KR101873456B1 - 2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 메틸화 마커 및 이를 이용한 확인 방법 - Google Patents

2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 메틸화 마커 및 이를 이용한 확인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환경성 폐질환 유발 환경유해물질 중의 하나인 PM2.5(particulate matter2.5)의 마우스 모델에서의 노출에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 메틸화 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 PM2.5에 의해 특이적으로 발현이 증가 또는 감소하는 메틸화 DNA 및 이를 이용한 PM2.5에 대한 마우스 모델에서의 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오마커는 메틸화 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 메틸화 DNA들을 바이오마커로 이용하여 환경 중 PM2.5의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, PM2.5에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 예상하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

2.5 마이크로미터 이하 미세먼지 노출 여부 확인용 메틸화 마커 및 이를 이용한 확인 방법{Methylation marker for identifying of exposure to particulate matter 2.5 and the identification method using thereof}
본 발명은 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지(PM2.5) 노출 여부 확인용 메틸화 마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수용성 PM2.5 또는 유기성 PM2.5 노출에 의해 농도 의존적으로 발현이 변화하는 메틸화 마커 및 이를 이용하여 PM2.5에 대한 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
후성유전학은 DNA 염기서열의 변화를 초래하지 않고 유전자 발현의 조절에 변화가 일어나는 현상으로서, DNA 메틸화는 DNA 메틸 전이 효소에 의해 DNA의 시토신 염기에 메틸기가 전이되는 증상이다. 이는 마이크로 RNA, 히스톤 단백질의 메틸화 또는 아세틸화, 뉴클레오솜 위치결정(positioning)과 함께 후성유전학의 중요한 요인으로 알려져 있다.
DNA 메틸화와 관련하여 특정 유전자의 프로모터 부위가 과메틸화(hypermethylation)되면 상기 유전자의 발현이 억제되고, 반대로 저메틸화(hypomethylation)되면 유전자의 발현이 증가된다.
DNA 메틸화는 외부 유전자의 침입으로부터 원핵생물을 보호해 주거나 진핵생물의 발달과정에서 유전자의 발현을 조절하는 역할을 한다. 이외에도, DNA 메틸화는 발생과 발달, 염색체의 안정성, X염색체의 불활성화, 외부 기생 유전체의 발현 억제, 유전자 각인 등 정상 세포의 기능에 관여한다. 또한, 조직 특이적 유전자 활성이나, 질병과 연관된 유전자들의 발현 변화에도 영향을 미친다고 알려져 있다.
따라서, 메틸화 관련 연구는 암 발생, 노화 등과 같은 생명현상의 인과 관계 규명에 중추적인 역할을 할 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있다. 또한, 메틸화 마커의 발굴은 암을 포함한 다양한 질병의 조기 진단, 예후 예측 모니터링, 치료 및 사후 관리 등에 많은 도움을 줄 것이다.
최근 급격한 기술 발달에 따라 유전체 전반에 걸친 메틸화 분석이 시도되고 있으며, 이를 통해 이제까지 알려지지 않은 새로운 것을 포함하여 전반적인 메틸화의 기능에 대한 연구가 가능해 질 것으로 예상된다. 특히, 고 분해능의 마이크로어레이와 초고속 차세대 염기서열분석 등의 기술들은 보다 많은 질병의 유발 과정에 대한 새로운 지식을 제공하고, 이를 통한 새로운 진단 마커 및 치료 표적의 발굴을 가능하게 할 것이다. 또한, 메틸화 마커는 특정 환경유해물질의 노출 예측에도 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 전망된다. 지금까지는 환경유해물질의 노출에 따른 유전자의 발현 변화 양상과 그에 따른 질병과의 연관성에 관련된 연구가 주로 진행되었다. 그러나, 최근 DNA 메틸화와의 연관성에 대한 관심이 증가함에 따라, 벤젠, 비소 또는 RDX(1,3,5-Trinitroperhydro-1,3,5-triazine)와 같은 유해물질과 실외 및 실내 공기오염원 노출에 따라 특이적인 변화를 보이는 메틸화 유전자를 확인하였다(Baccarelli A. and Bollati V., Current Opinion in Pediatrics, 21, 243-251 (2009); Carmen J. Marsit, The journal of experimental biology, 218, 71-79 (2015); Hyang-Min Byun et al., Methods in molecular biology, 1265, 271-283(2015)).
또한, 발굴된 메틸화 유전자는 환경유해물질에 의한 독성 기작 예측에도 쓰일 수 있다. 이와 같이, 메틸화 마커의 환경유해물질 노출 및 독성기작 예측에서의 역할이 매우 중요하다고 할 수 있으나, 현재 DNA 메틸화 관련 연구는 주로 질병 진단용 마커 발굴에 국한되어 있다. 또한, 후성유전학적 변화는 유전학적 변화의 다양성에 비해 그 정도가 심하지 않기 때문에 하나의 DNA 메틸화나 마이크로 RNA와 같은 마커로도 질병이나 유해물질 노출을 초기에 진단할 수 있다는 장점과 비침습적 방법으로 진단할 수 있다는 이점이 있다.
한편, 미세먼지는 입자의 크기가 10 ㎛(=0.001 ㎝) 이하인 먼지를 통칭한다. 연료의 연소에 의해 인위적으로 발생하는 미세먼지는 일반적으로 직경이 10 ㎛보다 작은 PM10과 직경이 2.5 ㎛보다 작은 초미세먼지인 PM2.5로 분류된다. PM2.5는 일반적으로 연료 연소에 의해 발생하며, 보일러나 자동차, 발전시설 등의 배출물질이 주요 발생원이다. 그 외 공사장, 도로 등에서 비산되는 먼지에도 포함되어 있다. 인체에 심각한 영향을 끼칠 것으로 보이는 PM2.5는 호흡을 통해 인체에 노출되므로, 이는 공장이나 교통이 혼잡한 도로, 발전시설 등에서 과하게 노출될 수 있다.
PM2.5는 크기가 작을수록 공기 중의 이동속도가 빠르며 약 1/3은 장거리 이동, 1/3은 지역에서의 직접적인 배출, 1/3은 공기 중 반응에 기인한다고 추정된다. PM2.5는 직경이 2.5 ㎛보다 작아 눈으로는 분간이 어렵고, 호흡기를 통해 폐포까지 깊숙하게 침투하여 폐질환을 일으킨다. 장시간 노출될 경우, 입자가 미세할수록 코 점막을 통해 걸러지지 않고 폐포까지 직접 침투하여 천식, 아토피, 폐암 등의 질병을 일으킬 수 있다. 이러한 위해성 때문에 신축 공동주택의 실내공기질 관리법에서는 PM2.5의 대기환경기준은 연평균 25 ㎍/㎥이하, 하루 평균 50 ㎍/㎥이하로 두고 있다.
국내 대기 중 PM2.5에 대한 오염도 자료는, 공기 중에서 이동성이 높고 지역마다 분포농도, 조성 등의 차이가 큰 초미세먼지라는 물질의 특성상 조사 자료가 미흡하다. 이에 환경부에서는 PM2.5의 장거리이동현황, 지역별 성분분석자료 수집에 기여하고 다량 배출사업장을 우선 대상으로 실태조사와 대책마련을 구상 중에 있다.
또한 황사, 미세먼지 PM10 등의 인체 독성 정도와 구성성분분석, 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되어 있지만, 초미세먼지 PM2.5 대한 연구는 구성성분분석 연구에 대부분 국한되어 있다. 이처럼 PM2.5의 잠재적 건강 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 확립되지 않았다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝 방법, 예를 들면 마이크로어레이 칩 또는 프라이머를 이용하는 실시간 PCR 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용에 관여하는 메틸화 DNA의 발현 변화 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하는 것이 필요하다.
DNA 칩 기술의 발달로 인해, 최근 연구들은 암이나 기타 질병 또는 특정 자극에 따른 DNA 메틸화 양상 변화의 특징을 분석하는 쪽으로 이루어지고 있다. 이러한 분석 방법에는 메틸화된 서열과 그렇지 않은 서열의 차이를 이용한 방법, 제한효소를 사용하는 방법(HELP)과 항 5-메틸시토신 항체를 이용한 면역침강 방법(MIRA, MeDIP) 그리고 아황산수소나트륨을 이용한 서열분석 방법 등이 사용되고 있다. 이들 중, 한 번의 실험으로 수천 개 유전자의 메틸화 양상을 확인하고 이들의 기능을 연구하기 위한 게놈-와이드 익스프레션 연구, 즉 마이크로어레이 분석이 주로 이루어지고 있다.
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍 길이의 올리고뉴클레오티드들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산된다. 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어지고 있다. 한편, Agilent사 등에서는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 이를 생산하고 있다(Sellheyer, K. et al., Journal of the American Academy of Dermatology, 51, 681-692, 2004). 유전자의 메틸화 분석은 시료에서 얻어진 메틸화된 DNA를 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응하여 수행된다. 얻어진 DNA는 형광이나 동위원소로 표지화한다.
최근 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법이 독성유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목되어 대량(high throughput)으로 의약품, 신 의약 후보물질, 환경오염물질 또는 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서의 DNA 메틸화 변화 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라, 특정 세포 내에서 특정 유전자의 메틸화 양상을 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해 작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능해졌다. 이를 통하여 환경오염물질의 유해 작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘과 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능해질 수 있다.
이에 본 발명자들은, 마우스 프로모터 부위의 105,234개의 유전자가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 수용성 PM2.5 또는 유기성 PM2.5에 노출된 마우스 모델들의 메틸화 DNA 발현 변화를 확인하였고, PM2.5 노출에 의해 발현이 변화되는 메틸화 DNA를 발굴함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, PM2.5 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 포함하는 마이크로어레이 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PM2.5 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 마이크로어레이 칩을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PM2.5 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 PM2.5 노출 여부 확인용 바이오마커 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, PM2.5 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) PM2.5에 노출된 실험군 및 PM2.5에 노출되지 않은 대조군의 시료에서 전체 DNA를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 분리된 전체 DNA에서 메틸화 DNA를 추출하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 메틸화 DNA를 형광물질로 표지하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 형광물질로 표지된 DNA를 본 발명에 따른 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
5) 상기 단계 4)의 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)에서 분석한 데이터에서 본 발명에 따른 바이오마커의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, PM2.5 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명의 PM2.5 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 PM2.5 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은, PM2.5에 노출된 개체의 모니터링, PM2.5의 위해성 판정 및 PM2.5에 의해 야기되는 독성 작용 기작의 규명에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 DNA 메틸화 마이크로어레이 칩을 이용하여, 수용성 PM2.5 또는 유기성 PM2.5에 대해 노출된 BALB/C 마우스 폐 조직의 전체 DNA 메틸화 변화 양상을 분석한 결과이다.
도 2는 수용성 PM2.5의 노출 농도에 의존적으로 메틸화 양상이 변화하는 21종의 유전자 프로브의 메틸화 변화 양상을 클러스터링 분석 방법으로 분석한 결과이다.
도 3은 수용성 PM2.5의 노출 농도에 의존적으로 메틸화 양상이 변화하는 21종의 유전자 프로브의 메틸화 변화 양상을 라인-플롯 분석 방법으로 분석한 결과이다.
도 4는 유기성 PM2.5의 노출 농도에 의존적으로 메틸화 양상이 변화하는 30종의 유전자 프로브의 메틸화 변화 양상을 클러스터링 분석 방법으로 분석한 결과이다.
도 5는 유기성 PM2.5의 노출 농도에 의존적으로 메틸화 양상이 변화하는 30종의 유전자 프로브의 메틸화 변화 양상을 라인-플롯 분석 방법으로 분석한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 프로모터 부위를 포함하는 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지(PM2.5)에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다:
GenBank 유전자 등록번호 NM_172704(Dnajc11, DnaJ heat shock protein family(Hsp40) member C11), GenBank 유전자 등록번호 NM_172762(Rbm34, RNA binding motif protein 34), GenBank 유전자 등록번호 NM_008408(Stt3a, subunit of the oligosaccharyltransferase complex, homolog A), GenBank 유전자 등록번호 NM_198614(C2cd4c, C2 calcium-dependent domain containing 4C), GenBank 유전자 등록번호 NM_028672(Fam161a, family with sequence similarity 161, member A), GenBank 유전자 등록번호 NM_028014(2310067B10Rik (Tmem94), transmembrane protein 94), GenBank 유전자 등록번호 NM_017270(Sec14l1, SEC14 like lipid binding 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_016893(Timm9, translocase of inner mitochondrial membrane 9), GenBank 유전자 등록번호 NM_016893(Fut8, fucosyltransferase 8), GenBank 유전자 등록번호 NM_177082(Sp8, trans-acting transcription factor 8), GenBank 유전자 등록번호 NM_027290(Mcm10, minichromosome maintenance 10 replication initiation factor), GenBank 유전자 등록번호 NM_001123327(Qser1, glutamine and serine rich 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_027491(Rragd, Ras related GTP binding D), GenBank 유전자 등록번호 NM_017467(Zfp316, zinc finger protein 316), GenBank 유전자 등록번호 NM_010069(Doc2a, double C2 domain alpha), GenBank 유전자 등록번호 NR_001461(Kcnq1ot1, KCNQ1 overlapping transcript 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_008609(Mmp15, matrix metallopeptidase 15), GenBank 유전자 등록번호 NM_001166416(Med23, mediator complex subunit 23), GenBank 유전자 등록번호 NM_175128(4930430F08Rik, RIKEN cDNA 4930430F08 gene), GenBank 유전자 등록번호 NM_145443(L2hgdh, L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase), GenBank 유전자 등록번호 NR_031761(Rmi1, RecQ mediated genome instability 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_001005425(Zfp663, zinc finger protein 663), GenBank 유전자 등록번호 NM_013885(Clic4, chloride intracellular channel 4), GenBank 유전자 등록번호 NM_030886(Ankrd17, ankyrin repeat domain 17), GenBank 유전자 등록번호 NM_001035228(St3gal5, ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 5), GenBank 유전자 등록번호 NM_009866(Cdh11, cadherin 11), GenBank 유전자 등록번호 NM_001205157(Yipf2, Yip1 domain family member 2), GenBank 유전자 등록번호 NM_008548(Man1a, mannosidase 1, alpha), GenBank 유전자 등록번호 NM_001113548(Adamtsl5, ADAMTS like 5), GenBank 유전자 등록번호 NM_001168507(Tmem11, transmembrane protein 11), GenBank 유전자 등록번호 NM_02421(Slc25a11, solute carrier family 25 member 11), GenBank 유전자 등록번호 AK041762(D130051D11Rik, RIKEN cDNA D130051D11 gene), GenBank 유전자 등록번호 NM_019980(Litaf, LPS-induced TN factor), GenBank 유전자 등록번호 NM_152824(Rbm17, RNA binding motif protein 17), GenBank 유전자 등록번호 NM_001177366(Fut7, fucosyltransferase 7), GenBank 유전자 등록번호 NM_028806(Phactr3, phosphatase and actin regulator 3), GenBank 유전자 등록번호 NM_001081320(Cyb561d1, cytochrome b561 family member D1), GenBank 유전자 등록번호 NM_001163793(C530008M17Rik, RIKEN cDNA C530008M17 gene), GenBank 유전자 등록번호 NM_145997(Kdm5a, lysine demethylase 5A), GenBank 유전자 등록번호 NM_008514(Lrp6, LDL receptor related protein 6), GenBank 유전자 등록번호 NM_001163590(Stx11, syntaxin 11), GenBank 유전자 등록번호 NM_001195268(Dos, voltage-dependent calcium channel beta subunit-associated regulatory protein), GenBank 유전자 등록번호 NM_030083(Lsmd1, LSM domain containing 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_199200(Fam171a2, family with sequence similarity 171 member A2), GenBank 유전자 등록번호 NM_178682(4933426M11Rik, sushi domain containing 6), GenBank 유전자 등록번호 NM_001024602(AW555464, centrosomal protein 170), GenBank 유전자 등록번호 NM_021556(Mrps30, mitochondrial ribosomal protein S30), GenBank 유전자 등록번호 NM_027395(Basp1, brain abundant, membrane attached signal protein 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_029253(Atf7ip2, activating transcription factor 7 interacting protein 2), GenBank 유전자 등록번호 NM_001204229(Clec16a, C-type lectin domain family 16 member A) 및 GenBank 유전자 등록번호 NM_172493(Diap2, diaphanous related formin 2).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 PM2.5 시료를 채취하여, 수용성 성분과 유기성 성분을 각각 추출하고, 마우스를 대조군, 저용량 및 고용량 그룹으로 나누어 수용성 또는 유기성 PM2.5에 노출시켰다(표 1 참조). 상기 마우스 모델의 폐조직에서 DNA를 분리 및 정제하고, 메틸화 DNA는 Cy5-dUTP로, 전체 DNA는 Cy3-dUTP로 표지하여 올리고마이크로어레이 분석을 하였다. 상기 형광표지된 메틸화 DNA를 Mouse CpG 2X105K(Agilent, USA)와 혼성화하고, 형광 이미지를 스캔하여 메틸화 DNA 발현 양상을 분석하였다(도 1 참조). PM2.5 노출에 대한 유전자의 메틸화 양상을 살펴보면, 수용성 PM2.5의 저농도 처리군에서는 429개(과메틸화: 277개, 저메틸화: 152개), 고농도 처리군에서는 420개(과메틸화 297개, 저메틸화 123개)의 부위가 메틸화되었다(표 3 참조). 또한, 수용성 PM2.5의 두 노출 농도에서 공통으로 발현이 변화된 메틸화 유전자 프로모터 부위 49개(과메틸화: 31개, 저메틸화: 18개)와 이에 해당하는 메틸화 유전자 48개를 선별하였다.
또한, 이들 유전자 중에서 라인-플롯 분석 방법을 이용하여 농도 의존적 메틸화 발현 양상을 보이는 유전자 21개를 선별하였다(표 4, 도 2 및 도 3 참조).
한편, 유기성 PM2.5의 저농도 처리군에서는 966개(과메틸화: 522, 저메틸화: 414), 고농도 처리군에서는 404개(과메틸화: 246, 저메틸화: 158)의 부위가 메틸화되었다. 또한, 상기 두 노출 농도에서 공통으로 발현이 변화된 메틸화 유전자 프로모터 부위 65개(과메틸화; 36, 저메틸화: 29)와 이에 해당하는 유전자 65개를 선별하였다.
아울러, 이들 유전자 중에서 라인-플롯 분석 방법을 이용하여 농도 의존적으로 메틸화 발현 양상을 보이는 유전자 30개를 선별하였다(표 5, 도 4 및 도 5 참조).
따라서, 상기 PM2.5 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 PM2.5에 노출된 개체의 모니터링, PM2.5의 위해성 판정 및 PM2.5에 의해 야기되는 독성 작용 기작의 규명에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바이오마커 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, PM2.5 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
본 발명의 PM2.5 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 메틸화 DNA 분자로 이용하여 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 inkjet 방식 등을 사용할 수 있으나, 본 발명의 일 실시예에서는 SurePrint inkjet micro dropping 마이크로어레이를 이용하였다.
상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 에폭시, 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신 및 알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 활성기가 코팅된 것일 수 있다. 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있으나 구체적으로는 에폭시가 코팅된 슬라이드 글래스일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 마우스 프로모터 부위의 105,234개의 유전자가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 수용성 PM2.5 또는 유기성 PM2.5에 노출된 마우스 모델들의 메틸화 DNA 발현 변화를 확인하였고, PM2.5 노출에 의해 발현이 변화되는 메틸화 DNA를 발굴하였다.
또한, 본 발명은
1) PM2.5에 노출된 실험군 및 PM2.5에 노출되지 않은 대조군의 시료에서 전체 DNA를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 분리된 전체 DNA에서 메틸화 DNA를 추출하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 메틸화 DNA를 형광물질로 표지하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 형광물질로 표지된 DNA를 본 발명에 따른 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
5) 상기 단계 4)의 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)에서 분석한 데이터에서 본 발명에 따른 바이오마커의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는, PM2.5 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.
상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 시료는 혈액, 뇨, 체세포, 조직 등 일 수 있으며, 구체적으로는 마우스 또는 인간의 조직 유래인, 더욱 구체적으로는 마우스의 폐조직인 PM2.5 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 시료는 PM2.5에 노출되거나 노출되지 않은 마우스의 각 그룹으로부터 수득되는 폐조직일 수 있다. 상기 단계 3)의 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있으며, 구체적으로는 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 형광물질은 Cy3 및 Cy5 일 수 있다.
상기 단계 5)의 분석 방법은 GeneSpring GX 12.6.1 소프트웨어(Agilent, USA)를 사용하는 것이나, 당업자에게 알려진 어떠한 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 마우스 프로모터 부위의 105,234개의 유전자가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 수용성 PM2.5 또는 유기성 PM2.5에 노출된 마우스 모델들의 메틸화 DNA 발현 변화를 확인하였고, PM2.5 노출에 의해 발현이 변화되는 메틸화 DNA를 발굴하였다.
또한, 본 발명은 PM2.5 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있으며, 구체적으로는 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있으나, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 형광물질은 Cy3 및 Cy5 일 수 있다.
본 발명의 키트는 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있다. 그러나 상기 키트는 당업자에게 알려진 메틸화 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 마우스 프로모터 부위의 105,234개의 유전자가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 수용성 PM2.5 또는 유기성 PM2.5에 노출된 마우스 모델들의 메틸화 DNA 발현 변화를 확인하였고, PM2.5 노출에 의해 발현이 변화되는 메틸화 DNA를 발굴하였다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
PM2.5 노출 모델 선정 및 마우스 폐조직 시료 수득
<1-1> PM2.5 노출 모델
환경유해물질인 PM2.5는 입자상의 공기 내 부유물질이다. 입자상 물질은 폐 내에서 전형적인 입자 유도 염증(particle induced inflammation)을 유도한다. 이러한 반응을 측정하기 위한 동물 모델로 BALB/C를 사용한 연구가 보고되어 있다. 또한 BALB/C는 만성폐렴에 잘 걸리고, 방사선에 대한 감수성이 높으며, 비교적 온순하여 최종 모델로 선정되었다.
<1-2> 마우스 모델에서의 PM2.5 노출 농도 선정 및 노출
기존문헌의 PM2.5를 이용한 BALB/C 마우스 모델 노출연구에서는, 절대량을 기준으로 PM2.5의 양이 100 ㎍이 넘지 않도록 노출 농도를 선정하였다. 본 연구에서는 보고된 문헌의 연구 방법 및 결과(Hans Hedrich. The laboratory mouse, 2004)를 참고하였다. 또한, 마우스의 치사율과 실제 환경에서 발생되는 PM2.5의 분포 농도 등을 고려하여, 대조군(0 ㎍), 저용량군(20 ㎍), 고용량군(164 ㎍)의 세 그룹으로 나누어 PM2.5 노출 실험을 하였다(표 1).
PM2.5 시료의 노출은 실제로 흡입 실험을 하는 것이 가장 좋으나, 이를 여러 개체의 마우스에 원하는 농도로 동일하게 노출시킨다는 것이 불가능하다. 따라서, 포집한 두 그룹의 PM2.5를 액체 상태의 시료로 제조하여 하기의 계산으로 결정된 양을 기도 내로 직접 투여(tracheal instillation)하는 방식으로 BALB/C 마우스에 노출시켰다.
PM2.5 마우스 투여량 계산방법
1분당 마우스의 호흡용량(㎖) = 33.5 ~ 47.5 ㎖/min
1주일 동안 마우스의 호흡용량(㎖) = 337,680 ~ 478,800 ㎖/week
20 ㎍을 투여하였을 경우,
20 ㎍/337,680 ㎖ = 0.0000592277 ㎍/㎖
20 ㎍/478,800 ㎖ = 0.0000417711 ㎍/㎖
일일 대기 환경 기준에 따른 PM2.5의 농도 50 ㎍/m3
1분당 사람의 호흡 용량(㎖) = 6000 ㎖
1주일 동안 사람의 호흡용량(㎖) = 6000 * 60분 * 24시간 * 7주일 = 60,480,000 ㎖ = 60 m3
25 ㎍ ~ 50 ㎍의 양으로 일주일동안 PM2.5에 노출되었을 경우,
25 ㎍ * 60 m3/60,480,000 ㎖ = 0.0000248016 ㎍/㎖
50 ㎍ * 60 m3/60,480,000 ㎖ = 0.0000496032 ㎍/㎖
따라서, 마우스를 20 ㎍의 PM2.5에 노출시키면 이는 41 ~ 59 ㎍/㎖-6의 PM2.5에 노출된 것이고, 상기 노출량은 대기 환경에서 인간이 PM2.5에 대해 노출되는 양인 24 ~ 49 ㎍/㎖- 6과 유사한 수준으로, 이를 적용 가능한 노출량으로 판단하였다. 세포독성이나, 조직병리학적 수준에서 문제가 발생하지 않으나, 유전자 수준에서의 변화는 일어날 가능성이 있는 농도로서 20 ㎍의 저농도에서 마우스를 노출시켰다. 반면, 세포독성을 나타내고, 조직병리학적 수준 및 유전자 수준에서의 변화도 일어날 것으로 예상되는 농도로서 164 ㎍의 고농도에서 마우스를 노출시켰다.
PM2.5에 대한 노출 농도 및 마우스 실험 그룹 구성
실험군 노출량(절대량 ㎍) 개체수(BALB/C)
대조군(control) 0 24마리
저용량(low dose) 20 24마리
고용량(high dose) 164 24마리
<1-3> 폐조직 시료
BALB/C 마우스 모델로부터 최대한 손상되지 않은 상태의 폐조직을 확보하였다. 확보된 조직은 빛이 차단된 상태로, -20℃에서 6개월 및 -80℃에서 1년 동안 보관할 수 있는 얼프로텍트 용액(Allprotect Solution, Qiagen)을 사용하여 -80℃에서 보관하였다.
마이크로어레이 실험
<2-1> 전체 DNA의 분리
PM2.5 노출군과 비노출군 마우스의 폐 조직으로부터 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여, 제조사의 방법에 따라 전체 DNA를 분리 및 정제하였다. 분리된 전체 DNA의 농도는 나노드롭 ND 1000 분광광도계(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 이용하여 측정하였으며, 순도는 아가로스젤 전기영동으로 확인하였다.
<2-2> 전체 DNA의 단편화
상기 실시예 <2-1>에서 수득한 PM2.5 노출군과 비노출군 전체 DNA로부터 메틸화 DNA만을 특이적으로 추출하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 유전체 DNA를 단편화하였다.
구체적으로, 호모믹서(sonic dismembrator)를 이용하여 전체 DNA를 200 bp 내지 1,000 bp로 단편화하였다. 단편은, 호모믹서를 20초 간격으로 'ON' 및 'OFF'를 4회 반복하는 것을 1사이클(cycle)로하여, 3사이클을 수행해 수득하였다. 수득된 단편의 크기는 아가로스젤 전기영동으로 확인하였다.
<2-3> 메틸화 DNA 면역침강법
상기 <실시예 2-2>에서 분리한 전체 DNA로부터 메틸화 DNA만을 추출하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 면역침강을 수행하였다.
구체적으로, 면역침강은 MethylMiner™ Methylated DNA Enrichment Kit(Invitrogen, USA)를 사용하여, 제조사의 방법에 따라 수행하였다. 단편화된 전체 DNA를 비드와 섞고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응되지 않은 비결합(non-captured) DNA는 세척과정을 반복하여 제거하고, 2000 mM 농도의 NaCl 수용액으로 메틸화된 DNA를 용출(elution)하였다. 여기에 페놀-클로로포름 용액을 첨가하여 메틸화된 DNA를 추출하였다. 추출된 메틸화 DNA는 하기 표 2와 같은 메틸화 및 비메틸화 특이 프라이머를 이용하여 PCR한 후, 아가로스젤을 이용하여 전기영동으로 확인하였다.
메틸화 및 비메틸화 특이 프라이머 서열
PCR 프라이머 서열(5'->3') 서열번호
메틸화 특이 프라이머 센스 ACAGGGCGTGTTAACGATATAA 서열번호 1
안티센스 CGCTGGTAGGAACGAGAGTC 서열번호 2
비메틸화 특이 프라이머
 센스 GTCGCCACACCAATTCGTTACTCA 서열번호 3
안티센스 AGATCCCTGACTGAATTGCGACGA 서열번호 4
<2-4> 표지된 DNA 제조
올리고마이크로어레이 분석을 위하여, 상기 <실시예 2-1>에서 수득한 PM2.5 노출군의 전체 DNA와 상기 <실시예 2-3>에서 수득한 메틸화 DNA에 하기와 같은 방법으로 형광 물질을 표지하였다.
전체 DNA는 Whole Genome Amplification(WGA) Kit(Sigma, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 증폭하였다. 증폭한 DNA와 4 ㎍의 메틸화 DNA를 Bioprime labeling kit(Invitrogen, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 표지하였다. 구체적으로, 50 ㎕의 master mix(dNTPs-dATP, dGTP, dCTP; 120 μM, dTTP; 60 μM, Cy5-dUTP 또는 Cy3-dUTP; 60 μM)를 사용하여, 메틸화 DNA는 Cy5-dUTP로, 전체 DNA는 Cy3-dUTP로 표지하였다. 표지한 DNA 샘플을 정제하고, 나노드롭 ND 1000 분광광도계(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 사용하여 농도를 측정하였다.
<2-5> 혼성화 반응
상기 <실시예 2-4>의 방법으로 형광 물질이 표지된 전체 DNA와 메틸화 DNA를 하기와 같은 방법으로 혼성화시켰다.
구체적으로, 정제과정을 거친 전체 DNA와 메틸화 DNA에 10x 블로킹 버퍼 및 2x 혼성화 버퍼(Agilent Technology, USA)를 넣고 혼합하였다. 상기 혼합물을 95℃에서 3분간 변성시키고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응물을 칩(chip)에 넣어, 65℃에서 40시간(2x formats) 동안 Agilent Hybridization 오븐에서 반응시킨 뒤, 제조사의 방법에 따라 세척하였다. 이때, 메틸화 DNA 마이크로어레이를 위한 칩으로는 Mouse CpG 2X105K 메틸화 마이크로어레이(Agilent, USA)를 이용하였다.
<2-6> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 에질런트 DNA 마이크로어레이 스캐너(Agilent technologies, USA)로 스캔하였으며, 추출된 데이터는 진스프링 GX 12.6(Agilent technology, USA)소프트웨어를 이용하여 정규화(normalization)하여, 메틸화 DNA의 발현양상을 분석하였다.
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 105,234개의 유전자 프로모터 부위를 포함하는 프로브 중에서 PM2.5 비노출군에 비해 PM2.5 노출군 그룹에서 유의하게 메틸화 변화가 3배 이상 증가 또는 감소한(p-value < 0.05) 프로모터 부위를 선별하였다. 상기 선별은 메틸화 양상 변이를 나타낸 유전자 프로브들에 대해 독립표본 t-검정(unpaired t-test)으로 확인하였다. 이들 중, 노출된 PM2.5의 농도별로 발현이 변화한 메틸화 유전자 프로모터 부위는 하기 표 3과 같다. 각각의 PM2.5 노출에 따른 유전자의 메틸화 양상을 살펴보면, 수용성 PM2.5는 저농도 처리군에서는 429개(과메틸화: 277개, 저메틸화: 152개), 고농도 처리군에서는 420개(과메틸화 297개, 저메틸화 123개)의 부위가 메틸화되었다. 또한, 수용성 PM2.5의 두 노출 농도에서 공통으로 발현이 변화된 메틸화 유전자 프로모터 부위 49개(과메틸화: 31개, 저메틸화: 18개)와 이에 해당하는 메틸화 유전자 48개를 선별하였다.
또한, 이들 유전자 중에서 라인-플롯 분석 방법을 이용하여 농도 의존적 메틸화 발현 양상을 보이는 유전자 21개를 선별하였다(표 4, 도 2 및 도 3).
유기성 PM2.5는 저농도 처리군에서는 966개(과메틸화: 522, 저메틸화: 414), 고농도 처리군에서는 404개(과메틸화: 246, 저메틸화: 158)의 부위가 메틸화되었다. 또한, 유기성 PM2.5의 두 노출 농도에서 공통으로 발현이 변화된 메틸화 유전자 프로모터 부위 65개(과메틸화; 36, 저메틸화: 29)와 이에 해당하는 유전자 65개를 선별하였다. 또한, 이들 유전자 중에서 라인-플롯 분석 방법을 이용하여 농도 의존적으로 메틸화 발현 양상을 보이는 유전자 30개를 선별하였다(표 5, 도 4 및 도 5).
상기 메틸화 유전자들은 PM2.5의 노출에 의한 독성과 관련되어 있다는 보고는 없다.
마우스 모델에서 PM2.5 노출에 의해 메틸화 양상이 변화된 프로브 및 유전자 수
저농도 고농도
메틸화된 부위 메틸화된 유전자 메틸화된 부위 메틸화된 유전자
수용성 PM2.5 429 409 420 406
유기성 PM2.5 966 911 406 388
수용성 PM2.5 노출에 의해 농도 의존적으로 메틸화 변화 양상을 보이는 유전자
등록번호 유전자명
 대조군 대비 메틸화 발현 변화 값 메틸화 정도
수용성-저농도 수용성-고농도
NM_172704 Dnajc11 0.220 0.156 저메틸화
NM_172762 Rbm34 0.059 0.036 저메틸화
NM_008408 Stt3a 0.330 0.204 저메틸화
NM_198614 C2cd4c 0.252 0.207 저메틸화
NM_028672 Fam161a 0.152 0.074 저메틸화
NM_028014 2310067B10Rik 0.221 0.209 저메틸화
NM_017270 Sec14l1 0.148 0.098 저메틸화
NM_016893 Timm9 0.079 0.078 저메틸화
NM_016893 Fut8 0.203 0.198 저메틸화
NM_177082 Sp8 0.213 0.186 저메틸화
NM_027290 Mcm10 3.626 3.693 과메틸화
NM_001123327 Qser1 3.259 3.394 과메틸화
NM_027491 Rragd 4.290 6.190 과메틸화
NM_017467 Zfp316 3.525 3.741 과메틸화
NM_010069 Doc2a 3.190 3.639 과메틸화
NR_001461 Kcnq1ot1 4.402 4.973 과메틸화
NM_008609 Mmp15 3.066 3.193 과메틸화
NM_001166416 Med23 3.321 6.847 과메틸화
NM_175128 4930430F08Rik 4.234 5.157 과메틸화
NM_145443 L2hgdh 3.579 5.242 과메틸화
NR_031761 Rmi1 3.853 3.910 과메틸화
유기성 PM2.5 노출에 의해 농도 의존적으로 메틸화 변화 양상을 보이는 유전자
등록번호
 유전자명 대조군 대비 메틸화 발현 변화 값 메틸화 정도
유기성-저농도 유기성-고농도
NM_001005425 Zfp663 0.294 0.242 저메틸화
NM_013885 Clic4 0.287 0.284 저메틸화
NM_030886 Ankrd17 0.147 0.105 저메틸화
NM_001035228 St3gal5 0.258 0.255 저메틸화
NM_009866 Cdh11 0.164 0.138 저메틸화
NM_001205157 Yipf2 0.315 0.300 저메틸화
NM_008548 Man1a 0.272 0.260 저메틸화
NM_001113548 Adamtsl5 0.158 0.067 저메틸화
NM_001168507 Tmem11 0.295 0.239 저메틸화
NM_02421 Slc25a11 0.282 0.228 저메틸화
AK041762 D130051D11Rik 0.332 0.287 저메틸화
NM_019980 Litaf 0.269 0.261 저메틸화
NM_152824 Rbm17 5.803 6.898 과메틸화
NM_001177366 Fut7 8.796 12.532 과메틸화
NM_028806 Phactr3 5.508 14.933 과메틸화
NM_001081320 Cyb561d1 12.435 12.837 과메틸화
NM_001163793 C530008M17Rik 4.315 5.959 과메틸화
NM_145997 Kdm5a 9.168 24.321 과메틸화
NM_008514 Lrp6 5.140 6.584 과메틸화
NM_001163590 Stx11 8.634 16.743 과메틸화
NM_001195268 Dos 3.870 4.832 과메틸화
NM_030083 Lsmd1 9.516 15.805 과메틸화
NM_199200 Fam171a2 11.821 16.094 과메틸화
NM_178682 4933426M11Rik 3.293 3.784 과메틸화
NM_001024602 AW555464 4.363 4.759 과메틸화
NM_021556 Mrps30 3.237 6.332 과메틸화
NM_027395 Basp1 4.857 12.813 과메틸화
NM_029253 Atf7ip2 5.328 5.718 과메틸화
NM_001204229 Clec16a 3.747 4.543 과메틸화
NM_172493 Diap2 4.512 7.120 과메틸화
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Methylation marker for identifying of exposure to particulate matter 2.5 and the identification method using thereof <130> 2016P-10-010 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylation specific primer sense <400> 1 acagggcgtg ttaacgatat aa 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylation specific primer antisense <400> 2 cgctggtagg aacgagagtc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unmethylation specific primer sense <400> 3 gtcgccacac caattcgtta ctca 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unmethylation specific primer antisense <400> 4 agatccctga ctgaattgcg acga 24

Claims (6)

  1. 하기 모든 유전자의 프로모터 서열 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지(PM2.5) 노출 여부 확인용 마이크로어레이 칩:
    GenBank 유전자 등록번호 NM_172704(Dnajc11, DnaJ heat shock protein family(Hsp40) member C11), GenBank 유전자 등록번호 NM_172762(Rbm34, RNA binding motif protein 34), GenBank 유전자 등록번호 NM_008408(Stt3a, subunit of the oligosaccharyltransferase complex, homolog A), GenBank 유전자 등록번호 NM_198614(C2cd4c, C2 calcium-dependent domain containing 4C), GenBank 유전자 등록번호 NM_028672(Fam161a, family with sequence similarity 161, member A), GenBank 유전자 등록번호 NM_028014(2310067B10Rik (Tmem94), transmembrane protein 94), GenBank 유전자 등록번호 NM_017270(Sec14l1, SEC14 like lipid binding 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_016893(Timm9, translocase of inner mitochondrial membrane 9), GenBank 유전자 등록번호 NM_016893(Fut8, fucosyltransferase 8), GenBank 유전자 등록번호 NM_177082(Sp8, trans-acting transcription factor 8), GenBank 유전자 등록번호 NM_027290(Mcm10, minichromosome maintenance 10 replication initiation factor), GenBank 유전자 등록번호 NM_001123327(Qser1, glutamine and serine rich 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_027491(Rragd, Ras related GTP binding D), GenBank 유전자 등록번호 NM_017467(Zfp316, zinc finger protein 316), GenBank 유전자 등록번호 NM_010069(Doc2a, double C2 domain alpha), GenBank 유전자 등록번호 NR_001461(Kcnq1ot1, KCNQ1 overlapping transcript 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_008609(Mmp15, matrix metallopeptidase 15), GenBank 유전자 등록번호 NM_001166416(Med23, mediator complex subunit 23), GenBank 유전자 등록번호 NM_175128(4930430F08Rik, RIKEN cDNA 4930430F08 gene), GenBank 유전자 등록번호 NM_145443(L2hgdh, L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase), GenBank 유전자 등록번호 NR_031761(Rmi1, RecQ mediated genome instability 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_001005425(Zfp663, zinc finger protein 663), GenBank 유전자 등록번호 NM_013885(Clic4, chloride intracellular channel 4), GenBank 유전자 등록번호 NM_030886(Ankrd17, ankyrin repeat domain 17), GenBank 유전자 등록번호 NM_001035228(St3gal5, ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 5), GenBank 유전자 등록번호 NM_009866(Cdh11, cadherin 11), GenBank 유전자 등록번호 NM_001205157(Yipf2, Yip1 domain family member 2), GenBank 유전자 등록번호 NM_008548(Man1a, mannosidase 1, alpha), GenBank 유전자 등록번호 NM_001113548(Adamtsl5, ADAMTS like 5), GenBank 유전자 등록번호 NM_001168507(Tmem11, transmembrane protein 11), GenBank 유전자 등록번호 NM_02421(Slc25a11, solute carrier family 25 member 11), GenBank 유전자 등록번호 AK041762(D130051D11Rik, RIKEN cDNA D130051D11 gene), GenBank 유전자 등록번호 NM_019980(Litaf, LPS-induced TN factor), GenBank 유전자 등록번호 NM_152824(Rbm17, RNA binding motif protein 17), GenBank 유전자 등록번호 NM_001177366(Fut7, fucosyltransferase 7), GenBank 유전자 등록번호 NM_028806(Phactr3, phosphatase and actin regulator 3), GenBank 유전자 등록번호 NM_001081320(Cyb561d1, cytochrome b561 family member D1), GenBank 유전자 등록번호 NM_001163793(C530008M17Rik, RIKEN cDNA C530008M17 gene), GenBank 유전자 등록번호 NM_145997(Kdm5a, lysine demethylase 5A), GenBank 유전자 등록번호 NM_008514(Lrp6, LDL receptor related protein 6), GenBank 유전자 등록번호 NM_001163590(Stx11, syntaxin 11), GenBank 유전자 등록번호 NM_001195268(Dos, voltage-dependent calcium channel beta subunit-associated regulatory protein), GenBank 유전자 등록번호 NM_030083(Lsmd1, LSM domain containing 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_199200(Fam171a2, family with sequence similarity 171 member A2), GenBank 유전자 등록번호 NM_178682(4933426M11Rik, sushi domain containing 6), GenBank 유전자 등록번호 NM_001024602(AW555464, centrosomal protein 170), GenBank 유전자 등록번호 NM_021556(Mrps30, mitochondrial ribosomal protein S30), GenBank 유전자 등록번호 NM_027395(Basp1, brain abundant, membrane attached signal protein 1), GenBank 유전자 등록번호 NM_029253(Atf7ip2, activating transcription factor 7 interacting protein 2), GenBank 유전자 등록번호 NM_001204229(Clec16a, C-type lectin domain family 16 member A) 및 GenBank 유전자 등록번호 NM_172493(Diap2, diaphanous related formin 2).
  2. 제1항의 마이크로어레이 칩을 포함하는 2.5 마이크로미터(㎛) 이하 미세먼지(PM2.5) 노출 여부 확인용 키트.
  3. 1) PM2.5에 노출된 실험군 및 PM2.5에 노출되지 않은 대조군으로부터 분리된 시료에서 전체 DNA를 분리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 분리된 전체 DNA에서 메틸화 DNA를 추출하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 메틸화 DNA를 형광물질로 표지하는 단계;
    4) 상기 단계 3)의 형광물질로 표지된 DNA를 제 1항의 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
    5) 상기 단계 4)의 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
    6) 상기 단계 5)에서 분석한 데이터에서 실험군의 마이크로어레이 칩의 메틸화 변화 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계;
    를 포함하는, PM2.5 노출 여부를 확인하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료는 마우스로부터 수득되는 폐조직인, PM2.5 노출 여부를 확인하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 단계 3)의 형광물질이 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, PM2.5 노출 여부를 확인하는 방법.
  6. 삭제
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