KR20030087279A - 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석 방법 - Google Patents

환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20030087279A
KR20030087279A KR1020020025275A KR20020025275A KR20030087279A KR 20030087279 A KR20030087279 A KR 20030087279A KR 1020020025275 A KR1020020025275 A KR 1020020025275A KR 20020025275 A KR20020025275 A KR 20020025275A KR 20030087279 A KR20030087279 A KR 20030087279A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
environmental
analysis
gene chip
environmental stress
Prior art date
Application number
KR1020020025275A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100456501B1 (ko
Inventor
구만복
민지호
박경서
Original Assignee
광주과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 광주과학기술원 filed Critical 광주과학기술원
Priority to KR10-2002-0025275A priority Critical patent/KR100456501B1/ko
Priority to JP2002360331A priority patent/JP2004121205A/ja
Publication of KR20030087279A publication Critical patent/KR20030087279A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100456501B1 publication Critical patent/KR100456501B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 송사리(Japanese Medaka , 학명: Orzyias latipes)내에서 환경 유해물질로 인한 스트레스에 특이적으로 반응하는 cDNA pools을 선정하여 기판에 고착화하여 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩을 제작하고, 이를 이용하여 환경 유해물질에 대한 수중 생물체의 생리적인 반응을 신속하게 검색하기 위한 환경 유해성 분석방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해, 기존에 환경 유해 물질로 인한 유전자 발현 정도 분석을 위해 사용되었던 DDRT-PCR 및 northern blott들에 비하여 고감도의 방법으로 여러가지 유전자를 신속 정확하게 정량화할 수 있게 되었으며, 특히 본 발명의 송사리 cDNA칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법은 특이적으로 유해성에 발현하는 22종의 유전자를 포함하고 있어 분석시 민감도가 탁월하고 22종의 유전자 발현 여부 및 정량적인 분석을 한번에 실행할 수 있어 정확한 분석이 가능하다. 또한 본 발명은 스트레스에 특이적인 바이오마커의 확인 및 환경 바이오 센서 개발에 이용 가능하며, 유전자 발현 정도의 정량적인 비교를 수행함으로써 내분비계 혼란 효과, 세포 독성 효과, 암 발생 효과 및 생체 발생 관련 독성 효과의 생체 스트레스 형태 구분이 가능해진다.

Description

환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법{FISH DNA CHIPS FOR ENVIRONMENTAL STRESS ANALYSIS AND METHOD OF ENVIRONMENTAL HARMFULNESS ANALYSIS THERETHROUGH}
본 발명은 환경 유해 물질에 특이적으로 반응하는 송사리 유전자종을 선정하여 칩에 고착시킨 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법에 관한 것이다.
최근 환경 유해 물질(내분비계 장애 물질-환경 호르몬)이 생태계 및 인간의 생식 기능 저하, 기형, 성장장애 및 암 등을 유발하여 모든 생물종에 위협이 될 수 있다는 인식이 제기되면서 오존층 파괴 및 지구 온난화 문제와 더불어 새로운 환경 문제로 대두되고 있다.
환경 유해 물질로 추정되는 물질로는 각종 산업용 화학물질(원료물질), 살충제 및 제초제 등의 농약류, 유기중금속류, 다이옥신류, 식물에 존재하는 식물성 에스트로젠등의 호르몬 유사물질, 디에틸스틸베스트롤(DES)과 같은 의약품으로 사용되는 합성 에스트로젠류 및 식품첨가물이 있으며 이러한 환경 유해 물질의 계측 방법을 개발하고 이용하는 것은 환경 유해 물질의 발견 및 이들의 독성학적 의미의 정량적 분석에 있어서 필요하다.
또한 환경 유해 물질의 초고감도 기기분석기법 개발이나 바이오마커의 확인 및 계측법 개발은 생태계내에서 환경 유해 물질의 실태를 해명하는데 매우 중요하다.
특히 최근까지 환경호르몬으로 알려져 있는 nonylphenol, bisphenolA, beta-estradiol, phthalate 및 dioxin 등의 유해물질과 세포독성을 유발하는 것으로 알려져 있는 phenol류들 그리고 methyl viologen, aldrin 및 isodrin등의 농약류의 스트레스 분류 및 수중 생물체의 생리적인 반응을 유전자 수준에서 신속하게 검색하기 위한 방법이 요구된다.
한편 종래 휴먼 게놈 프로젝트를 포함한 많은 유기체의 게놈 프로젝트가 수행되어 수많은 유전정보가 쏟아져 나옴에 따라, 이를 어떻게 해석하고 서로 연관 지을 수 있는가에 대해 많은 관심과 연구가 이루어지고 있다. 그 중 최근에 개발된 DNA 칩은 짧은 시간에 많은 양의 정보를 분석할 수 있으며 자동화가 용이하기 때문에 여러 게놈 프로젝트로부터 축적된 방대한 양의 유전정보를 이용하여 시료를 효율적으로 분석하는 방법으로 가장 주목받고 있다.
DNA 칩은 붙이는 유전물의 크기에 따라 올리고뉴클레오티드 칩(Lipshutz et al., 1999)과 cDNA 칩(Schena et al., 1995)으로 구분할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 칩에는 약 15 ~ 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 붙여져 있고염기의 서열을 알고 있기 때문에 하나의 염기 변화에 의한 다양성에 대한 연구( SNPs, single nucleotide polymorphisms)가 가능하다. 그러나, 반드시 서열 정보가 필요하고, 실제로 몇 kb나 되는 유전자에서 극히 일부의 염기만을 살피는 것이므로 어느 부분을 선택하느냐의 문제가 남는다. 이와 달리 cDNA chip는 SNPs를 볼 수는 없지만, 염기 자체가 크며 서열 정보가 필수적이지 않으므로 유전자의 발현 분석에 강력하고 유용한 도구가 된다.
기존에 편리성, 가격 및 민감도에 있어서 각각 다른 다양한 기술들이 유전자발현을 분석하기 위하여 이용되어 왔다. 예를 들어 차별적 전시 (differential display), 색인화 (indexing), 공제혼성화 (subtraction hybridization) 및 많은 DNA 핑거프린팅 기술들, 예를 들어 Vos 등, Nucleic Acids Research, 23:4407-4414 (1995);Hubank 등, Nucleic Acids Research, 22:5640-5648 (1994); Lingo 등, Science, 257:967-971 (1992); Erlander 등, 국제특허출원 PCT/US94/13041; McClelland 등, 미국특허 제5,437,975호; Unrau 등, Gene, 145:163-169 (1994); 등이 포함된다. 또 mRNA 수준에서의 유전자 발현을 분석하는 방법은 Northen-blott, differential display(Liang and Pardee, 1992), dotblot analysis(Lennon and Lehrach, 1991), Serial analysis of gene expression (SAGE; Velculescu et al., 1995) 등이 포함된다.
그러나 기존의 방식으로 대량의 유전자를 동시에 분석하기에는 기술적인 한계가 있고 어떤 공급원으로부터 얻어진 알려지거나 알려지지 않은 유전자들의 분석을 허용하는 유전자 발현을 분석하기 위한 편리하고 민감한 기술의 필요성은 여전히 존재한다.
특히 생체 환경 독성 분야에 있어, 환경 유해 물질로 인한 유전자 발현 정도 분석에 사용되었던 DDRT-PCR 및 northern blott의 경우 다량의 샘플이 요구되고 실험상의 조건 유지가 어려우며 동시에 여러가지 유전자를 분석하기가 불가능한 문제점이 있다.
이에 따라 본 발명자들은 환경 유해 물질로 인해 수중 생물체가 입을 수 있는 유해성 및 스트레스를 신속하게 확인하고자 고감도의 방법으로 여러가지 유전자를 신속 정확하게 정량화 할 수 있는 방법을 예의 연구하여 왔다.
따라서, 본 발명의 목적은 환경 유해물질로 인한 스트레스에 특이적으로 반응하는 유전자를 선정하여 기판에 고착시킨 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적의 다른 일면은 스트레스에 특이적인 바이오마커의 확인 및 환경 바이오 센서의 개발에 사용 가능한 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 유전자 칩을 이용하여, 기존에 환경 유해 물질로 인한 유전자 발현 정도 분석을 위해 사용되었던 DDRT-PCR 및 northern blott들에 비하여 고감도이고 신속하며, 유전자 발현 여부 및 정량적인 분석을 한번에 실행할 수 있어 정확한, 환경 유해 물질 및 기타 스트레스로 인한 수중 생물체의 생리적인 반응을 유전자 수준에서 정량화 할 수 있는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 송사리 유전자 칩을 이용하여, 유전자 발현 정도의 정량적인 비교를 통해 특정 환경 유해 물질에 대한 생체 스트레스의 형태 구분이 가능한 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적 및 다른 목적을 달성하기 위하여,
송사리(Japanese Medaka, 학명: Orzyias latipes)내에서 환경 유해물질로 인한 스트레스에 특이적으로 반응하는 cDNA pools을 이용하여 기판에 고착시킨 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법을 제공한다.
상세하게는 에스트로게닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 유전자로서 비텔레오제닌(Vitellogenin), 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 아릴 하이드로카본 수용체(aryl hydrocarbon receptor), 촐리오제닌 하이(choliogenin high), 촐리오제닌 로우(choliogenin low) 및 고나도트로핀(gonadotrophine)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 1종 이상을 포함하고; 생체 독성 관련 유전자로서 시토크롬 p450(cytochrome p450), 히트쇼크 70(heat shock 70), 엔도테린 수용체(endotherin receptor), 구아닌 시클라제(guanyl cyclase) 및 스트로마이셀린-3(stromyselin-3)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 1종 이상을 포함하고; 암 유발 유전자로서 브이-포스(v-fos), 어레스틴(arrestin), 라스-2-프로툰코진(ras-2-protooncogene), p53, 아폽토시스 RVP1(apoptosis RVP1), 브이-믹(V-myc) 및 레티노블라스토마(retinoblastoma)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 1종 이상을 포함하고; 생체 발생 관련 유전자로서 베타-액틴(beta-actin), 발생 전사 인자(developmental transcription factor), 글루타치온-에스-트랜스페라제(glutathion-S-transferase) 및 시클린2(cyclin2)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 1종 이상을 포함하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법을 제공한다.
더욱 상세하게는 에스트로게닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 유전자로서 비텔레오제닌(Vitellogenin), 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 아릴 하이드로카본 수용체(aryl hydrocarbon receptor), 촐리오제닌 하이(choliogenin high), 촐리오제닌 로우(choliogenin low) 및 고나도트로핀(gonadotrophine)의 6종으로 구성되고; 생체 독성 관련 유전자로서 시토크롬 p450(cytochrome p450), 히트쇼크 70(heat shock 70), 엔도테린 수용체(endotherin receptor), 구아닌 시클라제(guanyl cyclase) 및 스트로마이셀린-3(stromyselin-3)의 5종으로 구성되고; 암 유발 유전자로서 브이-포스(v-fos), 어레스틴(arrestin), 라스-2-프로툰코진(ras-2-protooncogene), p53, 아폽토시스 RVP1(apoptosis RVP1), 브이-믹(V-myc) 및 레티노블라스토마(retinoblastoma)의 7종으로 구성되고; 생체 발생 관련 유전자로서 베타-액틴(beta-actin), 발생 전사 인자(developmental transcription factor), 글루타치온-에스-트랜스페라제(glutathion-S-transferase) 및 시클린2(cyclin2)의 4종으로 구성되는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 또 다른 목적을 달성하기 위하여,
내분비계 혼란 효과, 세포 독성 효과, 암 발생 효과 및 생체 발생 관련 독성 효과의 4가지로 환경 유해 물질에 대한 생체 스트레스 형태를 구분하는 송사리 유전자 칩을 이용한 환경 유해성 분석 방법을 제공한다.
도 1은 송사리 cDNA 칩의 설계 및 구성도를 나타내는 모식도이다.
도 2는 노닐 페놀 25ppb(㎍/ml)에 관한 암컷 송사리의 간 조직에서 추출한 RNA에 대한 cDNA 칩의 반응성 및 22종 유전자의 반응 정도에 대한 분석 결과에 관한 사진이다.
이하 본 발명에 따른 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명에 제공되는 유전자는 현재까지 송사리에 대하여 전체 염기 서열에 밝혀진 전체 유전자중에 환경 스트레스에 의하여 합성이 유도된다고 알려진 유전자를 모두 선정하였다. 따라서 향후 환경 스트레스에 반응하는 새로운 유전자의 염기 서열이 밝혀지면 본 발명상의 송사리 유전자 칩에 추가적으로 첨가하여 송사리 유자 칩의 제작이 가능하며 이에 따라 스트레스 형태의 추가적인 분류도 가능하다.
본 발명의 송사리 유전자 칩은 송사리 게놈 유전자의 70% 이상을 제작된 프라이머를 이용하여 RT-PCR방법으로 증폭하여 핀 스폿팅 방법에 의해 칩상에 고착시켰다.
본 발명의 송사리 유전자 칩 제작시 cDNA가 직접 부착되어지는 유리 슬라이드 표면은 결합을 쉽게하기 위해서 화학적으로 처리되어지는데 poly-L-lysine,amine, aldhyde 등이 이용된다 (Schena et al., 1995; Schena et al., 1996; Rogers et al., 1999). 이렇게 처리된 유리 슬라이드의 표면과 cDNA 조각은 쉽게 결합을 형성한다. 이외에도 유리 슬라이드 표면은 polyacrylamide gel pad, nylon membrane, nitrocellulose, other polymer를 이용해 코팅이 가능하다(Prounikov et al., 1998).
본 발명의 송사리 유전자 칩을 이용하여 수중 생물체에 대한 스트레스 효과 를 신속히 파악하기 위해 스트레스 효과 분류를 내분비계 혼란 효과 분류, 세포 독성 효과 분류, 암 발생 효과 분류 및 생체 발생 관련 독성 효과 분류로 나누고 유전자 발현 정도를 분석하였다.
이하 본 발명을 하기의 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하고자 하며 하기 실시예에 의하여 본 발명이 제한되지 않는다.
[실시예1]
바람직한 실시예에 의하면 본 발명은 송사리 유전자 칩으로서 1종의 대조 유전자와 함께 22종의 환경 유해성 반응 유전자를 포함하고 있다. 상기 유전자는 현재까지 송사리에 대하여 전체 염기 서열에 밝혀진 전체 유전자중에 환경 스트레스에 의하여 합성이 유도된다고 알려진 유전자이다.
즉, 에스트로제닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 유전자 6종으로서 비텔레오제닌(Vitellogenin), 에스트로젠 수용체(estrogen receptor), 아릴 하이드로카본 수용체(aryl hydrocarbon receptor), 촐리오제닌 하이(choliogenin high), 촐리오제닌 로우(choliogenin low) 및 고나도트로핀(gonadotrophine); 생체 독성 관련 유전자 5종으로서 시토크롬 p450(cytochrome p450), 히트쇼크 70(heat shock 70), 엔도테린 수용체(endotherin receptor), 구아닌 시클라제(guanyl cyclase) 및 스트로마이셀린-3(stromyselin-3); 암 유발 유전자 7종으로서 브이-포스(v-fos), 어레스틴(arrestin), 라스-2-프로툰코진(ras-2-protooncogene), p53, 아폽토시스 RVP1(apoptosis RVP1), 브이-믹(V-myc) 및 레티노블라스토마(retinoblastoma); 생체 발생 관련 유전자 4종으로서 스트레스에 관계 없이 항상 발현되는 베타-액틴(beta-actin), 발생단계에 이상이 생겼을때 발생이 유도되는 발생 전사 인자(developmental transcription factor), 산화적 손상이 발생하였을 때 합성되는 글루타치온 -에스- 트랜스페라제(glutathion-S-transferase) 및 cell cycle에 이상이 생겼을 때 발생하는 시클린2(cyclin2)를 선정하였다.
상기 선정된 송사리 게놈 유전자 22종의 70% 이상을 제작된 프라이머를 이용하여 RT-PCR방법으로 증폭하여 핀 스폿팅 방법에 의해 칩상에 고착시켰다.
다음의 [표1]은 송사리 유전자 칩으로서 1종의 대조 유전자와 함께 22종의 송사리 유전자의 cDNA을 확보하기 위한 프라이머 서열을 설명하고 있다.
1종의 대조 유전자와 22종의 송사리 유전자의 cDNA를 제작하기 위한 프라이머 서열
Genes U-primer D-primer
Beta-actin ctctgacagggcactttac caccccaccatgtaagatac
Cytochrom P-450 aromatase tgagcagtttgtcttacgtg ctaaaagggtgagggacttt
Prepro-gonadotropin-releasing hormone cagctccctgacttatgaac gcttcagttacactcccaag
Heat shock protein70 agtccttctaccctgaggag cttcataaacctggttgagc
V-fos cggcaagaataagagactga taaatctgttgggatgttcc
Arrestin ttgaggttcccttcaaatta ggagagttctttggtcatca
Ras-2 protooncogene gacggaatataagctggttg ccttgctcatcttctcctta
p53 ttccagctcttggataata ccataaacctcaaaatgaa
Vitellogenin ttggcatacactgagaaatg tctttctttgcaatgttcct
Choliogenin H caatcctgctactttggaac ggttcactgttcagatggtt
Estrogen receptor gtccctctttatgacctcct gtgcagtcagtcaacttgtg
Stromelysin-3 ctcttaccctctgcagctta catttaagctggttccacat
Developmentaltranscription factor tggattcgttgattttaagg ctaagcagtgtttcccagac
Endothelin receptor caacactgctgaggatcata tgatgacagattgtccaaaa
Apoptosis protein RVP1 aagctccgtcccatgtag aactgcatctaccagaccac
Cyclin2 ctctgcagtgaatacgtgaa gtgcatttctgaggtcaaat
Choliogenin-L taaaccttcataccctccaa atccaccagactcacaagag
V-myc agattcctggtttctgtgtg ctccagaacgttatgagtcc
Glutation S-transferase ccttttgagttcaagcatgt agattttgttgctgatgagg
Retinoblastoma ggatactcgatgtgttcgat agattttgttgctgatgagg
Aryl hydrogen receptor ggcatcatattcttctgctc tcctgactcatcagaacctc
Guanylyl cyclase accccctcacttctaagac ggttggtgtcaaaacttcat
ACT(Yeast) acagcaattaatgcacaaca catcaccaacgtaggagtct
도 1은 1종의 대조 유전자와 22종의 송사리 유전자의 cDNA 칩의 구성도이다. 두번의 반복 결과를 위하여 칩상의 spot을 두 번 반복하여 고착화 하였다. 칩 상에서 나타내고 있는 N은 negative control 유전자를 표시하며, 효모균의 ACT유전자를 사용하였다. 칩의 구성은 에스트로게닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 유전자 6종, 생체 독성 관련 유전자 5종, 암 유발 유전자 7종 및 생체 발생 관련 유전자 4종의 순서로 고착화 되었다.
환경 호르몬으로 알려져 있는 노닐페놀에 대한 송사리 유전자 칩 적용을 실시하였다. 25ppb(㎍/ml)의 노닐페놀에 노출되었던 암컷 송사리의 간 조직에서 분리된 RNA 샘플을 이용하여 개발된 송사리 유전자칩에의 hybridization을 실시하였다. 결과는 도 2와 같다. 환경호르몬으로 알려져 있는 노닐페놀에 노출된 암컷 송사리의 간조직에서 분리된 RNA 샘플과의 반응에서 에스트로게닉 포텐셜(estrogenic potential)과 관련된 첫 번째 유전자 그룹에서 반응성을 나타내는 붉은 신호가 나타나는 것이 확인되었다.
다음의 [표2]는 도 2의 결과를 수치 변형한 것이다. 대조 유전자로써 칩 상에 고착화시킨 spot에서는 반응이 전혀 일어 나지 않았으며 수치상으로 비교해 볼때 역시, 노닐 페놀에 의하여 에스트로게닉 포텐셜(estrogenic potential)과 관련된 유전자가 다량 합성 되는 것을 확인하였다.
도 2에서의 유전자 칩 분석 결과를 수치화하여 비교한 것
F635 F532 Ratio F635 F532 Ratio
1 38 55 1.286 1 38 55 2.25
NC 31 47 -2 NC 31 50 -2
2 1692 148 16.62 2 1276 121 17.306
3 2692 95 56.6 3 124 80 78.9
4 236 52 41.4 4 44 52 23.5
5 57 55 3.11 5 819 53 2.5
6 1746 71 74.65 6 46 62 65.3
7 49 57 2.22 7 41 57 2.42
8 45 52 4 8 46 53 3
9 47 61 1.286 9 29 61 1.417
10 30 50 0.333 10 33 47 0
11 33 53 0.571 11 32 51 1
12 33 52 1.333 12 264 52 1
13 320 122 3.986 13 31 106 4.5
14 32 52 0.75 14 528 53 0.5
15 1028 2383 0.428 15 35 1249 0.415
16 36 60 0.538 16 43 59 0.545
17 52 62 1.438 17 39 56 1.75
18 44 56 2.143 18 296 55 1.8
19 217 112 2.968 18 32 141 2.956
20 30 49 1 20 41 51 2
21 42 59 1.182 21 33 58 1.333
22 32 61 0.214 22 28 56 0.571
본 발명은 특정 스트레스에 반응하는 유전자를 선정하여 기판에 고착화함으로써, 기존에 환경 유해 물질로 인한 유전자 발현 정도 분석을 위해 사용되었던 DDRT-PCR 및 northern blott들에 비하여 고감도의 방법으로 여러가지 유전자를 신속 정확하게 정량화 할 수 있게 되었으며 이는 생체 독성 분야의 전혀 새로운 시도이다.
특히 본 발명의 송사리 cDNA칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석 방법은 특이적으로 유해성에 발현하는 22종의 유전자를 포함하고 있어 분석시 민감도가 탁월하고 22종의 유전자 발현 여부 및 정량적인 분석을 한번에 실행할 수 있어 정확한 분석이 가능하다.
또한 본 발명의 송사리 cDNA칩을 이용하여 유전자 발현 정도의 정량적인 비교를 수행함으로써 내분비계 혼란 효과, 세포 독성 효과, 암 발생 효과 및 생체 발생 관련 독성 효과의 생체 스트레스 형태 구분이 가능해진다.
또한 본 발명의 송사리 cDNA칩은 스트레스에 특이적인 바이오마커의 확인 및 환경 바이오 센서의 개발에 사용 가능하다.
비록 본 발명이 상기 언급된 바람직한 실시예와 관련하여 설명되어졌지만, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 따라서 첨부된 특허청구의 범위는 본 발명의 요지에서 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함할 것이다.

Claims (13)

  1. 환경 유해 물질에 특이적으로 반응하는 송사리 유전자종으로 구성된 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자종은 (a)에스트로게닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 유전자종, (b)생체 독성 관련 유전자종, (c)암 유발 유전자종 및 (d)생체 발생 관련 유전자종으로 구성된 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 (a)에스트로게닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 유전자는 비텔레오제닌(Vitellogenin), 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 아릴 하이드로카본 수용체(aryl hydrocarbon receptor), 촐리오제닌 하이(choliogenin high), 촐리오제닌 로우(choliogenin low) 및 고나도트로핀(gonadotrophine)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 (b)생체 독성 관련 유전자는 시토크롬 p450(cytochrome p450), 히트쇼크 70(heat shock 70), 엔도테린 수용체(endotherin receptor), 구아닌 시클라제(guanyl cyclase) 및 스트로마이셀린-3(stromyselin-3)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 (c)암 유발 유전자는 브이-포스(v-fos), 어레스틴(arrestin), 라스-2-프로툰코진(ras-2-protooncogene), p53, 아폽토시스 RVP1(apoptosis RVP1), 브이-믹(V-myc) 및 레티노블라스토마(retinoblastoma)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 (d)생체 발생 관련 유전자는 베타-액틴(beta-actin), 발생 전사 인자(developmental transcription factor), 글루타치온-에스-트랜스페라제(glutathion-S-transferase) 및 시클린2(cyclin2)으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 (a)에스트로게닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 유전자는 비텔레오제닌(Vitellogenin), 에스트로겐 수용체(estrogen receptor), 아릴 하이드로카본 수용체(aryl hydrocarbon receptor), 촐리오제닌 하이(choliogenin high), 촐리오제닌 로우(choliogenin low) 및 고나도트로핀(gonadotrophine)으로 구성되고;
    상기 (b)생체 독성 관련 유전자는 시토크롬 p450(cytochrome p450), 히트쇼크 70(heat shock 70), 엔도테린 수용체(endotherin receptor), 구아닌 시클라제(guanyl cyclase) 및 스트로마이셀린-3(stromyselin-3)으로 구성되고;
    상기 (c)암 유발 유전자는 브이-포스(v-fos), 어레스틴(arrestin), 라스-2-프로툰코진(ras-2-protooncogene), p53, 아폽토시스 RVP1(apoptosis RVP1), 브이-믹(V-myc) 및 레티노블라스토마(retinoblastoma)으로 구성되고;
    상기 (d)생체 발생 관련 유전자는 베타-액틴(beta-actin), 발생 전사 인자(developmental transcription factor), 글루타치온-에스-트랜스페라제(glutathion-S-transferase) 및 시클린2(cyclin2)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 송사리 유전자칩은 음성적 조절(negative control) 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 음성적 조절(negative control) 유전자는 효모균의 ACT 유전자인 것을 특징으로 하는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩.
  10. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 송사리 유전자 칩을 이용한 것을 특징으로 하는 송사리 유전자 칩을 이용한 환경 유해성 분석 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 송사리 유전자 칩은 음성적 조절(negative control) 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 송사리 유전자 칩을 이용한 환경 유해성 분석 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 음성적 조절(negative control) 유전자는 효모균의 ACT 유전자인 것을 특징으로 하는 송사리 유전자 칩을 이용한 환경 유해성 분석 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 분석 방법은 스트레스 효과 분류로서 (a)내분비계 혼란 효과 분류, (b)세포 독성 효과 분류, (c)암 발생 효과 분류 및 (d)생체 발생 관련 독성 효과 분류를 포함하는 것을 특징으로 하는 송사리 유전자 칩을 이용한 환경 유해성 분석 방법.
KR10-2002-0025275A 2002-05-08 2002-05-08 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석 방법 KR100456501B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0025275A KR100456501B1 (ko) 2002-05-08 2002-05-08 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석 방법
JP2002360331A JP2004121205A (ja) 2002-05-08 2002-12-12 環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0025275A KR100456501B1 (ko) 2002-05-08 2002-05-08 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030087279A true KR20030087279A (ko) 2003-11-14
KR100456501B1 KR100456501B1 (ko) 2004-11-10

Family

ID=32291634

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-0025275A KR100456501B1 (ko) 2002-05-08 2002-05-08 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석 방법

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2004121205A (ko)
KR (1) KR100456501B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100896934B1 (ko) * 2003-10-17 2009-05-14 한국과학기술연구원 환경호르몬 검색용 ｃＤＮＡ 칩
KR20150055582A (ko) * 2013-11-11 2015-05-21 경상대학교산학협력단 가금류의 환경 스트레스에 특이적인 유전자 바이오마커, 환경 스트레스 진단용 조성물, 진단용 키트 및 이를 이용한 스트레스 가능성, 산란율 예측방법

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100735731B1 (ko) 2005-07-22 2007-07-06 이시혁 별늑대거미의 분자지표를 이용한 지표환경 내 중금속 오염평가방법
JP2008000131A (ja) * 2006-05-24 2008-01-10 Genefrontier Corp 被検水棲生物の生理状態を評価する方法
JP2008167699A (ja) * 2007-01-12 2008-07-24 Roche Diagnostics Kk 化学物質の影響評価方法
KR101012122B1 (ko) 2008-08-04 2011-02-07 한국해양연구원 벤조플로란센 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한확인 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100430397B1 (ko) * 2001-07-18 2004-05-04 한국원자력연구소 암세포에서의 방사선 반응 유전자 검출 방법 및 유전자군

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100896934B1 (ko) * 2003-10-17 2009-05-14 한국과학기술연구원 환경호르몬 검색용 ｃＤＮＡ 칩
KR20150055582A (ko) * 2013-11-11 2015-05-21 경상대학교산학협력단 가금류의 환경 스트레스에 특이적인 유전자 바이오마커, 환경 스트레스 진단용 조성물, 진단용 키트 및 이를 이용한 스트레스 가능성, 산란율 예측방법

Also Published As

Publication number Publication date
JP2004121205A (ja) 2004-04-22
KR100456501B1 (ko) 2004-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Meyers et al. Methods for transcriptional profiling in plants. Be fruitful and replicate
Dufva Introduction to microarray technology
Rockett et al. DNA arrays: technology, options and toxicological applications
CA2459731A1 (en) Genetic analysis of biological samples in arrayed expanded representations of their nucleic acids
KR100456501B1 (ko) 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석 방법
CN106350601A (zh) 高通量检测玉米轴色基因分型的方法及其试剂盒
Fredrickson et al. Towards environmental toxicogenomics—development of a flow-through, high-density DNA hybridization array and its application to ecotoxicity assessment
Gomase et al. Microarray: an approach for current drug targets
Vo-Dinh et al. Micro arrays and biochips: Applications and potential in genomics and proteomics
US9944994B2 (en) Anuran cross-species molecular sensors
Püffeld et al. Analysis of developing rice grain transcriptome using the agilent microarray platform
US20070105103A1 (en) Array having substances fixed on support arranged with chromosomal order or sequence position information added thereto, process for producing the same, analytical system using the array and use of these
US7723023B2 (en) Use of intrinsic reporters of cell signaling for high content drug profiling and toxicity screening
KR100638854B1 (ko) 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석방법
Gupta et al. Drosophila microarray platforms
Khassanova et al. SNP Genotyping with Amplifluor-Like Method
EP1250449B1 (en) Methods to identify evolutionarily significant changes in polynucleotide and polypeptide sequences in domesticated plants and animals
CN117821633B (zh) 用于甘薯种质鉴定的kasp标记引物组合及其应用
CN102787160A (zh) 一种高通量检测基因多态性的方法
Pathak Use of Radiation in Molecular Biology
KR20070011880A (ko) 별늑대거미의 분자지표를 이용한 지표환경 내 중금속 오염평가방법
KR101801019B1 (ko) 60s 리보좀 유전자 기반 잎마름병 저항성 백합 품종 판별용 SNP 마커 및 이의 용도
KR100978791B1 (ko) 디클로로메탄 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한확인 방법
Auesukaree cDNA microarray technology for the analysis of gene expression
KR20220047180A (ko) 청고병 저항성 고추 판별용 분자마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20111010

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121005

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee