KR100735731B1

KR100735731B1 - 별늑대거미의 분자지표를 이용한 지표환경 내 중금속 오염평가방법

Info

Publication number: KR100735731B1
Application number: KR1020050066516A
Authority: KR
Inventors: 이시혁; 정찬식
Original assignee: 이시혁; 정찬식
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2005-07-22
Publication date: 2007-07-06
Also published as: KR20070011880A

Abstract

본 발명은 지표생물의 분자지표를 이용하여 지표환경 내 중금속오염을 평가하는 방법에 관한 것으로, 특히 별늑대거미(Pardosa astrigera)의 유전자 발현량 분석을 통한 지표환경 내 중금속 오염 평가방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, 대한민국의 대표적인 지표절지동물인 별늑대거미를 대상으로 COI (cytochrome c oxidase subunit 1); CdTA (Cd transporting ATPase); CTA (cation transporting ATPase) 3 종의 유전자의 상대적인 발현량을 전사체 수준에서 비교·분석하여 지표환경 내 중금속 오염을 평가한다. 본 발명에서는 별늑대거미의 3 종의 유전자군의 발현양상을 통해 중금속 노출 영향을 다양한 측면에서 평가함으로써 중금속 노출의 진행과정을 보다 정확하게 유추하여 중금속 노출은 물론 중금속이 생태계에 미치는 전반적인 영향을 효율적으로 모니터링할 수 있으며, 비교적 간단한 실험 방법과 저렴한 경비로 정확한 분석을 실시할 수 있다.

별늑대거미, 중금속 노출 분자지표, Cytochrome c oxidase subuint 1, COI, putative Cd transporting ATPase, CdTA, cation transporting ATPase, CTA, 실시간 정량 PCR

Description

별늑대거미의 분자지표를 이용한 지표환경 내 중금속 오염 평가방법 {Analysis system on molecular biomarkers of Pardosa astrigera for the effect of heavy metal exposure}

도 1은 중금속 실내노출군을 대상으로 본 발명의 분자지표를 분석한 결과이다.

도 2는 실제 야외에서 채집한 별늑대거미를 대상으로 분자지표 유전자의 발현량을 분석한 결과이다.

본 발명은 지표생물의 분자지표를 이용하여 지표환경 내 중금속오염을 평가하는 방법에 관한 것으로, 특히 별늑대거미(Pardosa astrigera)의 유전자 발현량 분석을 통한 지표환경 내 중금속 오염 평가방법에 관한 것이다.

종래 가장 널리 선호되고 있는 기술인 지표생물 및 생태환경 중금속함량 분석법의 경우(Gijs Du laing et al., The science of the Total Environment 289 (2002) 71-81), 각 대상의 중금속함량은 정확히 분석할 수 있으나, 이러한 결과로부터 중금속의 생체 축적양상 및 포화수준과 생태환경 내 중금속 노출의 정도와 기 간 간의 관계를 유추하는 것은 많은 문제점을 갖고 있고, 실제로 많은 오류가 있는 것으로 평가되고 있다. 또, 중금속 함량분석에 필요한 ICP-ES가 고가로 연구 수행 기관의 자체 보유가 어려워 사용시 고가의 이용료를 지불해야 하는 경제적인 부담도 있었다.

또, 이미 중금속 결합 단백질인 MT (metallothionein), 무독화효소 등 분자수준의 지표가 개발되어 있으나, 새로운 지표생물종에서는 낮은 진화적 보전성 때문에 유사지표의 동정이 매우 어려워 이들을 활용한 생태영향평가에 많은 제약이 있어 왔다. 또한, MT나 무독화효소, hsp 등 종래에 제시된 분자지표들의 경우 실제 적용될 경우 중금속에 대한 특이성 및 선택성에 대한 문제가 계속 제기되고 있고, 분석과 진단의 신뢰성 확보가 어려운 경우가 상당수 발견되고 있다.

Ingrid Sterenborg 등은 톡토기목에 속하는 곤충의 mRNA 수준에서 중금속 결합단백질인 MT (metallothionein)의 발현 수준을 비교하고 있다 (Insect Biochemistry and Molecular Biology 33 (2003) 741-747). 그러나 이 방법은 MT 유전자가 이미 동정된 이후에 유용한 방법이며, 노던블로팅(Northern Blotting) 방법으로 정량분석을 하고 있는데 민감도가 떨어지고 주관적인 해석이 개입될 소지가 있다는 문제점을 갖고 있다.

Miren P. Cajaraville 등은 일부 생체지표(biomarker)를 실제로 해변 생태계의 오염도를 진단하는데 적용시키고 있다 (The science of the Total Environment 247 (2000) 295-311). 그러나 사용된 대부분의 지표들이 비특이적인 자극에도 반응하고, 또 반응의 경향도 일정하지 않아 해석에 난해함이 있다는 지적을 받고 있 다.

본 발명에서는 우리나라의 대표적인 지표절지동물인 별늑대거미(Pardosa astrigera)의 유전자의 발현양상만으로 중금속 노출의 수준을 비롯하여 중금속 오염의 진행 상황 및 현재 생태환경의 생물학적 건강상태를 모니터링할 수 있는 지표환경 내 중금속 오염 평가방법을 제공하고자 한다.

이를 위해 본 발명에서는 지표생물종인 별늑대거미의 총단백질을 대상으로 단백질체학적 방법론에 입각하여 중금속에 특이적으로 반응하는 단백질만을 선발하여 중금속에 의한 노출 영향을 보다 정확하고 신속하게 평가할 수 있는 새로운 분자지표와 그 활용법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 분자지표와 이를 활용한 지표환경 내 중금속 오염 평가방법은 종래 중금속 함량 분석방법의 한계를 극복하고 중금속 노출 수준은 물론 중금속 오염의 진행 상황 및 생태환경의 생물학적 건강상태를 전반적으로 모니터링할 수 있다는 특징을 갖는다.

기타 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시에 의해 더 잘 알게 될 것이다.

본 발명에서는,

지표생물의 분자지표를 이용하여 지표환경 내 중금속오염 수준을 평가하는 방법에 있어서, COI (cytochrome c oxidase subunit 1); CdTA (Cd transporting ATPase); CTA (cation transporting ATPase) 중에서 선택된 하나 이상의 별늑대거미의 유전자를 분자지표로 사용하는 것을 특징으로 하는 중금속 오염 평가방법이 제공된다.
본 발명에서 "발현량"이라 함은 목적유전자 (COI, CdTA, CTA)가 RNA로 전사되는 수준을 의미하며, "상대적인 발현량"이란 목적유전자의 발현량을 내재대조유전자의 발현량과 비교한 것으로 본 발명에서는 "△△Ct법"을 사용하여 비교분석하였다.

본 발명에서 분자지표로 사용되는 유전자군은 2D 단백질체학 스크리닝 시스템을 이용하여 중금속에 특이적으로 반응하는 것으로 확인된 단백질의 유전자이다. 본 발명에서 별늑대거미(Pardosa astrigera)로부터 동정한 각 유전자의 부분 염기서열은 서열 1 내지 3과 같다.

서열 1은 별늑대거미의 cytochrome c oxidase subunit 1 (COI) 유전자의 부분 염기서열이다. 동정된 총 488 bp 가운데 164∼427 염기서열 부분인 264 bp가 실시간 정량 PCR에 사용되었다.

서열 2는 별늑대거미의 putative Cd transporting ATPase (CdTA) 유전자의 부분 염기서열이다. 동정된 총 603 bp 가운데 134∼387 염기서열 부분인 254 bp가 실시간 정량 PCR에 사용되었다.

서열 3은 별늑대거미의 cation transporting ATPase (CTA) 유전자의 부분 염기서열이다. 동정된 총 603 bp 가운데 220∼472 염기서열 부분인 253 bp가 실시간 정량 PCR에 사용되었다.

종래의 기술들이 단일 생체지표를 이용함으로써 연구목적에 따라 다른 생체 지표 평가방법을 적용시켜야 하는데 비해, 본 발명에 따른 평가방법은 개발된 지표 유전자군을 각 연구대상의 목적에 따라 개별적으로 선발 이용하거나 3 종의 지표 유전자를 연계하여 종합적으로 분석할 수 있다. 또, 본 발명의 분자지표는 기존의 분자지표와 관계없이 독립적으로 또는 다른 분자지표들와 연계하여 분석에 활용될 수 있다.

본 발명의 분자지표를 이용한 중금속 노출 영향 분석은 실시간 정량 PCR을 통해 각 유전자 전사체를 증폭시키는 실험 과정과 이를 정량분석하여 중금속 노출의 수준을 역추적하는 과정으로 이루어진다.

COI와 CdTA의 발현량으로 지표환경 내 중금속의 노출 정도를, CTA의 발현량으로 지표환경 내 중금속 축적 정도를 평가할 수 있다.

또, 본 발명의 분자지표인 3종의 유전자를 동시에 비교분석함으로써 별늑대거미의 중금속 노출 수준을 비롯하여 중금속 오염의 진행 상황 및 현재 생태환경의 전반적인 생물학적 건강상태를 모니터링할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 3종의 유전자를 동시에 비교분석하는 방법으로 CdTA의 상대적인 발현량을 x 축으로, COI의 상대적인 발현량을 y 축으로, CTA의 상대적 발현량을 좌표로 표시되는 원으로 하나의 도표 상에 나타내어 자료를 해석하는 방법을 제시하고 있다 (도 1 및 도 2).

기존의 지표생물 체내 중금속 함량분석이나 노출량에 따른 치사량 분석이 단지 중금속의 노출량만을 예측했던 것에 비해, 본 발명은 중금속 노출에 대한 별늑 대거미의 특징적인 생체축적 양상과 이에 따른 각 유전자의 발현양상으로 중금속 노출의 수준을 비롯하여 중금속 오염의 진행 상황 및 현재 생태환경의 생물학적 건강상태를 전반적으로 모니터링할 수 있다는 특징을 갖는다.

본 발명에서 사용한 별늑대거미의 3 종의 유전자는 실내 노출실험을 통하여 중금속에 반응하는 것으로 확인되었으며, 실제 야외개체군을 대상으로 한 실험에서도 그 특이성이 확인되었고, 나아가 체내 중금속 축적량에 따른 3 종 분자지표 발현량이 고도의 상관관계를 보임으로써 선택성과 더불어 지표로서의 정확도도 검증되었다.

또, 실시간 정량 PCR을 이용하는 본 발명의 분석방법은 통상 한 번의 실험세트 내에서 최대 12 개의 지역 별늑대거미 시료에 대해서 각각 4개의 유전자를 증폭시킴으로써, 별늑대거미 시료를 채취한 이후의 실험에서부터 결과 분석까지 10 시간 이내의 시간이 소요되어 단시간에 중금속노출과 영향을 분석할 수 있다. 본 발명의 분석방법은 종래의 중금속함량 분석법과 비교할 때 시간과 비용의 경제성 측면에서도 큰 장점을 가지며, 연구에 필요한 공간 또한 적게 소요된다는 잇점이 있다.

이하 구체적인 실험예 및 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실험예 및 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

1. 별늑대거미 채집

중금속 노출이 의심되는 생태환경지역을 선정한 후, 해당지역의 별늑대거미를 채집하였다. 중금속 위해성 분자지표 실험과 결과분석에 이용되는 별늑대거미 개체는 암컷 (아)성체로서, 7∼10 ㎜ 정도 크기와 30 ㎎ 전후의 체중을 가지는 개체가 선발되었다. 해당지역 당 살아있는 9 마리의 별늑대거미 개체만으로 실험과 분석이 가능하다.

2. 별늑대거미의 total RNA 추출 및 cDNA 합성

분자생물학적 실험방식에 따라, 해당지역 당 3마리의 별늑대거미를 1 반복으로 하여 살아있는 상태에서 total RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. 이러한 실험을 3회 반복하였다. RNA는 반드시 살아있는 개체로부터 추출하여야 하며, 합성된 cDNA는 cDNA의 손실을 유발하는 어떤 filtering 처리도 허용해서는 안된다.

3. 실시간 정량 PCR 과 정량분석

합성한 cDNA를 100 ng/㎕로 희석한 후, 이 cDNA를 다시 2 ng/㎕의 농도로 희석 (50 배)한 주형 cDNA, dNTP, MgCl₂, DNA polymerase, ploymerase antibody, SyberGreen (형광염료), 18s rRNA (내재 대조유전자)·COI·CdTA·CTA를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 준비하였다 (표 1). 청정지역으로부터 채집한 중금속 비노출 별늑대거미 개체군의 cDNA를 대조군으로 사용할 경우, 선정된 지역간의 상대적인 비교는 물론 중금속 비노출군과의 절대적인 비교가 가능하다.

각 시료가 준비되면, PCR 반응을 시작한다. 하나의 PCR 반응 (20 ㎕)을 기준으로 5 ㎕ (2 ng/㎕)의 cDNA를 각 PCR 튜브에 분주한 후 (모든 반응은 최소 3 반복을 기준으로 실시한다.) 각 유전자 별 PCR 반응 마스터 믹스를 만든다. DNA 폴리머레이즈와 폴리머레이즈 항체(polymerase antibody)는 최종 마스터 믹스(master mix)를 만들기 5 분전에 별도의 튜브에 혼합하여 얼음에 두어야 하며, 빛에 의해 민감하게 분해되는 시버그린(SyberGreen)은 호일 등으로 빛을 완전히 차단한 상태에서 최종적으로 마스터 믹스에 첨가해야 한다. 각 반응에 해당하는 마스터 믹스를 PCR 반응 튜브에 분주한 후, 다음과 같은 조건으로 PCR 기계를 작동시켰다 (약 2시간 30분 소요 예상)

1 단계(초기 해리, initial denaturation) : 95 ℃, 15분

2 단계(유전자 증폭 본 단계 : 해리(denaturation), 아닐링(annealing), 증폭(extension), 형광감지) : (95 ℃, 15초 + 60 ℃, 15초 + 72 ℃, 15초 + 형광 감지) x 45 cycles

3 단계(최종 증폭, Final extension) : 72 ℃, 5분

4 단계(확인) : 63∼95 ℃ 까지 0.2 ℃씩 상승시키며 1초 + 형광 감지

PCR 종료 후 melting curve를 확인하여 단일 유전자 산물이 목적에 맞게 정확하게 증폭되었는지를 점검한다.

Threshold에 따른 Ct값을 확인하여 정량 분석을 실시하였다.

내재 대조유전자를 이용한 상대정량분석은 '△△Ct 법'을 적용하는 것을 원칙으로 하였다. 다음 수식을 이용하여 초기 주형 cDNA 양을 정량, 비교, 분석하였다.

상기 식에서 Et는 목적유전자의 PCR 증폭효율(Efficiency of target)을 의미하며, Er은 내재대조유전자의 PCR 증폭효율(Efficiency of reference)을 의미한다. Ctt는 목적유전자(target)의 Ct값을 의미하며 Ctr은 내재대조유전자의 Ct값을 의미하는 것으로, △Ctt는 중금속 무처리구 별늑대거미(control)의 목적유전자 Ct값에서 중금속 처리구 별늑대거미(treated)의 목적유전자 Ct값을 빼준 것(즉, control Ct값 - treated Ct값)이며, △Ctr은 중금속 무처리구 별늑대거미(control)의 내재대조유전자 Ct값에서 중금속 처리구 별늑대거미(treated)의 내재대조유전자 Ct값을 빼준 것(즉, control Cr값 - treated Cr값)이다.

4. 분석 자료의 해석

상기와 같은 실험을 통해 실시간 정량 PCR을 이용하여 확인한 유전자의 발현양상을 최종적으로 SigmaPlot (자료분석프로그램)의 「Bubble plot」로 재구성하여 중금속 위해성 평가 지표로 활용하였다. 즉, 상기와 같은 실험방법으로 중금속에 노출된 별늑대거미의 유전자(CdTA, COI, CTA)의 상대적인 발현량과 중금속에 전혀 노출시키지 않은 별늑대거미 대조군의 유전자의 상대적인 발현량을 구하고 이들 실험값을 「Bubble plot」로 재구성함으로써 새로운 분석모델과 해석방법을 제시하였다.

Bubble plot

Bubble plot의 좌표는 기본적으로 3 개의 자료 값을 필요로 한다. CdTA의 상대적인 발현량을 x 축으로, COI의 상대적인 발현량을 y 축으로, CTA의 상대적인 발현량을 좌표로 표시되는 원 (bubble)으로 설정하였다. CTA의 자료는 발현량의 역수를 취한 후에 5를 곱한 값으로 변환시켜 이용하였다. 만일 CTA의 자료를 변환시키지 않을 경우에는 결과가 반대로 해석된다.

CTA의 발현량의 역수를 취한 값을 나타내는 원의 크기로부터 원의 크기로 중금속의 축적 정도를 예측할 수 있다. 중금속에 노출된 별늑대거미와 중금속에 전혀 노출시키지 않은 별늑대거미 대조군의 상대적인 발현량의 실험값을 통해 확인한 결과, 그래프에 제시된 표준 원의 크기보다 클 경우 별늑대거미의 체내에 중금속이 유의하게 축적되었음을 의미하였다. 또, 상대적인 발현량의 실험값을 통해 확인한 결과, COI와 CdTA의 발현량을 나타내는 그래프의 좌표 영역으로부터 중금속의 노출 정도를 예측할 수 있는 것으로 나타났다. 즉, 빗금으로 표시된 영역에 관측치가 위치하게 될 경우 별늑대거미는 장기간 중금속에 만성노출 되었음을 의미하였다.

중금속 실내노출군을 대상으로 분석한 결과를 도 1에 그래프로 나타내었다. 표준 원은 중금속에 전혀 노출시키지 않은 별늑대거미 대조군의 유전자 발현을 나타낸다. 그래프에서 빗금으로 표시된 영역은 CdTA의 상대적인 발현량이 3 이상, COI의 상대적인 발현량이 0.7 이하인 영역으로서, 이는 실험을 통해 8 주 이상 중금속에 장기노출 시켰을 경우에 나타난 유전자 발현양상으로“중금속 노출 위험영역”이다.

5. 분자지표의 현장 적용

다음은 실제로 야외 개체군인 신길천의 상류, 중류, 하류로부터 채집한 별늑 대거미를 대상으로 중금속 노출 지표유전자의 발현량을 상기와 같은 방법을 적용하여 분석한 결과이다. 결과는 도 2와 같다. 또, 실제 별늑대거미의 체내 및 주변 환경에 축적된 중금속 축적량을 확인하여 본 발명에 따른 분자지표를 이용한 분석결과와 비교하였다.

(A) 신길천 상류

분자지표를 이용한 분석결과, 관측치의 원(A)의 크기가 표준 원에 비해 작은 것으로 나타나 중금속의 축적 정도는 중금속 비노출군과 크게 다르지 않은 것으로 예측되었다. 실제로 이 지역의 별늑대거미는 비노출군과 유사한 중금속 축적량을 보였다. 또, 빗금을 표시된 “중금속 노출 위험영역”과도 거리를 두고 있는 것으로 나타나 중금속에 장기 노출되지 않은 것으로 예측되었으며, 결론적으로 비교적 중금속에 대한 위해성이 낮은 것으로 판단되었다. 확인결과, 신길천 상류는 0.03 ㎎의 Cd와 0.44 ㎎의 Pb가 1 ㎏의 토양에 함유되어 있었으며, 0.06 ㎍의 Cd와 0.72 ㎍의 Pb가 한 마리의 별늑대거미에 축적되어 있었다.

(B) 신길천 중류

분자지표를 이용한 분석결과, 관측치의 원(B)의 크기가 표준 원에 비해 다소 큰 것으로 나타나 다소의 중금속 축적이 있을 것으로 예측되었으나, 확인결과 실제로 이 지역의 별늑대거미 체내 중금속 함량은 상류의 경우와 크게 차이가 나지 않았다. 한편, 표준 원과 근접해 있으며 빗금으로 표시된 “중금속 노출 위험영역” 과도 상당한 거리를 두고 있는 것으로 보아 중금속에 장기 노출되지 않은 것으로 예측되었다. 결론적으로 상류와 유사하게 비교적 중금속에 대한 위해성이 낮은 것으로 판단되었다. 확인결과, 신길천 중류는 0.05 ㎎의 Cd와 5.10 ㎎의 Pb가 1 ㎏의 토양에 함유되어 있었으며, 0.06 ㎍의 Cd와 0.31 ㎍의 Pb가 한 마리의 별늑대거미에 축적되어 있었다.

(C) 신길천 하류

분자지표를 이용한 분석결과, 관측치의 원(C)의 크기가 표준 원에 비해 현저하게 큰 것으로 나타나 상당한 양의 중금속이 축적되어 있을 것으로 예측되었으며, 확인결과 실제로 이 지역의 별늑대거미는 높은 수준의 중금속 축적량을 나타내었다. 또한, 빗금으로 표시된 “중금속 노출 위험영역” 내에 위치하고 있는 것으로 보아 이미 중금속에 장기 노출도어 있을 것으로 예측되었으며, 결론적으로 중금속에 대한 위해성이 높은 지역으로 판단되었다. 확인결과, 신길천 하류는 0.94 ㎎의 Cd와 83.4 ㎎의 Pb가 1 ㎏의 토양에 함유되어 있었으며, 1.74 ㎍의 Cd와 1.32 ㎍의 Pb가 한 마리의 별늑대거미에 축적되어 있었다.

본 발명에서는 별늑대거미의 3 종의 유전자군의 발현양상을 통해 중금속 노출 영향을 다양한 측면에서 평가함으로써 중금속 노출의 진행과정을 보다 정확하게 유추하여 중금속 노출은 물론 중금속이 생태계에 미치는 전반적인 영향을 보다 신 뢰성 있게 효율적으로 모니터링할 수 있다. 또한, 기존의 방법들이 시료 준비에서부터 분석까지 많은 시간과 경비를 소요했던 데 비해, 본 발명은 비교적 간단한 실험 방법과 저렴한 경비로서 정확한 분석을 실시할 수 있고, 이에 따라 실내 실험이 아닌 실제 특정 야외생태환경의 평가에도 적합하다. 본 발명의 별늑대거미의 분자지표를 이용한 분석은 지표생태계의 중금속 노출 영향을 평가하는 새로운 방법으로 크게 활용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

지표생물의 분자지표를 이용하여 지표환경 내 중금속오염을 평가하는 방법에 있어서, COI (cytochrome c oxidase subunit 1); CdTA (Cd transporting ATPase); CTA (cation transporting ATPase) 중에서 선택된 하나 이상의 별늑대거미의 유전자를 분자지표로 사용하는 것을 특징으로 하는 중금속 오염 평가방법.
제1항에 있어서, 상기 별늑대거미의 유전자 전사체를 실시간 정량 PCR로 증폭시켜 각 유전자의 상대적 발현량을 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, COI와 CdTA의 발현량으로 지표환경 내 중금속의 노출 정도를, CTA의 발현량으로 지표환경 내 중금속 축적 정도를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, CdTA의 상대적인 발현량을 x 축으로, COI의 상대적인 발현량을 y 축으로, CTA의 상대적 발현량을 좌표로 표시되는 원으로 하나의 도표 상에 나타내어 3종의 유전자의 상대적인 발현량을 비교함으로써 중금속에 대한 지표환경 내 생태계 건강도를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PCR에 의해 증폭되는 서열 1(COI)의 164∼427 염기서열 부분; 서열 2(CdTA)의 134∼387 염기서열 부분; 서열 3(CTA)의 220∼472 염기서열 부분을 분자지표로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.