CN112469835A

CN112469835A - 扩增方法及用于其中的引物

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Publication number: CN112469835A
Application number: CN201980048507.5A
Authority: CN
Inventors: A·A·莫利
Original assignee: Monoquant Pty Ltd
Current assignee: Monoquant Pty Ltd
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2019-06-07
Publication date: 2021-03-09
Also published as: EP3802871A4; CA3103140A1; US20220098655A1; CA3103142A1; AU2019284210A1; EP3802870A4; WO2019237146A1; KR20210019501A; AU2019284211A1; JP2021526824A; JP2021526822A; JP7555272B2; US11306352B2; US20210087619A1; KR20210030929A; EP3802871A1; EP3802870A1; CN112424374A; WO2019237145A1

Abstract

本发明一般涉及扩增感兴趣的核酸区的改进方法和用于其中的引物。更具体地，本发明涉及扩增由两个或多个免疫球蛋白或T细胞受体基因片段重组产生的核酸区的改进方法和用于其中的引物。本发明的方法基于以下确定：在相对于给定反应唯一的临界退火温度确定的退火温度下和/或使用优化的引物执行扩增步骤，可以实现比先前在现有技术的扩增重排的免疫或T细胞受体基因的方法中可获得的更高水平的灵敏度。当本发明的重组靶标仅包含一个N区时，本发明的方法特别有用。提供检测特异性免疫和T细胞受体核酸重组事件的高度灵敏但简单的方法可用于多种应用，包括但不限于：诊断和/或监测克隆淋巴样细胞群体或疾病病症，或分析或鉴定感兴趣的免疫或T细胞受体基因区，克隆淋巴样细胞群体或疾病病症的特征在于特异性V/D/J重组事件(诸如检测白血病中的微小残留病)。

Description

扩增方法及用于其中的引物

技术领域

背景技术

本说明书中对任何在先出版物(或由其衍生的信息)，或对任何已知或未知的物质的引用，并且不应被视为承认或认可或任何形式的暗示：在先出版物(或由其衍生的信息)或已知的物质形成本说明书所致力的领域的公知常识的一部分。

本说明书中作者引用的出版物的著录细节按字母顺序收集在说明书末尾。

克隆通常被理解为已经从共同的前体细胞传代的细胞群体。诊断和/或检测受试者中细胞或生物体的克隆群体的存在通常构成了相对成问题的程序。具体地，克隆群体可以仅构成细胞或生物体的较大群体内的次要组分。例如，就哺乳动物生物体而言，在诸如癌症的赘生物诊断和/或检测方面发生需要检测细胞克隆群体的更常见情况之一。然而，检测一个或多个克隆群体在诊断诸如脊髓发育不良或真性红细胞增多症的疾病病症中以及在检测由免疫系统产生的抗原驱动克隆中也可能是重要的。

通常，产生克隆的群体对应于身体的特定组织或区室中的细胞群体。然而，尽管对这样的细胞群进行采样有效地将检查缩小到细胞或生物的亚组，但是这仍然可能向临床医师呈现非克隆细胞或生物的大背景群，在所述非克隆细胞或生物的大背景群内必须鉴定克隆群。

如果所述克隆的成员的特征在于分子标记,诸如DNA的改变的序列，则所述检测问题可以转化为在具有不同序列的较大分子群体内检测全部具有相同分子序列的分子群体的问题，所述较大分子群体或者全部相同或者不同，或者在更大或更小程度上是异源的。可以实现的标记分子的检测水平非常取决于检测方法的灵敏度和特异性，但是几乎总是，当较大分子群体中的靶分子的比例变得小时，来自较大群体的信号噪音使得不可能检测来自靶分子的信号。

尽管是高度特异性的，但是在其检测方面呈现独特复杂性的一类特定分子标记是那些由遗传重组事件产生的标记。

遗传物质在体细胞中的重组涉及将最初分离的基因组的两个或更多个区集合在一起。它可以作为随机过程发生，但也作为正常淋巴细胞发育过程的一部分发生。

对于癌症，重组可以是简单的或复杂的。简单的重组可被认为是其中两个不相关的基因或区并置的重组。复杂重组可被认为是其中多于两个基因或基因片段被重组的重组。复杂重组的经典示例是免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)可变基因的重排，其发生在淋巴样细胞的正常发育期间并且涉及V、D和J基因片段的重组。这些基因片段的基因座在胚系中广泛分离，但是淋巴发育过程中的重组导致V、D和J基因片段，或V和J基因片段的并置，这些基因片段之间的连接的特征在于小的核苷酸插入和缺失区(N₁和N₂区)。该过程随机发生，使得每个正常淋巴细胞携带唯一的V(D)J重排，其可以是完全VDJ重排或VJ或DJ重排，这取决于重排的基因和重排的性质。由于在单个正常细胞中发生赘生变化而发生淋巴样癌症，诸如急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，所有癌细胞至少最初将携带最初存在于生成细胞中的连接V(D)J重排。亚克隆可能出现在赘生群体的扩增过程中，并且其中可能发生进一步的V(D)J重排。

由重组产生并存在于癌症克隆或亚克隆中的独特DNA序列提供了独特的遗传标记，该遗传标记可用于监测对治疗的应答并决定治疗。可通过PCR、流式细胞仪或下一代(next-gen)测序对克隆进行监测。流式细胞术监测涉及在诊断时确定癌细胞的免疫表型并在后续样品中寻找相同表型以检测和定量癌细胞。下一代测序是一种较新的方法，其优点和缺点仍在评估中。然而，这也是一种昂贵的技术。

基于PCR的分析是优选的方法，因为其具有潜在的高水平特异性和自动化。通过PCR定量通常涉及使用来自在诊断时采集的样品的DNA对标志物重排进行测序，合成患者特异性引物，以及在PCR中使用这些引物对从治疗期间获得的样品中提取的DNA进行测序。通常在重组位点的任一侧放置两个引物，通常下游引物针对J基因片段，而上游引物(也称为等位基因特异性寡核苷酸[ASO])被设计为针对重排的最可变区(Bruggemann et al,2004；Pongers-Willemse et al,1999；Nakao et al,2000；van der Velden et al,2002；vander Velden et al,2004；van der Velden et al,2007；van der Velden et al,2009；vander Velden et al,2014；Verhagen et al,2000)。有时上游引物针对V基因片段，而ASO引物位于下游并针对重排的最可变区。因此，非ASO引物是共有引物，因为它针对许多不同重排所共有的保守区。

PCR检测白血病微小残留病(MRD)已广泛应用于临床。通常，通过在诱导治疗结束时(约一个月)和几个巩固治疗周期后(约80天)测量白血病细胞(MRD)的数量来决定是否继续或改变治疗。通常，如果诱导结束时的MRD水平高于限定的截止水平，则可以决定增加治疗强度。该截止水平在不同组方案之间略有不同，但通常在10^-3(1/1000)和10^-4(1/10,000)白血病细胞/总细胞之间。

目前该方法存在的问题是非特异性的，这可能导致假阳性结果，并且重要的是限制了检测和测量的灵敏度。结果，有时不可能检测到，并且常常不可能量化低于10^-4水平的MRD。这具有两个后果：

·当MRD低于检测极限时，定量是不可能的。这是许多患者的情况。对试图鉴定对初始治疗反应非常好并且后续治疗强度可降低的患者存在极大兴趣。这样的患者的特征在于具有非常低的MRD水平，例如<10^-6，但是，如果检测极限为10^-4，则不能将他们与水平为10^-4和10^-6之间的患者区分开。

·由于测定过程中的随机变化，当MRD水平接近但仍高于检出极限时，测定精度较差。

导致非特异性的因素包括：

·两个引物所结合的序列不是唯一的，而是通常存在于基因组中的序列，并且扩增的特异性仅由于使结合序列彼此靠近的重排而产生。

·V基因家族的不同成员之间以及D基因家族的不同成员之间存在一定程度的同源性。这增加了上游引物与非白血病重排杂交的可能性。

·非白血病淋巴细胞群体中的重排是极其异质性的，从而存在正常群体中一个或多个细胞中的重排类似于白血病细胞群体中的普遍重排的真实可能性。

在过去的18年里，有许多现有技术的方法试图使非特异性扩增的发生率最小化。包括：

·使用靶向重排靶基因的不同区的一系列上游引物进行2轮或3轮嵌套PCR。靶区通常包括两个N区。这消除了非特异性并且导致高敏感性测定(例如Morley et al,2009)。然而，这种方法更复杂，并且存在PCR产物污染环境的风险。

·用新一代测序代替PCR。该过程可以测量低至10^-5的MRD，并且可能具有低至10^-6的额外步骤。然而，该过程是复杂且昂贵的，特别是在需要高灵敏度的情况下。

·使用改进的流式细胞术。

·设计等位基因特异性(ASO)引物的3’端以试图最小化非特异性。广泛认为需要在PCR引物的3’端包括G或C碱基以进行有效扩增。具体地，在3’端存在一个或多个G或C碱基有利于有效的引物杂交和延伸，因为这些碱基与它们的互补碱基形成了比A或T碱基更强的氢键

·将上游ASO引物导向最大N区，且下游引物导向胚系J序列，退火温度约为60℃(例如，Bruggemann et al,2004；Pongers-Willemse et al,1999；Nakao et al,2000；vander Velden et al,2002；van der Velden et al,2004；van der Velden et al,2007；vander Velden and van Dongen,2009；van der Velden et al,2014；Verhagen et al,2000)。

·使用Tm高达约65℃的引物和/或使用高达69℃的退火温度(Bruggemann et al,2004；Pongers-Willemse et al,1999；Nakao et al,2000；van der Velden et al,2002；van der Velden et al,2007；van der Velden and van Dongen,2009；van der Veldenet al,2014；Verhagen et al,2000)。

·使用缩短的引物。

·进行touch-down PCR(Pongers-Willemse et al,1999；Nakao et al 2000)

·设计引物以显示其在重排基因上的定位情况下的特定位置特征。

·进行熔解曲线分析以试图区分特异性扩增子和非特异性扩增子。然而，当其中一个引物是通用引物时，熔解曲线分析失败。

然而，这些方法在将近二十年的时间里一直未能显着减少非特异性扩增(Bruggemann et al,2004；Pongers-Willemse et al,1999；Nakao et al,2000；van derVelden et al,2002；van der Velden et al,2007；van der Velden et al,2009；van derVelden et al,2014；Verhagen et al,2000)。实际上,作为不可避免的事件,非特异性扩增已经被接受到这样的程度，使得用于解释MRD结果的标准推荐将该结果与已经观察到的非特异性水平相关(van der Velden et al,2007)。

因此，一直需要开发改进的扩增方法，该方法简单，但由于在重排Ig和TCR基因，诸如在MRD的情况下，非特异性扩增水平的降低而显示出改进的灵敏度。

在导致本发明的工作中，已经开发了基于使用退火温度的高度灵敏的单轮PCR，所述退火温度通过基于选择用于给定反应的引物的性能的反应来确定。具体地，在低于临界退火温度(Tc)3℃且至多该反应的Tc的范围内的退火温度下进行主题反应，产生非特异扩增的显著降低，使得能够定量在治疗患有急性成淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病的患者期间获得的样品中的MRD，这迄今尚未实现。这些发现与几乎所有现有技术的方法形成对比，所述现有技术的方法基于选择在所有反应的固定值下确定的退火温度，而不是通过参考所选择的用于给定反应的引物的功能性通过实验确定的退火温度。

还进一步确定了，当以其自身独立地或与根据本发明方法选择的退火温度组合使用时，引物的设计和使用也显著降低了非特异性扩增，其中引物3’末端的一个或多个核苷酸是A和/或T。当被设计为还包括熔解曲线分析时，本发明的方法变得特别灵敏，并且因此是强大的工具。

尽管可应用于任何Ig或TCR重排分析，但已经确定本发明的发展证明了关于仅包含一个N区的Ig或T细胞重组靶区的扩增的特定功效。

考虑到迄今为止由于引物设计、退火温度和PCR条件的变化而取得的有限改进，这些发现既是意料之外的又是违反直觉的，迄今为止，所有这些方法均已通过了有限的测试。该高灵敏度方法的开发避免了执行更复杂的多重或嵌套PCR反应或另外使用十分昂贵的新一代测序的需要。现在本方法的发展已经能够改进检测和/或监测特征在于特异性Ig或TCR基因重组的淋巴样细胞克隆的群体，诸如T细胞或B细胞的赘生群体。还提供了诊断和/或监测疾病病症的方法，所述疾病病症的特征在于所述细胞的克隆群体的扩增。

发明内容

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”之类的变体将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。

本发明的范围不受这里描述的特定实施方案的限制，这里描述的特定实施方案仅用于示例的目的。如本文所述，功能上等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。

如本文所用，术语“衍生自”应理解为表示特定的整数或整数的组源自指定的物种，但不一定直接从指定的来源获得。此外，如本文所用，单数形式的“一”，“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。

本说明书包含使用程序PatentIn第3.1版制备的核苷酸序列信息，其在本文中在参考文献之后给出。每个核苷酸序列在序列表中由数字指示符<210>和其后的序列标识符(例如<210>1，<210>2，等)列出。每个核苷酸序列的长度、序列类型(DNA等)和来源生物分别由数字指示符字段<211>、<212>和<213>中提供的信息指示。本说明书中提及的核苷酸序列由指示序列SEQ ID NO：及其后的序列标识符(例如：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，等)标识。说明书中提及的序列标识符与序列表中数字指示符字段<400>及其后的序列标识符(例如<400>1，<400>2，等)中提供的信息相关。即说明书中详述的SEQ ID NO：1与序列表中<400>1所示序列相关。

本发明的一个方面涉及一种扩增Ig或TCR核酸区的方法，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或更多个V、D或J基因片段的重排，所述方法包括使感兴趣的核酸样品与针对所述重排的Ig或TCR核酸区的正向引物和反向引物接触，并使用以下扩增所述核酸样品：

(i)在主题扩增反应的Tc和(Tc-3℃)之间的范围内的退火温度；和/或

(ii)至少一种引物，其在3’末端核苷酸位置包含至少一个A和/或T核苷酸；

和任选地进行熔解曲线分析的手段。

在另一方面，提供了一种扩增Ig或TCR DNA区的方法，所述Ig或TCR DNA区的特征在于两个或更多个V、D或J基因片段的重排，所述方法包含使感兴趣的核酸样品与针对所述重排的Ig或TCR核酸区的正向引物和反向引物接触，并使用以下扩增所述核酸样品：

(ii)至少一种引物，其在所述引物的3’末端核苷酸位置包含至少一个A和/或T核苷酸；

和任选地进行熔解曲线分析的手段。

在还另一方面，提供了一种扩增Ig或TCR核酸区的方法，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或更多个V、D或J基因片段的重排，所述重排的特征在于只有一个N区，所述方法包括使感兴趣的核酸样品与针对所述重排的Ig或TCR核酸区的正向引物和反向引物接触，并使用以下扩增所述核酸样品：

和任选地进行熔解曲线分析的手段。

根据这些方面，在一个实施方案中，所述至少一种引物是ASO引物。

在另一个实施方案中，所述方法包含使用以下两者：在主题扩增反应的Tc和(Tc-3℃)之间的范围内的退火温度，和一或多种引物，其在所述引物的3’末端核苷酸位置包含至少一个A和/或T核苷酸。

在又另一个实施方案中，所述核酸是DNA。

在还另一个实施方案中，在所述引物的两个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在另一个实施方案中，在所述引物的三个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在另一个实施方案中，在所述引物的四个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在还又另一个实施方案中，在所述引物的五个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在还又另一个实施方案中，在所述引物的六个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。

在还又另一个实施方案中，进行熔解曲线分析。

在又还另一个实施方案中，针对下游基因片段的所述引物针对J片段。

在进一步的实施方式中所述扩增是聚合酶链反应。

本发明的又另一方面提供一种检测和/或监测哺乳动物中细胞的克隆群体的方法，所述克隆细胞的特征在于Ig或TCR核酸区，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或多个V、D或J基因片段的重排，所述方法包括：

(i)在足以促进所述引物与所述靶核酸分子相互作用的条件下，使来自哺乳动物的生物样品的DNA材料与如上文定义的正向引物和反向引物接触一段时间；

(ii)使用以下扩增所述核酸靶标：(a)在主题扩增反应的Tc至(Tc-3℃)范围内的退火温度；和/或(b)至少一种引物，其在所述引物的3’末端核苷酸位置包含至少一个A和/或T核苷酸；和任选的进行熔解曲线分析的手段；和

(iii)检测所述扩增产物。

根据该方面，在一个实施方案中，所述至少一种引物是ASO引物。

在另一个实施方案中，所述方法包含使用以下两者：在主题扩增反应的Tc和(Tc-3℃)之间的范围内的退火温度，和至少一种引物，其在所述引物的3’末端核苷酸位置包含至少一个A和/或T核苷酸。

在又另一个实施方案中，所述核酸是DNA。

在还又另一个实施方案中，进行熔解曲线分析。

在进一步的实施方式中所述扩增反应是聚合酶链反应。

在进一步方面，所述病症是赘生物形成，甚至更优选淋巴样赘生物形成。

另一方面，本发明的方法用于检测淋巴性白血病中的微小残留疾病。

本发明的又另一方面涉及上文所述的分离的引物。

本发明的又另一个方面涉及用于帮助鉴定Ig或TCR核酸区的试剂盒，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或多个V、D或J基因片段的重排，所述试剂盒包含：适合于含有如上定义的任何一种或多种寡核苷酸引物的隔室、用于促进所述引物与靶核酸分子相互作用的试剂、和用于使所述相互作用能够导致所述靶核酸扩增的试剂。

附图说明

图1是观察到的MRD值相对于预期MRD值的图示。将白血病DNA和非白血病DNA以各种已知的比例混合以提供含有一定范围水平MRD的人工样品。测定来自每个样品的三十μg的DNA，并且在图中观察到的MRD水平与期望值相关。注意，通过测定这种量的DNA，MRD的检测极限低于10^-6。ALL是指来自急性成淋巴细胞白血病患者的DNA，CLL是指来自慢性淋巴细胞白血病患者的DNA。

图2是获自由急性成淋巴细胞白血病患者血样中MRD测量结果的图示。左手列显示检测和测量的水平。中间列显示未检测到MRD的样品的结果；MRD水平低于指定值，显示值的变化是可用于研究的DNA量变化的结果。右手列显示用引物观察到的53例患者的非特异性水平。5个引物对观察到非特异性，并显示了其水平。48名患者的引物没有观察到非特异性，表明该水平小于3.4×10^-7。

图3是非特异性相对于退火温度的图示。使用来自5名患者的2μg非白血病DNA和引物对进行PCR。选择这些引物进行研究，因为它们在较低温度下显示出一些非特异性。非特异性的量与Ct值成反比。在每种情况下，非特异性的量保持大约相同，直到退火温度升高到大于70℃。然后它逐渐减少并且最终用引物对中的4个检测不到。

图4是用于确定临界退火温度(Tc)的方法的图示。使用一定范围的退火温度进行一系列PCR。Tc是PCR保持最佳效率的最高温度，如最小Ct的保持所示。测试了四种不同的ASO引物，各引物的Tc用箭头表示。

图5显示了熔解曲线分析的结果。PCR含有用于测量Ct的探针和低浓度的荧光染料Syto 82。在PCR结束时，缓慢升高温度并连续测量荧光。该图显示了荧光相对于温度曲线的一阶导数，并且非特异性扩增和特异性扩增的分离峰是明显的。

图6显示了在治疗期间来自36名慢性淋巴细胞白血病患者的111个样品的MRD测量结果。获得<10^-6的灵敏度。

具体实施方式

本发明部分基于开发用于检测特征在于重排Ig或TCR基因的细胞克隆群体的简单但高度灵敏的扩增方法。使用低于所述PCR反应的Tc至比Tc低3℃(“Tc-3℃”)的范围内的退火温度出乎意料地使得能够开发高度灵敏的单轮PCR，特别是如果与作为扩增过程的一部分的熔解曲线分析结合时。更进一步，引物的使用被设计为使得至少引物的3’末端核苷酸位置是A和/或T，当根据本发明的方法单独使用或与选择的退火温度组合使用时，更进一步地提高了扩增反应的灵敏度和特异性。该方法的发展现在促进了感兴趣的特异性Ig或TCR基因重排的检测，特别是在检测特征在于仅一个N区的重排的情况下。这使得能够改善对特征在于表达已知的Ig或TCR基因重排的细胞(诸如细胞的克隆群体)的病症的监测。本发明的方法和引物在检测微小残留疾病方面特别有用，这需要高水平的灵敏度和特异性，这目前通常仅可通过应用高度复杂和昂贵的分子技术来实现。

因此，本发明的一个方面涉及一种扩增Ig或TCR核酸区的方法，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或更多个V、D或J基因片段的重排，所述方法包括使感兴趣的核酸样品与针对所述重排的Ig或TCR核酸区的正向引物和反向引物接触，并使用以下扩增所述核酸样品：

和任选地进行熔解曲线分析的手段。

在一个实施方案中，所述至少一种引物是ASO引物。

在又另一个实施方案中，进行熔解曲线分析。

对“Ig或TCR核酸区”的提及应理解为指寻求扩增的Ig或TCR DNA或RNA的任何区的提及。所述核酸区可对应于部分重排的基因或完全重排的基因。

对“核酸”或“核苷酸”或“碱基”的提及应理解为既指脱氧核糖核酸或核苷酸又指核糖核酸或核苷酸或嘌呤或嘧啶碱基或其衍生物或类似物的提及。在这方面，应当理解为包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸的磷酸酯，包括DNA(cDNA或基因组DNA)、RNA或mRNA等。本发明的核酸分子可以是任何来源的，包括天然存在的(诸如衍生自生物样品)、重组产生的或合成产生的。碱基还可以是非标准碱基，诸如肌苷。

“衍生物”的提及应理解为包括对来自天然、合成或重组来源的所述核酸分子的片段、部件、部分、同系物和模拟物的提及。“功能性衍生物”应理解为表现出嘌呤或嘧啶碱基、核苷酸或核酸分子的任何一种或多种功能活性的衍生物。所述核苷酸或核酸序列的衍生物包括具有与其它蛋白质或非蛋白质分子融合的核苷酸或核酸分子的特定区的片段。本文考虑的“类似物”包括但不限于对核苷酸或核酸分子的修饰，诸如对其化学组成或整体构象的修饰。这包括诸如在骨架形成或互补碱基对杂交的水平上对核苷酸或核酸分子与其它核苷酸或核酸分子相互作用的方式的修饰。锁定的核酸是本文定义的类似物的示例。核苷酸或核酸分子的生物素化是本文定义的“功能衍生物”的实例。核酸分子的衍生物可以衍生自单或多核苷酸取代、缺失和/或添加。术语“功能衍生物”还应当理解为包括显示核苷酸或核酸序列的任何一种或多种功能活性的核苷酸或核酸，诸如在天然产物筛选后获得的产物。

主题“核酸”区可以是DNA或RNA或其衍生物或类似物。因为感兴趣区是编码蛋白质分子的DNA序列，所以它可以采取基因组DNA、从mRNA转录物产生的cDNA、或通过核酸扩增产生的DNA的形式。如果本发明方法涉及检测RNA区，则应理解首先需要诸如使用RT-PCR来将RNA逆转录为DNA。主题RNA可以是任何形式的RNA，诸如mRNA、初级RNA转录物、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA等。优选地，所述感兴趣核酸区是感兴趣DNA区。为此，所述DNA包括通过逆转录从最终作为分析主题的RNA产生的DNA，和通过诸如PCR的核酸扩增方法产生的DNA。

作为扩增主题的核酸区是经过V、D或J基因片段的两个或多个重排的Ig或TCR核酸区。因此，感兴趣的主题核酸区可对应于部分或完全重排的基因。如下文更详细论述，Ig和TCR重排作为一系列连续重排发生，所述一系列连续重排产生完全重排的可变区，所述完全重排的可变区在最后步骤中重排以连接恒定区基因。本发明的方法可以扩增全部或部分重排的基因，这取决于克隆淋巴样细胞可能已经停止分化的点。

在一个实施方案中，所述靶核酸区是DNA。

根据该实施方案，提供了一种扩增Ig或TCR DNA区的方法，所述Ig或TCR DNA区的特征在于两个或更多个V、D或J基因片段的重排，所述方法包含使感兴趣的核酸样品与针对所述重排的Ig或TCR核酸区的正向引物和反向引物接触，并使用以下扩增所述核酸样品：

和任选地进行熔解曲线分析的手段。

在另一个实施方案中，所述至少一种引物是ASO引物。

在还另一个实施方案中，所述方法包含使用以下两者：在主题扩增反应的Tc和(Tc-3℃)之间的范围内的退火温度，和至少一种引物，其在所述引物的3’末端核苷酸位置包含至少一个A和/或T核苷酸。

在又另一个实施方案中，进行熔解曲线分析。

本发明的方法通过将待检测的核酸样品与正向和反向引物接触来实现。关于“引物”或“寡核苷酸引物”应理解为涉及包含核苷酸序列的任何分子，或其功能衍生物或类似物，其功能包括与感兴趣核酸分子的区杂交。该引物可以含有一个或多个锁定的核酸。还应当理解，引物可以包含非核酸组分。例如，引物还可以包含非核酸标签，诸如荧光或酶标签或一些其他非核酸组分，其促进分子用作探针或以其他方式促进其检测或固定。引物还可以包含另外的核酸组分，诸如寡核苷酸标签。在另一个实例中，引物可以是包含显示核酸侧链的肽骨架的蛋白核酸。优选地，所述寡核苷酸引物为DNA引物。本发明的引物“针对”重排的Ig或TCR核酸。“针对”是指设计引物以部分或全部与寻求扩增的重排Ig或TCR核酸区杂交。

在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，具有适应性免疫系统的生物体中的V(D)J重组是一种位点特异性遗传重组类型的示例，其帮助免疫细胞快速多样化以识别和适应新病原体。每个淋巴样细胞取决于重排的特定基因片段进行其种系可变区基因片段(V和J，D和J或V、D和J片段)的体细胞重组，以产生约10¹⁶个不同可变区结构的总抗原多样性。在任何给定的淋巴样细胞，诸如T细胞或B细胞，由于包含TCR或免疫球蛋白分子的两条链中的两条或更多条，具体地，TCR的α、β、γ或δ链和/或免疫球蛋白分子的重链和轻链，发生了重排，因此可能发生至少两个不同的可变区基因片段重排。除了任何给定免疫球蛋白或TCR基因的VJ、DJ或VDJ片段的重排之外，在片段之间的接合处随机去除和/或插入核苷酸。这导致产生巨大的多样性。

这些基因片段的基因座在胚系中广泛分离，但是在淋巴发育期间的重组导致V、(D)和J基因的并置，这些基因之间的连接的特征在于核苷酸的小的插入和缺失区。该过程随机发生，使得每个正常淋巴细胞携带独特的V(D)J重排。由于在单个正常细胞中发生赘生变化而发生淋巴样癌症，诸如急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，所有癌细胞至少最初将携带最初存在于生成细胞中的连接V(D)J重排。亚克隆可能出现在赘生群体的扩增过程中，并且其中可能发生进一步的V(D)J重排。

对“基因片段”的提及应理解为指免疫球蛋白和T细胞受体基因的V、D和J区。将V、D和J基因片段聚类成家族。例如，对于κ免疫球蛋白轻链有52个不同的功能性V基因片段和5个J基因片段。对于免疫球蛋白重链有55个功能性V基因片段，23个功能性D基因片段和6个J基因片段。在免疫球蛋白和T细胞受体V、D和J基因片段家族的全体中，存在大量的单个基因片段，从而能够实现V(D)J重排的独特组合方面的巨大多样性。为了清楚起见，重排的免疫球蛋白或T细胞受体[V(D)J]可变核酸区在本文中将被称为“基因”，并且单独的V、D或J核酸区将被称为“基因片段”。因此，术语“基因片段”不仅仅指基因的片段的提及。更确切地说，在Ig和TCR基因重排的情况下，是指在其自身权利中的基因的提及，这些基因片段聚集成家族。“重排的”免疫球蛋白或T细胞受体可变区基因在本文中应理解为这样的基因，其中一个V区段、一个J区段和一个D区段(如果将D区段并入所讨论的特定重排可变基因中)中的两个或更多个已经剪接在一起以形成单个重排的“基因”。实际上，这种重排的“基因”实际上是一段基因组DNA，包含已经拼接在一起的一个V基因片段、一个J基因片段和一个D基因片段。因此，它有时也称为“基因区”(尽管不在本说明书的上下文中)，因为它实际上由已经拼接在一起的2或3个不同的V、D或J基因(本文中称为基因片段)组成。因此重排的免疫球蛋白或T细胞受体基因的各个“基因片段”被定义为各个V、D和J基因。在IMGT数据库上详细讨论了这些基因。本文所用的术语“基因”是指重排的免疫球蛋白或T细胞受体可变基因。术语“基因片段”在本文中用于指V、D、J和框架3区。然而，应当注意，使用“基因”/“基因片段”语言在免疫球蛋白和T细胞受体重排方面存在明显的不一致。例如，IMGT指个体V、D和J“基因”，而一些科学出版物将这些称为“基因片段”。一些来源将重排的可变免疫球蛋白或T细胞受体称为“基因区”，而其它来源将其称为“基因”。本说明书中使用的术语如先前所定义。

仍然不将本发明限制于任何一种理论或作用模式，遗传重组事件的性质是使得重组基因或基因片段(如本文所定义)之间的连接可以以导致形成“N区”的随机核苷酸的缺失和插入为特征。这些N区也是独特的，因此在本发明引物的设计中是有用的靶标。在这点上，为了简化本文件中关于本发明的引物相对于它们所结合的基因/基因片段的亚区的讨论，这些N区可以在本发明的上下文中备选地被称为“基因片段”，尽管它们不作为离散的基因片段存在于染色体中并且仅在由于核苷酸在重组位点的插入和缺失而发生重排时产生。将这些称为N基因片段或N区的选择完全基于简化本文件任何给定部分的语言以帮助清楚。因此，特别是在V(D)J重排的情况下，可以作为分析主题的基因片段是单独的V、N₁、D、N₂和J区，以及框架3基因片段。在本文中，V和D基因片段之间的N基因片段称为N₁，而D和J基因片段之间的N基因片段称为N₂。然而，还应当理解，N区(或“基因片段”)可出现在V、D或J基因片段内。在不将本发明限制于任何一种作用模式理论的情况下，这在D基因片段的上下文中最普遍地观察到，其在用J基因片段重排期间可以在D基因片段内经历一个或多个N区的形成。因此，尽管完全重排的VDJ区通常总是包括N1和N2基因片段，但它也可以包括另外的N区，例如在V、D或J基因片段内，或者甚至在重排的J基因片段和恒定基因的连接处，这种最后的重排通常在VDJ重排结束后发生。

对“正向引物”(或“上游引物”)的提及应理解为是指对下述引物的提及，其通过与靶DNA的反义链杂交且或5’与另一引物杂交而扩增感兴趣核酸(例如DNA)样品中的靶核酸(例如DNA)。

对“反向引物”(或“下游引物”)的提及应理解为是指对下述引物的提及，其通过与靶核酸(例如DNA)的有义链杂交，或3’与另一引物杂交而扩增感兴趣核酸(例如DNA)样品和PCR中的靶核酸(例如DNA)。

而通常正向或上游引物是ASO引物，而下游或反向引物是指向例如保守的J区的通用引物，在偶尔的情况下发生相反的情况，使得正向引物指向诸如V区的保守序列，而反向引物是ASO引物。

设计和合成适用于本发明的引物的方法是本领域技术人员熟知的。如上所述，已经充分鉴定并测序了V、D和J基因片段家族。因此，设计引物扩增特定片段或重排片段的组合是本领域技术人员所熟知的。然而，在实施例1和2中还提供了与显示由此提及的Tc值的引物的设计和测试有关的实质性示例。

如上文详述的，本发明的方法基于以下确定：当通过参考临界退火温度选择扩增反应的退火温度时，获得了显著提高的灵敏度水平，所述临界退火温度对于由唯一引物组限定的每个反应是唯一的。对“临界退火温度”(“Tc”)的提及应理解为对最高退火温度的提及，在该最高退火温度下，诸如PCR的扩增反应相对于扩增期望靶标以最佳效率进行操作。扩增的效率可以通过Ct评估。具体地，PCR的每个循环的最佳扩增取决于每种引物与靶分子的最佳杂交，使得所有靶分子有效地杂交。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，如果使用不同但逐渐增加的退火温度范围进行一系列扩增反应，则将鉴定杂交变得不完全、扩增变得低效并且Ct增加的温度。这些扩增低效变得明显之前的最高温度是临界退火温度(Tc)，如图3所示。本领域技术人员将充分理解，引物的Tc是根据经验确定的温度，其与计算的Tm相差几度。这种差异的大小随引物的不同而不同。更进一步，由于Tc的精确值将取决于扩增条件和由用于测定Tc的仪器产生的温度梯度的分辨率，所以技术人员将理解计算Tc所处于的扩增条件应该对应于此后用于扩增测试样品的扩增条件。Tc值的测定是本领域技术人员熟知的并且可以通过任何合适的手段进行，诸如使用能够在退火温度范围内对靶DNA进行一系列实时扩增的仪器。.Tc测定的示例描述于实施例2中。

还应当理解，Tc的测定需要在提出用于扩增测试样品的特异性引物的环境中评估，因为其效用与所选择的引物的实际性能的分析有关。因此，需要在应用本发明的方法之前完成该分析，并且需要在提出要使用的每个不同引物组的情况下进行该分析。然而，如上所详述，用于测定Tc的方法是熟知的并且可以常规且容易地进行而没有任何不适当的负担。为此，对相对于“主题反应”的Tc选择的退火温度的提及应被理解为是指这样的事实的提及，即相关的Tc是在给定的反应的环境中寻求使用的特定引物的Tc。因此Tc不是可以在不同引物组的范围内应用的固定值。

“退火温度”应理解为引物与靶核酸区(模板)发生杂交的扩增阶段的温度。如在上文中详述的，本发明的一个方面是基于以下确定：如果所使用的退火温度落在Tc和比Tc低3℃之间(在此称为“Tc-3℃”)。因此，当使用的引物不同时，本发明方法的退火温度可能从一个反应到另一个反应变化。这种设计完全不同于在所有反应中使用固定退火温度的大多数扩增系统。还应当理解，对落入Tc和(Tc-3℃)或之间的退火温度的提及包括选择使用Tc或(Tc-3℃)温度本身。还应该理解的是，也可以考虑使用处于或大约处于该范围的外界限的温度，诸如略低于或高于这些界限的温度，但是其功能与处于或处于该范围内的温度等同。

还可以理解的是，由于正向和反向引物具有不同的序列，单个反应中两种引物的Tc可以有一些变化。就最小化非特异性而言，ASO引物是最重要的引物，并且在实践中，当研究来自不同患者的样品时，相同的反向共识(通常为J)引物将经常与不同的ASO引物联合使用。在这种情况下，本领域技术人员将理解，可以首先针对特定Tm设计反向引物，然后可以通过实验确定其Tc。然后设计ASO引物，其目标温度为比反向引物的Tm低1-2℃。然后，ASO引物的Tc应该略低于反向引物的Tc，并且如果PCR的退火温度基于ASO引物的Tc，那么PCR的特异性将被优化。

如上所述，正向引物通常是ASO引物，针对IgH或TCR重排的最可变区，且反向引物针对IgH或TCR基因的下游基因片段。由于本发明提供的改进的敏感性是由于降低的非特异性而产生的，因此，如前所述设计非ASO引物也是有利的，以进一步使非特异性最小化。

如上文所述，在另一方面，技术人员可以寻求设计和合成引物以实现最佳杂交，诸如通过在引物的3’端插入一个或多个A和/或T核苷酸。在一个实施方案中，当使用两个或多个A和/或T核苷酸时，它们彼此直接相邻。即按顺序。具体而言，一个可优选在正向或反向引物之一或两者的3’末端核苷酸位置上包括至少一个A或T核苷酸。在另一个示例中，所述A或T核苷酸单独包括在反向引物的3’末端核苷酸位置，J引物或表1中公开的任何J引物中的3’末端核苷酸位置。在另一个实施方案中，在所述引物的两个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在又另一个实施方案中，在所述引物的三个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在另一个实施方案中，在所述引物的四个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在还又另一个实施方案中，在所述引物的五个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在还又另一个实施方案中，在所述引物的六个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。对引物的“3’末端”的提及应理解为对如果它与它靶标杂交将进行延伸的引物端部。在本文中提及的一个、两个、三个、四个、五个或六个核苷酸因此是在引物经历任何延伸之前引物的3’端的末端核苷酸。A或T核苷酸的任何组合可用于这些位置中的任何一个或多个。

在一个实施方案中，在引物的3’末端核苷酸位置有A或T核苷酸。在另一个实施方案中，在所述引物的两个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在又另一个实施方案中，在所述引物的三个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在另一个实施方案中，在所述引物的四个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在还又另一个实施方案中，在所述引物的五个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在还又另一个实施方案中，在所述引物的六个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。

如上文详述的，如果将扩增设计为并入熔解曲线分析，可以实现更进一步的灵敏度。对“熔解曲线分析”的提及应理解为扩增子的熔点分析作为鉴定非特异性扩增的手段。由于扩增子的熔点与扩增子的核苷酸序列的组成和长度相关联，因此熔解曲线分析可用于检测样品内的长度和/或序列变异，并且特别用于区分特异性扩增子与非特异性扩增子的产生。用于在PCR完成后进行熔解曲线分析的手段是本领域技术人员熟知的，并且常规并入扩增反应中。可以使用任何合适的方法，例如将当分子非特异性地与DNA双链体结合时发荧光或可检测的分子并入反应中。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，如果通过缓慢升高温度进行熔解曲线分析，则由于DNA双链体的异质范围的熔解，荧光在宽的温度范围内逐渐降低。在窄的温度范围内，荧光的突然降低可以识别双链体的均质亚群体(homogeneous subpopulation)(诸如靶扩增子)的存在。这最容易通过遵循荧光对温度的一阶导数即斜率来识别。将观察到在特定温度的峰。非特异性扩增通常在与靶扩增子不同的温度下不产生峰，或产生复杂图样或产生峰。

更进一步，在本发明的方法中并入与检测手段偶联的探针提供了更进一步的特异性，因为探针的序列与靶扩增子的序列互补，从而几乎完全结合其预期的靶标。当它们非特异性地结合到DNA双链体时发荧光的分子已经用于PCR中的终点Ct测量，但是在本方法中对此目的是禁忌的，因为它们结合到所有DNA双链体且当试图测量低水平MRD时它们的Ct值是不可靠的。因此推荐此类荧光体仅用于熔解曲线分析。然而，这种荧光团分子可用于本方法中，用于PCR完成后存在的DNA双链体的熔点分析，条件是所使用的特定荧光团的性质和浓度不会影响PCR扩增的效率，如通过对探针提供的Ct值没有影响所示。使用荧光团Syto 82区分特异性扩增与非特异性扩增的熔解曲线分析的示例示于图4中。

因此，探针提供Ct和染料，或其它合适的手段，使得熔解分析成为可能。本领域技术人员应当理解，可以将探针设计成与任何合适的检测手段偶联。然而，在本文示例的方法的环境中，探针和染料响应于UV发荧光，但是它们的发射光谱不同，因此它们可以被分别监测。

因此，在另一个实施方案中，所述方法包括Ct测定，优选使用针对感兴趣的重排Ig或TCR的探针，该探针与检测手段偶联。

本发明的方法在提高检测仅包含一个N区(在本说明书中也可替换地称为“基因片段”)的Ig或TCR基因的重排的检测的敏感性中特别有用。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，完整的Ig重链基因重排或完整的TCRβ链基因重排，二者均包含VDJ重排，通常将包括两个N区(N1和N2)。然而，部分重排可以包含一个或两个N区，这取决于一个或多个V、D或J基因片段是否显示在重排过程中形成的内部N区。例如，Ig轻链和TCRα链只包含VJ重排，且IgH链和TCRβ链的部分DJ重排发生在用DJ重组完成V基因片段重排之前。因此，VDJ重排将产生两个N区(如果在V、D或J基因段中产生了N个区，则有时会超过两个)，这些区被配置为VN₁DN₂J，而Ig轻链，TCRα链或瞬时部分重排可能仅生成一个N区，诸如VNJ或DNJ。这可以应用于例如不含有D基因并且重排仅涉及V和J基因的遗传基因座，诸如IGκ和TCRγ。这也可应用于IGH或TCRβ基因的重排，其中仅存在可具有VJ或DJ结构和仅一个N区的“部分”重排。

在另一方面，提供了一种扩增Ig或TCR核酸区的方法，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或更多个V、D或J基因片段的重排，所述重排的特征在于只有一个N区，所述方法包括使感兴趣的核酸样品与针对所述重排的Ig或TCR核酸区的正向引物和反向引物接触，并使用以下扩增所述核酸样品：

和任选地进行熔解曲线分析的手段。

在一个实施方案中，所述至少一种引物是ASO引物。

在又另一个实施方案中，所述核酸是DNA。

在还另一个实施方案中，在所述引物的两个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在又另一个实施方案中，在所述引物的三个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在另一个实施方案中，在所述引物的四个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在还又另一个实施方案中，在所述引物的五个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。在还又另一个实施方案中，在所述引物的六个最3’末端核苷酸位置的每一个位置都有A和/或T核苷酸。

在还又另一个实施方案中，进行熔解曲线分析。

在又还另一个实施方案中，所述方法包括Ct测定，优选使用针对感兴趣的重排Ig或TCR的探针，该探针与检测手段偶联。

下表1中提供了适用于本发明该实施方案的J引物的实例。

表1.用于IGH和TCRβ的J引物。这些是用于这些区的最长引物。还使用较短的引物，其包含与上述引物相同的中间和3’端，但除去了可变数目的5’碱基，以产生具有期望Tm的引物。

根据本文描述的本发明的实施方案，可以将引物设计为与一个或更多个N基因片段杂交，诸如N₁基因片段5’与D基因片段，与N₂基因片段3’与完全重排的VDJ基因的D基因片段或可以在重排的V、D或J基因片段中形成的N个区(基因片段)。就这一点而言，在一个实施方案中，当正向或反向引物中的至少一个与至少两个N基因片段杂交时，实现了高水平的敏感性。在优选的实施方案中，它是与两个N基因片段杂交的正向(ASO)引物。在该实施方案中，反向引物可以与下游基因片段(诸如J基因片段)杂交，并且甚至不必是患者特异性的。在另一个实施方案中，它是与至少两个N基因片段杂交的反向引物。

还应该认识到，将存在这样的情况，其中尽管VDJ重排含有两个或更多个N区，优选引物仅针对一个N区。如果被靶向的N区特别长并因此实现高特异性，或者被靶向的N区含有足够数目的A或T碱基以使引物的3’端包含互补的T或A碱基，或者如果不被靶向的N区含有不足数目的A或T碱基，则可能出现这样的情况。

在某种程度上，人们试图设计一种在两个N个基因片段之间杂交的引物，本发明的引物的设计使得为了在两个都位于V、D或J基因片段的结合处的两个N个基因片段之间杂交，引物必须与感兴趣的重组基因的至少三个连续基因片段杂交，其中这三个连续基因片段的5’和3’基因片段是N区/基因片段。因此，构建引物使其包含三个亚区，每个亚区设计为与感兴趣的重组基因的三个连续基因片段之一杂交，其中两个为N基因片段。“连续的”是指三个基因片段已经重组，使得它们彼此直接相邻，优选以线性排列。在这点上，应当理解，与三个重组的和连续的基因片段杂交的引物的三个亚区中的每一个可操作地彼此连接以形成单引物。

引物亚区的长度可以相同或不同。应当理解，根据这些寡核苷酸亚区中每一个的长度和它们所针对的特定基因片段靶标，它们可以仅仅与一个基因片段的全部或部分杂交，或者它们可以与多个基因片段中每一个的全部或部分杂交。在概念上，可以设计部分重排的引物(DNJ或VNJ)以例如与以下重排基因片段靶标之一杂交：N、DN、NJ、DNJ、VN、NJ、VNJ。可以将完整的VN₁DN₂J重排的引物设计为与例如以下重排的基因片段靶标之一杂交：N_1、VN₁、N₁D、VN₁D、N₁DN₂、VN₁DN₂、N₁DN₂J、VN₁DN₂J、N₂、DN₂、N₂J、DN₂J。应当理解，V、D和J基因片段也可以在该片段自身内包含N区。

可以理解，当引物设计成与两个N基因片段杂交时，引物将跨越插入两个N基因片段的基因片段的全长。通常的情况是VDJ重排，而插入基因片段通常是D基因片段。本领域技术人员可以理解，由于D基因片段的长度，设计跨越D基因片段全长杂交的引物会导致特异性丧失，因为与D基因片段杂交的引物的亚区可能代表引物的最长亚区，因为N基因片段通常相对较短。因此，N基因片段的特异性可能受损，因为引物的大部分杂交将由其与D基因片段的互补性决定。由于感兴趣的特定D基因片段可能在许多其它VDJ重排组合中发现，因此，除了未重排的基因之外，它在许多不同的细胞而不仅仅是感兴趣的细胞中是可检测的。这可导致显著的假阳性结果。为了降低这种非特异性结合的发生率(无论引物针对的是多少N区)，可以对与D基因片段杂交的引物的亚区进行修饰，以降低其特异性。实现该目的的方法包括但不限于：

(i)向引物的亚区引入一个或多个间隔区或接头，所述引物被设计为与D基因片段(或寻求降低其特异性的其它基因片段)杂交，以减少寡核苷酸的该亚区与D基因片段的杂交。

(ii)合成引物，使得在设计成与基因片段(诸如D基因片段)杂交的引物的亚区内的多个核苷酸位置处，通过添加从所有4个核酸碱基的等摩尔混合物(称为N混合物)中随机选择的核苷酸来代替添加单个核苷酸。这显著降低了这些位置上的氢键对寡核苷酸引物的总杂交的贡献，因为对于取代位置上的每轮扩增，在模板核苷酸和寡核苷酸核苷酸之间仅存在1/4的适当键合的可能性。使用较不随机的N混合物(例如仅A/T)具有较小的效果。

在不将本发明限制于任何一种理论或作用方式的情况下，已经确定用N混合物修饰引物亚区的大约每四个碱基或一串3-7个相邻核苷酸的修饰，可以实现特异性的充分降低，但不会损失引物功能，所述引物亚区针对长基因段。

促进本发明的引物与靶DNA的相互作用可以通过任何合适的方法进行。那些方法是本领域技术人员已知的。实现引物指导的扩增的方法也是本领域技术人员熟知的。在一种方法中,所述扩增为聚合酶链反应、NASBA或链置换扩增。优选地，所述扩增为聚合酶链反应。

对“样品”的提及应理解为对生物或非生物样品的提及。非生物样品的实例例如包括合成产生的核酸群体的核酸产物。对“生物样品”的提及应理解为是指衍生自哺乳动物或哺乳动物组织培养物的生物材料的任何样品，诸如但不限于细胞材料，血液、粘液、粪便、尿液、组织活检标本或已引入动物体内并随后移除的流体(诸如，在肺灌洗后从肺中提取盐水溶液或从灌肠洗涤循环中回收的溶液)。根据本发明的方法测试的生物样品可以直接测试或者在测试之前可能需要某种形式的处理。例如，活组织检查样品在测试之前可能需要均质化。此外，在生物样品不是液体形式的情况下，可能需要添加试剂(诸如缓冲液)以使样品流动。

就靶DNA存在于生物样品中而言，可直接测试生物样品，或者可在测试前分离生物样品中存在的所有或一些核酸材料。在测试之前预处理靶核酸分子，例如活病毒的灭活或跑凝胶，在本发明的范围内。还应当理解的是，生物样品可以是新鲜采集的，或者其可以在测试之前已经储存(例如通过冷冻)或者在测试之前以其他方式处理(诸如通过进行培养)。

关于使样品与引物“接触”应理解为是指促进引物与样品的混合使得可以发生相互作用(例如，杂交)。实现该目的的手段是本领域技术人员公知的。

根据本文公开的方法选择最适合测试的样品类型将取决于情况的性质，诸如被监测的病症的性质。例如，在优选的实施方案中，赘生性病症是分析主题。如果赘生性病症是淋巴性白血病,则血液样品、淋巴液样品或骨髓抽吸物将可能提供合适的测试样品。当赘生性病症是淋巴瘤时，淋巴结活组织检查或血液或骨髓样品将可能提供用于测试的合适组织来源。还需要考虑是否正在监测赘生物细胞的原始起源，或者是否要监测从起源点开始的赘生物的转移或其他形式的扩散。在这点上，可能需要从任何一种哺乳动物收获并测试许多不同的样品。为任意给定的检测场景选择合适的样品属于所属领域普通技术人员的技能。

在本文中使用的术语“哺乳动物”包括人，灵长类动物，牲畜(例如马、牛、绵羊、猪、驴)，实验室测试动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)，伴侣动物(例如狗、猫)和圈养的野生动物(例如袋鼠、鹿、狐狸)。优选地，哺乳动物是人或实验室测试动物。甚至更优选地，哺乳动物是人。

本发明该方面的方法提供了用于检测感兴趣靶核酸区的存在(诸如用于诊断或监测目的)和任选地定量和/或分离该靶的方法。因此，为任何目的，诸如对靶的进一步分析，提供了检测、富集或纯化感兴趣靶核酸群体的方法。

本发明的另一方面提供一种检测和/或监测哺乳动物中细胞的克隆群体的方法，所述克隆细胞的特征在于Ig或TCR核酸区，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或多个V、D或J基因片段的重排，所述方法包括：

(iii)检测所述扩增产物。

在一个实施方案中，所述至少一种引物是ASO引物。

在又另一个实施方案中，所述核酸是DNA。

在还又另一个实施方案中，进行熔解曲线分析。

在进一步的实施方式中所述扩增反应是聚合酶链反应。

对“细胞”的提及应理解为指来自任何物种的所有形式的细胞及其突变体或变体。优选地，所述细胞是淋巴样细胞，尽管本发明的方法可以在已经经历部分或完全Ig或TCR重排的任何类型的细胞上进行。在不将本发明限于任何一种理论或作用模式的情况下，细胞可以构成生物体(在单细胞生物体的情况下)，或者它可以是多细胞生物体的亚单位，其中单个细胞可以或多或少地专门化(分化)用于特定功能。所有活的生物体都由一个或多个细胞组成。主题细胞可以形成生物样品的一部分，所述生物样品是在同基因、同种异体或异种环境中测试的主题。同基因环境是指克隆细胞群体和该克隆群体所在的生物样品共有相同的MHC基因型。例如，这很可能是筛查个体中瘤形成存在的情况。“同种异体”环境是指主题克隆群体实际上表达与采集生物样品的个体的MHC不同的MHC。例如，在诸如移植物抗宿主病的情况下，正在筛查移植的供体细胞群体(诸如具有免疫能力的骨髓移植)的增殖时，可能会发生这种情况。“异种的”环境是指主题克隆细胞与生物样品来源的主题的细胞完全不同的物种。例如，当潜在的肿瘤供体群体来自异种移植时，可能会发生这种情况。

主题细胞的“变体”包括但不限于表现出它是变体的细胞的一些但不是全部形态学或表型特征或功能活性的细胞。“突变体”包括但不限于天然或非天然修饰的细胞，诸如遗传修饰的细胞。

“克隆”是指主题细胞群体衍生自共同的细胞来源。例如，赘生性细胞群体衍生自已经在特定分化阶段经历转化的单个细胞。在这方面，经历进一步核重排或突变以产生遗传上不同的赘生性细胞群的赘生性细胞也是“克隆”细胞群体，尽管是不同的细胞克隆群体。在另一个实例中，响应于急性或慢性感染或免疫刺激而扩增的T或B淋巴细胞也是本文提供的定义内的“克隆”细胞群体。在又一个实例中，细胞的克隆群体是克隆微生物群体，诸如在较大的微生物群体内产生的抗药性克隆。优选地，细胞的主题克隆群体是细胞的赘生物群体或克隆免疫细胞群体。

在一个实施方案中，所述克隆细胞是克隆淋巴样细胞的群体。

应当理解，提及“淋巴样细胞”是指已经重新排列了至少一个免疫球蛋白或TCR可变区基因片段的种系集的任何细胞。可以重排、编码基因组DNA的免疫球蛋白可变区包括与重链或κ或λ轻链相关联的可变区，而可以重排、编码基因组DNA的TCR链可变区包括α、β、γ和δ链。就此而言，细胞应理解为属于“淋巴样细胞”定义的范围内，条件是该细胞已重排编码至少一个免疫球蛋白或TCR基因片段区的DNA的可变区。细胞也不必转录和翻译重排的DNA。就此而言，“淋巴样细胞”在其范围内包括但绝不限于已重排TCR或免疫球蛋白可变区基因片段但尚未表达重排链的未成熟T细胞和B细胞(诸如TCR-胸腺细胞)或尚未重排其TCR或免疫球蛋白可变区基因片段的两条链的未成熟T细胞和B细胞。该定义进一步延伸至淋巴样细胞，所述淋巴样细胞已经经历至少一些TCR或免疫球蛋白可变区重排，但所述细胞可能不会另外表现出传统上与成熟T细胞或B细胞相关的所有表型或功能特征。因此，本发明的方法可用于监测细胞的赘生物形成，所述细胞包括但不限于处于任何分化发育阶段的淋巴样细胞，活化的淋巴样细胞或非淋巴样/淋巴样细胞，条件是一个可变区基因区的至少一部分已经发生重排。其还可用于监测响应于特定抗原而发生的克隆扩增。

关于本发明的这一方面，提及“监测”应该被理解为在对所述群体的存在进行初步诊断之后测试主题的细胞克隆群体的存在或水平的提及。“监测”包括在数天、数周、数月或数年的时间内进行单独的一次试验或一系列试验。可以出于多种原因进行测试，包括但不限于，预测处于缓解中的哺乳动物会复发的可能性，筛查微小残留病，监控治疗方案的有效性，检查处于缓解中的患者的状况，在应用治疗方案之前或之后监测病情进展，以便就合适的治疗方法做出决定或测试新的治疗方法。因此，本发明的方法可用作临床工具和研究工具。

还应当理解，尽管优选至少一个可变区基因区的重排已经完成，但本发明的方法仍然适用于监测仅显示部分重排的赘生性细胞。例如，仅经历DJ重组事件的B细胞是仅经历部分重排的细胞。直到DJ重组片段进一步与V片段重组，才能实现完全重排。因此，本发明的方法可以被设计成利用与该标记序列互补的参考分子来检测一种TCR或免疫球蛋白链的部分或完全可变区重排，或者，例如，如果需要更高的特异性并且赘生性细胞已重排了TCR或免疫球蛋白链二者的可变区，则可以利用针对两种重排形式的引物分子。

对“赘生性细胞”的提及应理解为对表现出异常“生长”的细胞的提及。术语“生长”应以其最广泛的含义理解，并包括对增殖的提及。在这方面，异常细胞生长的实例是细胞的不受控制的增殖。淋巴样细胞的不受控制的增殖可导致呈实体瘤或单细胞悬浮液形式的细胞群体(诸如在白血病患者的血液中观察到的)。赘生性细胞可以是良性细胞或恶性细胞。在优选的实施方案中，赘生性细胞是恶性细胞。在这方面，提及“赘生性病症”是指主题哺乳动物中赘生性细胞的存在。尽管“赘生性淋巴样疾病”是指特征在于异常高数量的肿瘤细胞(诸如在白血病、淋巴瘤和骨髓瘤中发生)的疾病，但该短语也应理解为包括以下病症的提及：在哺乳动物中发现的赘生性细胞数量低于阈值，该阈值通常被认为是划定哺乳动物从明显的疾病状态转变为缓解状态的过程，反之亦然(缓解过程中存在的细胞数通常称为“微小残留病”)。更进一步，即使在哺乳动物中存在的赘生性细胞的数量低于可通过在本发明出现之前使用的筛查方法检测到的阈值的情况下，哺乳动物仍然被认为表现出“赘生性病症”。

适于在这方面分析的疾病病症是任何淋巴恶性肿瘤，诸如急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。监测微小残留病在所有这些病症中是重要的。

优选地，所述病症是赘生物形成，甚至更优选淋巴样赘生物形成。

在一个具体的实施方案中，本发明的方法用于检测淋巴性白血病中的微小残留病。

本发明的另一方面涉及上文所述的分离的引物。

本发明的另一个方面涉及用于帮助鉴定Ig或TCR核酸区的试剂盒，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或多个V、D或J基因片段的重排，所述试剂盒包含：适合于含有如上定义的任何一种或多种寡核苷酸引物的隔室、用于促进所述引物与靶核酸分子相互作用的试剂、和用于使所述相互作用能够导致所述靶核酸扩增的试剂。还可以包括另外的隔室，例如，以接收生物或非生物样品。

在以下非限制性实施例中更充分地描述本发明的其它特征。

实施例1

引物设计指南

3’端

-最后3’碱基为A/T

-优选最后两个或甚至三个碱基为A/T

-可以具有A/T作为最多至最后四个3’碱基的碱基。如果多于这种情况，存在引物不能有效进行的风险。

-在最后7个碱基中至少2个G/C。

设计是否使用2个N区

-引物将针对部分或全部N1、全部D、和部分或全部N2。

-包括最多4个碱基5’至N1和/或1-3个碱基3’至N2可能是有利的。这利用了半唯一的V-N1和N2-J结以及由J提供的任何A/T碱基。

-如果引物的Tm太高，大于74℃，则可以将一个或多个N碱基插入D区以降低有效Tm。

设计是否使用一个N区

在V-N-J或部分D-N-J重排的存在下将仅有一个N区可用。有时，即使可获得2N区，也可以决定仅使用一个，特别是如果它是长的，则包含有利的异源碱基序列并且能够设计良好的3’端。当N区较短和/或难以设计具有良好3’端的引物时：

-如果N区后面是D区，则通常有利的是将引物4-6个碱基延伸到D区，特别是如果这改善了3’端。这利用了半唯一N-D连接。

-如果N区后面是J区，则通常有利的是将引物1-3个碱基延伸到J区中，如果在3’端寻找A/T，有时还要进一步延伸。然而，特别是在这种情况下，重要的是测试几种不同的引物。

-如果在N区之前是V区的3’端，那么只要引物不会变得太长，将V的3至5个碱基并入5’端可能是有利的。这利用了半唯一V-N结。

Tm和退火温度

ASO引物的长度和Tm取决于重排的性质，但在许多情况下，在决定精确的长度和Tm方面存在一些灵活性。如果是，则建议设计引物使得其Tm与反向引物的Tm大致相同或比反向引物的Tm小一个℃。

用于PCR的退火温度取决于引物的Tm。指导原则如下

Tm＝59--61，退火温度＝63-64。

Tm＝69-71，退火温度＝72。

Tm＝71-74，退火温度＝75。

Tm>74，退火温度＝75，但考虑使用N个碱基以降低Tm。

这些指导通常导致退火温度在Tc值的三℃内。然而，对于仅具有一个N区的重排引物可能存在一些困难，特别是如果N区含有5个或更少的碱基。对于这种重排，退火温度应当接近或等于Tc值，以便产生最小的或没有非特异性。合成并测试几种候选引物也是明智的。

注

以上仅是指导原则，并且应依赖于温度梯度结果和引物序列。对于一些数患者，建议合成和测试多于一种的候选引物。

实施例2

用于IGH重排的不同组J引物

通常使用的组是AAM或setB。

实施例3

测试引物

1.确定扩增效率、Tc和特异性

为每个患者合成一种或几种引物。使用梯度退火温度，测试每种引物从白血病DNA扩增的能力和从非白血病DNA扩增的失败。一个示例是

上行显示DNA来源(第0天白血病，D0，或非白血病外周血淋巴细胞，PBL)，下一行显示退火温度范围，并且最下2行显示用测试的2种不同引物观察到的Ct值。右侧的列显示了Tc值。在65.2℃或更低温度下有效扩增这两种引物。两种引物均未在62.0℃下用PBL产生扩增(NA)。由于该温度比Tc值低3°以上，因此结果表明在未来的实验中不太可能会观察到非特异性。

2.接下来测试所选择的引物以确保其扩增白血病DNA中的重排靶基因的能力不受非白血病DNA伴随存在的抑制。

测试的实施例如下所示。500ng或1μg非白血病DNA的存在与用400pg白血病DNA观察到的CT没有差异。单独用500ng非白血病DNA或用水对照未观察到扩增。

Do	32.89
		Do+500ng	32.90
Do+1μg	32.78
		500ng	N/A
水	N/A

3.非特异性的确定性检验

这可以在引物后处理结束时或在测定MRD的第一个最后的实验期间进行。针对20个孔测试引物，每个孔含有从五个非白血病个体获得的1μg汇集的DNA。

实施例4

具有Tm和Tc值的患者ASO引物序列

vorV、N、D、N、J显示了引物所靶向的重组区。引物用于急性成淋巴细胞性或慢性淋巴细胞性白血病患者的样品。

实施例5

梯度-用于测试引物

在6个不同的温度下一式两份地查看每种引物。

在2个较低温度下运行正常DNA以检查引物的非特异性

将诊断样品稀释至200pg/μl。加2μl/管，需要28μl/引物组

将正常DNA稀释至250ng/μl

将D0 DNA添加到A、B、C、D、E和F行

将PBL DNA加入G和H行中

该表列出了6种引物，但可以减少以在板或条上放置更少的引物。

以17.25×17.84μl＝307.74μl分成6份，并以50uM添加2.76ul的正向引物

对于每个引物组，去除13×18μl＝234μl，并以200pg/μl添加26μl D0 DNA

向混合物的剩余部分中以250ng/μl加入8.5μl正常DNA。(500ng/孔)

将20μl D0等分试样混合到ABCDE和F行中，并将20μl正常DNA混合到G和H行中，密封并运行以下方案。

在PCR机器CFX上运行，91℃，3min,×1：

97℃ 15秒，68-75℃ 30秒，×5个循环

96℃ 15秒，68-75℃ 30秒，×5个循环

94℃ 15秒，68-75℃ 30秒，×35个循环

熔解70℃-95℃

-该方法用于测试引物在退火温度范围内的扩增效率和特异性。

-1和106分别指单个孔或总孔的组分体积

实施例6

附录5.工作表4：以组成用于使用单引物定量的混合物

患者诊断DNA，1ng/μl

Pbl DNA需要120μl，250ng/4ùl/管

在MR管中稀释

自1ng/ul 3ul+27ul FG3 0.1ng/ul

自0.1ng/ul 2ul+18ul FG3 0.01ng/ul

需要pbl 250ng/ul,补充混合物以添加20ul/管

实施例7

使用单引物对2个样品、2个管和5个管进行定量

	1	41
			H<sub>2</sub>O	16	656
10X缓冲液	5	205
			MgCl<sub>2</sub>	5	205
TTP	1.5	61.5
			单引物500ng	0.4	16.4
syto 82	0.5	20.5
			反向500ng/μ1	0.4	16.4
igHJ探针	0.4	16.4
			Platinum taq 5U/ul	0.8	32.8
	30	1230

运行：91℃,3分钟

97℃，15秒；72℃，30秒×5个循环

96℃，15秒；72℃，30秒×5个循环

94℃，15秒；72℃，30秒×35个循环

实施例8

熔解曲线分析

该PCR含有浓度为0.5μM的荧光染料Syto 82。初步研究显示，如报道探针所测量的，该浓度不延长Ct。当温度缓慢升高时测量荧光，并使用合适的程序分析结果。荧光对温度曲线的一阶导数显示了非特异性扩增和特异性扩增的峰。

本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的之外，还可以进行变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还单独或共同包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任何两个或更多个的任何和所有组合。

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序列表

<110> 莫诺匡特私人有限公司

<120> 扩增方法和用于其的引物

<130> P45241PCUS

<150> US 62/683,415

<151> 2018-06-11

<150> US 62/757,634

<151> 2018-11-08

<160> 21

<170> PatentIn 第3.5版

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAMJ1b

<400> 1

ctttgctgag cacctgtccc caagtctgaa 30

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAMJ2

<400> 2

aggccggctg cagaccccag ata 23

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAMJ3c

<400> 3

cccccggaca ttatctccca gctcca 26

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAMJ4c

<400> 4

gcttatttcc ccccaaaaat gcagcaaaac cctt 34

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAMJ5c

<400> 5

cctccaaaat gcctccaaga ctctgaccct ga 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAMJ6c

<400> 6

aggaaacccc acaggcagta gcagaaaaca a 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR1.1b

<400> 7

ttccctgtga cggatctgca aaagaacctg a 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR1.2b

<400> 8

ccctcctaga gacccccagc cttacctaca a 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR1.3b

<400> 9

caagttccca gctgtccagc cttgacttac t 31

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR1.4b

<400> 10

ccaggaactc cgaccttatg atacactatc ccgaaagaa 39

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR1.5b

<400> 11

atggccatac caccctgatt ctgcaactta ccta 34

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR1.6b

<400> 12

gagtcaagag tggagccccc atacctgt 28

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.1b

<400> 13

cacctggagc ccccttctta cctagca 27

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.2b

<400> 14

cggagcccca accgcctcct t 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.3b

<400> 15

ggagccccgc ttaccgagca ct 22

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.4b

<400> 16

ccggcggccc cagctt 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.5b

<400> 17

gcgctcaccg agcaccagga 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.5c

<400> 18

ccgcgctcac cgagcaccag ga 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.5d

<400> 19

cccgcgctca ccgagcacca gga 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.6b

<400> 20

cgcgaaaact cacccagcac ggtca 25

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR2.7d

<400> 21

ggaaggtggg gagacgcccg aat 23

Claims

1.一种扩增Ig或TCR核酸区的方法，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或更多个V、D或J基因片段的重排，所述方法包含使感兴趣的核酸样品与针对所述重排的Ig或TCR核酸区的正向引物和反向引物接触，并使用以下扩增所述核酸样品：

和任选地进行熔解曲线分析的手段。

2.一种检测和/或监测哺乳动物中细胞的克隆群体的方法，所述克隆细胞的特征在于Ig或TCR核酸区，所述Ig或TCR核酸区的特征在于两个或多个V、D或J基因片段的重排，所述方法包含：

(i)在足以促进所述引物与所述靶核酸分子相互作用的条件下，使来源于哺乳动物的生物样品的DNA材料与针对所述重排的Ig或TCR核酸区的正向和反向引物接触；

(iii)检测所述扩增产物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包含使用以下两者：在主题扩增反应的Tc和(Tc-3℃)之间的范围内的退火温度，和一或多种引物，其在所述引物的3’末端核苷酸位置包含至少一个A和/或T核苷酸。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述核酸区是DNA。

5.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述引物的两个最3’末端核苷酸位置中的每一个位置处存在A和/或T核苷酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述引物的三个最3’末端核苷酸位置中的每一个位置处存在A和/或T核苷酸。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述引物的四个最3’末端核苷酸位置中的每一个位置处存在A和/或T核苷酸。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述引物的五个最3’末端核苷酸位置中的每一个位置处存在A和/或T核苷酸。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述引物的六个最3’末端核苷酸位置中的每一个位置处存在A和/或T核苷酸。

10.根据权利要求1-10中任一项或多项所述的方法，其中将所述正向或反向引物之一或两者设计成包括所述A和/或T核苷酸。

11.根据权利要求1-10中任一项或多项所述的方法，其中仅将所述反向引物设计成包括所述A和/或T核苷酸。

12.根据权利要求1-11中任一项或多项所述的方法，其中所述VDJ重排是部分重排并且存在位于一个或多个重排的V和D基因片段、重排的D和J基因片段或重排的V和J基因片段之间的连接处的N区。

13.根据权利要求1-11中任一项或多项所述的方法，其中所述VDJ重排是完全重排并且存在位于一个或多个重排的V和D基因片段、重排的D和J基因片段或重排的V和J基因片段之间的连接处的N区。

14.根据权利要求1-12中任一项或多项所述的方法，其中所述VDJ重排是部分重排并且存在位于所述V基因片段、D基因片段或V基因片段中的一个或多个内的N区。

15.根据权利要求1-11或13中任一项或多项所述的方法，其中所述VDJ重排是完全重排并且存在位于所述V基因片段、D基因片段或V基因片段中的一个或多个内的N区。

16.根据权利要求1至14中任一项或多项所述的方法，其中所述引物中的至少一个包含针对所述重排的V、D和J基因片段的一个N基因片段的杂交亚区。

17.根据权利要求1至14中任一项或多项所述的方法，其中所述引物中的至少一个包含针对所述重排的V、D和J基因片段的至少两个N基因片段的杂交亚区。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中针对所述J基因片段的所述引物在它的3’端包含至少一个A和/或T核苷酸。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中引物亚区被修饰以用来自N混合物的核苷酸替代所述亚区的一个或多个核苷酸。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述亚区的每第四个核苷酸被取代。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述亚区的3-7个相邻核苷酸的序列被取代。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中进行熔解曲线分析。

23.根据权利要求22所述的方法，其中使用染料进行所述熔解曲线分析。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述染料是荧光团。

25.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述方法包括Ct确定步骤。

26.根据权利要求25的方法，其中使用针对所述重排的Ig或TCR区的探针进行所述Ct测定，且所述探针与检测手段偶联。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述检测手段是荧光分子。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述至少一种引物是ASO引物。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中针对所述下游基因片段的所述引物针对所述J片段。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述扩增是聚合酶链反应。

31.根据权利要求2所述的方法，其中所述病症是赘生物形成，且甚至更优选淋巴样赘生物形成。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述淋巴样赘生物是淋巴恶性肿瘤。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和骨髓瘤。

34.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法用于检测微小残留病。

35.根据权利要求34的方法，其中在淋巴白血病的情况下检测所述微小残留病。