errores estándar ajustados de la predicción lineal. En análisis por separado, usando un procedimiento de prueba de puntuación de modelo lineal generalizado (Lake y col., Hum Hered 55, 56-65 (2003)) que adicionalmente tiene en cuenta la incertidumbre de las asignaciones de haplotipos, se obtuvieron estimaciones similares para la dosis de warfarina media, y los valores de confianza fueron ligeramente más amplios.
La prueba de Kruskal-Wallis, un ANOVA sin distribución, se usó para evaluar las diferencias en las dosis de mantenimiento entre los grupos A/A, A/B y B/B. Esto se hizo por separado para tres subconjuntos de datos: (1) para sujetos con la variante 2* o 3*, (2) naturales y (3) 2* o 3* y natural combinados. Los sujetos con un haplotipo no A o B no se usaron en el análisis. Tras la prueba chi cuadrado general para evaluar las diferencias entre los tres grupos, se llevaron a cabo comparaciones por parejas usando la normalidad asintótica de los intervalos totales dentro de cada grupo. Para cada una de las tres comparaciones individuales (A/A frente a A/B, A/B frente a B/B, y A/A frente a B/B) se realizó la corrección de Bonferroni para controlar la tasa de error de tipo I general.
Las diferencias entre distribuciones de haplotipo específicas de población se hicieron usando una prueba de χ2.
B. Resultados
Con el fin de investigar la relación entre los polimorfismos de nucleótido simple (PNS) no codificantes, comunes, en VKORC1 y la dosificación de warfarina, se llevó a cabo de nuevo la secuenciación del locus del gen VKORC1 (11,2 kilobases) de una cohorte de 185 pacientes americanos de origen europeo que recibían tratamiento con warfarina a largo plazo. Todos los pacientes habían sido previamente genotipados para mutaciones de CYP2C9 funcionales conocidas (*2 y *3) que se asocian con necesidades de dosis de warfarina bajas (Higashi y col., Jama 287, 1690-8 (2002); Aithal y col., Lancet 353, 717-9 (1999)). En VKORC1, se volvieron a secuenciar todas las muestras clínicas a lo largo de 5 kilobases en la región promotora corriente arriba, 4,2 kilobases de secuencia intragénica (intrones y exones) y 2 kilobases de la región corriente abajo en 3'. Se identificaron diez PNS no codificantes con una frecuencia alélica secundaria mayor del 5 % en los pacientes clínicos americanos de origen europeo. Estos PNS se utilizaron para estimar los haplotipos de VKORC1 que se asignaron a cada paciente. A partir de estos 185 pacientes, se identificaron cinco haplotipos frecuentes (> 5%) (H1, H2, H7, H8, H9 (Tabla 1).
Cuando se ensayó cada PNS individualmente, siete sitios (381, 3673, 5808, 6484, 6853, 7566 y 9041) fueron altamente significativos (p < 0,001) y tres sitios fueron escasamente significativos (861, 2653 y 6009, p = 0,01, 0,02 y 0,02, respectivamente) cuando se hizo la regresión frente a la dosis de warfarina de mantenimiento diaria. De los siete puntos altamente significativos, cinco (381, 3673, 6484, 6853, 7566) tienen un desequilibrio de ligamiento fuerte (r2 = 0,9) y dos sitios independientes (5808 y 9041) no se correlacionan con ningún otro PNS de esta región. El análisis de las interacciones PNS-PNS también mostró efectos significativos entre varias combinaciones de sitios, por lo que también se cuantificó la asociación de haplotipos individuales con dosis de warfarina. Se usó un análisis de regresión lineal múltiple usando haplotipos inferidos para cada paciente para determinar la asociación del haplotipo y la dosis de warfarina, al mismo tiempo que se ajustaron covariables genéticas y otras clínicamente importantes (por ejemplo, edad, CYP2C9-*2 o *3, etc.; véanse, la Tabla 1 y la Tabla 4). Se encontró que cuatro de los cinco haplotipos comunes (frecuencia > 5 %) estaban asociados significativamente con la dosis de warfarina (p
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<= 0,05) (Tabla 1). A partir de este análisis se identificaron dos haplotipos (H1 y H2) de dosis baja (2,9 y 3,0 mg/d) y dos haplotipos (H7 y H9) de dosis alta (6,0 y 5,5 mg/d).
Se construyó un árbol genealógico a partir de los cinco haplotipos comunes para identificar agrupamientos de haplotipos jerárquicos potenciales (Fig 1 -panel superior). Se identificaron dos tipos distintos de clados de haplotipos, que se separaban completamente en cinco de los diez PNS de VKORC1 y se denominaron clado A (H1 y H2) y clado B (H7, H8 y H9). Usando esta denominación, todos los pacientes fueron agrupados basándose en su genotipo CYP2C9 y se les asignó un diplotipo de clado de VKORC1 (es decir, combinación de dos clados) de A/A, A/B o B/B (Fig. 1 -panel inferior). La media general (5,1 ± 0,2 mg/d) y el intervalo de las dosis de warfarina de mantenimiento fueron las normales de otros estudios de pacientes clínicos (Aithal y col., supra). La dosis de mantenimiento de warfarina difirió significativamente entre los tres agrupamientos de diplotipos de clados (A/A, AB, BB, p < 0,001) en el grupo de pacientes combinado (es decir, Fig. 1 -Todos los pacientes) y para los pacientes con CYP2C9 natural (WT) se observó un efecto aditivo en todo el intervalo de dosificación de warfarina. En general, la proporción de variación de dosis de warfarina explicada por los clados A y B de VKORC1 fue del 25 % y era similar a los valores obtenidos al considerar todos los sitios de PNS de VKORC1 con interacciones. Los pacientes que eran portadores de mutaciones *2 o *3 de CYP2C9 mostraron un efecto similar del diplotipo de clado de VKORC1 sobre la dosis de warfarina (p < 0,001 entre el diplotipo A/A y el A/B). Se observó una tendencia general hacia dosis de warfarina menores asociadas con genotipo variante de CYP2C9 (Fig. 1, panel inferior), coherente con el metabolismo de la warfarina atenuado conocido en portadores de estas variantes alélicas (Rettie y col., Epilepsy Res 35, 253-5 (1999)). La separación de haplotipos de VKORC1 en clados asociados a dosis bajas y altas, independientemente de CYP2C9*2 y *3, sugiere que el genotipado de los PNS de VKORC1 tiene un poder predictivo fuerte para determinar la dosis de warfarina requerida para lograr y mantener la anticoagulación terapéutica en el ámbito clínico.
Con el fin de validar estos resultados iniciales, se realizó un estudio de repetición en una cohorte independiente, más grande, de pacientes americanos de origen europeo tratados con warfarina (n = 368). Estos pacientes se genotiparon usando cuatro PNS informativos (861, 5808, 6853, 9041 -Fig. 1 - panel superior -números en negrita) que resuelven los cinco haplotipos comunes (H1, H2, H7, H8 y H9) presentes en la cohorte clínica inicial de americanos de origen europeo. Se infirieron los haplotipos, se asignaron los diplotipos de clados y se separaron los pacientes en función de su genotipo CYP2C9 conocido. En general, los resultados de esta población clínica mayor resumieron los descubrimientos notables en la población índice para los tres subgrupos de pacientes. En esta segunda cohorte, los pacientes CYP2C9-WT (n = 233) y todos los pacientes (n = 357) mostraron un efecto aditivo significativo en los diplotipos de clados A/A (3,4 ± 0,26 y 3,2 ± 0,21 mg/d), A/B (4,9 ± 0,17 y 4,4 ± 0,13 mg/d) y B/B (6,7 ± 0,29 y 6,1 ± 0,23 mg/d) (p < 0,05 entre A/A, A/B y B/B).
Una variable usada en la estimación de la dosis de warfarina clínica es el origen racial del paciente (Blann y col.,Br J Haematol 107, 207-9 (1999); Gan y col., Int J Hematol 78, 84-6 (2003)). Los individuos con antepasados asiáticos, europeos y africanos tienden a requerir, de media, dosis inferiores (~3,0 mg/d), intermedias (~5,0 mg/d) y superiores (~6,5 mg/d), respectivamente (Yu y col., Qjm 89, 127-35 (1996); Chenshu y col., Ann Pharmacother 34, 1395-401 (2000); Absher y col., Ann Pharmacoter 36, 1512-7 (2002); Gage y col., Thromb Haemost 91, 87-94 (2004)). Con el fin de averiguar si esta variación en la necesidad de dosis puede deberse a diferencias específicas de población en la distribución de los haplotipos de VKORC, se volvieron a secuenciar 335 individuos de control no relacionados, seleccionados de entre estos antepasados de la población (europeos, n = 119, africanos, n = 96, asiáticos, n = 120) y se determinó el genotipo en cada uno de los 10 PNS presentes en los pacientes clínicos descendientes de europeos. Se infirieron parejas de haplotipos para cada individuo y se determinaron las frecuencias de haplotipo de la población junto con la distribución de los haplotipos de clado A y B (Tabla 2). La distribución de haplotipos comunes (H1, H2, H7, H8 y H9) entre las poblaciones de americanos de origen europeo clínica y de control fue significativamente diferente (p < 0,001), principalmente debido a un incremento en el haplotipo H7 asociado a dosis alta en los pacientes clínicos. Esto puede deberse a un sesgo en la selección de la población clínica, resultado de la derivación preferencial a un centro médico universitario, del que se reclutaron los pacientes.
Los cinco haplotipos predictivos supusieron el 99 % y el 96 % del total de haplotipos de las poblaciones de americanos de origen europeo clínica y de control ; no se observaron diferencias significativas basadas en la distribución de clados A (35 % frente a 37 %) y B (64 % frente a 58 %). Los cinco haplotipos comunes dentro de la población de americanos de origen europeo supusieron sólo el 61 % del total de haplotipos de americanos de origen africano. Esta distribución más diversa de haplotipos en la población americana de origen africano es coherente con la mayor diversidad de secuencia genómica encontrada en poblaciones de descendientes de africanos (Przeworski y col., Trenda Genet 16, 296-302 (2000); Crawford y col., Am J Hum Genet 74, 610-22 (2004)). Estas diferencias de haplotipos específicas de población pueden deberse a efectos demográficos tales como presiones selectivas geográficas, migraciones o cuellos de botella, y se han observado para otros genes relevantes médicamente (por ejemplo, ADRB2), (Drysdale y col., Proc Natl Acad Sci USA 97, 10483-8 (2000)). Las poblaciones americanas de origen africano y asiático mostraron diferencias significativas en las frecuencias de clados A y B (p < 0,001) comparadas con la población de control americana de origen europeo. La frecuencia de haplotipos del clado A fue más alta entre la población americana de origen asiático (89 %) y más baja en la población americana de origen africano (14 %) comparadas con la población de control americana de origen europeo (37 %). Debido a que los haplotipos del clado A predicen fenotipos de baja dosis de warfarina (Tabla 1), las diferencias étnicas en la
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frecuencia de haplotipos de VKORC1 establecen un paralelismo con la experiencia clínica de las diferencias poblacionales en las necesidades de dosis de warfarina de mantenimiento. Por tanto, este ejemplo describe diferencias específicas de población en la distribución de haplotipos que son la contribución principal a la variación de las necesidades de dosis de warfarina de mantenimiento entre grupos raciales.
El/los mecanismo(s) moleculares por los que estos haplotipos, o los alelos de PNS individuales que los comprenden, determinan las dosis de warfarina, permanece sin definir. Dos de estos PNS (381 y 3673) están presentes en la región promotora corriente arriba en 5', dos en el primer intrón (5808 y 6484) y uno (9041) en la región no traducida (UTR) en 3'. Ninguno de los PNS significativamente asociados están presentes en secuencias no codificantes muy conservadas presentes en ratón o rata. La presente invención no se limita a un mecanismo concreto. De hecho, no es necesaria la comprensión del mecanismo para poner en práctica la presente invención. No obstante, se contempla que los PNS de la UTR en 3' pueden afectar al plegamiento y estabilidad del ARNm (Durrin, L. K., Haile,
R. W., Ingles, S. A. y Coetzee, G. A. Vitamin D receptor 3’-untranslated region polymorphisms: lack of effect on mRNA stability. Biochim Biophys Acta 1453, 311-20 (1999); Carter, A. M., Sachchithananthan, M., Stasinopoulos, S., Maurer, F. y Medcalf, R. L. Prothrombin G20210A is a bifunctional gene polymorphism. Thromb Haemost 87, 846-53 (2002)), lo que podría afectar a la expresión de VKORC1 y, posiblemente, a la respuesta a warfarina. La presente invención no se limita a un mecanismo concreto. De hecho, no es necesaria la comprensión del mecanismo para poner en práctica la presente invención. No obstante, se contempla que la fuerte asociación de haplotipos individuales con dosis de warfarina también sugiere que una interacción funcional entre alelos de PNS llevada a cabo en el mismo haplotipo puede estar contribuyendo a los resultados observados.
En resumen, este Ejemplo describe PNS no codificantes y haplotipos de VKORC1 que están fuertemente asociados con las dosis de warfarina. Estos grupos de haplotipos se agrupan en clados de orden superior que separan a los pacientes en dosis de warfarina de mantenimiento bajas, intermedias y altas. La asociación gen VKORC1-dosis de warfarina es dependiente del genotipo CYP2C9 y explica el 23 %-25 % de la variabilidad en la dosis de warfarina. El genotipado para estos PNS y haplotipos de VKORC1 proporciona una dosificación inicial más precisa y reduce la cantidad de tiempo para estabilizar la anticoagulación, mejorando de este modo la seguridad, eficacia y costes de hospitalización asociados con el tratamiento con warfarina.
Tabla 1. Necesidad media de dosis de warfarina de mantenimiento basada en el haplotipo de VKORC1.
Haplotipo
Secuencia del haplotipo Frecuencia Dosis de mantenimiento media para pacientes homocigóticos (mg/d)*
H1
CCGATCTCTG (SEQ ID NO: 14) 0,12 2,9 (2,2 -3,7)
H2
CCGAGCTCTG (SEQ ID NO: 15) 0,24 3,0 (2,5 -3,6)
H7
TCGGTCCGCA (SEQ ID NO: 16) 0,35 6,0 (5,2 -6,9)
H8
TAGGTCCGCA (SEQ ID NO: 17) 0,08 4,8 (3,4 -6,7)
H9
TACGTTCGCG (SEQ ID NO: 18) 0,21 5,5 (4,5 -6,7)
*Ajustado para la raza, edad, sexo, amiodarona, losartán, y genotipo variante de CYP2C9. El efecto de la dosis de warfarina para cada haplotipo se muestra como: Media (intervalo de confianza del 95 %). Valores p para cada haplotipo, donde H1, p < 0,0001; H2, p < 0,001; H7, p < 0,001; H8, p = 0,76; y H9, p = 0,05). n = 185 muestras cínicas.
Nota: Para cada secuencia de haplotipo los alelos se enumeran en orden secuencial a los largo del gen VKORC1 (381, 861, 2653, 3673, 5808, 6009, 6484, 6853, 7566, y 9041).
Tabla 2. Distribuciones de haplotipos de VKORC1 en poblaciones de americanos de origen europeo, africano y asiático.
Secuencia del Controles Controles Haplotipo haplotipo Clínico europeo Controles europeos africanos asiáticos
CCGATCTCTG1
(SEQ ID NO: 14) 43 (0,12) 28 (0,12) 14 (0,07) 213 (0,89) CCGAGCTCTG
2 (SEQ ID NO: 15) 88 (0,24) 61 (0,26) 12 (0,06) 0 (0,00) CCGGTCCCCG
3 (SEQ ID NO: 19) 2 (0,01) 3 (0,01) 27 (0,14) 0 (0,00) CCGGTCCGTG
4 (SEQ ID NO: 20) 1 (0,00) 0 (0,00) 11 (0,06) 0 (0,00) TCGAGCTCTG
5 (SEQ ID NO: 21) 1 (0,00) 5 (0,02) 0 (0,00) 0 (0,00) TCGGTCCGCG
6 (SEQ ID NO: 22) 0 (0,00) 0 (0,00) 15 (0,08) 0 (0,00) TCGGTCCGCA
7 (SEQ ID NO: 16) 132 (0,35) 49 (0,21) 80 (0,42) 25 (0,10) TAGGTCCGCA
8 (SEQ ID NO: 17) 28 (0,08) 34 (0,14) 2 (0,01) 0 (0,00) TACGTTCGCG
(SEQ ID NO: 18) 77 (0,21) 56 (0,24) 11 (0,06) 0 (0,00) OTROS -0 (0,00) 2 (0,01) 20 (0,10) 2 (0,01)
Clado A (1,2) 131 (0,35) 89 (0,37) 26 (0,14) 213 (0,89) Clado B (7,8,9) 237 (0,64) 139 (0,58) 93 (0,47) 25 (0,10) TOTAL (A y B) 340 (0,99) 194 (0,96) 119 (0,61) 238 (0,99)
Cromosomas totales 372 238 192 240 (2N)
Individuos Totales 186 119 96 120
(N)
Nota: Los alelos haplotípicos de cada posición se enumeran en el mismo orden que en la Tabla 1. Para cada población se enumera el número de haplotipos mencionados. Los números en paréntesis denotan la proporción de individuos con haplotipo dado.
Tabla 3. Ensayos de genotipo de PNS de VKORC1 y dosis de warfarina de mantenimiento
Genotipo # (%) Dosis media (IC 95 %) Valor P no ajustado Valor P ajustado*
VKORC1 381 <0,001 <0,001 C/C 49 (42) 5,4 (4,7 -6,3) C/T 56 (47) 4,6 (4,2 -5,1) T/T 13(11) 2,3 (1,8 -2,9)
VKORC1 861 0,01 0,01
A/A 58 (48) 4,0 (3,5 -4,5) A/C 49 (40) 5,0 (4,4 -5,7) C/C 14 (12) 5,3 (4,2 -6,6)
VKORC1 2653 0,009 0,02
G/G 115 (64) 4,3 (3,9 -4,7) G/C 59 (33) 4,9 (4,3 -5,6) 20
Genotipo
# (%) Dosis media (IC 95 %) Valor P no ajustado Valor P ajustado*
C/C
7 (4) 6,6 (4,3 -10,2)
VKORC1 3673
<0,001 <0,001
A/A G/A G/G
77 (43) 81 (45) 22 (12) 5,5 (4,9 -6,2) 4,6 (4,2 -5,0) 2,6 (2,2 -3,1) <0,001 0,004 <0,001 <0,001 0,005 <0,001
VKORC1 5808
<0,001 0,0001
T/T T/G G/G VKORC1 6009 C/C C/T T/T
104 (60) 60 (35) 9 (5) 110 (62) 61 (34) 7 (4) 5,2 (4,8 -5,7) 4,0 (3,6 -4,6) 2,6 (2,0 -3,5) 4,3 (3,9 -4,7) 5,0 (4,4 -5,6) 6,6 (4,3 -10,2) 0,007 0,02
VKORC1 6484
<0,001 <0,001
C/C C/T T/T
77 (42) 83 (46) 22 (12) 5,5 (4,9 -6,2) 4,5 (4,1-4,9) 2,6 (2,2 -3,1)
VKORC1 6853
<0,001 <0,001
C/C C/G G/G VKORC1 7566
72 (41) 80 (46) 22 (13) 5,5 (4,8 -6,1) 4,4 (4,1 -4,8) 2,6 (2,2 -3,0) <0,001 <0,001
C/C C/T T/T VKORC1 9041
74 (42) 83 (47) 21 (12) 5,4 (4,8 -6,1) 4,5 (4,1 -4,9) 2,6 (2,2 -3,0) <0,001 <0,001
A/A G/A G/G
56 (32) 87 (50) 30 (17) 3,7 (3,3 -4,3) 4,8 (4,4 -5,3) 5,9 (5,2 -6,6)
* Ajustados para la edad, la raza, sex, amiodarona, losartán, CYP*2 y CYP*3.
Los valores de P se obtuvieron de ensayos estadísticos de tasa de probabilidad de modelos de regresión lineal en los que el número de alelos PNS se codificó como 0, 1, 2 para representar un modelo de herencia genética aditivo o codominante.
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Tabla 4. Características de 185 pacientes clínicos de warfarina americanos de origen europeo
Característica
N (%) o la media ± DE (intervalo)
Sexo
Masculino Femenino Raza
121 (65) 64 (35)
Blanca Hispana Edad, años (intervalo) Fumador de cigarrillos Diagnóstico Fibrilación auricular Arritmia Insuficiencia cardiaca congestiva Enfermedad tromboembólica venosa Miocardiopatía dilatada Valvulopatía Hipertensión Diabetes tipo Neoplasia maligna
179 (97) 6 (3) 59,9 ± 15,7 (19 -88) 25 (14) 95 (52) 81 (44) 77 (42) 40 (22) 37 (20) 13 (7) 85 (46) 41 (22 27 (15)
Medicación
Amiodarona Losartán Torasemida Acetaminofeno Vitamina C Vitamina E
24 (13) 17 (9) 11 (6) 52 (28) 27 (15) 25 (14)
Dosis de warfarinaSeguimiento, días Media
de mantenimiento, mg/día 5,1 ± 2,5 831
Mediana
545
Intervalo
14 -4032
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Tabla 5. Comparación de la dosis diaria de warfarina y el diplotipo de clado entre las dos cohortes clínicas de americanos de origen europeo
Población índice (n = 185) -Seattle -Universidad de Washington AAAB BB TODOS *2 o *3 WT TODOS *2 o *3 WT TODOS *2 o *3 WT
Media
2,58 2,37 2,69 4,79 4,00 5,15 6,23 4,40 7,00
DesvEst
0,82 0,87 0,79 1,83 1,10 1,98 2,71 1,41 2,77
SEM
0,17 0,31 0,20 0,20 0,21 0,26 0,32 0,30 0,38
n
23 8 15 86 27 59 74 22 52
Población de repetición (n = 368) -St. Louis -Universidad de Washington
AA
AB BB
TODOS
*2 o *3 WT TODOS *2 o *3 WT TODOS *2 o *3 WT
Media
3,20 2,78 3,35 4,42 3,61 4,90 6,11 5,00 6,68
DesvEst
1,40 1,21 1,46 1,75 1,40 1,77 2,71 2,08 2,83
SEM
0,21 0,35 0,26 0,13 0,18 0,17 0,23 0,30 0,29
n
44 12 32 170 63 107 143 49 94
Nota: algunos individuos no pudieron clasificarse dentro de los clados A o B.
Ejemplo 2
Expresión de ARNm de VKORC1
Para explorar el mecanismo de la asociación entre la dosis de warfarina y los polimorfismos de VKORC1, se ensayaron los niveles de ARNm de VKORC1 en tejido hepático humano y se compararon con los principales grupos de haplotipos de VKORC1 (A/A, A/B, B/B).
A. Procedimientos
Ensayo de ARNm de VKORC1. Se usaron 1,2 μl de ADNc total de cada muestra como molde para la PCR cuantitativa (usando reacciones de 9 μl) en presencia de indicador verde SYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores de PCR (5' a 3' -directo = ATCAGCTGTTCGCGCGTC (SEQ ID NO: 14), inverso = AGAGCACGAAGAACAGGATC (SEQ ID NO: 15) se seleccionaron a partir de secuencias del exón 1 y 3 de la secuencia codificante de VKORC1 (N.º de acceso NM_024006). Todas las PCR cuantitativas se realizaron en un 7900HT de Applied Biosystems y se recogieron datos en tiempo real durante todo el periodo de ciclado térmico (condiciones de ciclado: 95 ºC -15 minutos para la desnaturalización inicial y 40 ciclos de 94 ºC -30 s, 60 ºC -30 s, 72 ºC -30 s y una extensión final de 72 ºC -5 minutos). Cada muestra se midió por duplicado y se promediaron los resultados de dos experimentos independientes. Todos los niveles de VKORC1 estaban normalizados con niveles de expresión de GAPDH (cebadores (5' a 3'): directo = ACAGTCAGCCGCATCTTCTT (SEQ ID N.O: 16), inverso = ATGGGTGGAATCATATTGGAAC (SEQ ID NO: 17), y a escala con relación al grupo de haplotipo A/A (valor medio = 1,49).
Los datos de expresión de ARNm hepático se analizaron después de su transformación logarítmica y se realizó la prueba general para diferencias de grupo usando un ANOVA. Se realizaron comparaciones por parejas entre grupos para evaluar la significancia usando la prueba del rango estudentizado de Turkey. Los niveles de significancia se establecieron a p < 0,05.
B. Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 3. Se evidencia un efecto gen-dosis muy significativo y graduado (p = 0,002), con niveles de ARNm aproximadamente 3 veces mayores en el grupo (B/B ('dosis alta') comparado con el A/A (grupo de 'dosis baja') (Figura 3 -p < 0,05).
Diversas modificaciones y variaciones de los descritos procedimiento y sistema de la invención resultarán obvias para los expertos en la técnica sin alejarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones preferidas específicas, debería entenderse que la invención como se reivindica no debería limitarse indebidamente a tales realizaciones específicas.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para determinar una dosis de warfarina óptima para un sujeto humano, comprendiendo dicho procedimiento:
    determinar, en una molécula de ácido nucleico correspondiente a la SEQ ID NO: 1, que es de una muestra 5 obtenida de un sujeto humano, el genotipo en las posiciones de nucleótidos 381 y/o 3673; e identificar la dosis de warfarina óptima para el sujeto basándose en dicha determinación.
  2. 2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha determinación comprende:
    secuenciar la molécula de ácido nucleico al menos en la posición 381 para determinar el nucleótido de la posición 381.
    10 3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha determinación comprende:
    secuenciar la molécula de ácido nucleico al menos en la posición 3673 para determinar el nucleótido de la posición 3673.
  3. 4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha determinación comprende:
    detectar, en un ensayo de hibridación, una capacidad de la molécula de ácido nucleico para hibridar con 15 una sonda de oligonucleótidos.
  4. 5.
    El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha determinación comprende:
    detectar, en un ensayo basado en PCR, una capacidad de cebadores de oligonucleótidos de amplificar la molécula de ácido nucleico.
  5. 6.
    El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el nucleótido de la posición 381 es citosina o timina.
    20 7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el nucleótido de la posición 3673 es adenosina o guanina.
  6. 8. Un procedimiento para predecir la respuesta de un sujeto humano a warfarina, que comprende:
    determinar, en una molécula de ácido nucleico correspondiente a la SEQ ID NO: 1, que es de una muestra obtenida de un sujeto humano, el genotipo en las posiciones de nucleótidos 381 y/o 3673; y predecir la respuesta a warfarina de un sujeto humano basándose en dicha determinación.
    25 9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha determinación comprende:
    secuenciar la molécula de ácido nucleico al menos en la posición 381 para determinar el nucleótido de la posición 381.
  7. 10. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha determinación comprende:
    secuenciar la molécula de ácido nucleico al menos en la posición 3673 para determinar el nucleótido de la30 posición 3673.
  8. 11.
    El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha determinación comprende:
    detectar, en un ensayo de hibridación, una capacidad de la molécula de ácido nucleico para hibridar con una sonda de oligonucleótidos.
  9. 12.
    El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha determinación comprende:
    35 detectar, en un ensayo basado en PCR, una capacidad de cebadores de oligonucleótidos de amplificar la molécula de ácido nucleico.
  10. 13.
    El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el nucleótido de la posición 381 es citosina o timina.
  11. 14.
    El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el nucleótido de la posición 3673 es adenosina o guanina.
  12. 15. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha determinación comprende determinar el genotipo en 40 las posiciones de nucleótidos 381, 3673, 6484, 6853 y 7566.
  13. 16. Un kit para identificar una dosis de warfarina óptima para un sujeto humano, comprendiendo dicho kit:
    un ensayo de detección para determinar en una molécula de ácido nucleico correspondiente a la SEQ ID NO: 1, que es de una muestra de un sujeto humano, el nucleótido de una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 381 y 3673; e
    instrucciones para correlacionar los resultados del ensayo de detección con la dosis de warfarina óptima para el sujeto.
  14. 17. El kit según la reivindicación 16, en el que dicho ensayo de detección comprende reactivos adecuados para amplificar la molécula de ácido nucleico.
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