KR101499094B1

KR101499094B1 - 휘발성 유기화합물 노출 여부 진단용 바이오마커

Info

Publication number: KR101499094B1
Application number: KR1020120087441A
Authority: KR
Inventors: 황승용; 오문주; 김승준; 안유리; 유소연; 김연정; 류재천; 송미경
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2015-03-06
Also published as: KR20140021280A

Abstract

휘발성 유기화합물 노출 여부 진단용 바이오마커이다.
본 발명에 따른 바이오마커는 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌 등 특정 휘발성 유기화합물에 대한 노출을 진단하는 효과가 있다. 그리하여 상기 바이오마커를 통해 저농도의 특정 휘발성 유기화합물에 노출된 후에도 이의 노출 여부를 직접 확인할 수 있다.

Description

휘발성 유기화합물 노출 여부 진단용 바이오마커{Biomarker for diagnosis of exposure to volatile organic compounds}

본 발명은 바이오마커에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 휘발성 유기화합물 노출 여부 진단용 바이오마커에 관한 것이다.

휘발성 유기화합물(Volatile Organic Compounds: VOCs)은 증기압이 높아 대기 중으로 쉽게 증발되는 액체 또는 기체상 유기화합물의 총칭으로, 대기 중에서 질소산화물과 공존하면 햇빛의 작용으로 광화학반응을 일으켜 오존 및 팬(PAN: 퍼옥시아세틸 나이트레이트) 등 광화학 산화성물질을 생성시켜 광화학스모그를 유발하는 물질을 통틀어 일컫는다. 대기오염물질이며 발암성을 지닌 독성 화학물질로서 광화학산화물의 전구물질이기도 하다. 또한 지구온난화의 원인물질이며 악취를 일으키기도 한다. 따라서, 국가마다 배출을 줄이기 위해 정책적으로 관리하고 있다.

또한, 휘발성 유기화합물은 피부접촉이나 호흡기 흡입을 통해 신경계에 장애를 일으키는 발암물질이다. 이들 휘발성 유기화합물은 대개의 경우 저농도에서도 악취를 유발하며, 화합물 자체로서도 환경 및 인체에 직접적으로 유해하거나 대기 중에서 광화학반응에 참여하여 광화학산화물 등 2차 오염물질을 생성하기도 한다.

이러한 휘발성 유기화합물 중 에틸벤젠(Ethylbenzene)은 석유화학산업에서 스타이렌을 생산하는데 중간물질로서 사용되는 중요한 방향족탄화수소이며, 톨루엔(Toluene)은 무색의 액체로서 석탄을 건류하여 얻은 경유를 황산으로 씻은 다음 정류하여 만들거나 메틸사이클로헥세인을 수소이탈하여 제조하며 유기합성화학에서 중요한 화합물이다. 또한 자일렌(Xylene)은 주로 인쇄, 고무, 가죽 산업에서 용매로 사용되는 화합물이다.

한편, 최근에는 빠른 산업화에 따른 환경오염이 심각해짐에 따라 극미량의 환경유해 물질의 위험성을 조기에 확인하고 분석할 수 있는 효과적인 분석 시스템이 필요하며, 특히 저 농도로 장기간 축적되는 형태의 환경유해물질노출에 의한 인간의 건강 피해 평가는 매우 중요한 환경기술로 대두되고 있다. 최근의 유해성 평가기술은 과거의 고용량으로 실험된 독성실험결과에 의존하기보다는 현실적인 생활환경에서의 인체노출 수준을 반영할 수 있는 저용량 노출영향규명에 초점을 두고, 저용량 노출에서의 유해 영향이 나타나지 않는 수준을 고려하여 관리기준을 설정하는 방법을 개발할 필요성이 부각되고 있다.

이러한 방법의 개발에는 바이오마커를 개발하는 일이 선행되어야 한다. 하지만, 현재 저농도의 휘발성 유기화합물 노출 여부를 효과적으로 진단할 수 있는 바이오마커의 개발이 미흡한 현실에 처해 문제가 있다.

또한 진핵생물의 유전자 발현 조절에 중요한 역할을 담당하고 있는 마이크로 RNA(microRNA)와 암발생 조절에 중요하게 관련되는 메틸레이션 DNA(methylation DNA)를 바이오마커로 활용하고자 하는 노력은 현재 많이 부족한 문제점이 있다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 휘발성 유기화합물에 대한 노출 여부를 진단하는 바이오마커를 제공하는 것이다. 또한 상기 바이오마커를 활용하여 휘발성 유기화합물에 대한 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 바이오마커는 서열번호1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 이들 각각의 상보적 염기서열을 포함하는 에틸벤젠에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커이다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 바이오마커는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 이들 각각의 상보적 염기서열을 포함하는 톨루엔에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커이다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 바이오마커는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 이들 각각의 상보적 염기서열을 포함하는 자일렌에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커이다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 유전자 발현의 증가 또는 감소를 확인하는 방법은 1) 실험군 및 대조군의 혈액으로부터 마이크로 RNA를 추출하는 단계와, 2) 상기 단계 1)에 따른 실험군 및 대조군의 마이크로 RNA를 상보적 염기서열의 cDNA로 합성하는 단계와, 3)상기 단계 2)의 cDNA를 PCR을 통해 증폭시키는 단계, 및 4) 상기 단계 3)의 증폭된 산물을 증폭 전후로 비교 분석하여 상기 바이오마커를 확인하는 단계를 포함하는 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 물질에 대한 유전자 발현의 증가 또는 감소를 확인하는 방법이다.

또한 상기 바이오마커는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 바이오마커인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 유전자의 메틸레이션 여부를 확인하는 방법은 1) 실험군 및 대조군의 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계와, 2) 상기 단계 1)의 DNA를 메틸레이션 여부 확인용 프라이머를 이용해 PCR을 수행하는 단계, 및 3) 상기 단계 2)의 PCR 결과를 통해 메틸레이션 여부를 비교 분석하여 상기 바이오마커를 확인하는 단계를 포함하는 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 물질에 대한 유전자의 메틸레이션 여부를 확인하는 방법이다.

또한 상기 바이오마커는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 바이오마커인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 바이오마커는 특정 휘발성 유기화합물에 대한 노출을 진단하는 효과가 있다. 그리하여 상기 바이오마커를 통해 저농도의 특정 휘발성 유기화합물에 노출된 후에도 이의 노출 여부를 직접 확인할 수 있다.

도 1은 휘발성 유기화합물에 노출된 후 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 5에 따른 마이크로 RNA 바이오마커의 유전자 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 휘발성 유기화합물에 노출된 후 본 발명에 따른 서열번호 6에 따른 메틸레이션 DNA 바이오마커의 유전자 발현 변화를 밴드로 나타낸 아가로스 젤 사진이다.
도 3는 휘발성 유기화합물에 노출된 후 본 발명에 따른 서열번호 7에 따른 메틸레이션 DNA 바이오마커의 유전자 발현 변화를 밴드로 나타낸 아가로스 젤 사진이다.
도 4는 휘발성 유기화합물에 노출된 후 본 발명에 따른 서열번호 8에 따른 메틸레이션 DNA 바이오마커의 유전자 발현 변화를 밴드로 나타낸 아가로스 젤 사진이다.
도 5는 휘발성 유기화합물에 노출된 후 본 발명에 따른 서열번호 9에 따른 메틸레이션 DNA 바이오마커의 유전자 발현 변화를 밴드로 나타낸 아가로스 젤 사진이다.
도 6은 휘발성 유기화합물에 노출된 후 본 발명에 따른 서열번호 10에 따른 메틸레이션 DNA 바이오마커의 유전자 발현 변화를 밴드로 나타낸 아가로스 젤 사진이다.

이에 본 발명자들은 특정 휘발성 유기화합물에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 바이오마커를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

구체적으로 본 발명에 따른 바이오마커는 바람직하게는 하기 서열번호 1 내지 서열번호 10 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 포함할 수 있으며, 특정 휘발성 유기화합물에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

서열번호 1: AGTAGTGCTTTCTACTTTA

서열번호 2: TCAGTTTTGCATAGATTTGCA

서열번호 3; TCAGCCGCTGTCACAC

서열번호 4: TTGCCCTCTCAACCC

서열번호 5: TTCAAAACATGAATTGCTGCTG

서열번호 6: TCGGTGTTTATAGGTGTTGGC

서열번호 7: TTTAGGAGACGTTTATGAGTTTGC

서열번호 8: TTTGTTAGTTAGGGTTTGGGTTTC

서열번호 9: TTGAGATTAGTTTGGTTAATATGGC

서열번호 10: TAAGTGTTTAGTTGGGAGAGTTGTAAC

일반적으로 마이크로 RNA는 진핵세포의 유전자 발현을 조절하는데 있어 중요하며, 메틸레이션 DNA는 시토신의 탄소원자에 CH3가 붙은 DNA로서 암발현 유전자의 발현 조절 및 억제에 있어 중요하다.

한편 상기 서열번호 1 내지 서열번호 5의 염기서열은 바람직하게는 마이크로 RNA의 염기서열일 수 있고, 상기 서열번호 6 내지 서열번호 10의 염기서열은 바람직하게는 메틸레이션 DNA의 염기서열일 수 있다.

또한 상기 서열번호 6 내지 서열번호 10의 염기서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 진행함에 있어서 5’ 말단에서 3’ 말단 방향으로 향하는 것이며, 상기 염기서열에 상보적인 염기서열이 이중결합할 수 있다.

또한 상기 특정 휘발성 유기화합물은 바람직하게는 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 물질일 수 있다.

특히 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 바이오마커는 바람직하게는 에틸벤젠에 대하여 상기 유전자의 발현량이 변화하므로, 에틸벤젠에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 바이오마커는 바람직하게는 톨루엔에 대하여 상기 유전자의 발현량이 변화하므로 톨루엔에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 바이오마커는 바람직하게는 자일렌에 대하여 상기 유전자의 발현량이 변화하므로, 자일렌에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 더욱 구체적으로는 상기 서열번호 1의 염기서열은 마이크로 RNA의 염기서열을 갖는 바이오마커로서, 에틸벤젠, 자일렌 및 톨루엔에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 감소하므로, 에틸벤젠, 자일렌 및 톨루엔에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 2의 염기서열은 마이크로 RNA의 염기서열을 갖는 바이오마커로서, 에틸벤젠, 자일렌 및 톨루엔에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 감소하므로, 에틸벤젠, 자일렌 및 톨루엔에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 3의 염기서열은 마이크로 RNA의 염기서열을 갖는 바이오마커로서 톨루엔에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 증가하므로, 톨루엔에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 4의 염기서열은 마이크로 RNA의 염기서열을 갖는 바이오마커로서, 자일렌에 대한 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 증가하므로, 자일렌에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 5의 염기서열은 마이크로 RNA의 염기서열을 갖는 바이오마커로서, 에틸벤젠에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 감소하므로, 에틸벤젠에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 6의 염기서열을 갖는 바이오마커는 메틸레이션 DNA인 바이오마커로서, 자일렌에 대한 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 변화하므로, 자일렌에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 7의 염기서열을 갖는 바이오마커는 메틸레이션 DNA인 바이오마커로서, 톨루엔에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 변화하므로, 톨루엔에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 7의 염기서열을 갖는 바이오마커는 메틸레이션 DNA인 바이오마커로서, 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 변화하므로, 톨루엔에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 8의 염기서열을 갖는 바이오마커는 메틸레이션 DNA인 바이오마커로서, 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 변화하므로, 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 9의 염기서열을 갖는 바이오마커는 메틸레이션 DNA인 바이오마커로서, 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 변화하므로, 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

또한 상기 서열번호 10의 염기서열을 갖는 바이오마커는 메틸레이션 DNA인 바이오마커로서, 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 노출시 유전자의 발현량이 유의하게 변화하므로, 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 일 수 있다.

상기 에틸벤젠(Ethylbenzene)은 석유화학산업에서 스타이렌을 생산하는데 중간물질로서 사용되는 중요한 방향족탄화수소이며, 톨루엔(Toluene)은 무색의 액체로서 석탄을 건류하여 얻은 경유를 황산으로 씻은 다음 정류하여 만들거나 메틸사이클로헥세인을 수소이탈하여 제조하며 유기합성화학에서 중요한 화합물이다.

또한 자일렌(Xylene)은 주로 인쇄, 고무, 가죽 산업에서 용매로 사용되는 화합물이다. 이러한 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌은 소량으로 인체에 축적되더라도 유해한 효과를 내는 물질로 잘 알려져 있다.

상기 바이오마커는 염기서열의 개수 및 형태에 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 10 내지 50 bp, 더욱 바람직하게는 15 내지 30 bp 일 수 있다. 또한 본 발명의 바이오마커는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열뿐 만 아니라 바람직하게는 상기 바이오마커 전체 염기서열을 포함하여 추가될 수 있으며, 그 염기서열의 숫자는 제한이 없으나, 상기 추가된 염기서열을 포함한 전체 bp는 바람직하게는 100 내지 300 bp일 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징으로서 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 물질에 노출된 후 유전자 발현의 증가 또는 감소를 확인하는 방법은 1) 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 물질에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군)의 혈액 및 대조군의 혈액으로부터 전체 RNA(Total RNA)를 추출하는 단계와, 2) 상기 단계 1)에 따른 실험군 및 대조군의 전체 RNA로부터 상기 바이오마커에 대하여 상보적 염기서열의 cDNA 를 합성하는 단계와, 3) 상기 단계 2)의 cDNA를 PCR을 통해 증폭시키는 단계, 및 4)상기 단계 3)의 증폭된 산물을 증폭 전후로 비교 분석하여 상기 바이오마커를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 바이오마커는 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 바이오마커 일 수 있다.

상기 혈액의 수득 방법은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 실험군의 혈액 수득 방법은 바람직하게는 상기 휘발성 유기화합물을 취급하는 근로 현장 등에서 수득 된 것일 수 있다.

상기 RNA를 cDNA 로의 합성은 당업계에 적용되는 공지의 모든 방법에 의해 합성될 수 있으며, 바람직하게는 역전사효소에 의해 합성 될 수 있다.

상기 PCR의 조건은 상기 cDNA 를 효과적으로 증폭할 수 있는 범위 이내라면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 적용되는 PCR의 조건이 모두 포함될 수 있으나, 바람직하게는 정량적 분석을 위해 실시간 RT-PCR인 것이 바람직하다.

상기 분석은 당업계에 적용되는 모든 유전자 분석 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 당업계에 알려진 분석 소프트웨어를 사용할 수 있다.

상기 바이오마커를 확인하는 단계는 바람직하게는 상기 PCR에 의해 증폭된 산물의 증폭 전후를 비교하여 유전자의 발현량이 유의하게 변화한 내용을 가지고 상기 바이오마커를 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징으로서 바람직하게는 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 물질에 대한 유전자의 메틸레이션 여부를 확인하는 방법은 1) 바람직하게는 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 물질에 대한 노출이 의심되는 개체(실험군)의 혈액 및 대조군의 혈액으로부터 DNA를 추출하는 단계와, 2) 상기 단계 1)의 DNA를 메틸레이션 여부 확인용 프라이머를 이용해 PCR을 수행하는 단계, 및 3)상기 단계 2)의 PCR 결과를 통해 메틸레이션 여부를 비교 분석하여 상기 바이오마커를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 바이오마커는 바람직하게는 상기 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 바이오마커일 수 있다.

상기 PCR의 조건은 상기 DNA 를 효과적으로 증폭할 수 있는 범위 이내라면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 적용되는 PCR의 조건이 모두 포함될 수 있으나, 바람직하게는 메틸레이션 특이 PCR(MSP, Methylation specific PCR)일 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

< 실시예 1: 특정 휘발성 유기화합물에 특이하게 발현하는 마이크로 RNA바이오마커 확인>

(1) cDNA 제작

에틸벤젠, 톨루엔 또는 자일렌의 휘발성 유기화합물을 취급하고 있으며, 이에 각각 노출된 공장 등 산업현장의 근로자들로부터 혈액을 채취하였다. 그리고 각 노출된 물질별로 샘플을 구분하였다. 그리고 각 샘플의 전체 RNA(Total RNA)를 추출하였다. 추출된 토탈 RNA는 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (ABI, Applied Biosystems, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 실험과정은 100mM dNTPs 0.15 ul, Multi Reverse Transcriptase 1ul (50U/ul), 10X buffer 1.5 ul, RNase Inhibitor 0.19 ul, Nuclase-free water 4.16 ul를 섞어서 Maser mix를 제조하였다. 제조한 master mix 7ul 에 primer 3ul, Total RNA 5ul를 첨가하여 얼음에 5분간 방치하여 둔 후, 16℃에서 30분, 42℃ 30분간 cDNA를 합성한 후, 85℃에서 5분간 반응하여 cDNA합성을 종료 시켰다. 이러한 cDNA 합성 조건을 하기 표 1에 나타냈다.

(2) 실시간 RT - PCR 의 수행

전 단계에서 합성한 cDNA와 주문 제작한 태크맨 프로브(Taqman probe)를 사용하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 이러한 실시간 RT-PCR의 수행을 수행한 이유는 발현되는 유전자를 정량적으로 분석하기 위함이다. 이의 구체적인 조건은 하기 표 2에 나타냈다.

이러한 실시간 RT-PCR을 수행한 후 상기 휘발성 유기화합물인 에틸벤젠, 톨루엔 또는 자일렌을 처리함에 따라 유전자의 발현이 변화하는 5개의 마이크로RNA를 확인하였다. 이러한 5개의 마이크로RNA는 각각 miR-142-5p, miR-19a, miR-210, miR-320b, miR-424-5p라고 명명하였다. 또한 각각의 유전자 발현 양상을 측정한 결과는 하기 도 1에 나타냈다.

상기 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 miR-142-5p의 유전자 발현 양상은 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌 모두에서 그 발현 양상이 변화하며, 특히 세가지 휘발성 유기화합물 모두에 노출되면 그 발현양이 감소하는 것임을 확인할 수 있었다. 또한 miR-19a의 경우에도 세가지 휘발성 유기화합물에 모두 유전자의 발현량이 감소하는 것으로 확인되었다. 또한 miR-210의 경우에는 톨루엔의 노출시 그 발현양이 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 miR-320b의 경우에는 자일렌의 노출시 그 발현양이 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 miR-424-5p의 경우에는 에틸벤젠에 노출시 그 발현양이 감소하는 것으로 확인되었다. 그러므로 miR-142-5p과 miR-19a의 경우에는 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 대한 바이오마커로서 활용 가능함을 확인하였으며, miR-210의 경우에는 톨루엔에 대한 바이오마커로서 활용가능함을 확인하였다. 또한, miR-320b의 경우에는 자일렌에 대한 바이오마커로서 활용가능함을 확인하였고, miR-424-5p의 경우에는 에틸벤젠에 대하여 바이오마커로서 활용가능함을 확인하였다.

이러한 각각의 마이크로 RNA는 본원출원에서, miR-142-5p는 서열번호 1로 표시되며, miR-19a는 서열번호 2로 표시되며, miR-210는 서열번호 3으로 표시되며, miR-320b는 서열번호 4로 표시되며, miR-424-5p는 서열번호 5로 표시된다.

< 실시예 2: 특정 휘발성 유기화합물에 특이하게 발현하는 메틸레이션 DNA바이오마커 확인>

(1) DNA 컨버젼( conversion )

에틸 벤젠, 톨루엔 또는 자일렌에 노출된 각각의 혈액 샘플에서 추출한 DNA는 EpiTect Bisulfite conversion Kit (Qiagen, USA)를 사용하여 bisulfite conversion 및 cleanup을 수행하였다. DNA 20 ul (1 ug), bisulfite mix 85 ul, DNA protect buffer 35 ul를 섞어 mixture 140 ul를 만들어 95℃ 5분, 60℃ 25분, 95℃ 5분, 60℃ 85분, 95℃ 5분, 60℃ 175분(Denaturation과 Incubation의 반복) 반응하여 컨버젼(conversion)을 종료하고 컬럼을 사용하여 클린업(cleanup) 하였다.

(2) 메틸레이션 특이 PCR ( MSP , Methylation Specific PCR )의 수행

전 단계에서 준비된 컨버젼(conversion) DNA와 주문 제작한 프라이머를 사용하여 메틸레이션 특이 PCR을 수행하였다. 각 프라이머 마다 annealing 온도가 달라 다른 조건은 동일하되, 프라이머 간 annealing 온도만을 변화시켜주며 PCR을 진행하였다. 본 PCR의 조건을 하기 표 3에 나타냈다.

본 PCR 결과 에틸벤젠, 톨루엔 또는 자일렌과 같은 휘발성 유기화합물에 노출된 후 그 발현 양상이 변화하는 5가지의 메틸레이션 DNA를 확인하였다. 이는 각각 FAM173A(family with sequence similarity 173, member A), HSPB7(heat shock 27kDa protein family, member 7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier), MYADM (myeloid-associated differentiation marker), ZC3H3(zinc finger CCCH-type containing 3)로 명명하였다. 그리고 이러한 PCR의 결과는 하기 도 2 내지 도 6에 나타냈다.

상기 도 2 내지 도 6에서 M size는 메틸레이션 DNA의 사이즈를 말하며, U size는 메틸레이션 되지 않은 DNA(unmethylation DNA)의 사이즈를 의미한다. 즉, M은 메틸레이션 DNA를 의미하며, U는 메틸레이션 되지 않은 DNA(unmethylation DNA)를 의미한다. 또한 도 2 내지 도 6에서 ‘con’ 및 ‘Ctrl’은 ‘control’의 약어로서 어떠한 휘발성 유기화합물도 처리 하지 않은 혈액 샘플의 대조군을 의미한다. 이러한 PCR의 결과는 DNA 아가로스 젤 상에서 전기영동을 하여 나타나는 밴드의 두께를 비교하여 확인하였다.

상기 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 FAM173A는 자일렌에 노출된 메티레이션 DNA의 경우 그 두께가 대조군에 비해 가늘어지며 흐릿해짐을 확인할 수 있어 그 발현 양상이 변화함을 확인할 수 있다. 또한 대조군 대비 실험군의 시료에서 메틸레이션의 활성이 어느 정도인지를 메틸레이션 마이크로어레이 결과를 바탕으로 계산하였다. 그리하여 그 측정값이 대조군의 경우 25%를 보이지만, 자일렌에 노출된 메틸레이션 DNA 경우 100%의 측정값을 나타내 유의한 변화를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

또한 상기 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 HSPB7의 경우 톨루엔에 노출시 대조군에 비해 그 밴드 두께가 두꺼워짐을 확인하였다. 또한 대조군 대비 실험군의 시료에서 메틸레이션의 활성이 어느 정도인지를 메틸레이션 마이크로어레이 결과를 바탕으로 계산하였다. 그리하여 그 측정값이 대조군의 경우 100%를 보이지만, 톨루엔에 노출된 메틸레이션 DNA의 경우 90%의 측정값을 나타내 유의한 변화를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

또한 상기 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 ISG15의 경우 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 노출된 경우 모두에 있어서 대조군과 비교하여 그 밴드 두께가 달라짐을 확인할 수 있었다. 또한 대조군 대비 실험군의 시료에서 메틸레이션의 활성이 어느 정도인지를 메틸레이션 마이크로어레이 결과를 바탕으로 계산하였다. 그리하여 그 측정값이 대조군의 경우 83.33333%를 보임에 반하여, 에틸벤젠에 노출된 메틸레이션 DNA의 경우 14.28571%의 측정값을 나타내며, 톨루엔에 노출된 경우는 60%의 측정값을 나타내고, 자일렌에 노출된 경우는 36.36364%를 나타내 각각 유의한 변화를 보임을 확인할 수 있었다.

또한 상기 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 MYADM의 경우도 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 노출된 경우 모두에 있어서 대조군과 비교하여 그 밴드 두께가 달라짐을 확인할 수 있었다. 또한 대조군 대비 실험군의 시료에서 메틸레이션의 활성이 어느 정도인지를 메틸레이션 마이크로어레이 결과를 바탕으로 계산하였다. 그리하여 그 측정값은 대조군의 경우 75%를 보임에 반하여, 에틸벤젠에 노출된 메틸레이션 DNA의 경우 14.28571%의 측정값을 나타내며, 톨루엔에 노출된 경우는 50%의 측정값을 나타내고, 자일렌에 노출된 경우는 18.18182%를 나타내 각각 유의한 변화를 보임을 확인할 수 있었다.

또한 상기 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 ZC3H3의 경우도 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌에 노출된 경우 모두에 있어서 대조군과 비교하여 그 밴드 두께가 달라짐을 확인할 수 있었다. 또한 대조군 대비 실험군의 시료에서 메틸레이션의 활성이 어느 정도인지를 메틸레이션 마이크로어레이 결과를 바탕으로 계산하였다. 그리하여 그 측정값은 대조군의 경우 100%를 보임에 반하여, 에틸벤젠에 노출된 메틸레이션 DNA의 경우 14.28571%의 측정값을 나타내며, 톨루엔에 노출된 경우는 30%의 측정값을 나타내고, 자일렌에 노출된 경우는 18.18182%를 나타내 각각 유의한 변화를 보임을 확인할 수 있었다.

그러므로 이러한 결과로 보아, FAM173A는 자일렌에 노출 여부를 진단할 수 있는 바이오마커로 활용 가능함을 확인하였고, HSPB7의 경우는 톨루엔에 노출 여부를 진단할 수 있는 바이오마커로 활용 가능함을 확인하였다. 또한 ISG15, MYADM, ZC3H3는 에틸벤젠, 톨루엔 및 자일렌 모두에 대한 노출 여부를 진단할 수 있는 바이오마커로 활용 가능함을 확인하였다.

그리하여 바이오마커로 활용할 수 있는 상기 각각의 메틸레이션 DNA는 진뱅크(Genebank)에 등록하여 등록번호를 부여받았다. 그 등록번호는 각각 FAM173A는 NM_023933.1를, HSPB7는 NM_014424.4를, ISG15는 NM_005101.3를, MYADM는 NM_001020818.1를, ZC3H3는 NM_015117.2이다.

이러한 각각의 마이크로 RNA는 본원출원에서, FAM173A(family with sequence similarity 173, member A)는 5’에서 3’방향의 염기서열이 서열번호 6으로 표시되며, HSPB7(heat shock 27kDa protein family, member 7)는 5’에서 3’방향의 염기서열이 서열번호 7로 표시되며, ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier)는 5’에서 3’방향의 염기서열이 서열번호 8로 표시되며, MYADM (myeloid-associated differentiation marker)는 5’에서 3’방향의 염기서열이 서열번호 9로 표시되며, ZC3H3(zinc finger CCCH-type containing 3)는 5’에서 3’방향의 염기서열이 서열번호 10으로 표시된다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Biomarker for diagnosis of exposure to volatile organic compounds <130> HPC3424 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Human <400> 1 agtagtgctt tctacttta 19 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Human <400> 2 tcagttttgc atagatttgc a 21 <210> 3 <211> 16 <212> RNA <213> Human <400> 3 tcagccgctg tcacac 16 <210> 4 <211> 15 <212> RNA <213> Human <400> 4 ttgccctctc aaccc 15 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Human <400> 5 ttcaaaacat gaattgctgc tg 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Human <400> 6 tcggtgttta taggtgttgg c 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Human <400> 7 tttaggagac gtttatgagt ttgc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Human <400> 8 tttgttagtt agggtttggg tttc 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Human <400> 9 ttgagattag tttggttaat atggc 25 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Human <400> 10 taagtgttta gttgggagag ttgtaac 27

Claims

서열번호 5로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적 염기서열인 것을 특징으로 하는 에틸벤젠에 대한 노출 여부 진단용 바이오마커 조성물.
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1) 실험군 및 대조군의 혈액으로부터 전체 RNA(Total RNA)를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에 따른 실험군 및 대조군의 전체 RNA로부터 서열번호 5인 것을 특징으로 하는 바이오마커에 대하여 상보적 염기서열을 갖는 cDNA를 합성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 cDNA를 PCR을 통해 증폭시키는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 증폭된 산물을 증폭 전후로 비교 분석하여 서열번호 5인 것을 특징으로 하는 바이오마커를 확인하는 단계;
를 포함하는 에틸벤젠에 대한 유전자 발현의 증가 또는 감소를 확인하는 방법.
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