JP2021526824A - 増幅方法及びそこで使用されるプライマー - Google Patents

Abstract

本発明は一般に、目的の核酸領域を増幅する改良された方法、及びそこで使用されるプライマーに関する。より詳細には、本発明は、２つ以上の免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体遺伝子セグメントの再構成から生じている核酸領域を増幅する改良された方法、及びそこで使用されるプライマーに関する。本発明の方法は、所与の反応に固有の臨界アニーリング温度に対して決定されたアニーリング温度で増幅ステップを実施する、及び／または最適化プライマーを使用すると、再構成免疫学的もしくはＴ細胞受容体遺伝子を増幅する先行技術の方法と関連して以前に達成可能であるよりも高いレベルの感度を可能にする、という判断に基づく。主題の再構成標的が唯一のＮ領域を含む場合、本発明の方法は特に有用である。特定の免疫学的及びＴ細胞受容体核酸再構成事象を検出する高感度であるが単純な手段の提供は、特定のＶ／Ｄ／Ｊ再構成事象（例えば、白血病における微小残存病変の検出）または目的の免疫学的もしくはＴ細胞受容体遺伝子領域の分析もしくは同定を特徴とする、限定されないが、クローンリンパ系細胞集団または病態の診断及び／または監視を含む、幅広い用途に有用である。
【選択図】図１

Description

本発明は一般に、目的の核酸領域を増幅する改良された方法、及びそこで使用されるプライマーに関する。より詳細には、本発明は、２つ以上の免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体遺伝子セグメントの再構成から生じている核酸領域を増幅する改良された方法、及びそこで使用されるプライマーに関する。本発明の方法は、所与の反応に固有の臨界アニーリング温度に対して決定されたアニーリング温度で増幅ステップを実施する、及び／または最適化プライマーを使用すると、再構成免疫学的もしくはＴ細胞受容体遺伝子を増幅する先行技術の方法に関連して以前に達成可能であるよりも高いレベルの感度を可能にする、という判断に基づく。主題の再構成標的が唯一のＮ領域を含む本発明の方法は特に有用である。特定の免疫学的及びＴ細胞受容体核酸再構成事象を検出する高感度であるが単純な手段の提供は、特定のＶ／Ｄ／Ｊ再構成事象（例えば、白血病における微小残存病変の検出）または目的の免疫学的もしくはＴ細胞受容体遺伝子領域の分析もしくは同定を特徴とする、限定されないが、クローンリンパ系細胞集団または病態の診断及び／または監視を含む、幅広い用途に有用である。

本明細書での、任意の先行刊行物（もしくはそれから得られる情報）、または知られている任意の事項への言及は、その先行出版物（もしくはそれから派生する情報）または既知の事項が、本明細書の取り組みの分野における一般的な共通知識の一部を形成することの承認または容認または任意の形態の示唆ではなく、これらとしてみるべきではない。

本明細書で著者が言及する出版物の文献詳細は、説明の最後にアルファベット順にまとめられる。

クローンは一般に、共通の前駆細胞から派生した細胞の集団として理解される。対象におけるクローン細胞集団または生物の存在を診断及び／または検出することは一般に、比較的問題のある手順を構成している。具体的には、クローン集団は、細胞または生物のより大きな集団内のわずかな構成要素のみを構成し得る。例えば、哺乳動物生物に関して、クローン細胞集団の検出が必要とされるより一般的な状況の１つは、がんなどの新生物の診断及び／または検出に関して生じる。しかし、１つ以上のクローン集団の検出はまた、骨髄異形成または真性赤血球増加症などの状態の診断において、また、免疫系により生成された抗原駆動クローンの検出に重要であり得る。

一般に、クローンが生じる集団は、体の特定の組織または区画内の細胞集団に対応する。それにもかかわらず、そのような細胞集団をサンプリングすることは、細胞または生物の下位群に検査を効果的に狭めるという事実にもかかわらず、これは、それにもかかわらず、クローン集団が同定されなければならない非クローン細胞または生物の大きいバックグラウンド集団内で、臨床医に提示し得る。

クローンのメンバーが、ＤＮＡの配列の変更などの分子マーカーを特徴とする場合、検出の問題は、全てが、異なる配列を有する大きい分子集団内に同じ分子配列を有する分子集団を検出する問題に変換することが可能であることがあり、全てが類似で異なるか、または多かれ少なかれ異種である。達成することができるマーカー分子の検出のレベルは、検出方法の感度及び特異性に大いに依存するが、ほとんどの場合、より大きな分子集団内の標的分子の割合が小さくなると、より大きな集団からのシグナルノイズは、標的分子からのシグナルを検出することを不可能にする。

特定のクラスの分子マーカーは、非常に特異的であるが、検出に関して固有の複雑さを示し、これは、遺伝子再構成事象から生じるものである。

体細胞における遺伝物質の再構成は、最初は分離しているゲノムの２つ以上の領域を一緒にすることを含む。それは、ランダムなプロセスとして生じ得るが、それは、正常リンパ系細胞の発生プロセスの一部としても生じ得る。

がんに関連して、再構成は、単純または複雑であり得る。単純な再構成は、２つの無関係な遺伝子または領域が並置されるものとみなされてもよい。複雑な再構成は、３つ以上の遺伝子または遺伝子セグメントが再編成されるものとみなされ得る。複雑な再構成の典型例は、リンパ系細胞の正常な発育中に起こり且つＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの再構成を伴う免疫グロブリン（Ｉｇ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）可変遺伝子の再編成である。これらの遺伝子セグメントの遺伝子座は、生殖系列で広く分離されるが、リンパ球の発達中の再構成は、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメント、またはＶ及びＪ遺伝子セグメントの並置をもたらし、これらの遺伝子セグメント間の接合部は、ヌクレオチドの挿入及び欠失の小さい領域を特徴とする（Ｎ_１及びＮ_２領域）。このプロセスは、ランダムに生じ、従って、各正常リンパ球が、再編成される遺伝子及び再編成の性質の両方に応じて、完全なＶＤＪ再編成またはＶＪもしくはＤＪ再編成であり得る固有のＶ（Ｄ）Ｊ再編成を有するようになる。急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫、または骨髄腫などのリンパ性癌が、単一の正常細胞の腫瘍性変化の結果として生じるので、がん細胞は全て、創始細胞に元々存在する接合部Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成を、少なくとも元々有するであろう。サブクローンが、腫瘍性集団の膨張中に生じ得、さらに、Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成が、それらの中に生じ得る。

再構成から生じ且つがんクローンまたはサブクローン中に存在する固有のＤＮＡ配列は、治療への応答を監視し、治療法を決定するために使用することができる固有の遺伝子マーカーを提供する。クローンの監視は、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、または次世代配列決定で実施することができる。フローサイトメトリーによる監視は、診断時にがん細胞の免疫表現型を決定すること、ならびにがん細胞を検出及び定量化するために、後続の試料で同じ表現型を調査することを含む。次世代配列決定は、より新しいアプローチであり、この長所及び短所は依然として評価されている。しかし、これも費用のかかる手法である。

ＰＣＲベースの分析は、その潜在的に高レベルの特異性及び自動化のために、好ましい方法である。ＰＣＲによる定量化は従来、診断時に採取した試料からのＤＮＡを使用したマーカー再編成の配列決定、患者固有のプライマーの合成、及び治療中に得られた試料から抽出したＤＮＡのＰＣＲでのこれらのプライマーの使用を含む。通常、２つのプライマーが、再構成部位の片側に配置され、通常、下流プライマーは、Ｊ遺伝子セグメントを対象とし、上流プライマー（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］としても知られる）は、再構成の最も可変な領域を対象とする（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２００４、Ｐｏｎｇｅｒｓ−Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９、Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ，２０００、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００２、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００４、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００７、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００９、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１４、Ｖｅｒｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ，２０００）。場合により、上流プライマーは、Ｖ遺伝子セグメントを対象とし、ＡＳＯプライマーは、下流にあり、再編成の最も可変な領域を対象とする。従って、非ＡＳＯプライマーは、多くの異なる再編成に共通する保存領域を対象とするので、コンセンサスプライマーである。

白血病における微小残存病変（ＭＲＤ）のＰＣＲによる監視は、臨床診療で広く使用されるようになっている。通常、導入治療（約１か月）の終了時及び数サイクルの地固め治療（約８０日）後に白血病細胞（ＭＲＤ）の数を測定することにより、処理を継続または変更するかどうかの決定がなされる。通常、導入終了時のＭＲＤのレベルが、規定されたカットオフレベルを超える場合、治療の強度を増加させる決定がなされてもよい。このカットオフレベルは、グループプロトコールによりわずかに変動するが、通常は、１０^−３（１／１０００）〜１０^−４（１／１０，０００）の白血病細胞／総細胞である。

現在この方法で存在する問題は、偽陽性結果を生じ且つ重要なことに検出及び測定の感度を制限し得る非特異性である。結果として、１０^−４のレベル未満のＭＲＤを、場合によると検出することができず、多くの場合定量化することができない。これは、２つの結果をもたらす。
・ＭＲＤが検出限界未満の場合、定量化が不可能である。これは、多くの患者に当てはまる。初期治療に非常によく応答し、且つその後の治療の強度が減少させることができる患者を特定する試みには大きな関心が寄せられている。そのような患者は、非常に低レベルの、例えば、１０^−６未満のＭＲＤを有することを特徴とすることになるが、検出限界が１０^−４である場合、１０^−４〜１０^−６のレベルを有する患者と区別することができない。
・アッセイの確率的変動のために、ＭＲＤのレベルが検出限界に近いが、依然としてそれを超える場合、測定の精度は不十分である。

非特異性につながる要因は、以下を含む。
・２つのプライマーが結合する配列は固有ではなく、通常はゲノムに存在する配列であり、増幅の特異性は、結合配列を互いに近づける再編成に起因してのみ生じる。
・ある程度の相同性は、Ｖ遺伝子ファミリーの異なるメンバー間、及びＤ遺伝子ファミリーの異なるメンバーの間でも存在する。これは、上流のプライマーが非白血病性の再編成にハイブリダイズする可能性を増加させる。
・非白血病リンパ球の集団における再編成は非常に不均一であり、従って、正常集団の１つ以上の細胞の再編成が、白血病細胞の集団の普遍的な再編成に類似する可能性がある。

過去１８年間にわたって、非特異的増幅の発生率を最小限に抑えるように試みた、多くの先行技術の方法がある。それらは、以下を含む。
・再編成標的遺伝子の異なる領域を標的とする一連の上流プライマーを使用する２ラウンドまたは３ラウンドのネスティッドＰＣＲの実施。標的とされる領域は通常、２つのＮ領域を含む。これは、非特異性を排除し、高感度アッセイをもたらす（例えば、Ｍｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ、２００９）。しかし、このアプローチは、より複雑であり、ＰＣＲ産物による環境汚染のリスクがある。
・ＰＣＲを次世代配列決定に置き換えること。この手順は、可能性として、１０^−５までのＭＲＤを、及びおそらく、追加ステップを用いて、１０^−６までのＭＲＤを測定し得る。しかし、この手順は、特に、高感度が所望される場合、複雑で費用がかかる。
・改善されたフローサイトメトリーを使用すること。
・非特異性を最小限に抑える試みで、対立遺伝子特異的（ＡＳＯ）プライマーの３’末端を設計すること。効率的な増幅を得るために、ＰＣＲプライマーの３’末端にＧまたはＣ塩基を含むことが望ましいと広く信じられている。具体的には、効率的なプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長、３’末端に１つ以上のＧまたはＣ塩基が存在することにより支持される。それは、これらの塩基が、ＡまたはＴ塩基よりも相補的な塩基に対してより強い水素結合を形成するからである。
・約６０℃のアニーリング温度と組み合わせて、上流のＡＳＯプライマーを最大のＮ領域に、下流のプライマーを生殖細胞系Ｊ配列に向けること（例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２００４、Ｐｏｎｇｅｒｓ−Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９、Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ，２０００、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００２、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００４、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００７、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ａｎｄ ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ，２００９、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１４、Ｖｅｒｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ，２０００）。
・Ｔｍが最大約６５℃のプライマーの使用及び／または最大６９℃のアニーリング温度の使用（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２００４、Ｐｏｎｇｅｒｓ−Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９、Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ，２０００、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００２、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００７、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ａｎｄ ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ，２００９、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１４、Ｖｅｒｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ，２０００）。
・短縮プライマーの使用。
・タッチダウンＰＣＲを実施すること（Ｐｏｎｇｅｒｓ−Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９、Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ ２０００）。
・再編成遺伝子上での配置に関連して、特定の配置特性を示すようにプライマーを設計すること。
・特異的アンプリコンを非特異的アンプリコンと区別する取り組みにおいて、融解曲線分析を実施すること。しかし、プライマーの１つがコンセンサスプライマーである場合、融解曲線分析は失敗する。

しかし、ほぼ２０年にわたって遂行されているこれらの方法は、非特異的増幅を大幅に低減させることがなかった（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２００４、Ｐｏｎｇｅｒｓ−Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ｅｔ ａｌ，１９９９、Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ，２０００、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００２、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００７、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２００９、ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１４、Ｖｅｒｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ，２０００）。実に、非特異的増幅は、ＭＲＤ結果を解釈するための基準が、観察されている非特異性のレベルに、その結果を関連付けることを推奨する程度まで、不可避に出現するものとして認められている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ、２００７）。

従って、単純であり、しかもなお、例えば、ＭＲＤとの関連で、再構成Ｉｇ及びＴＣＲ遺伝子の非特異的増幅のレベルの低減により、さらに改善された感度を示す改善された増幅方法を開発する継続的な必要性がある。

本発明に至るまでの研究では、所与の反応での使用のために選択されるプライマーの性能に基づく反応により決定されたアニーリング温度の使用に基づいた、高感度の１ラウンドＰＣＲが開発されている。具体的には、臨界アニーリング温度（Ｔｃ）の３℃下とその反応のＴｃまでの範囲内のアニーリング温度の主題の反応を実施することは、急性リンパ芽球性白血病または慢性リンパ性白血病患者の治療中に得られた試料におけるＭＲＤの定量化を可能にするような非特異的増幅の大幅な低減を生じるが、これは、現在まで達成可能となっていない。これらの知見は、所与の反応に使用するために選択されたプライマーの機能性への参照により実験的に決定されているアニーリング温度ではなく、全反応に対し固定値で決定されたアニーリング温度の選択に基づいているほぼ全ての先行技術による方法と対照的である。

プライマーの末端の３’末端のヌクレオチドのうちの１つ以上がＡ及び／またはＴであるプライマーの設計及び使用は、それ自体で、または本発明の方法に従って選択されるアニーリング温度と組み合わせて使用される場合、非特異的増幅を大幅に低減させることもさらに決定されている。また、融解曲線分析を含むように設計される場合、本発明の方法は、特に、敏感であり、従って強力なツールとなる。

本発明の開発は、任意のＩｇまたはＴＣＲ再構成分析に適用可能であるが、唯一のＮ領域を含むＩｇまたはＴ細胞再構成標的領域の増幅に関して特定の有効性を示すことが確定されている。

これらの知見は、現在までに、これまでのところ試験されて限定的な成功を見ているプライマー設計、アニーリング温度、及びＰＣＲ条件への変更に基づいて達成されている、限定的な改善に照らして考えると、予想外であり且つ直観に反するものである。この高感度方法の開発により、より複雑なマルチプレックスまたはネスティッドＰＣＲ反応を実施するニーズ、または別途非常に高価な次世代配列結果を使用するニーズが不要になる。ここで、本方法の開発は、Ｔ細胞またはＢ細胞の腫瘍性集団などの、特定のＩｇまたはＴＣＲ遺伝子再構成を特徴とするリンパ系細胞のクローン集団の改善された検出及び／または監視が可能になる。そのような細胞のクローン集団の膨張を特徴とし得る病状を診断及び／または監視する手段も提供される。

本明細書及び続く特許請求の範囲の全体にわたって、文脈に別途要求のない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載の完全体もしくはステップ、または完全体もしくはステップの群を含むが、他の任意の完全体もしくはステップ、または完全体もしくはステップの群を除外することを意味すると理解されるであろう。

本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲を制限されることはなく、それらの実施形態は、例示の目的のみを意図している。機能的に同等の製品、組成物、及び方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本発明の範囲内である。

本明細書で使用される場合、「から由来する」という用語は、特定の完全体または完全体の群が特定された種に由来しているが、必ずしも特定された供給源から直接得られたわけではないことを示すと解釈されるべきである。さらに、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」の単数形は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。

主題の明細書は、本明細書の参考文献の後に提示されるプログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．１を使用して作成されたヌクレオチド配列情報を含有する。各ヌクレオチド配列は、配列表において、数字見出し＜２１０＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）で識別される。各ヌクレオチド配列の長さ、配列の種類（ＤＮＡなど）、及び供給源生物は、それぞれ、数字見出し欄＜２１１＞、＜２１２＞、及び＜２１３＞に提供される情報により示される。本明細書で参照されるヌクレオチド配列は、「配列番号」という見出しと、それに続く配列識別子により特定される（例えば、配列番号１、配列番号２など）。本明細書で参照される配列識別子は、配列表の数字見出し欄＜４００＞（その後に、配列識別子が続く（例えば、＜４００＞１、＜４００＞２など））で提供される情報と相関する。すなわち、本明細書に詳述される配列番号１は、配列表において＜４００＞１として示される配列と相関する。

本発明の一態様は、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を増幅する方法に関し、該方法は、該再編成ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を対象とするフォワード及びリバースプライマーと、目的の核酸試料を接触させること、ならびに、以下を使用して該核酸試料を増幅させることを含む。
（ｉ）主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに／または
（ｉｉ）３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／またはＴヌクレオチドを含む、少なくとも１つのプライマー、
ならびに、任意に、融解曲線分析を行う手段。

別の態様では、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ ＤＮＡ領域を増幅する方法が提供され、該方法は、該再構成ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を対象とするフォワード及びリバースプライマーと、目的の核酸試料を接触させること、ならびに、以下を使用して該核酸試料を増幅させることを含む。
（ｉ）主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに／または
（ｉｉ）少なくとも１つのプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／またはＴヌクレオチドを含むプライマー、
ならびに、任意に、融解曲線分析を行う手段。

さらに別の態様では、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を増幅する方法が提供され、この再編成は、唯一のＮ領域を特徴とし、該方法は、該再編成ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を対象とするフォワード及びリバースプライマーと、目的の核酸試料を接触させること、ならびに、以下を使用して該核酸試料を増幅させること、を含む。
（ｉ）主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに／または
（ｉｉ）少なくとも１つのプライマーであて、該プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／またはＴヌクレオチドを含むプライマー、
ならびに、任意に、融解曲線分析を行う手段。

これらの態様に従って、一実施形態では、該少なくとも１つのプライマーは、ＡＳＯプライマーである。

別の実施形態では、該方法は、主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに、１つ以上のプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチドの位置に、ＡまたはＴヌクレオチドを含むプライマーの両方を使用することを含む。

さらに別の実施形態では、該核酸は、ＤＮＡである。

さらに別の実施形態では、該プライマーの２つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。別の実施形態では、該プライマーの３つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの４つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの５つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの６つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。

さらに別の実施形態では、融解曲線分析が実施される。

さらに別の実施形態では、下流の遺伝子セグメントを対象とする該プライマーは、Ｊセグメントを対象とする。

さらなる実施形態では、該増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応である。

本発明のさらに別の態様は、哺乳動物のクローン細胞集団を検出及び／または監視する方法を提供し、このクローン細胞が、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とする、ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を特徴とし、該方法は、以下を含む。
（ｉ）上記のようなフォワード及びリバースプライマーと、哺乳動物に由来する生物学的試料のＤＮＡ物質を、該プライマーと該標的核酸分子との相互作用を促進するのに十分な時間及び条件下で接触させること、
（ｉｉ）（ａ）主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに／または、（ｂ）少なくとも１つのプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／もしくはＴヌクレオチドを含むプライマー、ならびに、任意に、融解曲線分析を実施する手段、を使用して該核酸標的を増幅すること、ならびに
（ｉｉｉ）該増幅産物を検出すること。

この態様によれば、一実施形態では、該少なくとも１つのプライマーは、ＡＳＯプライマーである。

別の実施形態では、該方法は、主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに、少なくとも１つのプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチドの位置に、ＡまたはＴヌクレオチドを含むプライマーの両方を使用することを含む。

さらに別の実施形態では、該核酸は、ＤＮＡである。

さらに別の実施形態では、該プライマーの２つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。別の実施形態では、該プライマーの３つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの４つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの５つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの６つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。

さらに別の実施形態では、融解曲線分析が実施される。

さらなる実施形態では、該増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。

さらに別の実施形態では、下流の遺伝子セグメントを対象とする該プライマーは、Ｊセグメントを対象とする。

さらなる態様では、該状態は、新生物、さらにより好ましくは、リンパ性新生物である。

別の態様では、本発明の方法は、リンパ性白血病に関連する微小残存病変を検出するために使用される。

本発明のさらに別の態様は、上記のような単離プライマーに関する。

本発明のさらに別の態様は、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域の同定を容易にするためのキットに関し、該キットは、上記のようなオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１つ以上を含有するように構成された部分、該プライマーの標的核酸分子との相互作用を容易にするのに有用な試薬、及び該相互作用が該核酸標的の増幅をもたらすことを可能にするのに有用な試薬を含む。

ＭＲＤ観察値とＭＲＤ予測値のグラフ表示である。白血病ＤＮＡ及び非白血病ＤＮＡを、種々の既知の比率で混合して、様々なレベルのＭＲＤを含有する人工試料を提供した。各試料由来の３０μｇのＤＮＡを評価し、観察されたＭＲＤのレベルを、図中で予測値に結びつけている。ＤＮＡのこの量のアッセイでは、ＭＲＤの検出の限界が、１０^−６未満であることに留意すべきである。ＡＬＬは、急性リンパ芽球性白血病の患者由来のＤＮＡを指し、ＣＬＬは、慢性リンパ性白血病患者由来のＤＮＡを指す。 急性リンパ芽球性白血病患者由来の血液試料中のＭＲＤの測定の得られた結果のグラフ表示である。左側の列は、検出及び測定されたレベルを示す。中央の列は、ＭＲＤが検出されなかった試料の結果を示し、ＭＲＤのレベルは、示された値未満であり、示される値のばらつきは、研究のために利用可能なＤＮＡの量のばらつきに起因していた。右側の列は、合計５３人の患者由来のプライマーで観察された非特異性のレベルを示す。非特異性は、５つのプライマー対で観察され、レベルが示される。非特異性は、レベルが３．４×１０^−７未満であることを示す、４８人の患者由来のプライマーでは観察されなかった。 非特異性とアニーリング温度のグラフ表示である。５人の患者由来の２μｇの非白血病ＤＮＡ及びプライマー対を使用して、ＰＣＲを実施した。これらのプライマーは、低温でいくらかの非特異性を示したので、試験のために選択した。非特異性の量は、Ｃｔ値に反比例する。それぞれの場合では、非特異性の量は、アニーリング温度が７０℃を超えて増加するまで、ほぼ同じままであった。それから非特異性の量は徐々に減少し、最終的には、４つのプライマー対では検出することができなかった。 臨界アニーリング温度（Ｔｃ）を決定するための方法のグラフ表示である。様々なアニーリング温度を使用して、一連のＰＣＲを実施する。Ｔｃは、最小Ｃｔの維持により示されるように、ＰＣＲが最適効率を維持する最高温度である。４つの異なるＡＳＯプライマーを試験し、それぞれのＴｃを、矢印で示す。 融解曲線分析の結果を示す。ＰＣＲは、Ｃｔを測定するためのプローブと低濃度の蛍光色素Ｓｙｔｏ８２の両方を含有していた。ＰＣＲの終わりに、温度を徐々に上昇させ、蛍光を継続的に測定した。図は、蛍光対温度曲線の１次導関数を示し、非特異的増幅及び特異的増幅の別々のピークが明らかである。 治療中の３６人の慢性リンパ性白血病患者由来の１１１の試料におけるＭＲＤの測定結果を示す。１０^−６未満の感度を達成した。

本発明は、部分的に、再編成ＩｇまたはＴＣＲ遺伝子を特徴とするクローン細胞集団を検出するための単純な高感度の増幅方法の開発に基づいている。特に、増幅プロセスの一部としての融解曲線分析と組み合わせる場合、問題のＰＣＲ反応のＴｃからＴｃより３℃低い範囲内のアニーリング温度（「Ｔｃ−３℃」）の使用により、高感度のシングルラウンドＰＣＲの開発が予想外に可能になる。さらに、プライマーの少なくとも末端３’ヌクレオチド位置がＡ及び／またはＴであるように設計されたプライマーの使用はさらに、それ自体で、または本発明の方法に従って選択されたアニーリング温度と組み合わせて使用される場合、増幅反応の感度及び特異性を改善する。この方法の開発により、特に、唯一のＮ領域を特徴とする再編成の検出の状況では、目的の特定のＩｇまたはＴＣＲ遺伝子再構成の検出が容易になった。これにより、既知のＩｇまたはＴＣＲ遺伝子再編成を発現する細胞のクローン集団などの細胞の存在を特徴とする状態の監視の改善を可能にする。本発明の方法及びプライマーは、高レベルの感度及び特異性を必要とする微小残存病変の検出に関して特定の用途を見出し、これは現在、非常に複雑で高価な分子技術の適用によってのみ達成可能である。

従って、本発明の一態様は、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を増幅する方法に関し、該方法は、該再編成ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を対象とするフォワード及びリバースプライマーと、目的の核酸試料を接触させること、ならびに、以下を使用して該核酸試料を増幅させることを含む。
（ｉ）主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに／または
（ｉｉ）少なくとも１つのプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／またはＴヌクレオチドを含むプライマー、
ならびに、任意に、融解曲線分析を行う手段。

一実施形態では、該少なくとも１つのプライマーは、ＡＳＯプライマーである。

別の実施形態では、該方法は、主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに、１つ以上のプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチドの位置に、ＡまたはＴヌクレオチドを含むプライマーの両方を使用することを含む。

さらに別の実施形態では、融解曲線分析を実施する。

「ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域」への言及は、増幅が求められるＩｇまたはＴＣＲのＤＮＡまたはＲＮＡの任意の領域への言及として理解されるべきである。該核酸領域は、部分的に再編成された遺伝子または完全に再編成された遺伝子に対応し得る。

「核酸」または「ヌクレオチド」または「塩基」への言及は、デオキシリボ核酸またはヌクレオチド及びリボ核酸またはヌクレオチドもしくはプリンもしくはピリミジン塩基またはその誘導体もしくはアナログの両方への言及として理解されるべきである。これに関しては、とりわけＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含む、リボヌクレオチド及び／またはデオキシリボヌクレオチドのリン酸エステルを包含することが理解されるべきである。本発明の核酸分子は、天然に存在するもの（例えば、生物学的試料に由来するであろう）、組み換え産生されるもの、または合成的に産生されるものを含む任意の起源のものであり得る。塩基はまた、イノシンなどの非標準塩基であってよい。

「誘導体」への言及は、天然、合成、または組み換え供給源の該核酸分子のフラグメント、部分、一部、相同体、及び模倣物への言及を含むと理解されるべきである。「機能的誘導体」は、プリンまたはピリミジン塩基、ヌクレオチドまたは核酸分子のいずれか１つ以上の機能的活性を示す誘導体として理解されるべきである。該ヌクレオチドまたは核酸配列の誘導体は、他のタンパク性または非タンパク性分子に融合しているヌクレオチドまたは核酸分子の特定の領域を有するフラグメントを含む。本明細書で企図される「アナログ」は、ヌクレオチドまたは核酸分子への改変、例えば、その化学的組成または全体的な立体配座への改変を含むが、これらに限定されない。これは、例えば、ヌクレオチドまたは核酸分子が、例えば、骨格形成または相補的塩基対ハイブリダイゼーションのレベルの、他のヌクレオチドまたは核酸分子と相互作用する方法に対する改変を含む。ロックされた核酸は、本明細書で記載されるアナログの例である。ヌクレオチドまたは核酸分子のビオチン化は、本明細書で記載される「機能的誘導体」の例である。核酸分子の誘導体は、単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失、及び／または付加に由来し得る。「機能的誘導体」という用語はまた、ヌクレオチドまたは核酸配列、例えば、天然の産物スクリーニング後に得られた産物の機能的活性のいずれか１つ以上を示すヌクレオチドまたは核酸を包含することが理解されるべきである。

主題の「核酸」領域は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの誘導体もしくはアナログであり得る。目的の領域が、タンパク質性分子をコードするＤＮＡ配列であるので、それは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ転写産物から生成されたｃＤＮＡ、または核酸増幅により生成されたＤＮＡの形をとってもよい。主題の方法がＲＮＡの領域を検出することに関する場合、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、最初にＲＮＡをＤＮＡに逆転写することが必要であることが理解されるだろう。主題のＲＮＡは、ｍＲＮＡ、１次ＲＮＡ転写物、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどの任意の形態のＲＮＡであってよい。好ましくは、目的の該核酸領域は、目的のＤＮＡ領域である。この目的のために、該ＤＮＡは、最終的に分析の対象となるＲＮＡからの逆転写により生成されたＤＮＡ、及びＰＣＲなどの核酸増幅方法により生成されたＤＮＡを含む。

増幅の対象である核酸領域は、Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントのうちの２つ以上の再編成を受けているＩｇまたはＴＣＲ核酸領域である。従って、目的の主題の核酸領域は、部分的または完全再編成遺伝子のいずれかに対応し得る。以下でより詳細に考察されるように、Ｉｇ及びＴＣＲ再編成は、一連の連続的な再編成として生じ、これにより、最後のステップで、定常領域遺伝子に結合するように再編成される完全に再編成された可変領域がもたらされる。本発明の方法は、クローンリンパ系細胞が分化を停止し得る点に応じて、部分的に再編成された遺伝子の全部または一部が増幅されてもよい。

一実施形態では、該標的核酸領域は、ＤＮＡである。

この実施形態によると、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ ＤＮＡ領域を増幅する方法が提供され、該方法は、該再編成ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を対象とするフォワード及びリバースプライマーと、目的の核酸試料を接触させること、ならびに、以下を使用して該核酸試料を増幅させること、を含む。
（ｉ）主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに／または
（ｉｉ）少なくとも１つのプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／またはＴヌクレオチドを含む少プライマー、
ならびに、任意に、融解曲線分析を行う手段。

別の実施形態では、該少なくとも１つのプライマーは、ＡＳＯプライマーである。

さらに別の実施形態では、該方法は、主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに、該プライマーｎの３’末端ヌクレオチドの位置に、ＡまたはＴヌクレオチドを含む少なくとも１つのプライマーの両方を使用することを含む。

さらに別の実施形態では、融解曲線分析を実施する。

本発明の方法は、フォワード及びリバースプライマーと、試験されるべき核酸試料を接触させることにより達成される。「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」への言及は、ヌクレオチドの配列、またはその機能的誘導体もしくはアナログを含む任意の分子への言及として理解されるべきであり、その機能は、目的の核酸分子の領域へのハイブリダイゼーションを含む。プライマーは、１つ以上のロックされた核酸を含有してもよい。プライマーが非核酸成分を含み得ることも理解されるべきである。例えば、プライマーはまた、蛍光もしくは酵素タグなどの非核酸タグ、またはプローブとしての分子の使用を容易にするか、もしくは別途検出または固定化を容易にする他の一部の非核酸成分を含んでもよい。プライマーはまた、オリゴヌクレオチドタグなどの追加の核酸成分を含んでもよい。別の例では、プライマーは、核酸の側鎖を示すペプチド骨格を含むタンパク質核酸であってよい。好ましくは、該オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡプライマーである。本発明のプライマーは、再構成ＩｇまたはＴＣＲ核酸を「対象とする」。「対象とする」は、プライマーが、増幅されるように求められる再構成ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域に、部分的または全体的にハイブリダイズするように設計されることを意味する。

本発明をいかなる１つの理論または作用様式にも限定することなく、適応免疫系を有する生物におけるＶ（Ｄ）Ｊ再構成は、免疫細胞が、新しい病原体を認識して、それに適応するように急速に多様化するのを助ける一種の部位特異的遺伝子再構成の例である。各リンパ系細胞は、約１０^１６の異なる可変領域構造の総抗原多様性を生じるために、再編成された特定の遺伝子セグメントに応じて、生殖細胞系列可変領域遺伝子セグメント（Ｖ及びＪ、Ｄ及びＪ、またはＶ、Ｄ、及びＪセグメントのいずれか）の体細胞再構成を受ける。Ｔ細胞またはＢ細胞などの任意の所与のリンパ系細胞では、少なくとも２つの異なる可変領域遺伝子セグメント再編成が、ＴＣＲまたは免疫グロブリン分子を含む２つの鎖、具体的には、ＴＣＲのα、β、γもしくはδ鎖及び／または免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖のうちの２つ以上の再編成に起因して起こる可能性がある。任意の所与の免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子のＶＪ、ＤＪ、またはＶＤＪセグメントの再編成に加えて、ヌクレオチドが、ランダムに除去及び／またはセグメント間の接合部に挿入される。これは、膨大な多様性の生成につながる。

これらの遺伝子セグメントの遺伝子座は、生殖細胞系列で広く分離されるが、リンパ球の発育中の再構成により、Ｖ、（Ｄ）、及びＪ遺伝子が並置され、これらの遺伝子間の接合部は、ヌクレオチドの挿入及び欠失の小さな領域を特徴とする。このプロセスは、各正常リンパ球が固有のＶ（Ｄ）Ｊ再編成を有するようになるようにランダムに生じる。急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫、または骨髄腫などのリンパ性癌が、単一の正常細胞の腫瘍性変化の結果として生じるので、がん細胞は全て、創始細胞に元々存在する接合部Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成を、少なくとも元々有するであろう。サブクローンが、腫瘍性集団の増殖中に生じ得、さらに、Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成が、それらの中に生じ得る。

「遺伝子セグメント」への言及は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体遺伝子のＶ、Ｄ、及びＪ領域への言及として理解されるべきである。Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントは、ファミリーにクラスター化される。例えば、κ免疫グロブリン軽鎖の５２の異なる機能的Ｖ遺伝子セグメント及び５つのＪ遺伝子セグメントがある。免疫グロブリン重鎖では、５５の機能的Ｖ遺伝子セグメント、２３の機能的Ｄ遺伝子セグメント、及び６つのＪ遺伝子セグメントがある。免疫グロブリンならびにＴ細胞受容体のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントファミリーの全体にわたって、多数の個別の遺伝子セグメントがあり、それにより、影響を受けることができるＶ（Ｄ）Ｊ再編成の固有の組み合わせに関する膨大な多様性が可能になる。明確にするために、再編成免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体［Ｖ（Ｄ）Ｊ］可変核酸領域は、本明細書では「遺伝子」と呼ばれ、個々のＶ、Ｄ、またはＪ核酸領域は、「遺伝子セグメント」と呼ばれる。従って、「遺伝子セグメント」という用語は、もっぱら遺伝子のセグメントへの言及ではない。むしろ、Ｉｇ及びＴＣＲ遺伝子再編成の文脈では、それは、これらの遺伝子セグメントがファミリーにクラスター化されることの関連での遺伝子への言及である。「再編成」免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体可変領域遺伝子は、本明細書では、（Ｄセグメントが、問題の特定の再編成可変遺伝子に組み込まれる場合）１つのＶセグメント、１つのＪセグメント、及び１つのＤセグメントのうちの２つ以上が、単一の再編成「遺伝子」を形成するように、一緒にスプライシングされている遺伝子として理解されるべきである。実際には、この再編成「遺伝子」は実際に、一緒にスプライシングされている１つのＶ遺伝子セグメント、１つのＪ遺伝子セグメント、及び１つのＤ遺伝子セグメントを含むゲノムＤＮＡのストレッチである。それ故、実際には、一緒にスプライシングされている２つまたは３つの異なるＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子（本明細書では遺伝子セグメントと呼ばれる）で実際構成されるので、「遺伝子領域」とも呼ばれる場合がある（但し、本明細書の文脈ではない）。従って、再変性免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体遺伝子の個々の「遺伝子セグメント」は、個々のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子として記載される。これらの遺伝子は、ＩＭＧＴデータベースで詳細に説明される。「遺伝子」という用語は、本明細書では、再編成免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体可変遺伝子を指すように使用されるであろう。「遺伝子セグメント」という用語は、本明細書では、Ｖ、Ｄ、Ｊ及びフレームワーク３領域を指すように使用される。しかし、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体再編成に関して、「遺伝子」／「遺伝子セグメント」という文言の使用はかなりの不整合性があるという点に留意すべきである。例えば、ＩＭＧＴは、個々のＶ、Ｄ、及びＪ「遺伝子」に言及するが、一部の科学出版物は、これらを「遺伝子セグメント」と呼ぶ。再編成可変免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体を「遺伝子領域」と呼ぶ供給元もいれば、「遺伝子」と呼ぶ供給元もいる。本明細書で使用される用語は、上記のとおりである。

さらに、本発明をいかなる１つの理論または作用様式にも限定することなく、遺伝子再構成事象の性質は、再構成遺伝子または遺伝子セグメント（本明細書で記載される）間の接合部が、「Ｎ領域」の形成をもたらすランダムヌクレオチドの欠失及び挿入を特徴とし得るようなものである。これらのＮ領域もまた独特であり、従って、本発明のプライマーの設計に関連して有用な標的である。この点に関しては、本発明のプライマーのサブ領域に関して、それらが結合する遺伝子／遺伝子セグメントと比較して、本文書中で考察することを単純化するために、これらのＮ領域は、それらが別個の遺伝子セグメントとして染色体に存在せず且つ再構成部位でのヌクレオチドの挿入及び欠失による再編成時にのみ生成されるという事実にもかかわらず、代替的に本発明の文脈では「遺伝子セグメント」と呼ばれてもよい。これらをＮ遺伝子セグメントまたはＮ領域と呼ぶという選択は、明確にするために、この文書の任意の所与のセクションの文言を単純化することに純粋に基づいて行われる。従って、特に、Ｖ（Ｄ）Ｊ再編成との関連で、分析の対象となり得る遺伝子セグメントは、個々のＶ、Ｎ_１、Ｄ、Ｎ_２、及びＪ領域、ならびにフレームワーク３遺伝子セグメントである。本文脈中、Ｖ及びＤ遺伝子セグメント間のＮ遺伝子セグメントは、Ｎ_１と呼ばれ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント間のＮ遺伝子セグメントは、Ｎ_２と呼ばれる。しかし、Ｎ領域（または「遺伝子セグメント」）が、Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメント内で生じ得ることも理解されるべきである。本発明を作用様式のいかなる１つの理論にも限定することなく、これは、Ｊ遺伝子セグメントとの再編成中に、Ｄ遺伝子セグメント内の１つ以上のＮ領域の形成を受けることができるＤ遺伝子セグメントとの関連で最も一般に観察される。従って、完全再編成ＶＤＪ領域は一般に常に、Ｎ_１及びＮ_２遺伝子セグメントを含むであろうが、それは、例えば、Ｖ、Ｄ、もしくはＪ遺伝子セグメント内に、または再構成Ｊ遺伝子セグメント及び定常遺伝子の接合部にさえも、付加的なＮ領域も含んでもよく、この最終的な再構成は通常、ＶＤＪ再構成の終了後に生じる。

「フォワードプライマー」（または「上流プライマー」）への言及は、標的ＤＮＡのアンチセンス鎖に、及び他のプライマーの５’にハイブリダイズすることにより、目的の核酸（例えば、ＤＮＡ）試料中の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を増幅するプライマーへの言及として理解されるべきである。

「リバースプライマー」（または「下流プライマー」）への言及は、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）のセンス鎖または他のプライマーの３’にハイブリダイズすることにより、目的の核酸（例えば、ＤＮＡ）試料中及びＰＣＲにおいて標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を増幅するプライマーへの言及として理解されるべきである。

一般に、フォワードまたは上流プライマーは、ＡＳＯプライマーであり、下流またはリバースプライマーは、例えば、保存Ｊ領域を対象とするコンセンサスプライマーであるが、時々の状況で、例えば、フォワードプライマーがＶ領域の保存配列を対象とするように逆が起こり、リバースプライマーは、ＡＳＯプライマーである。

本発明で使用するのに好適なプライマーを設計及び合成するための手段は、当業者らによく知られているであろう。上記で詳述されているように、Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントファミリーは、完全に同定及び配列決定されている。従って、特定のセグメントまたは再編成セグメントの組み合わせを増幅するプライマーの設計は、十分に当業者の技術の範囲内である。それにもかかわらず、実質的な例示が、本明細書で参照されるＴｃ値を示すプライマーの設計及び試験に関連して実施例１及び２にも提供される。

上記で詳述されているように、本発明の方法は、増幅反応のアニーリング温度が臨界アニーリング温度（固有のプライマーセットにより規定される各反応に固有である）を参照することにより選択される場合、有意に改善されたレベルの感度が達成されるという決定に基づく。「臨界アニーリング温度」（「Ｔｃ」）への言及は、ＰＣＲなどの増幅反応が、所望の標的の増幅に関して最適な効率で作動する最高のアニーリング温度への言及として理解されるべきである。増幅の操作の効率は、Ｃｔで評価することができる。具体的には、ＰＣＲの各サイクルでの最適な増幅は、実質的に全ての標的分子がハイブリダイズするようになるように標的分子に各プライマーを最適なハイブリダイズすることに依存する。本発明をいかなる理論または作用様式にも限定することなく、一連の増幅反応が、様々な異なるが漸増するアニーリング温度を使用して実施される場合、ハイブリダイゼーションが不完全になり、増幅が非効率になり、Ｃｔが増加する温度が特定されるであろう。これらの増幅の非効率性が明らかになる前の最高温度は、図３に示されるように、臨界アニーリング温度（Ｔｃ）である。プライマーのＴｃは、計算されたＴｍと数度異なる、経験的に決定された温度であることは、当業者には十分に理解されるであろう。この差異の大きさは、プライマー毎に変動するであろう。さらに、Ｔｃの正確な値は、増幅条件及びＴｃを決定するために使用される機器により生じる温度勾配の分解能に依存するので、Ｔｃが計算される増幅条件が、その後に試験試料の増幅に使用される増幅条件に対応しなければならないことを、当業者は理解するであろう。Ｔｃ値の決定は、十分に当業者の技術の範囲内であり、例えば、様々なアニーリング温度にわたって標的ＤＮＡの一連のリアルタイム増幅を可能にする器具を使用して、任意の好適な手段により実施することができる。Ｔｃ決定の例は、実施例２に記載される。

Ｔｃの決定は、有用性が選択されたプライマーの実際の性能の分析に関連しているので、試験試料を増幅するために使用されることが提案される特定のプライマーの関連で評価される必要があることも理解されるべきである。従って、この分析は、本発明の方法が適用される前に、完了することが要求されることになり、利用されることが提案されるプライマーのそれぞれ異なるセットに照らして実施されることが要求されるであろう。しかし、上記で詳述されているように、Ｔｃを決定するための方法は、周知であり、あらゆる過度の負担なしに、日常的且つ容易に実施することができる。この目的のために、「主題の反応の」Ｔｃに対して選択されるアニーリング温度への言及は、関連Ｔｃが、所与の反応に照らして使用されることが求められる特定のプライマーのＴｃであるという事実への言及として理解されるべきである。それ故、Ｔｃは、様々な異なるプライマーセットに適用することができる固定値ではない。

「アニーリング温度」への言及は、標的核酸領域（テンプレート）へのプライマーのハイブリダイゼーションが生じる増幅段階の温度への言及として理解されるべきである。上記で詳述されているように、本発明の一態様は、非特異的増幅の低減は、使用されるアニーリング温度がＴｃからＴｃより３℃下（本明細書では「Ｔｃ−３℃」と呼ばれる）に入る場合、達成することができるという判断に基づく。それ故、本発明の方法のアニーリング温度は、使用されるプライマーが異なる場合、反応毎に変動する可能性がある。この設計は、全ての反応にわたって固定アニーリング温度が使用されるほとんどの増幅システムとは完全に異なる。さらに、Ｔｃ及び（Ｔｃ−３℃）「内」または「間」に入るアニーリング温度への言及は、Ｔｃまたは（Ｔｃ−３℃）温度自体を使用することを選択することを含むと理解されるべきである。この範囲の外側限界でまたはその付近の温度、例えば、これらの限界をわずかに下回るまたは上回るが、この範囲の温度またはこの範囲内の温度と同等に機能する温度の使用も企図されることも理解されるべきである。

さらに、フォワード及びリバースプライマーが異なる配列を有するので、単一の反応内の２つのプライマーのＴｃは、幾分変動し得ることが理解されるであろう。ＡＳＯプライマーは、非特異性の最小化の点から最も重要なプライマーであり、実際には、同じリバースコンセンサス（通常Ｊ）プライマーは多くの場合、様々な患者由来の試料を試験する時に様々なＡＳＯプライマーに伴って使用されるであろう。この状況では、特定のＴｍを得るためにリバースプライマーが、最初に設計され得ること、次に、Ｔｃが実験的に決定することができることを、当業者は理解するであろう。その後、リバースプライマーよりも１〜２℃低いＴｍを得るためにＡＳＯプライマーが設計される。次に、ＡＳＯプライマーのＴｃは、わずかにリバースプライマーのＴｃより低くなければならず、ＰＣＲのアニーリング温度が、ＡＳＯプライマーのＴｃに基づく場合、ＰＣＲの特異性が最適化されるであろう。

上記で詳述されるように、フォワードプライマーは通常、ＡＳＯプライマーであり、ＩｇＨまたはＴＣＲ再構成の最も可変な領域を対象とし、リバースプライマーは、ＩｇＨまたはＴＣＲ遺伝子の下流遺伝子セグメントを対象とする。本発明により得られる感度の改善が、非特異性の低減からもたらされるので、さらに非特異性を最小化するために、上記の非ＡＳＯプライマーも設計することが有利である。

上記のように、さらなる態様では、当業者は、例えば、プライマーの３’末端に、１つ以上のＡ及び／またはＴヌクレオチドを挿入することにより、最適なハイブリダイゼーションを可能にするために、プライマーを設計及び合成することを試みてもよい。２つ以上のＡ及び／またはＴヌクレオチドが利用される一実施形態では、これらは、互いに直接隣接して配置される。つまり、順番に配置される。具体的には、好ましくは、フォワードまたはリバースプライマーの一方または両方の３’末端ヌクレオチド位置に少なくとも１つのＡまたはＴヌクレオチドが含まれてもよい。別の例では、該ＡまたはＴヌクレオチドは、リバースプライマーのみの３’末端ヌクレオチド位置、Ｊプライマーの３’末端ヌクレオチド位置、または表１に開示されるＪプライマーのいずれかに含まれる。別の実施形態では、プライマーの２つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの３つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの４つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの５つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの６つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。プライマーの「３’末端」への言及は、標的にハイブリダイズする場合に伸長を受けることになるプライマーの末端への言及として理解されるべきである。それ故、この文脈内で言及される１、２、３、４、５、または６ヌクレオチドは、プライマーが伸長を受ける前の、３’末端でのプライマーの末端ヌクレオチドである。ＡまたはＴヌクレオチドの任意の組み合わせが、これらの位置のうちのいずれか１つ以上で使用されてもよい。

一実施形態では、プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、ＡまたはＴヌクレオチドが存在する。別の実施形態では、プライマーの２つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの３つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの４つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの５つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの６つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。

上記で詳述されているように、増幅が融解曲線分析を組み込むように設計される場合、さらに別の感度を達成することができる。「融解曲線分析」への言及は、非特異的増幅を同定する手段としてのアンプリコンの融点の分析への言及として理解されるべきである。アンプリコンの融点が、アンプリコンのヌクレオチド配列の組成及び長さに関連するので、融解曲線分析は、試料内の長さ及び／または配列の変動を検出するために、特に、特異的アンプリコンの生成を非特異的アンプリコンの生成と区別するために、使用されてもよい。ＰＣＲの完了後に融解曲線分析を実施するための手段は、当業者らに周知であり、日常的に増幅反応に組み込まれる。ＤＮＡ二重鎖と非特異的に結合する場合、蛍光を発するか、または別途検出可能な反応分子への組み込みなど、任意の好適な方法が利用されてもよい。本発明をいかなる１つの理論または作用様式にも限定することなく、融解曲線分析が、温度を徐々に上昇させることにより実施される場合、蛍光は、ＤＮＡ二重鎖の不均一な範囲の融解により、広範囲の温度にわたって漸減する。標的アンプリコンなどの二本鎖の均質な亜集団の存在は、狭い温度範囲にわたる蛍光の急減により認識することができる。これは、蛍光対温度の１次導関数、すなわち、勾配を追跡することにより最も容易に認識される。特定の温度でピークが観察されるであろう。非特異的増幅は通常、ピークを生じないか、または複雑なパターンを生じるか、または標的アンプリコンの温度とは異なる温度でピークを生じる。

さらに、検出手段に結合されたプローブの本発明の方法への組み込みは、プローブの配列が標的アンプリコンの配列に相補的であり、それにより、ほぼ完全に意図された標的に結合するので、さらなる特異性を提供する。ＤＮＡ二重鎖に非特異的に結合する際に蛍光を発する分子は、ＰＣＲにおいてエンドポイントＣｔ測定値に使用されているが、全てＤＮＡ二本鎖に結合するので、本方法におけるこの目的に対し禁忌であり、それらのＣｔ値は、低レベルのＭＲＤの測定を試みる場合、信頼できない。それ故、そのようなフルオロフォアは、融解曲線分析にのみ使用されることが推奨される。しかし、そのようなフルオロフォア分子は、ＰＣＲの完了後に存在するＤＮＡ二重鎖の融点分析のための本方法で使用することができ、但し、使用される特定のフルオロフォアの性質及び濃度が、プローブにより提供されるＣｔ値への影響の欠如により示されるようにＰＣＲ増幅の効率に影響を及ぼさないようなものである。特異的増幅を非特異的増幅と区別するためにフルオロフォアＳｙｔｏ８２を使用する融解曲線分析の例が図４に示される。

それ故、プローブは、Ｃｔ及び色素を提供するか、または他の好適な手段が融解分析を可能にする。プローブが、任意の好適な検出手段と結合するように設計することができることが、当業者に理解されるであろう。しかし、本明細書で例示される方法との関連で、プローブ及び色素の両方がＵＶに応答して蛍光を発するが、発光スペクトルが異なるので、別々に監視することができる。

従って、さらに別の実施形態では、該方法は、好ましくは、目的の再編成ＩｇまたはＴＣＲを対象とするプローブを使用するＣｔ決定を含み、このプローブは、検出手段に結合している。

本発明の方法は、特に、唯一のＮ領域（あるいは、本明細書では「遺伝子セグメント」とも呼ばれる）を含むＩｇまたはＴＣＲ遺伝子の再編成の検出の感度を改善することとの関連で有用である。本発明をいかなる１つの理論または作用様式にも限定することなく、完全Ｉｇ重鎖遺伝子再編成または完全ＴＣＲβ鎖遺伝子再編成は、ともにＶＤＪ再構成を含むが、通常、２つのＮ領域（Ｎ_１及びＮ_２）を含むであろう。しかし、部分的再編成は、Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの１つ以上が、再編成プロセス中に形成される内部Ｎ領域を示すかどうかに応じて、１つまたは２つのＮ領域を含み得る。例えば、Ｉｇ軽鎖及びＴＣＲα鎖は、ＶＪ再編成のみを含むが、ＩｇＨ鎖及びＴＣＲβ鎖の部分的ＤＪ再編成は、ＤＪ再構成によるＶ遺伝子セグメントの再編成が完了する前に生じる。従って、ＶＤＪ再編成は、２つのＮ領域を生成し（場合により、Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメント内のＮ領域が生成される場合は３つ以上）、これらはＶＮ_１ＤＮ_２Ｊとして構成され、Ｉｇ軽鎖、ＴＣＲα鎖、または一時的な部分的再編成は、ＶＮＪまたはＤＮＪなどの唯一のＮ領域を生成し得る。これは、例えば、Ｄ遺伝子を含有しないＩＧκ及びＴＣＲγなどの遺伝子座に適用され得、再編成は、Ｖ遺伝子及びＪ遺伝子のみを含む。これは、ＶＪまたはＤＪ構造及び唯一のＮ領域を有し得る「部分的な」再編成のみが存在するＩＧＨまたはＴＣＲβ遺伝子の再編成にも適用され得る。

それ故、別の態様では、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を増幅する方法が提供され、この再編成は、唯一のＮ領域を特徴とし、該方法は、該再編成ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を対象とするフォワード及びリバースプライマーと、目的の核酸試料を接触させること、ならびに、以下を使用して、該核酸試料を増幅させること、を含む。
（ｉ）主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに／または
（ｉｉ）少なくとも１つのプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／またはＴヌクレオチドを含むプライマー、
ならびに、任意に、融解曲線分析を行う手段。

一実施形態では、該少なくとも１つのプライマーは、ＡＳＯプライマーである。

別の実施形態では、該方法は、主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに、少なくとも１つのプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチドの位置に、ＡまたはＴヌクレオチドを含むプライマーの両方を使用することを含む。

さらに別の実施形態では、該核酸は、ＤＮＡである。

さらに別の実施形態では、該プライマーの２つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、該プライマーの３つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの４つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの５つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの６つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。

さらに別の実施形態では、融解曲線分析が実施される。

さらに別の実施形態では、該方法は、好ましくは、目的の再編成ＩｇまたはＴＣＲを対象とするプローブを使用するＣｔ決定を含み、このプローブが検出手段に結合している。

さらに別の実施形態では、下流の遺伝子セグメントを対象とする該プライマーは、Ｊセグメントを対象とする。

本発明のこの実施形態に関連する使用に適するＪプライマーの例は、以下の表１に提供される。

表１：ＩＧＨ及びＴＣＲβに使用されるＪプライマー。これらは、これらの領域に使用される最長のプライマーである。短いプライマーも使用され、上記プライマーの同じ中間及び３’末端を含むが、短いプライマーは、所望のＴｍを有するプライマーをもたらすために、可変数の５’塩基が除去される。

本明細書に記載の本発明の実施形態によると、完全再編成ＶＤＪ遺伝子のＤ遺伝子セグメントの５’のＮ_１遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントの３’のＮ_２遺伝子セグメント、または再編成Ｖ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメント内に形成され得るＮ領域（遺伝子セグメント）などの１つ以上のＮ遺伝子セグメントにハイブリダイズするプライマーを設計されてもよい。この点に関しては、一実施形態では、高レベルの感度が、フォワードまたはリバースプライマーのうちの少なくとも１つが、少なくとも２つのＮ遺伝子セグメントにハイブリダイズする場合に達成される。好ましい実施形態では、２つのＮ遺伝子セグメントにハイブリダイズするのはフォワード（ＡＳＯ）プライマーである。本実施形態では、リバースプライマーは、Ｊ遺伝子セグメントなどの下流遺伝子セグメントにハイブリダイズしてもよく、必ずしも患者特異的である必要はない。別の実施形態では、少なくとも２つのＮ遺伝子セグメントにハイブリダイズするのはリバースプライマーである。

ＶＤＪ再編成が２つ以上のＮ領域を含有するにもかかわらず、プライマーが唯一のＮ領域を対象とすることが好ましい状況があることも認識されるべきである。そのような状況は、標的とされるＮ領域が特に長いことにより、高い特異性を可能にするか、または標的とされるＮ領域がプライマーの３’末端が相補的ＴもしくはＡ塩基を含むことを可能にするのに十分な数のＡもしくはＴ塩基を含む場合、あるいは、標的とされないＮ領域が不十分な数のＡまたはＴ塩基を含有する場合に生じ得る。

２つのＮ遺伝子セグメント間でハイブリダイズするプライマーを設計することを試みるという範囲で、本発明のプライマーの設計は、ともにＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの接合部に位置する２つのＮ遺伝子セグメント間にハイブリダイズするために、プライマーは目的の再構成遺伝子の少なくとも３つの連続する遺伝子セグメント間でハイブリダイズしなければならないものであり、これらの３つの連続する遺伝子セグメントの５’及び３’遺伝子セグメントがＮ領域／遺伝子セグメントである。従って、プライマーは、それぞれが目的の再構成遺伝子の３つの連続する遺伝子セグメントのうちの１つにハイブリダイズするように設計された３つのサブ領域を含むように構成され、そのうちの２つがＮ遺伝子セグメントである。「連続的」とは、３つの遺伝子セグメントが、好ましくは、線形配置で互いに直接隣接するように再構成されていることを意味する。この点に関しては、３つの再構成及び連続した遺伝子セグメントにハイブリダイズするプライマーの３つのサブ領域のそれぞれが互いに作動可能に連結されて単一のプライマーを形成すると理解すべきである。

プライマーサブ領域は、長さに関して同じであっても異なっていてもよい。これらのオリゴヌクレオチドのサブ領域の長さ及びそれらが対象とする特定の遺伝子セグメント標的に依存して、それらは排他的にただ１つの遺伝子セグメントの全部または一部にハイブリダイズし得るか、またはそれらがいくつかの遺伝子セグメントのそれぞれの全部または一部にハイブリダイズし得るのそれぞれの長さに依存すると理解すべきである。概念的には、部分的再編成に対するプライマー（ＤＮＪまたはＶＮＪ）は、例えば、以下の再編成された遺伝子セグメント標的のうちの１つにハイブリダイズするように設計され得る：Ｎ、ＤＮ、ＮＪ、ＤＮＪ、ＶＮ、ＮＪ、ＶＮＪ。完全ＶＮ_１ＤＮ_２Ｊ再編成に対するプライマーは、例えば、以下の再構成遺伝子セグメント標的のうちの１つにハイブリダイズするように設計され得る：Ｎ_１、ＶＮ_１、Ｎ_１Ｄ、ＶＮ_１Ｄ、Ｎ_１ＤＮ_２、ＶＮ_１ＤＮ_２、Ｎ_１ＤＮ_２Ｊ、ＶＮ_１ＤＮ_２Ｊ、Ｎ_２、ＤＮ_２、Ｎ_２Ｊ、ＤＮ_２Ｊ。Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントが、そのセグメント自体の中にＮ領域も含み得ると理解すべきである。

理解されるように、プライマーが２つのＮ遺伝子セグメントにハイブリダイズするように設計される場合、プライマーは、２つのＮ遺伝子セグメントに介在する遺伝子セグメントの全長に及ぶであろう。通常の状況は、ＶＤＪ再編成であり、介在する遺伝子セグメントは通常、Ｄ遺伝子セグメントである。Ｄ遺伝子セグメントの長さに起因して、Ｄ遺伝子セグメントの全長にわたってハイブリダイズするプライマーを設計することは、Ｎ遺伝子セグメントが通常比較的短いので、Ｄ遺伝子セグメントにハイブリダイズするプライマーのサブ領域は、プライマーの最も長いサブ領域を表す可能性が高いという事実のために、特異性の喪失をもたらし得ることが、当業者により理解されるであろう。それ故、プライマーのハイブリダイゼーションのほとんどが、Ｄ遺伝子セグメントへの相補性により決定されるので、Ｎ遺伝子セグメントの特異性が損なわれ得る。目的の特定のＤ遺伝子セグメントが、未再編成遺伝子に加えて、他の多くのＶＤＪ再編成組み合わせにみられる可能性があり、それ故、それは、目的の細胞だけではない、それ以外の多くの異なる細胞で検出可能であろう。これは、重大な偽陽性結果をもたらし得る。この非特異的結合の発生率を低減させるために（プライマーが対象とするＮ領域の数にかかわらず）、特異性を低減させるために、Ｄ遺伝子セグメントにハイブリダイズするプライマーのサブ領域に変更を行うことができる。これを達成する方法は、以下を含むが、これらに限定されない。
（ｉ）Ｄ遺伝子セグメント（または特異性を低減させることが試みられる他の遺伝子セグメント）にハイブリダイズするように設計されるプライマーのサブ領域への、オリゴヌクレオチドのそのサブ領域のＤ遺伝子セグメントへのハイブリダイゼーションを減少させるための、１つ以上のスペーサーまたはリンカーの導入。
（ｉｉ）Ｄ遺伝子セグメントなどの遺伝子セグメントにハイブリダイズするように設計されたプライマーのサブ領域内のいくつかのヌクレオチド位置で、単一のヌクレオチドの付加が、４つの核酸塩基全ての等モル混合物からランダムに選択されたヌクレオチドの付加により置き換えられるようなプライマーの合成（Ｎ混合物と呼ばれる）。これは、置換位置での増幅の各ラウンドで、テンプレートヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドヌクレオチド間の適切な結合の確率が４分の１しかないので、オリゴヌクレオチドプライマーの全体的なハイブリダイゼーションに対するこれらの位置での水素結合の寄与を大幅に低減させる。ランダム性の低いＮ混合物、例えば、Ａ／Ｔのみを使用すると、効果は低くなる。

本発明を任意のいかなる理論または作用様式にも限定することなく、Ｎ混合物で、約４塩基毎、または長い遺伝子セグメントを対象とするプライマーサブ領域の３〜７隣接ヌクレオチドのストリングのいずれかで修飾することが、プライマー機能を失うことなく、特異性の十分な低減を達成し得ることが決定されている。

標的ＤＮＡとの本発明のプライマーの相互作用を促進することは、任意の好適な方法により実施され得る。それらの方法は、当業者らに既知であろう。プライマー誘導の増幅を達成するための方法もまた、当業者らに非常によく知られている。一方法では、該増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、ＮＡＳＢＡ、または鎖置換増幅である。好ましくは、該増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応である。

「試料」への言及は、生物学的または非生物学的試料への言及として理解されるべきである。非生物学的試料の例としては、例えば、合成的に生成された核酸集団の核酸産物が挙げられる。「生体試料」への言及は、動物の体内に導入、続いて、除去されている、限定されないが、細胞物質、血液、粘液、糞便、尿、組織生検標本、または体液（例えば、肺洗浄後の肺から抽出された生理食塩水または浣腸洗浄から取り出された溶液）などの、哺乳動物または哺乳動物組織培養物に由来する生物学的物質の任意の試料への言及として理解されるべきである。本発明の方法に従って試験される生物学的試料は、直接試験され得るか、または試験前に、一部の形態の処理を必要とし得る。例えば、生検試料は、試験前に均質化を必要とし得る。さらに、生物学的試料は、液体形態でない限り、試料に流動性をもたせるために、緩衝液などの試薬の添加を必要とし得る。

標的ＤＮＡが生物学的試料に存在する限り、生物学的試料は、直接試験され得るか、または、他に、生物学的試料に存在する核酸物質の全部もしくは一部が試験前に単離されてもよい。試験前に標的核酸分子が前処理されること、例えば、生ウイルスの不活化またはゲル上での遊動は、本発明の範囲内である。また、生体試料は、新たに採取され得るか、または試験前に（例えば、凍結により）保存されている可能性があるか、もしくは別途試験前に（例えば、培養することにより）処理されている可能性があると理解されるべきである。

試料をプライマーと「接触させること」への言及は、相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）が生じ得るように、試料とのプライマーの混合を促進することへの言及として理解されるべきである。この目的を達成するための手段は、当業者らに周知であろう。

本明細書に開示の方法に従って試験するのに最も適する試料のタイプの選択は、監視されている状態の性質などの状況の性質に依存するであろう。例えば、好ましい実施形態では、腫瘍性状態が、分析の対象である。腫瘍性状態がリンパ性白血病である場合、血液試料、リンパ液試料、または骨髄穿刺液が、好適な試験試料を提供する可能性が高いであろう。腫瘍性状態がリンパ腫である場合、リンパ節生検または血液または骨髄試料が、試験に適する組織供給源を提供する可能性が高いであろう。腫瘍性細胞の元の供給源を監視しているかどうか、または転移もしくは起点からの新生物の拡散の他の形態の存在が監視されるべきかどうかについての考慮も必要とされるであろう。これに関しては、任意の１つの哺乳動物由来のいくつかの異なる試料を採取及び試験することが望ましい場合がある。所与の検出シナリオに適切な試料を選択することは、当業者の技術の範囲内に入るであろう。

本明細書で使用される範囲での「哺乳動物」という用語は、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ロバ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、及び飼育下の野生動物（例えば、カンガルー、シカ、キツネ）を含み、好ましくは、哺乳動物は、ヒトまたは実験室試験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。

本発明の本態様の方法は、目的の標的核酸領域の存在を検出するための手段（例えば、診断または監視目的用）と、任意にその標的を定量化及び／または単離するための手段の両方を提供する。従って、標的のさらなる分析などの、任意の目的のために、目的の標的核酸集団を検出、濃縮、または精製する手段が提供される。

本発明の別の態様は、哺乳動物のクローン細胞集団を検出及び／または監視する方法を提供し、このクローン細胞が、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を特徴とし、該方法は、以下を含む。
（ｉ）上記のようなフォワード及びリバースプライマーと、哺乳動物に由来する生物学的試料のＤＮＡ物質を、該プライマーと該標的核酸分子との相互作用を促進するのに十分な時間及び条件下で接触させること、
（ｉｉ）（ａ）主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに／または、（ｂ）少なくとも１つのプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／もしくはＴヌクレオチドを含むプライマー、ならびに、任意に、融解曲線分析を実施する手段、を使用して該核酸標的を増幅すること、ならびに
（ｉｉｉ）該増幅産物を検出すること。

一実施形態では、該少なくとも１つのプライマーは、ＡＳＯプライマーである。

別の実施形態では、該方法は、主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、ならびに、１つ以上のプライマーであって、該プライマーの３’末端ヌクレオチドの位置に、ＡまたはＴヌクレオチドを含むプライマーの両方を使用することを含む。

さらに別の実施形態では、該核酸は、ＤＮＡである。

さらに別の実施形態では、該プライマーの２つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、該プライマーの３つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの４つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの５つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。さらに別の実施形態では、プライマーの６つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する。

さらに別の実施形態では、融解曲線分析が実施される。

さらに別の実施形態では、該方法は、好ましくは、目的の再構成ＩｇまたはＴＣＲを対象とするプローブを使用するＣｔ決定を含み、このプローブが検出手段に結合している。

さらなる実施形態では、該増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。

さらに別の実施形態では、下流の遺伝子セグメントを対象とする該プライマーは、Ｊセグメントを対象とする。

「細胞」への言及は、任意の種由来の全ての形態の細胞、及びその変異体またはバリアントへの言及として理解されるべきである。好ましくは、細胞は、リンパ系細胞であるが、本発明の方法は、部分的または完全なＩｇまたはＴＣＲ再編成を受けている可能性がある任意のタイプの細胞に対して実施することができる。本発明をいかなる１つの理論または作用様式にも限定することなく、細胞は、生物を構成し得るか（単細胞生物の場合）、または個々の細胞が特定の機能について多かれ少なかれ特殊化（分化され）され得る多細胞生物のサブユニットであってよい。全ての生物は、１つ以上の細胞から構成される。主題の細胞は、同系、同種異系、または異種の状況での試験の対象である生物学的試料の一部を形成し得る。同系の状況は、クローン細胞集団及びクローン集団が存在する生物学的試料が、同じＭＨＣ遺伝子型を共有するということを意味する。これは、例えば、個体の新生物の存在についてスクリーニングしている場合である可能性が最も高いであろう。「同種異系」の状況は、主題のクローン集団が、実際に、生物学的試料が採取される個体とは異なるＭＨＣを発現する場合である。これは、例えば、移植片対宿主病などの状態との関連で、移植されたドナー細胞集団（例えば、免疫担当骨髄移植）の増殖についてスクリーニングしている場合に生じ得る。「異種」の状況は、対象のクローン細胞が、生物学的試料が由来する対象とは完全に異なる種のものである場合である。これは、例えば、潜在的に腫瘍性のドナー集団が異種移植に由来する場合に生じ得る。

主題の細胞の「バリアント」は、それがバリアントである細胞の形態学的もしくは表現型の特徴または機能的活性の全てではないがいくつかを示す細胞を含むが、これらに限定されない。「変異体」は、遺伝子改変される細胞などの、自然にまたは非自然に改変さている細胞を含むが、これらに限定されない。

「クローン」とは、主題の細胞集団が共通の細胞起源に由来することを意味する。例えば、腫瘍性細胞の集団は、分化の特定の段階で形質転換を受けている単一細胞に由来する。この点に関して、遺伝的に異なる腫瘍性細胞集団を生成するためにさらなる核再編成または変異を受ける腫瘍性細胞はまた、異なるクローン細胞集団ではあるが、「クローン」細胞集団である。別の例では、急性または慢性の感染症または免疫刺激に応答して膨張するＴまたはＢリンパ球もまた、本明細書で提供される記載内の細胞の「クローン」集団である。さらに別の例では、クローン細胞集団は、より大きな微生物集団内で生じている薬物耐性クローンなどのクローン微生物集団である。好ましくは、主題のクローン細胞集団は、腫瘍性細胞集団またはクローン免疫細胞集団である。

一実施形態では、該クローン細胞は、クローンリンパ系細胞の集団である。

「リンパ系細胞」への言及は、免疫グロブリンまたはＴＣＲ可変領域遺伝子セグメントの少なくとも１つの生殖系列セットを再編成している任意の細胞への言及であると理解すべきである。再編成され得るゲノムＤＮＡをコードする免疫グロブリン可変領域は、重鎖またはκもしくはλ軽鎖に関連する可変領域を含むが、再編成され得るゲノムＤＮＡをコードするＴＣＲ鎖可変領域は、α、β、γ、及びδ鎖を含む。この点に関して、細胞が少なくとも１つの免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子セグメント領域のＤＮＡをコードする可変領域を再編成している場合、細胞は「リンパ系細胞」記載の範囲内に入ると理解されるべきである。細胞はまた、再編成ＤＮＡを転写及び翻訳している必要はない。この点に関して、「リンパ系細胞」は、その範囲内に、ＴＣＲもしくは免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを再編成しているが、再編成鎖（例えば、ＴＣＲ胸腺リンパ球）をまだ発現していないか、またはＴＣＲもしくは免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントの両方の鎖をまだ再編成していない未成熟Ｔ及びＢ細胞を含むが、これらに全く限定されない。この定義はさらに、少なくとも一部のＴＣＲまたは免疫グロブリン可変領域再編成を受けているが、細胞が、別途、成熟Ｔ細胞またはＢ細胞に従来関連する全ての表現型または機能的特徴を示さない可能性があるリンパ様細胞にまで及ぶ。従って、本発明の方法は、限定されないが、１つの可変領域の遺伝子領域の少なくとも一部の再編成が生じていることを条件として、発育の任意の分化段階のリンパ系細胞、活性化リンパ系細胞、または非リンパ系／リンパ様細胞を含む細胞の新形成を監視するために使用することができる。特定の抗原に応答して生じるクローン増殖を監視するために使用することもできる。

本発明のこの態様に関して、「監視」への言及は、該集団の存在の初期診断後に、主題のクローン細胞集団の存在またはレベルについて対象を試験することへの言及として理解されるべきである。「監視」は、孤立した１回限りの試験、または数日、数週間、数か月、もしくは数年にわたる一連の試験の両方を実施することへの言及を含む。試験は、好適な治療に関する決定に至るのを助けるために、または新しい形態の治療を試験するために、限定されないが、寛解期にある哺乳動物が再発する可能性の予測、微小残存病変のスクリーニング、処理プロトコールの有効性の監視、寛解期にある患者の状態のチェック、治療レジメンの適用前または適用後の状態の進行の監視を含む任意数の理由で実施されてもよい。それ故、本発明の方法は、臨床ツール及び調査ツールの両方として有用である。

少なくとも１つの可変領域遺伝子領域の再編成が完了していることが好ましいが、それにもかかわらず、本発明の方法は、部分的な再編成のみを示す腫瘍性細胞の監視に適用可能であることも理解されるべきである。例えば、ＤＪ再構成事象のみを受けているＢ細胞は、部分的な再編成のみを受けている細胞である。ＤＪ再構成セグメントがさらに、Ｖセグメントと再構成するまで、完全な再編成は達成されないであろう。それ故、本発明の方法は、このマーカー配列に相補的な参照分子を利用して、１つのＴＣＲもしくは免疫グロブリン鎖の部分的もしくは完全な可変領域再編成を検出するように設計することができるか、または、例えば、より高い特異性が必要とされ且つ腫瘍性細胞がＴＣＲもしくは免疫グロブリン鎖の両方の可変領域を再編成している場合に、再編成の両形態を対象とするプライマー分子を利用することができる。

「腫瘍性細胞」への言及は、異常な「成長」を示す細胞への言及として理解されるべきである。「成長」という用語は、その最も広い意味で理解されるべきであり、増殖への言及を含む。この点に関して、異常な細胞成長の例は、細胞の制御不能な増殖である。リンパ系細胞の制御不能な増殖は、固形腫瘍または単一細胞懸濁液（例えば、白血病患者の血液で観察されるような）のいずれかの形態をとる細胞集団をもたらし得る。腫瘍性細胞は、良性細胞または悪性細胞であってよい。好ましい実施形態では、腫瘍性細胞は、悪性細胞である。この点に関して、「腫瘍性状態」への言及は、対象哺乳動物における腫瘍性細胞の存在への言及である。「腫瘍性リンパ状態」が、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫で生じる異常に多数の腫瘍性細胞の存在への言及を特徴とする病状への言及を含むが、この表現はまた、哺乳動物にみられる腫瘍性細胞の数が、通常、哺乳動物の明らかな病状から寛解状態への移行またはその逆の移行を区別するとみなされる閾値より低くなる（寛解中に存在する細胞数は多くの場合、「微小残存病変」と呼ばれる）状況への言及を含むと理解されるべきである。さらに、哺乳動物に存在する腫瘍性細胞の数が、本発明の出現前に利用されたスクリーニング方法により検出可能な閾値を下回った場合でも、それにもかかわらず、哺乳動物は、「腫瘍性状態」を示すとみなされる。

この点に関して分析に適する病状は、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫、及び骨髄腫などの任意のリンパ系悪性腫瘍である。微小残存病変の監視は、これらの状態の全てにおいて重要である。

好ましくは、該状態は、新生物であり、さらにより好ましくは、リンパ性新生物である。

特定の一実施形態では、本発明の方法は、リンパ性白血病との関連で微小残存病変を検出するために使用される。

本発明のさらに別の態様は、前述のような単離プライマーに関する。

本発明のさらに別の態様は、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域の同定を容易にするためのキットに関し、該キットが、上記で定義したようなオリゴヌクレオチドプライマー、標的核酸分子で該プライマーの相互作用を促進するのに有用な試薬、及び該核酸標的の増幅をもたらすために該相互作用を可能にするのに有用な試薬、のうちの任意の１つ以上を含有するのに適する区画を含む。例えば、生物学的または非生物学的試料を受容する、さらなる区画も含まれ得る。

本発明のさらなる特徴は、以下の非限定例においてより完全に説明される。

実施例１
プライマー設計のガイドライン
３’末端
−最後の３’塩基がＡ／Ｔとなる
−好ましくは、最後の２または３塩基がＡ／Ｔとなる
−最後の最大４つの最も３’の塩基に対する塩基としてＡ／Ｔを有し得る。これより多い場合、プライマーは効率的に機能しないリスクがある。
−最後の７塩基における少なくとも２つのＧ／Ｃ。

２つのＮ領域を使用する場合の設計
−プライマーは、Ｎ_１の一部または全て、Ｄの全て、及びＮ_２の一部または全てを対象とする。
−Ｎ_１の５’に最大４塩基、及び／またはＮ_２の３’に１〜３塩基を含むことが、有利な可能性がある。これは、半固有Ｖ−Ｎ_１及びＮ_２−Ｊ接合部、ならびにＪに提供される任意のＡ／Ｔ塩基を利用する。
−プライマーのＴｍが高すぎ、７４℃より高い場合、１つ以上のＮ塩基を、実効Ｔｍを下げるために、Ｄ領域に挿入することができる。

１つのＮ領域を使用する場合の設計
唯一のＮ領域が、Ｖ−Ｎ−Ｊまたは部分的なＤ−Ｎ−Ｊ再編成の存在下で利用可能であろう。場合により、２つのＮ領域が利用可能な場合であっても、特に、長く、好ましい不均一な塩基配列を含み、良好な３’末端の設計が可能になる場合、１つだけを使用することが決定されてもよい。Ｎ領域が短い場合、及び／または良好な３’末端を有するプライマーを設計することが難しい場合は、
−Ｎ領域の後に、Ｄ領域が続く場合、特に、これが３’末端を改善する場合、通常、Ｄ領域にプライマーを４〜６塩基を延長することが有利である。これは、半固有Ｎ−Ｄ接合部を利用する。
−Ｎ領域の後にＪ領域が続く場合、場合により、さらに３’末端でＡ／Ｔが調査される場合、通常は、プライマーを１〜３塩基伸長させてＪ領域にすることが有利である。しかし、特に、この状況では、いくつかの異なるプライマーを試験することが重要である。
−Ｎ領域の前にＶ領域の３’末端がある場合、プライマーが長くなりすぎない限り、５’末端にＶの３〜５塩基を組み込むことが有利であり得る。これは、半固有Ｖ−Ｎ接合部を利用する。

Ｔｍ及びアニーリング温度
ＡＳＯプライマーの長さ及びＴｍは、再編成の性質に依存するが、多くの場合、正確な長さ及びＴｍを決定する際にある程度の柔軟性がある。その場合、ＴｍがリバースプライマーのＴｍとほぼ同じか、または１℃低くなるように、プライマーを設計することが推奨される。
ＰＣＲで使用されるアニーリング温度は、プライマーのＴｍに依存する。ガイドラインは、
Ｔｍ＝５９〜６１：アニーリング温度＝６３〜６４、
Ｔｍ＝６９〜７１：アニーリング温度＝７２、
Ｔｍ＝７１〜７４：アニーリング温度＝７５、
Ｔｍ＞７４：アニーリング温度＝７５であるが、Ｔｍを低下させるためにＮ塩基の使用を考察する。
これらのガイドラインは通常、アニーリング温度がＴｃ値の３℃以内になる。しかし、特に、Ｎ領域が５以下の塩基を含有する場合、唯一のＮ領域を用いる再編成用のプライマーに対し、多少の困難が予想され得る。そのような再編成では、アニーリング温度は、最小限の非特異性を生じるか、または非特異性を全く生じないように、Ｔｃ値付近か、またはＴｃ値でなければならない。いくつかの候補プライマーを合成及び試験することも賢明である。

注記
上記は、ガイドラインのみであり、温度勾配結果及びプライマー配列に依存するべきである。一部の患者では、複数の候補プライマーを合成及び試験することが望ましい。

実施例２
ＩＧＨ再編成に使用されるＪプライマーの様々なセット
使用される通常のセットは、ＡＡＭまたはｓｅｔＢのいずれかである。

実施例３
プライマーの試験
１．増幅効率、Ｔｃ、及び特異性の決定
各患者に対し１つまたはいくつかのプライマーが合成される。アニーリング温度の勾配を使用して、各プライマーは、白血病ＤＮＡから増幅する能力及び非白血病ＤＮＡからの増幅の失敗について試験される。例は、以下である。

上の行は、ＤＮＡの供給源（０日目の白血病、Ｄ０、または非白血病末梢血リンパ球、ＰＢＬ）を示し、次の行は、アニーリング温度の範囲を示し、下の２行は、２つの異なるプライマーの試験で観察されたＣｔ値を示す。右の列は、Ｔｃ値を示す。両方のプライマーは、６５．２℃以下の温度で効率的に増幅した。どちらのプライマーも、６２．０℃でＰＢＬによる増幅を生成しなかった（データなし）。この温度は、Ｔｃ値を３°超下回り、結果は、非特異性が将来の実験で観察される可能性が低いことを示唆する。

２．次に、選択されたプライマーは、白血病ＤＮＡの再編成された標的遺伝子を増幅する能力が非白血病ＤＮＡの同時存在により阻害されないことを確認するために試験される。

試験の例が以下に示される。５００ｎｇまたは１μｇの非白血病ＤＮＡの存在は、４００ｐｇの白血病ＤＮＡで観察されたＣＴに変化をもたらさなかった。増幅は、５００ｎｇの非白血病ＤＮＡ単独で、または水対照で観察されなかった。

３．非特異性の最終試験
これは、プライマーの後処理の最後に、またはＭＲＤを測定する最初の最終的な実験中に実施することができる。プライマーは、２０ウェルに対して試験され、ウェルそれぞれは、５人の非白血病者から得られた１μｇのプールされたＤＮＡを含有する。

実施例４
患者ＡＳＯプライマーの配列と、Ｔｍ及びＴｃ値
ＶまたはＶ、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｊは、プライマーに標的とされる再構成領域を示す。プライマーは、急性リンパ芽球性または慢性リンパ性白血病患者由来の試料用であった。

実施例５
勾配−プライマーの試験用
各プライマーは、６つの異なる温度で２回ずつ調査される。
正常ＤＮＡは、非特異性についてプライマーをチェックするために、２つの低温で実行される。
２００ｐｇ／μｌに診断試料を希釈する。２μｌ／チューブを添加し、２８μｌ／プライマーセットを必要とする
２５０ｎｇ／μｌに正常ＤＮＡを希釈する
Ａ列、Ｂ列、Ｃ列、Ｄ列、Ｅ列、及びＦ列にＤ０ ＤＮＡを添加する
Ｇ列及びＨ列にＰＢＬ ＤＮＡを添加する
表は、６つのプライマー用であるが、プレートまたはストリップでより少ないプライマーを実行するために減少させることができる。

１７．２５×１７．８４μｌ＝３０７．７４μｌで６に分割し、５０μＭで２．７６μｌフォワードプライマーを追加する
各プライマーセットに対し、１３×１８μｌ＝２３４μｌを除去し、２００ｐｇ／μｌで２６μｌのＤ０ ＤＮＡを追加する
残りの混合物に、正常ＤＮＡ８．５μｌを２５０ｎｇ／μｌで添加する（５００ｎｇ／ウェル）。
Ａ列、Ｂ列、Ｃ列、Ｄ列、Ｅ列、及びＦ列に２０μｌのＤ０混合物を、Ｇ列及びＨ列に２０μｌの正常ＤＮＡ混合物を分注し、密封し、次のプロトコールを実行する。
ＰＣＲマシンＣＦＸ上、９１℃で３分×１実行する：
９７℃、１５秒、６８〜７５℃、３０秒、×５サイクル
９６℃、１５秒、６８〜７５℃、３０秒、×５サイクル
９４℃、１５秒、６８〜７５℃、３０秒、×３５サイクル
融解７０℃〜９５℃
この方法は、様々なアニーリング温度でプライマーの増幅効率及び特異性を試験するためのものである。
１及び１０６は、それぞれ、単一のウェルまたは全てのウェルの成分量を指す。

実施例６
付表５。ワークシート４：単一のプライマーを使用して定量化するための混合物を構成する
１ｎｇ／μｌの患者診断ＤＮＡ
Ｐｂｌ ＤＮＡは、２５０ｎｇ／μｌ、４μｌ／チューブの１２０μｌを必要とする。
ＭＲチューブの希釈
１ｎｇ／μｌから ３μｌ＋２７μｌ ＦＧ３ ０．１ｎｇ／μｌ
０．１ｎｇ／μｌから ２μｌ＋１８μｌ ＦＧ３ ０．０１ｎｇ／μｌ
２０μｌ／チューブを添加する混合物を構成するためのｐｂｌ ２５０ｎｇ／μｌを必要とする。

実施例７
２つの試料、２本のチューブ、及び５つのチューブに対して単一プライマーを使用する定量化

実行：９１℃、３分
９７℃、１５秒；７２℃、３０秒×５サイクル、
９６℃、１５秒；７２℃、３０秒×５サイクル、
９４℃、１５秒；７２℃、３０秒×３５サイクル

実施例８
融解曲線分析
ＰＣＲは、０．５μＭの濃度の蛍光色素Ｓｙｔｏ８２を含有する。予備試験は、この濃度が、レポータープローブで測定して、Ｃｔを延長しなかったことを示した。温度が徐々に上昇するにつれて蛍光が測定され、その結果は、適切なプログラムを使用して分析した。蛍光対温度曲線の１次導関数は、非特異的増幅及び特異的増幅のピークを示す。

当業者らは、本明細書に記載される本発明が、具体的に記載されるもの以外の変更及び修正を許すことを理解するであろう。本発明は、そのような全ての変形及び修正を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、個別にまたは集合的に本明細書で言及されるか、または示されるステップ、特徴、組成物、及び化合物の全て、ならびに該ステップまたは特徴の任意の２つ以上の任意及び全ての組み合わせを含む。

参考文献一覧
Ｂｒｉｓｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｒｔｌｅｙ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ ＭｏｒｌｅｙｈＡ．Ａ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＰＣＲ：Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ ｎｅｓｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ ＰＣＲ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；４０９：１７６−１８２
Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Ｍ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ＶＨ，Ｒａｆｆ Ｔ，Ｄｒｏｅｓｅ Ｊ，Ｒｉｔｇｅｎ Ｍ，Ｐｏｔｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ｇｅｎｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ａｎｄ ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００４；１８（４）：７０９−１９．
Ｌｉ Ａ−Ｈ，Ｆｏｒｅｓｔｉｅｒ Ｅ，Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ Ｒ，ａｎｄ Ｒｏｏｓ Ｇ．Ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｄｙｅ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２００２；３０：１１７０−１１７７
Ｍｏｒｌｅｙ ＡＡ，Ｌａｔｈａｍ Ｓ，Ｂｒｉｓｃｏ ＭＪ，Ｓｙｋｅｓ ＰＪ，Ｓｕｔｔｏｎ Ｒ，Ｈｕｇｈｅｓ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００９；１１（３）：２０１−１０．
Ｎａｋａｏ Ｍ，Ｊａｎｓｓｅｎ ＪＷ，Ｆｌｏｈｒ Ｔ，Ｂａｒｔｒａｍ ＣＲ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｏｃｉ ｂｙ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００；６０（１２）：３２８１−９．
Ｐｏｎｇｅｒｓ−Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ＭＪ，Ｓｅｒｉｕ Ｔ，Ｓｔｏｌｚ Ｆ，ｄ’Ａｎｉｅｌｌｏ Ｅ，Ｇａｍｅｉｒｏ Ｐ，Ｐｉｓａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ＴＡＬ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｓ ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔｓ： ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＢＩＯＭＥＤ−１ ＣＯＮＣＥＲＴＥＤ ＡＣＴＩＯＮ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３（１）：１１０−８．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ＶＨ，Ｂｏｅｃｋｘ Ｎ，ｖａｎ Ｗｅｒｉｎｇ ＥＲ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ＪＪ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ．２００４；１８（２）：１４６−５４．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ＶＨ，Ｐａｎｚｅｒ−Ｇｒｕｍａｙｅｒ ＥＲ，Ｃａｚｚａｎｉｇａ Ｇ，Ｆｌｏｈｒ Ｔ，Ｓｕｔｔｏｎ Ｒ，Ｓｃｈｒａｕｄｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉ−ｃｅｎｔｅｒ ｓｅｔｔｉｎｇ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００７；２１（４）：７０６−１３．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ＶＨ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ＪＪ．ＭＲＤ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｉｇ／ＴＣＲ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５３８：１１５−５０．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ＶＨ，Ｗｉｊｋｈｕｉｊｓ ＪＭ，Ｊａｃｏｂｓ ＤＣ，ｖａｎ Ｗｅｒｉｎｇ ＥＲ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ＪＪ．Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇａｍｍａ ｇｅｎｅ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００２；１６（７）：１３７２−８０．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ＶＨ，Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ＭＪ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈｏｏｔ ＣＥ，Ｈａｈｌｅｎ Ｋ，ｖａｎ Ｗｅｒｉｎｇ ＥＲ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ＪＪ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｄｅｌｅｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−Ｂ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｒｅ ｓｔａｂｌｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００２；１６（５）：９２８−３６．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ＶＨＪ，Ｎｏｏｒｄｉｊｋ Ｒ，Ｂｒｕｓｓｅｅ Ｍ，Ｈｏｏｇｅｖｅｅｎ Ｐ，Ｈｏｍｂｕｒｇ Ｃ，ｄｅ Ｈａａｓ Ｖ，Ｃ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈｏｏｔ Ｅ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ＪＪＭ．Ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ：Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｓｉｚｅ ｏｆ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１４，１６４，４５１−４６４
Ｖｅｒｈａｇｅｎ ＯＪ，Ｗｉｌｌｅｍｓｅ ＭＪ，Ｂｒｅｕｎｉｓ ＷＢ，Ｗｉｊｋｈｕｉｊｓ ＡＪ，Ｊａｃｏｂｓ ＤＣ，Ｊｏｏｓｔｅｎ ＳＡ，ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＩＧＨ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０００；１４（８）：１４２６−３５．

Claims (35)

1. ２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を増幅する方法であって、前記方法が、
   前記再編成ＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を対象とするフォワード及びリバースプライマーと、目的の核酸試料を接触させることと、
   （ｉ）前記主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）の間の範囲内のアニーリング温度、及び／または
   （ｉｉ）３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／またはＴヌクレオチドを含む、少なくとも１つのプライマー、
   ならびに、任意に、融解曲線分析を行う手段
   を使用して、前記核酸試料を増幅させること
   とを含む、前記方法。
2. 哺乳動物のクローン細胞集団を検出及び／または監視する方法であって、そのクローン細胞が、２つ以上のＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントの再編成を特徴とするＩｇまたはＴＣＲ核酸領域を特徴とし、前記方法が、
   （ｉ）前記再編成ＩｇまたはＴＣＲに核酸領域を対象とする前記フォワード及びリバースプライマーと、哺乳動物に由来する生物学的試料のＤＮＡ物質を、前記標的核酸分子との前記プライマーの相互作用を促進するのに十分な条件下で接触させること、
   （ｉｉ）（ａ）前記主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度、及び／または、（ｂ）少なくとも１つのプライマーであって、前記プライマーの３’末端ヌクレオチド位置に、少なくとも１つのＡ及び／もしくはＴヌクレオチドを含む、前記プライマー、ならびに、任意に、融解曲線分析を実施する手段、を使用して前記核酸標的を増幅すること、ならびに
   （ｉｉｉ）前記増幅産物を検出すること
   を含む、前記方法。
3. 前記方法が、
   前記主題の増幅反応のＴｃ及び（Ｔｃ−３℃）間の範囲内のアニーリング温度と、
   １つ以上のプライマーであって、前記プライマーの３’末端ヌクレオチドの位置に、ＡまたはＴヌクレオチドを含む、前記プライマー
   との両方を使用することを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記核酸領域が、ＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記プライマーの２つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記プライマーの３つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記プライマーの４つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記プライマーの５つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記プライマーの６つの３’最末端ヌクレオチド位置のそれぞれに、Ａ及び／またはＴヌクレオチドが存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記フォワードまたはリバースプライマーのいずれかまたは両方が、前記Ａ及び／またはＴヌクレオチドを含むように設計される、請求項１〜１０のいずれか１項以上に記載の方法。
11. 前記リバースプライマーのみが、前記Ａ及び／またはＴヌクレオチドを含むように設計される、請求項１〜１０のいずれか１項以上に記載の方法。
12. 前記ＶＤＪ再編成が、部分的再編成であり、前記再編成Ｖ及びＤ遺伝子セグメント、前記再編成Ｄ及びＪ遺伝子セグメント、または前記再編成Ｖ及びＪ遺伝子セグメントのうちの１つ以上の間の前記接合部に位置するＮ領域が存在する、請求項１〜１１のいずれか１項以上に記載の方法。
13. 前記ＶＤＪ再編成が、完全再編成であり、前記再編成Ｖ及びＤ遺伝子セグメント、前記再編成Ｄ及びＪ遺伝子セグメント、または前記再編成Ｖ及びＪ遺伝子セグメントのうちの１つ以上の間の前記接合部に位置するＮ領域が存在する、請求項１〜１１のいずれか１項以上に記載の方法。
14. 前記ＶＤＪ再編成が、部分的再編成であり、前記Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＶ遺伝子セグメントのうちの１つ以上の中に位置するＮ領域が存在する、請求項１〜１２のいずれか１項以上に記載の方法。
15. 前記ＶＤＪ再編成が、完全な再編成であり、前記Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＶ遺伝子セグメントのうちの１つ以上の中に位置するＮ領域が存在する、請求項１〜１１または１３のいずれか１項以上に記載の方法。
16. 前記プライマーの少なくとも１つが、前記再編成Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの１つのＮ遺伝子セグメントを対象とするハイブリダイゼーションサブ領域を含む、請求項１〜１４のいずれか１項以上に記載の方法。
17. 前記プライマーの少なくとも１つが、前記再編成Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの少なくとも２つのＮ遺伝子セグメントを対象とするハイブリダイゼーションサブ領域を含む、請求項１〜１４のいずれか１項以上に記載の方法。
18. 前記Ｊ遺伝子セグメントを対象とする前記プライマーが、３’末端に、少なくとも１つのＡ及び／またはＴヌクレオチドを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. プライマーサブ領域が、Ｎ混合物由来のヌクレオチドと、前記サブ領域のヌクレオチドのうちの１つ以上を置換するように改変される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記サブ領域の４つおきのヌクレオチドが置換される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記サブ領域の３〜７つの隣接ヌクレオチドの配列が置換される、請求項２０に記載の方法。
22. 融解曲線分析が実施される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記融解曲線分析が、染料を使用して実施される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記染料が、フルオロフォアである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記方法が、Ｃｔ決定ステップを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記Ｃｔ決定が、前記再編成ＩｇまたはＴＣＲ領域を対象とするプローブを使用して実施され、このプローブが、検出手段に結合している、請求項２５に記載の方法。
27. 前記検出手段が、蛍光分子である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記少なくとも１つのプライマーが、前記ＡＳＯプライマーである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 下流の遺伝子セグメントを対象とする前記プライマーが、前記Ｊセグメントを対象とする、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記状態が、新生物であり、さらにより好ましくは、リンパ性新生物である、請求項２に記載の方法。
32. 前記リンパ性新生物が、リンパ性悪性腫瘍である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記リンパ性悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、及び骨髄腫である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記方法が、微小残存病変を検出するために使用される、請求項２に記載の方法。
35. 前記微小残存病変が、リンパ性白血病に関連して検出される、請求項３４に記載の方法。
    

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