KR20110093129A

KR20110093129A - 잔류성 유기오염물질류 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법

Info

Publication number: KR20110093129A
Application number: KR1020100012980A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 김연정; 최한샘; 이지나; 송미; 송미경
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2010-02-11
Publication date: 2011-08-18
Also published as: KR101144199B1

Abstract

본 발명은 잔류성 유기오염물질류(Persistent Organic Pollutants)의 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 잔류성 유기오염물질류 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]에 의해 특이적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 잔류성 유기오염물질류 4종에 의해 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 환경 시료에서 잔류성 유기오염물질류 4종의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 잔류성 유기오염물질류 4종에 의해 특이적으로 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

잔류성 유기오염물질류 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법{Specific biomarker for identification of exposure to Persistent organic pollutants and the method of identification using the same}

본 발명은 잔류성 유기오염물질류(Persistent organic pollutants) 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 잔류성 유기오염물질류 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]에 의해 특이적으로 유전자 발현이 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 상기 잔류성 유기오염물질류 4종의 특이적 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

잔류성 유기오염 물질은 주요 오염 물질군 중 하나이다. 잔류성 유기 오염물질은 농작물의 병충해나 농작물에 해를 입히는 유해곤충을 죽이기 위해 주로 농약으로 사용되었다. 1997년에는 UNEP 집행이사회가 잔류성 유기오염물질(Persistent Organic Pollutants, POPs)에 대한 구속력 있는 국제규범을 만들기 위해 정부간 협상 위원회(Inter-Governmental Negotiating Committee)를 개최하였으며 독성과 환경잔류성이 커 넓은 지역에 걸쳐 장기간 인체 및 생태계에 큰 피해를 가져올 것으로 우려되는 12개 화학물질(Dirty Dozen)의 생산 금지 또는 배출 저감을 의무화하는 스톡홀름협약이 2001년 5월 23일에 채택되었다. 2004년 2월 17일에는 프랑스가 50번째로 비준서를 기탁함에 따라 발효요건이 충족되어 3개월 후인 2004년 5월 17일부터 발효되었다. 스톡홀름협약에서는 잔류성유기오염물질(POPs) 12종을 규제물질로 규정하고, 국제적 규모의 모니터링(Global Monitoring Program, GMP) 및 관리방안을 모색하고 있으며, 우리나라에서도 스톡홀름협약이 발효(2004.5.17)됨에 따라 당사국으로서(2007.01.25 가입) 협약 이행 및 효과평가를 위해 POPs 모니터링 체계를 구축하고 평가하는 등의 국가이행계획서(National Implementation Plan)를 2009년 4월 25일까지 UNEP에 제출할 계획이다.

POPs는 20세기 들어오면서부터 산업 발전의 가속화 및 합성 농약의 대량 사용 등에 의해 이미 지구 전역에 확산되어 있으며, DDT와 같은 농약은 국내에서 사용이 금지된 지 30년이 지났지만 아직도 토양 등의 환경 시료에서 검출되고 있을 정도로 잔류성이 크다. 일부 독성 및 잔류성이 큰 유해화학물질들은 환경에 배출된 후 분해되지 않고 대기 및 해류 등을 통해 장거리 이동되는 특성 때문에 전 세계를 돌아다니며 적당한 매체에 잔류한다. 이로 인해 북극 지역의 생물 및 주민들에게까지 사용사례가 없는 잔류성 유기오염물질이 검출되고 있는 것으로 보고되고 있다. 이와 같이 POPs는 환경 중 잔류성이 강하여 환경 중에 장기간 노출되며독성 또한 높고 생물학적 안정성 및 친 지질성으로 먹이 사슬을 통해 생물에 농축되고, 농축된 POPs는 암을 비롯한 신경계, 생식계, 성장 및 발육, 유전 등 인체에 해로운 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

또한, 잔류성 유기오염물질의 발암성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되고 있지만, 대부분 역학연구에 거의 국한되어 있다. 이처럼 잔류성 유기오염물질의 인간에 대한 발암 가능성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)또는 DNA 마이크로어레이 칩 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 유전자 발현여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 다이벤조에이에이취안트라센의 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어 지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., J. Am. Acad. Dermatol. 51:681-692, 2004).

유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3 및 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002). 최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯해 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 5천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 잔류성 유기오염물질류 4종의 유전자 발현 프로파일을 인간 간암 세포인 HepG2 세포주에서 관찰 및 분석하고 이를 본 발명자들이 수행한 다른 2가지 화학물질군 15종에 의한 유전자 발현 프로파일과 비교 분석하여 잔류성 유기오염물질류 4종에 의해서만 특이적으로 저발현되는 유전자를 발굴하여 잔류성 유기오염물질류만을 특이적으로 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 잔류성 유기오염물질류의 노출에 의해 특이적으로 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 잔류성 유기오염물질류 특이적 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잔류성 유기오염물질류 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]의 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 잔류성 유기오염물질류 4종에 대한 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 잔류성 유기오염물질류 4종의 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 잔류성 유기오염물질류 4종의 특이적 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 잔류성 유기오염물질류 4종의 특이적 노출 여부 확인용 검색 키트를 제공한다.

본 발명의 잔류성 유기오염물질류 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]의 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자를 바이오마커로 이용하여 잔류성 유기오염물질류 4종의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 잔류성 유기오염물질류 4종에 의해 야기되는 특이적인 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

도 1은 잔류성 유기오염물질 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]의 인간 간암 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다.
도 2는 마이크로 어레이 칩을 이용한 잔류성 유기오염물질 4종을 처리한 인간 간암 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과 중 특이적 발현을 보인 2종의 유전자를 나타내는 그림이다.
도 3은 마이크로어레이 칩을 이용한 총 19종의 화학물질 처리 후 상기 2종의 유전자 발현 양상을 총체적으로 분석한 결과를 나타내는 그림이다(그림 중 회색 부분은 칩에서 발현이 되지 않거나 유전자가 빠진 부분이다).
도 4는 잔류성 유기오염물질 4종에 의해서만 발현이 1.5배 이하로 감소하는 유전자인 LGALS9C, HIGD1B의 마이크로어레이 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 잔류성 유기오염물질류 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]의 노출에 의해 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 상기 잔류성 유기오염물질류 4종의 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

상기 바이오마커는 0.66배 이하로 발현이 감소한 유전자로써, 4만 5천여개의 유전자 중 하기 [표 1]의 다른 2가지 화학 물질군 15종에 의한 유전자발현 프로파일과 비교 분석시, 잔류성 유기오염물질류 4종에 의해서만 특이적으로 발현이 변화하는 2종의 유전자로 구성되어 있다.

2가지 화학 물질군 15종의 목록

	물질명
다환방향족탄화수소 (PAHs)	벤조에이피렌 (Benzo[a]pyrene)
	다이벤조에이에이취안트라센 (Dibenzo[a,h]anthracene)
	나프탈렌 (Naphthalene)
	페난트렌 (Phenanthrene)
	3-메틸콜란트렌 (3-methylcholanthrene)
	크라이센 (Chrysene)
	벤조에이안트라센 (Benzo[a]anthracene)
	벤조케이플루오란텐 (Benzo[k]fluoranthene)
	인데노[1,2,3-c,d]피렌 (Indeno[1,2,3-c,d]pyrene)
휘발성유기화합물 (VOCs)	벤젠 (Benzene)
	톨루엔 (Toluene)
	오르토-자일렌 (O-xylene)
	트리클로로에틸렌 (Trichloroethylene)
	디클로로메탄 (Dichloromethane)
	에틸벤젠 (Ethylbenzene)

본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다:

유전자 등록번호(Genebank) NM_001040078(LGALS9C, similar to galectin 9 short isoform) 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_016438(HIGD1B, HIG1 domain family, member 1B).

본 발명자들은 잔류성 유기오염물질류 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]의 특이적 노출 여부 확인용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 상기 잔류성 유기오염물질류 4종을 인간 간암 세포인 HepG2 세포주에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 잔류성 유기오염물질류 4종은 인간 간암 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 잔류성 유기오염물질류 4종의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 잔류성 유기오염물질류 4종을 인간 간암 세포주에 처리하고, 상기 물질을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 4 × 44 k 올리고마이크로어레이 칩 Human whole genome microarray(Agilent, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 1.5배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.66배 이하인 경우 발현 감소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 잔류성 유기오염물질 4종에서 공통적으로 발현 증가된 유전자는 0.00%(45,220개의 유전자 중 0개) 발현이 감소된 유전자는 0.02%(45,220개의 유전자 중 12개)임을 확인하였다. 이때, 다른 2가지 화학물질군 15종의 화학물질에 의한 유전자발현 프로파일과 비교 분석시 잔류성 유기오염물질류 4종에서만 특이적으로 발현이 감소한 유전자 2종을 선별하였다. 상기 유전자 HIGD1B는 기존의 다른 연구들에서 vinclozolin, Dietary Fats에 의한 생식독성과 관련 질병을 유발시키는데 관여한다는 보고는 있으나 아직 미미한 실정이며, 유전자 LGALS9C는 기존의 다른 연구들에서 보고된자가 전혀 없는 실정이며 본 발명에서 잔류성 유기오염물질 4종을 처리했을 때, 인간 간암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고 역시 밝혀진 바 없다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 집적된, 잔류성 유기오염물질 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex), 톡사펜(Toxaphene)] 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오마커 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.

본 발명의 잔류성 유기오염물질 4종의 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 잔류성 유기오염물질 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex), 톡사펜(Toxaphene)] 특이적 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 잔류성 유기오염물질 4종 특이적 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:

1) 인간 체세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;

4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;

5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 간암 세포인 HepG2 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 간세포 또는 인간 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 과발현 유전자(표 3)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 잔류성 유기오염물질 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex), 톡사펜(Toxaphene)]에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공한다:

1) 인간 체세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 RNA를 대상으로, 본 발명의 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 1)의 체세포는 인간 간암 세포인 HepG2 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 간 또는 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 유전자와 상보적이고, 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다.

또한, 본 발명은 잔류성 유기오염물질 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex), 톡사펜(Toxaphene)] 특이적 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 키트는 바이오마커 유전자의 프로브 세트(probe set) 또는 상기 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트(primer set)를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 프로브 세트는 마이크로어레이로 수행되는 것이 바람직하며, 상기 본 발명의 DNA 마이크로어레이칩을 포함하는 키트를 제작하여 수행하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 프라이머 세트는 PCR로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 키트는 추가적으로 인간 간세포를 포함할 수 있다. 상기 인간 간세포는 HepG2를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 간세포 또는 인간 간암의 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

본 발명의 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시-예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.

본 발명의 키트는 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리

<1-1> 세포배양

인간 간암 세포주인 HepG2 세포(한국 세포주 은행)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 100 ㎜ 디쉬(dish)에서 80% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 잔류성, 생체내 축적성, 발암성을 가지고 있는 잔류성 유기오염물질 4종을 선정하였으며, DMSO, 에탄올에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포 독성 실험(MTT assay) 및 화학 물질 처리

Mossman 등(J. Immunol. Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HepG2 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 4× 10⁵/웰 세포수로 DMEM 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 잔류성 유기오염물질 4종을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

HepG2 세포주에서 잔류성 유기오염물질 4종의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존율을 보이는 농도(IC₂₀)는 Chlordane, Hexachlorobenzene, Mirex, Toxaphene에서 각각 158.2, 80, 41.23, 238.33이었으며(도 1 참조), 상기 농도들로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

<실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> 표적 RNA의 분리 및 형광 물질 표지

6 × 10⁶ cell/㎖ 농도로 100 mm 디쉬에 HepG2 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정된 잔류성 유기오염물질 4종의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)와 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.

<2-2> 표지된 cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 잔류성 유기오염물질 4종 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 2와 같이 시약을 혼합하였다.

구성	부피(㎕)
5X first strand buffer	6
dNTPs	0.6
0.1 M DDT	3
SuperScript II enzyme	3
Cy-3 or Cy-5 dUTP	2

대조군인 HepG2 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)로 표지화하였고, 잔류성 유기오염물질 4종을 처리한 HepG2 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)로 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 44 k Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(2분간 2× SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1× SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.

<2-4> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 하여 얻어진 데이터로부터 잔류성 유기오염물질 4종에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2 참조).

그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 5천 여개의 유전자 중에서 잔류성 유기오염물질 4종에 의해 Cy5/Cy3의 비율이 1.5배 이상 공통적으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 0.00%(45,220개의 유전자 중 0개) 발현이 감소된 유전자는 0.02%(45,220개의 유전자 중 12개)임을 확인하였다.

이때, 다른 2가지 화학물질군 15종에 의한 유전자발현 프로파일과 비교 분석시(도 3 참조) 잔류성 유기오염물질 4종에서만 특이적으로 발현이 감소한 유전자 2종을 선별하였다 (도 4 참조). 상기 유전자는 본 발명에서 사용한 잔류성 유기오염물질 4종을 처리했을 때, 인간 간암 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

잔류성 유기오염물질 4종에 의해 특이적으로 발현이 변화하는 유전자

등록번호	유전자 약어	유전자명	중간값의 비
등록번호	유전자 약어	유전자명	Chlor- dane	Hexachlor- obenzene	Mirex	Toxa- phene
NM_001040078	LGALS9C	similar to galectin 9 short isoform	0.50	0.47	0.52	0.41
NM_016438	HIGD1B	HIG1 domain family, member 1	0.50	0.64	0.56	0.64

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 마이크로어레이 칩 또는 키트를 개발하여 잔류성 유기오염물질류 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex), 톡사펜(Toxaphene)]의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그 상보가닥 분자가 집적된 잔류성 유기오염물질 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)] 특이적 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이칩:
유전자 등록번호(Genebank) NM_001040078(LGALS9C, similar to galectin 9 short isoform) 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_016438(HIGD1B, HIG1 domain family, member 1B).
1) 실험군으로서 피검체 유래 인간 체세포와 대조군 체세포에서 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 5항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
4) 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
5) 분석한 데이터에서 상기 DNA 마이크로어레이칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 잔류성 유기오염물질 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]에 대한 노출 여부를 확인하는 방법.
제 2항에 있어서, 단계 1)의 인간 체세포는 인간 간세포 또는 인간 간암의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 인간 간암 세포는 HepG2인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 프로브 세트(probe set) 또는 상기 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트(primer set)를 포함하는 잔류성 유기오염물질 4종[클로로덴(Chlordane), 헥사클로로벤젠(Hexachlorobenzene), 미렉스(Mirex) 및 톡사펜(Toxaphene)]에 대한 노출 여부 확인용 키트:
유전자 등록번호(Genebank) NM_001040078(LGALS9C, similar to galectin 9 short isoform) 및 유전자 등록번호(Genebank) NM_016438(HIGD1B, HIG1 domain family, member 1B).
제 6항에 있어서, 상기 프로브 세트는 마이크로어레이로 수행되는 것을 특징으로 하는 키트.
제 6항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 PCR로 수행되는 것을 특징으로 하는 키트.
제 6항에 있어서, 인간 간세포 또는 간암 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.