KR100430397B1 - 암세포에서의 방사선 반응 유전자 검출 방법 및 유전자군 - Google Patents

암세포에서의 방사선 반응 유전자 검출 방법 및 유전자군 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사선 치료 효율의 증대를 위한 예측 인자 및 방사선 피폭의 진단을 위한 마커로서의 개발 등에 다양하게 적용될 수 있는 암세포에서 방사선 반응 유전자를 검출하는 방법, 및 상기 방법에 의해 검출된 유전자군에 관한 것이다.

Description

암세포에서의 방사선 반응 유전자 검출 방법 및 유전자군{Method for detecting radiation response genes in cancer cell and the genes}
본 발명은 방사선 치료 효율의 증대를 위한 암세포중의 방사선 반응 유전자 검출 방법 및 상기 방법에 의해 검출된 유전자군에 관한 것이다.
보다 상세하게 본 발명은 방사선 치료 효율의 증대를 위한 예측 인자 및 방사선 피폭의 진단을 위한 마커로서의 개발 등에 다양하게 적용될 수 있는 암세포에서 방사선 반응 유전자를 검출하는 방법, 및 상기 방법에 의해 검출된 유전자군에 관한 것이다.
암의 치료법은 수술, 방사선치료법, 항암화학요법으로 크게 나눌 수 있는데 현재 암 환자 중 국내의 경우 약 35%, 미국의 경우 약 50% 정도가 방사선 치료를 받고 있으며 국내에서 방사선치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세여서 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다. 그러나, 암세포의 종류 및 방사선 종류에 따라, 방사선에 대한 암세포의 반응성은 상이하게 나타나고, 따라서 상이한 방사선의 작용에 의해 각 유전자들은 상이하게 발현되므로, 이는 방사선 치료시 가장 큰 문제점의 하나로 지적되고 있다.
상기와 같은 이유로, 방사선 민감도에 대한 기전 연구는 방사선 분야의 연구자들의 주된 관심사 중 하나로서 많은 연구들이 진행되어져 왔다. 방사선에 대한 종양 조직 반응을 검색하는 초기 기술은 혈액검사 등을 통한 것으로 종양 조직 세포 자체의 반응을 해석하는데는 무리가 있어 전혀 실용성이 없는 것으로 밝혀졌다. 이 후 방사선에 대한 종양 조직의 반응에 대한 분자적 수준의 연구가 많이 수행되어졌는데 주로 DNA 손상과 수복에 대한 것이었다. 예를 들어, 방사선에 의해 발현 변화가 있다고 알려진 몇몇 인자들(H-Ras, oncogene c-Myc, Thymidine kinase, Basic fibroblast growth factor, Insulin-like growth factor, p21, Bcl-2, p53, Acid Sphinigomyelinase)을 이용하여 종양 조직의 방사선 반응성을 조기 진단하려는 시도가 있었으나 소수의 인자들로 반응성 전체를 해석하기에는 무리가 있어 이 또한 실용화가 힘들었다(Bump EA, Braubhut SJ, Lalayoor ST, Medeiros D, Lai LL, Cerce BA, Langley RE and Coleman CN: Novel concepts in modification of radiation sensitivity. Intl J Radiat Oncol Biol Phys, 29, 249-253, 1994; Hall EJ: Radiobiology for the radiologist. Lippincott, 3rd edition, p357-445, 1988; FitxGerald TJ, Santucci MA, Das I, Kase K, Pierce JH and Greenberger JS: The v-abl, c-fms, or v-myc oncogene induces gamma radiation resistance of hematopoietic progenitor cell line at clinical low dose rate. Int J Radiat Oncol Biol Phys 21: 1203-1210, 1991; Riva C, Lavielli JP, Reyt E, Brambilla E, Lunardi J, Brambilla C: Differential c-myc, c-jun, c-far and p53 expression in squamous cell carcinoma of the head and neck: implication indrug and radioresistance. Eur J Cancer 31B: 384-391, 1995). 방사선에 대한 암세포의 반응성 차이는 많은 연구자들의 주요 연구대상이 되어 왔으나 종양 조직 세포 내에서 방사선에 대하여 반응하는 모든 유전자를 검색할 수 있는 방법이 없어 큰 진전을 보여주지 못했다.
따라서, 이제까지 알려진, 몇몇 인자 및 지표를 사용하여 방사선에 대한 암세포의 반응을 검색하는 방법으로부터 이제는 대량으로 신속하게, 그리고 훨씬 민감한 방법으로 검색하는 것이 요청되어 왔다.
본 발명자들은 현재 단일 유전자 또는 단백질을 예측 인자로 사용하여 방사선에 대한 암세포의 반응을 검색하는 방법의 임상적 비효율성을 극복하기 위하여 거듭된 연구를 수행하여 왔다. 그 결과, 각 암세포별 방사선에 대한 반응에 관여하는 인자들을 신속하고 정확하게 검색하는 방법을 개발해내었다. 또한, 본 발명의 발명자들은 상기 방법에 따라 검출된 유전자군이 방사선치료 효율 증진을 위한 예측 인자의 개발 및 방사선 피폭정도 확인에 유용함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 방사선 치료 효율의 증대를 위한 예측 인자 및 방사선 피폭의 진단을 위한 마커로서의 개발 등에 다양하게 적용될 수 있는 암세포중의 방사선 반응 유전자를 검출하는 방법, 및 상기 방법에 의해 검출된 유전자군을 제공하는 것이다.
첫째, 본 발명은 암세포주에 방사선을 조사하고; 세포로부터 총 RNA 또는 mRNA를 분리하고; 그로부터 cDNA를 제조하고; cDNA를 레이블링하여; 유전자칩과 혼성화하고; 스캐닝 및 이미지 분석을 수행하고; 상기 결과를 방사선을 조사하지 않은 동일한 세포주의 것과 비교하여 발현이 2배 이상 증가 또는 0.5배 이하 감소한 유전자를 검출해냄을 특징으로 하는, 암세포중의 방사선 반응 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
둘째, 본 발명은 상기 방법에 따라 검출된 것임을 특징으로 하는, 암세포중의 유전자군에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 있어서, 암세포가 위암세포인 유전자군이다.
더욱 특히, 본 발명에 있어서, 위암세포에서 방사선에 반응하여 발현이 2배 이상 증가하는 유전자군이 HUMCKMA(크레아틴 키아나제 B(Creatine kinase B)); HSNRD1(NRD 1 컨버라아제(NRD 1 converase)); HUMETR(엔도테린 수용체(Endothelin receptor)); HSPEP19(PEP19); HSU24266(P5CDh); HUMBIGFII(인슐린성 성장 인자 결합 단백질(Insulin-like growth factor binding protein); HUMRXRB〕(레티노이드 X 수용체(Retinoid X receptor)); HUML14D(라노스테롤 디메틸라아제(Lanosterol demethylase)); AB000220(세마포린 E(Semaphorin E)); HSU75370(RNA 폴리머라아제 (RNA polymerase)); HSJ001388(RP58 cDNA); AF010314(피그(Pig10); HSU53468(옥시도리덕타아제(Oxidoreductase)); HSBCRR(Bcr 암유전자 (Bcr oncogene)); HUMMZF1(징크 핑거 프로테인(Zinc finger protein)); HSOCT1(옥타머 결합(Octamerbinding)); 및 AF008591(Rac3) 인 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 발명에 있어서, 위암세포에서 방사선에 반응하여 발현이 0.5배 이하 감소하는 유전자군이 s69232((옥시도리덕타아제(Oxidoreductase)); HUMHSPR (HSR1, HSF성 GTP-결합(HSR1); HUMRALBA (RALB); AF020918(GST4); HSNUP88(NUP88 프로테인(NUP88 protein)); AB002803 (BACH1); 및 HUMCKBR(크테아틴 키나아제 B(Creatine kinase B)인 것으로 밝혀졌다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 방사선에 반응하는 유전자는 방사선 조사에 의해 발현이 2배 이상 증가하거나 0.5배 이하 감소하는 유전자로서 정의된다. 그러한 유전자는 하기와 같은 방법으로 검출할 수 있다.
예를 들면, 인체 암세포주에 감마선을 3.81Gy/분의 선량률로 총 1Gy를 조사하고, 세포로부터 총 RNA 또는 mRNA를 분리한 후, 그로부터 cDNA를 제조하고, cDNA를 레이블링하여, NEN MICROMAX cDNA 마이크로어레이와 혼성화 시킨 후, PIX 4000 마이크로어레이 스캐너(Axon Instrument)로 스캐닝하고 Gene PIX 프로그램에 의해 이미지 분석을 수행한다. 상기 결과를 방사선을 조사하지 않은 동일한 세포주의 것과 비교하여 발현이 2배 이상 증가 또는 0.5배 이하 감소한 유전자를 검출한다. 각 암세포별로 상기와 같은 방법을 수행하여, 각 암세포의 종류에 따라 반응하는 유전자군을 검출할 수 있다.
상기와 같은 방법으로 검출된 유전자군중, 위암세포중의 방사선 반응 유전자군을 하기 표 1 및 2에 나타낸다.
방사선에 의해 발현이 2배 이상 증가하는 유전자군
기호 유전자 명칭 작용
HUMCKMA 크레아틴 키나아제 M 열 충격 단백질
HSNRD1 NRD1 컨버라아제 엔도펩티다아제
HUMETR 엔도테린 수용체 시그날링
HSPEP19 PEP19 고사 억제자
HSU24266 P5CDh 미토콘드리아 디하이드로게아나제
HUMBIGFII 인슐린성 성장 인자 결합 단백질 전이(Metasis)
HUMRXRB 레티노이드 X 수용체 시그날링
HUML14D 라노스테롤 디메틸라아제 스테롤 생합성
AB000220 세마포린 E 약제 내성
HSU75370 RNA 폴리머라아제 미토콘드리아 성분
HSJ001388 RP58 cDNA 약제 내성
AF010314 피그 10 p53 유도성
HSU53468 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 성분
HSBCRR Bcr 암유전자 암유전자
HUMMZF1 징크 핑거 프로테인 고사, 분화
HSOCT1 옥타머 결합 GADD 전사
AF008591 Rac3 NF-kB 공활성자(coactivator)
방사선에 의해 발현이 0.5배 이하 감소하는 유전자군
기호 유전자 명칭 작용
s69232 옥시도리덕타아제 미토콘드리아 성분
HUMHSPR HSR1 HSF성 GTP 결합
HUMRALBA RALB GTP 결합
AF020918 GST4 산화성 스트레스 리듀서(Oxidative stress reducer)
HSNUP88 NUP88 단백질 핵수송
AB002803 BACH1 DNA 수복
HUMCKBR 크레아틴 키나아제 B
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 위암세포에서의 방사선 반응 유전자 검출
인체 위암 세포(AGS(Human Gastric Carcinoma)를 10cm 디쉬(dish)에 심고10% 우태 혈청(FBS(Fetal bovine serum))을 함유하는 RPMI 배지(GIBCO, Gaithersburg, USA)에서 배양하였다. 5% CO2가 존재하는 인큐베이터내에 37°C에서 70-80% 융합(confluence)시까지 유지시킨 후, 감마선(137Cs)(Atomic Energy of Canada, Ltd., Canada)을 3.81Gy/분의 선량률로 총 1Gy를 조사하였다.
조사 24시간 후, 상품화된 트리아졸TM(TriazolTM)(Life Technology, Inc; Gaithersburg, MD, USA)을 이용하여 상기 배양물로부터 약 0.2 g의 총 RNA를 추출한 후, 올리고텍스 비드(oligotex bead(Qiagen Co.; Santa Clarita, CA, USA))를 이용하여 총 RNA로부터 mRNA를 분리하였다.
하기에 기재하는 방법에 따라, 역전사(reverse transcription) 반응을 수행하여 그로부터 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성을 위한 반응 혼합물(Reaction mixture(RT mixure)의 조성은 하기와 같다:
10mM의 dNTP(A,T,G,C 각 2㎕)(NEN, Boston, MA로부터 구입): 8㎕
500μg/ml의 프라이머 (oligo dT)(NEN, Boston, MA로부터 구입) : 2㎕
50ng/㎕ 의 mRNA + RNase가 없는 물(DEPC 처리된 증류수):13㎕
RT 혼합물을 65℃에서 10분간, 25℃에서 5분간 처리한 후, 레이블링을 위해 색깔을 띤 형광 물질을 띤 염기로서 4㎕의 시아닌 3-dUTP(그린)(NEN,Boston,MA; NEL578A)을 첨가하였다. 42℃에서 3분간 처리한 후, 500mM Tris-Hcl(pH 8.3), 400mM KCl 및 60mM MgCl2을 포함하는 2.5㎕의 10 X RT 완충액을 넣고 잘 혼합하였다. 역전사 효소로서 20 유니트/㎕의 2㎕ AMV(Avian Myeloblastosis Virus), 및 RNase 억제제로서 2㎕의 DEPC를 넣고 42℃에서 60분동안 인큐베이션시킨 후, 4℃에서 10분간 방치하였다. 0.5M의 2.5㎕ EDTA를 넣어 반응을 중단시키고 2.5㎕의 1 N NaOH을 넣어 반응물을 가수분해를 하였다. 6.2㎕의 1 M Tris HCl(pH 7.5)를 넣어 중화시키면서, 65℃에서 30분간, 4℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 상기 방법에 따라 합성된 cDNA를 스핀 칼럼(spin column(Millipore Company; Bedford, MA))으로 순수하게 분리하였다.
한편, 방사선에 조사되지 않는 대조군에 대하여, 레이블링을 위해 색깔을 띤 형광 물질을 띤 염기로서 4㎕의 시아닌 3-dUTP(그린)을 대신하여 2㎕의 시아닌 5-dUTP(레드)(NEN,Boston,MA; NEL579A)를 첨가하고, 상기와 동일한 방법으로 cDNA를 합성하고 분리하였다(단, 반응 혼합물을 구성하는 대조군 mRNA의 농도는 50ng/㎕로 실험군과 동일하다).
실험군 및 대조군으로부터 수득한 각 cDNA를 총 부피 25 μl로 혼합하고 형광 이미지가 함유된 마이크로어레이로서 NEN MICROMAX cDNA 마이크로어레이와 혼성화하였다. 결합이 안된 유전자들을 0.01% SDS를 포함하는 0.5 X SSC 및 0.01% SDS를 포함하는 0.06 X SSC로 각각 15분동안 세척하고, 최종적으로 0.06 X SSC로 16분동안 세척하고 건조시켰다. 마이크로어레이상의 형광 이미지를 PIX 4000 마이크로어레이 스캐너(Axon Instruments)로 570nm에서 Cy3 및 670nm에서 Cy5를 스캐닝하고, Gene PIX 프로그램을 사용하여 이미지를 분석하였다. 방사선 조사하지 않은 세포에 비해 발현이 2배 이상 증가했거나 0.5배 이하 감소한 유전자를 방사선에 반응하는 유전자로 간주하였다. 하기 표 3 및 표 4에 상기와 같은 방법으로 검출된, 방사선 반응 유전자군 및 그의 발현 정도를 나타내었다.
방사선 조사한지 24시간 후 발현이 2배 이상 증가하는 위암세포중의 18개 유전자군
기호 증가율(%)
HUMCKMA 860
HSNRD1 810
HUMETR 440
HSPEP19 350
HSU24266 320
HUMBIGFII 300
HUMRXRB 290
HUML14D 280
AB000220 280
HSU75370 280
HSJ001388 230
AF010314 220
HSU53468 220
HSBCRR 220
HUMMZF1 210
HSOCT1 210
AF008591 200
방사선 조사한 지 24시간 후 발현이 0.5배 이하 감소하는 위암세포중의 7개 유전자군
기호 감소율(%)
s69232 2.6
HUMHSPR 9.8
HUMRALBA 14.1
AF020918 20
HSNUP88 24
AB002803 29
HUMCKBR 39
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방사선 반응 유전자를 검출하는 방법은암세포중 방사선에 반응하는 유전자를 대량으로, 동시에, 신속하고 고감도로 검출할 수 있다는 점에서 효과적이다. 또한, 상기 방법에 의해 검출된 유전자군은 예측 인자 및 방사선 피폭의 진단을 위한 마커로서의 개발 등에 다양하게 적용될 수 있고, 이로써 방사선 치료시 각 종양별 방사선 치료 선량을 예측할 수 있으므로 방사선 치료 효율은 극대화될 것이다.

Claims (5)

  1. 위암세포주에 방사선을 조사하고; 세포로부터 총 RNA 또는 mRNA를 분리하고; 그로부터 cDNA를 제조하고; cDNA를 레이블링하여; 유전자칩과 혼성화하고; 스캐닝 및 이미지 분석을 수행하고; 상기 결과를 방사선을 조사하지 않은 동일한 세포주의 것과 비교하여 발현이 2배 이상 증가 또는 0.5배 이하 감소한 유전자를 검출해냄을 특징으로하는, 위암세포중의 방사선 반응 유전자 검출 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 방사선에 반응하여 발현이 2배 이상 증가하는 위암세포중의 유전자가 HUMCKMA(크레아틴 키아나제 B(Creatine kinase B)); HSNRD1(NRD 1 컨버라아제(NRD 1 converase)); HUMETR(엔도테린 수용체(Endothelin receptor)); HSPEP19(PEP19); HSU24266(P5CDh); HUMBIGFII(인슐린성 성장 인자 결합 단백질(Insulin-like growth factor binding protein); HUMRXRB〕(레티노이드 X 수용체(Retinoid X receptor)); HUML14D(라노스테롤 디메틸라아제(Lanosterol demethy lase)); AB000220(세마포린 E(Semaphorin E)); HSU75370(RNA 폴리머라아제(RNA polyme rase)); HSJ001388(RP58 cDNA); AF010314(피그(Pig10); HSU53468(옥시도리덕타아제(Oxido reductase)); HSBCRR(Bcr 암유전자 (Bcr oncogene)); HUMMZF1(징크 핑거 프로테인(Zinc finger protein)); HSOCT1(옥타머 결합(Octamer binding)); 및 AF008591(Rac3)인 검출 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 방사선에 반응하여 발현이 0.5배 이하 감소하는 위암세포중의 유전자가 s69232((옥시도리덕타아제(Oxidoreductase)); HUMHSPR(HSR1, HSF성 GTP-결합(HSR1); HUMRALBA(RALB); AF020918 (GST4); HSNUP88(NUP88 프로테인(NUP88 protein)); AB002803(BACH1); 및 HUMCKBR(크레아틴 키나아제 B(Creatine kinase B)인 방법.
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