KR20020090720A - 전이성 암의 진단방법 및 전이성 암의 진단용ｒｔ―ｐｃｒ 반응 전혼합물 - Google Patents

전이성 암의 진단방법 및 전이성 암의 진단용ｒｔ―ｐｃｒ 반응 전혼합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전이성 암의 진단방법 및 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 (a) 검체로부터 말초 혈액을 얻는 단계; 및 (b) 상기 말초 혈액에 함유된 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합의 전사체 또는 단백질의 발현 정도를 측정하여 전이성 암의 존재를 결정하는 단계를 포함하는 전이성 암의 진단 방법 및 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물에 관한 것으로서, 비교적 용이하게 얻을 수 있는 말초 혈액을 이용하므로 시료를 얻는 데 문제점이 없고, 전이성 단계에 있는 다양한 암의 진단에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

전이성 암의 진단방법 및 전이성 암의 진단용 ＲＴ―ＰＣＲ 반응 전혼합물 {Method for Diagnosis of Metastatic Cancers and RT-PCR Pre-Mixtures for Diagnosis of Metastatic Cancers}
본 발명은 전이성 암의 진단방법 및 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 혼합물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 말초 혈액을 이용한 전이성 암의 진단방법 및 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물에 관한 것이다.
암 진단의 연구는 암의 치료 연구와 함께 분자생물학 및 의학계의 초미의 관심사이다. 그러나, 수 많은 암 진단에 관한 연구가 있었음에도 불구하고, 현재까지 외과적 수술 없이 확실성을 갖고 암을 진단할 수 있는 방법은 개발되어 있지 않은 상태이다. 암 진단 연구는 분자생물학의 발전에 의해, 특히 유전적 결함 및 바이오 마커에 초점이 맞추어져 이루어졌다 (Dong et al.,Science, 268:884(1995)). 예를 들어, 라스 (ras) 발암 유전자의 변형 (transformation), HER-2/neu의 증폭, p53의 결손 및 변이, DCC의 결손 및 BRCA1의 변이 등에 관한 암진단 연구가 있어 왔다.
한편, 상술한 유전적 결함은 암 환자를 완전하게 진단할 수 없었고, 정상인에서도 포지티브한 결과를 보이는 경우가 많았으며, 대부분은 의심되는 조직의 직접적인 샘플링을 요구하는 문제점이 있다.
암의 진단과 관련된 특허로서, 미합중국 특허 제 5,942,385호는 VEGF (vascular endothelial growth factor)를 마커로 이용하는 전이성 암의 진단방법을 개시하고 있다. 미합중국 특허 제 6,171,796호는 트랜스글루타미나아제 등을 이용한 전이성 전립선 암의 진단방법을 개시하고 있다. 미합중국 특허 제 6,190,857호는 인터루킨 8 또는 인터루킨 10을 바이오마커로 이용하는 전립선 암의 진단방법을 개시하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
따라서, 본 발명의 목적은 전이성 암의 진단방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 전이성 암 진단용 RT-PCR 반응 혼합물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 검체로부터 말초 혈액을 얻는 단계; 및 (b) 상기 말초 혈액에 함유된 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합의 전사체 또는 단백질의 발현 정도를 측정하여 전이성 암의 존재를 결정하는 단계를 포함하는 전이성 암의 진단 방법을 제공한다.
본 발명자들은 용이하게 수득할 수 있는 말초 혈액 (peripheral blood)을 이용한 효율적인 전이성 암의 진단방법을 연구하였고, 결국 말초 혈액 내에 포함되어 있는 hEST2, TEM2 (Tumor endothelial marker 2), 안지오포이에틴-2 (angiopoietin-2), TIE2 단백질 또는 그의 전사체 (예: 스플라이싱된 mRNA)의 발현 정도가 전이성 암과 유의적으로 관련이 있음을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 종래에 종양 마커 또는 종양에 관계되는 것으로 규명된 생분자가, 혈액 시료를 이용한 전이성 암의 진단에 진단학적 가치를 갖는 지 여부에 대하여 과도한 확인 작업을 하였다.
상기 hEST2는 사람의 텔로머라아제 촉매 서브유니트 (Homo sapiens telomerase catalytic subunit)로서, 초기 종양, 암 세포주 등에서 높은 수준으로 발현된다는 것이 공지되어 있다 (Meyerson, M. et al., Cell, 90:785(1997)). 그러나, hEST2가 말초 혈액을 이용한 전이성 암의 진단에 이용될 수 있다는 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 확인되었다.
상기 TEM2는 종양의 내피세포 마커로서 공지된 것이다 (Brad St. Croix etal.,Science, 289:1197(2000)). 그러나, TEM2가 말초 혈액을 이용한 전이성 암의 진단에 이용될 수 있다는 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 확인되었다.
한편, 상기 안지오포이에틴-2 및 TIE2는 종양의 혈관 형성 (angiogenesis)에 관여하는 단백질이다. 종양의 혈관 형성은 암의 전이와 직접적인 관련이 있는 것으로 공지되어 있다 (Araya, M. et al.,J. Surg. Oncol., 65:232(1997); Hanahan, D. et al.,Cell, 86:353(1996)). 상기 안지오포이에틴-2 및 TIE2는 종양의 혈관혈성에 관여하는 단백질로서 종양 조직에서 그들의 발현이 증가된다는 사실이 공지되어 있다 (Tsuyoshi Etoh, et al.,Cancer Res., 61:2145(2001)). 그러나, 안지오포이에틴-2 및 TIE2가 말초 혈액을 이용한 전이성 암의 진단에 이용될 수 있다는 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 확인되었다.
본 발명의 진단방법에 있어서, 상기한 진단학적 유의성을 갖는 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2 또는 TIE2의 전사체 또는 단백질은 단독적으로 이용될 수도 있으나, 가장 바람직하게는 상기한 바이오 마커의 조합을 이용하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 말초 혈액에 함유된 내피 세포 내의 전사체의 발현 정도는 상기 전사체의 일부 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 방사선 또는 형광 표지된 핵산 분자와의 혼성화 반응에 의해 측정된다. 상기의 방사선 또는 형광 표지된 핵산 분자 (DNA 또는 RNA)는 전형적으로 10-20 뉴클레오티드가 적합하고, 상기 범위보다 더 긴 서열일 수도 있다.
상기의 혼성화 반응은 서던 블롯팅 및 노던 블롯팅과 같은 당업계에서 일반적으로 이루어지는 혼성화 반응 방법 (Southern, E.,J. Mol. Biol.98:503(1975);Thomas, P.S.,Methods in Enzymology, 100:255(1983); Thomas, P.S.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201(1980))에 따라 실시될 수 있다. 상기 혼성화 반응에 이용되는 프로브의 방사선 표지 또는 형광 표지는 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 실시될 수 있다 (Multiple DNA labelling systems booklet, Ammersham(1989); 및 Maxam & Gilbert,Methods in Enzymology, 65:499(1986)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 말초 혈액에 함유된 내피 세포 내의 전사체의 발현 정도는 RT-PCR (reverse transcriptase-PCR)에 의해 측정된다. 본 발명에서의 RT-PCR은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법에 따라 실시될 수 있다.
RT-PCR은 역전사 반응과 PCR이 결합된 것으로서, 역전사 반응은 예컨대 Sambrook et al.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)에 개시된 방법을 간단하게 변형하여 실시할 수 있다. PCR은 예컨대 미합중국 특허 제 4,683,195호, 제 4,683,202호 및 제 4,800,159호에 개시된 방법을 간단하게 변형하여 실시할 수 있다. 한편, 상기한 RT-PCR은 2-튜브 방법 또는 1-튜브 방법 (참조: QIAGEN One step RT-PCR 키트 카달로그 #210212)으로 실시할 수 있으며, 보다 바람직하게는 편의성을 고려하여 1-튜브 방법으로 실시하는 것이다.
RT-PCR 반응에서 이용되는 프라이머는 10-25 bp 길이의 올리고뉴클레오티드가 일반적으로 이용되며, 증폭하고자 하는 서열의 말단 부위의 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 것이 전형적이다. 프라이머를 디자인하는 경우에는 Omiga 프로그램과 같은 컴퓨터 프로그램이 이용될 수도 있다. 본 발명의 진단방법에서, hEST2의 cDNA를 증폭하는 경우에는 예컨대, 서열 1 및 서열 2와 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 이용될 수 있으며, TEM2의 cDNA를 증폭하는 경우에는 예컨대, 서열 3 및 서열 4와 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 이용될 수 있고, 안지오포이에틴-2의 cDNA를 증폭하는 경우에는 예컨대, 서열 5 및 서열 6과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 이용될 수 있으며, TIE2의 cDNA를 증폭하는 경우에는 예컨대, 서열 7 및 서열 8과 같은 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머가 이용될 수 있다.
RT-PCR의 최종 산물은 에티늄 브로마이드 염색과 같은 당업계에 공지된 방법에 따라 확인할 수 있다. 이러한 RT-PCR은 정량적으로 실시되어 매우 정밀하게 전사체의 양을 확인할 수 있다. 정량적 RT-PCR은 PCR 반응 자체의 여러 특성 때문에 접근하기가 어렵지만, Gilliland G. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87:2725(1990) 및 Sykes P. et al.,Biotechniques, 13:444(1992)에 개시된 방법을 간단하게 변형하면 정량적인 실시가 가능하다.
말초 혈액에 함유된 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2 또는 TIE2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 이용하는 경우에는, hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2 또는 TIE2를 단독적으로 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 상기한 단백질을 모두 이용하여 진단하는 것이다.
상기의 발현된 단백질의 양은 ELISA (Voller, A. et al.,J. Clin. Pathol.,31:507(1978)) 또는 방사선 면역분석 (Weintraub, B.,Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radio-ligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March(1986))에 의해 측정될 수 있다. 상기 분석에 이용되는 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2 또는 TIE2 단백질에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 폴리클로날 항체인 경우에는 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있고, 모노클로날 항체인 경우에는 미합중국 특허 제 4,196,265호에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 검체로부터 말초 혈액을 얻는 단계; 및 (b) 상기 말초 혈액으로부터 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합에 대한 전사체의 발현 정도를 RT-PCR로 측정하여 전이성 암의 존재를 결정하는 단계를 포함하는 전이성 암의 진단방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 검체로부터 말초 혈액을 얻는 단계; (b) 상기 말초 혈액으로부터 내피 세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 내피 세포 내에 존재하는 TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합에 대한 전사체의 발현 정도를 RT-PCR로 측정하여 전이성 암의 존재를 결정하는 단계를 포함하는 전이성 암의 진단방법을 제공한다.
TEM2, 안지오포이에틴-2 및 TIE2는 위에서 인용한 문헌 및 기타 다른 문헌에서 내피 세포에 존재하는 단백질로 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 진단방법은 상기한 바이오 마커를 함유하는 내피 세포만을 말초 혈액으로부터 특이적으로 분리하여 사용한다. 이러한 경우에는, 전이성 암에 대한 진단이 보다 큰 특이성 및 민감도를 갖고 실시될 수 있다.
상기한 본 발명의 진단방법은 혈액을 통해 전이되는 암, 예컨데, 위암, 폐암, 유방암 및 간암 등의 진단에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합에 대한 전사체에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머; dATP, dGTP, dCTP와 dTTP의 혼합물; 그리고 열안정성 중합효소와 열안정성 역전사효소의 혼합물을 포함하는 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물 (pre-mixture)을 제공한다.
본 발명의 RT-PCR 반응 전혼합물에는 PCR에 사용되는 것으로 당업계에 공지된 완충액 (예: Tris-HCl 완충액), K+이온, Mg2+이온 등이 포함되어 있다.
본 발명의 반응 혼합물에 있어서, 상기 hEST2의 전사체에 대한 RT-PCR 용 프라이머는 서열 1 및 서열 2에 기재된 염기서열을 갖는 것 또는 이의 기능적 등가물이 가장 바람직하다.
본 명세서에서 용어 "센스 프라이머 및 안티센스 프라이머의 기능적 등가물"은 본 발명에서 이용되는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머과 거의 유사한 효율로 PCR을 프라이밍 할 수 있는 것으로서, 예컨대, 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머에 의해 인코딩되는 아미노산에 대한 축퇴성 (degeneracy; Crick, F.H. et al., Nature, 192:1227(1961)) 염기 서열을 갖는 프라이머를 의미하는 것이다.
상기 TEM2의 전사체에 대한 RT-PCR 용 프라이머는 서열 3 및 서열 4에 기재된 염기서열을 갖는 것 또는 이의 기능적 등가물이 가장 바람직하다.
본 발명의 혼합물에서, 상기 안지오포이에틴-2의 전사체에 대한 RT-PCR 용 프라이머는 서열 5 및 서열 6에 기재된 염기서열을 갖는 것 또는 이의 기능적 등가물이 가장 바람직하다.
본 발명의 혼합물에서, 상기 TIE2의 전사체에 대한 RT-PCR 용 프라이머는 서열 7 및 서열 8에 기재된 염기서열을 갖는 것 또는 이의 기능적 등가물이 가장 바람직하다.
한편, 상기 열안정성 중합효소와 열안정성 역전사효소의 혼합물은 Tth DNA 중합효소, AMV 역전사효소와 Taq DNA 중합효소의 혼합물; AMV 역전사효소 및 Tfl DNA 중합효소의 혼합물 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상술한 본 발명의 진단방법은 하기의 실시예에서 확인할 수 있듯이, 민감도 및 특이성이 매우 큰 방법으로서, 오진이 다발하는 종래의 암 진단방법을 대체할 수 있는 획기적인 발명이다. 한편, 종래의 암 진단에 있어서 오진이 다발했던 이유 중 하나는, 암 이외의 다른 환부 치유 (wound healing)가 발생하는 경우에도 암의 마커에 대한 포지티브한 결과가 나오기 때문이다. 그러나, 본 발명의 진단방법에서 이용하는 바이오 마커는 예컨데, 하기의 실시예에서 확인할 수 있듯이, 위암과 위궤양에서의 발현되는 패턴, 보다 구체적으로는 위암과 위궤양에서 말초 혈액에서 검출되는 양상이 확연하게 차이가 난다.
따라서, 본 발명의 진단방법을 이용하는 경우에는 위궤양과 위암을 확연하게 구별하여 위암을 진단할 수 있는 것이다. 이러한, 특성은 종래의 진단방법에서는 찾아볼 수 없는 본 발명만의 우수한 특성이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 Ⅰ: 혈액으로부터 mRNA의 수득
Ⅰ-1:혈액으로부터 연막의 분리
검체 (위암 환자 21명, 위궤양 환자 8명 및 정상인 7명)로부터 혈액 5 ㎖을 채혈한 다음, 수집된 혈액을 ACD 튜브에 넣고 4℃에서 보관하였으며, 단 보관 기간은 하루를 넘지 않도록 하였다. 상기 환자는 서울대학교 의과대학 부속병원에 임원해 있는 환자이다. 한편, 위암 환자는 TNM 분류방법 (Stomach. In: AmericanJoint Committee on Cancer: Manual for Staging of Cancer. Philadelphia: JB Lippincott Company, 4th ed., 63-67(1992))에 따라 그 단계를 결정하였고, 단계 Ⅰ은 9명, 단계 Ⅲ은 5명, 단계 Ⅳ는 3명, GIST (Gastrointestinal Stromal Tumor)는 3명 그리고 미지의 위암 환자가 1명이다.
한편, 정상인 대조군 뿐만 아니라, 위궤양 대조군도 이용함으로써 본 발명의 진단방법이 암에 대하여 특이성이 매우 높음을 확인할 수 있도록 하였다.
이어, 1000g에서 5분 동안 원심분리해서 층분리를 시키고, 연막 (buffy coat)을 마이크로피펫을 이용하여 분리해 내었다. 분리한 연막을 10 ㎖의 RBC 분해 완충액에 첨가하고 부드럽게 10분 동안 교반하였다. 한편, 상기 RBC 분해 완충액은 암모늄 클로라이드 0.8 g, 포타슘 바이카보네이트 0.1 g 및 0.5 M EDTA 20 ㎕를 삼차 증류수 100 ㎖에 용해한 후 필터링하여 사용하였다. 그런 다음, 다시 1000g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액은 버리고 펠릿만 실험에 이용하였다.
Ⅰ-2:연막으로부터 mRNA의 분리
mRNA는 QIAGEN 키트 (올리고텍스 디렉트 mRNA 미니 키트: cat# 72022)를 이용하여 얻었다. 우선, 상기 실시예 Ⅰ-1에서 얻은 연막 펠릿에 1 ㎖의 분해 완충액과 30 ㎕의 베타 ME (Mercaptoethanol)를 첨가하였다. 이어, 올리고텍스 현탁액을 70 ㎕을 첨가한 다음, 용출 완충액 (5 mM Tris-Cl, pH 7.5) 200 ㎕를 첨가하여 mRNA를 용출하였다. 이렇게 하여 얻은 mRNA는 -70℃에서 보관하였다.
실시예 Ⅱ: RT-PCR을 이용한 cDNA의 증폭 및 확인
Ⅱ-1:RT-PCR
QIAGEN 1 스텝 RT-PCR 키트 (cat# 210212)를 이용하여 실시하였고, 전체 반응 부피는 25 ㎕로 하였다. 반응액은 5X 완충액 (Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4, 12.5 mM MgCl2, DTT, pH 8.7) 5 ㎕, dNTP 믹스 (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 10 mM) 1 ㎕, Q 용액 5 ㎕, 센스 프라이머 1 ㎕, 안티센스 프라이머 1 ㎕, 효소 믹스 (OmniscriptTM및 SensiscriptTM역전사 효소, 그리고 HotStarTaqTMDNA 중합효소) 1 ㎕, 및 RNase 부재 증류수 6 ㎕를 순서대로 혼합하여 마스터 믹스를 만든 다음, 상기 실시예 Ⅰ-2에서 얻은 mRNA를 5 ㎕을 첨가하여 혼합하여 최종적으로 제조하였다. 상기 반응액 제조는 모두 얼음에서 실시하였다. 상기 이용된 프라이머는 첨부한 서열 1 내지 12와 같고, (주)코스모젠텍에 의뢰하여 합성한 것이다. RT-PCR 반응은 하이바이드 장치 (hybaid machine; (주)자연과학)를 이용하여 실시하였고, 각각의 목적 mRNA에 대한 구체적인 반응 조건은 다음 표 1과 같다. 본 실시예에 증폭된 cDNA는 hEST2, 즉 사람의 텔로머라아제 촉매 서브유니트 (Homo sapiens telomerase catalytic subunit), 안지오포이에틴-2 (이하 "ANGPT2"라 한다), TEM2 유전자, 즉 사람의 종양 내피 마커 2 (Homo sapiens tumor endothelial marker 2), TIE2, EphB3 또는 EphA2에 대한 cDNA이다. 상기 EphB3는 EphB3는 에프린 (Ephrin) B2의 수용체이고, EphA2는 에프린 (Ephrin) A1의 수용체로서 공지되어 있다 (Nature, 407:242-248(2000)).
구 분 RT 조건 PCR 조건
hEST2 50℃ 1시간/95℃ 15분 94℃ 30초/56.3℃ 1분/72℃ 1분 (총 30 사이클)
TEM2 50℃ 1시간/95℃ 15분 94℃ 30초/57℃ 1분/72℃ 1분 (총 30 사이클)
ANGPT2 50℃ 1시간/95℃ 15분 94℃ 30초/56.3℃ 1분/72℃ 1분 (총 30 사이클)
TIE2 50℃ 1시간/95℃ 15분 94℃ 30초/59℃ 1분/72℃ 1분 (총 30 사이클)
EphB3 50℃ 1시간/95℃ 15분 94℃ 30초/53℃ 1분/72℃ 1분 (총 30 사이클)
EphA2 50℃ 1시간/95℃ 15분 94℃ 30초/57℃ 1분/72℃ 1분 (총 30 사이클)
Ⅱ-2:RT-PCR 결과물의 확인
상기 실시예 Ⅱ-1에서 증폭된 cDNA를 확인하기 위하여, 최종 생성물에 6 x 염색액 (0.25% 브로모페놀 블루 및 30% 글리세롤을 혼합하여 총 50 ㎖를 제조하여 사용함) 1.5 ㎕을 첨가 및 혼합하고, 25 ㎕을 취하여 2%의 아가로스 겔에 로딩하였다. 이어, 100 V로 4.5 ㎝ 정도 내려가도록 러닝하고, 러닝이 종결된 다음 BIPS 기계 ((주)바이오메드랩)를 이용하여 겔 사진을 촬영하였다. 한편, 최종적으로 얻은 겔 밴드 이미지 파일 (.tif)을 이미지 J 프로그램 (Image J program)을 이용하여 그 밴드 세기를 정량화 하였다. 상기 이미지 프로그램은 http//rsb.info.nih.gov/nih-image/에서 다운로드 받아 사용한 것이다.
또한, 상기 실시예 Ⅱ-1의 RT-PCR을 실시할 때, GAPDH 유전자, 즉 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제을 코딩하는 서열에 대하여도 RT-PCR를 실시하였고, 이는 시료에서 mRNA가 파괴되지 않았음을 보여주는 내부 대조군 (internal control) 및 정량에 있어서 기준으로 참조하기 위한 것이다. 결과는 선명한 RT-PCR 결과물 밴드가 관찰되었고, 이로부터 mRNA가 파괴되지 않았음을 확인할 수 있었다.
하기의 표 2는 상기한 결과들을 정리한 것이다. 먼저, 표 2a는 위암 환자에 대한 실험 결과를 요약한 것이다.
구 분 hEST2 ANGPT2 TIE2 TEM2 EphB3 EphA2
위암1 ++1 52.4942 + 13.67 ++ 47.369 +++ 130.372 +++ 133.305 +3
위암2 + 18.601 + 0 - 0 - 0 + 22.007 +
위암3 + 17.895 ++ 30.23 + 9.609 + 9.653 + 13.908 +
위암4 + 20.012 + 18.01 ++ 41.392 + 10.739 + 18.39 +
위암5 + 25.987 + 8.345 + 10.502 + 15.347 + 30.255 +
위암6 - 0 + 9.822 + 8.332 + 18.928 + 32.181 +
위암7 ++ 50.234 + 8.787 + 9.703 + 16.092 + 26.13 +
위암8 + 16.987 + 10.26 + 8.741 +3 16.631 ++ 53.611 +
위암9 + 19.781 + 7.432 - 0 + 8.401 + 15.679 +
위암10 + 17.682 + 8.339 ++ 32.459 + 17.793 ++ 82.329 -
위암11 + 16.890 + 9.66 + 19.456 ++ 62.059 + 14.849 -
위암12 + 18.901 + 11.19 ++ 42.066 +++ 102.486 + 22.169 +
위암13 + 13.551 + 9.561 + 21.3 + 23.44 + 49.564 +3
위암14 + 15.313 + 10.42 + 25.75 +3 16.74 ++ 98.131 ++3
위암15 + 13.979 + 14.19 + 23.662 ++ 100.788 +++ 113.821 ++3
위암16 ++ 30.243 + 12.35 + 7.072 +++ 136.842 ++ 98.317 ++3
위암17 + 12.897 - 0 + 9.374 +3 17.005 + 29.081 +3
위암18 - 0 + 7.56 + 8.822 + 12.653 + 32.883 -
위암19 + 18.987 + 8.94 + 10.741 - 0 + 15.613 -
위암20 + 16.827 + 9.56 - 0 + 14.789 + 21.758 -
위암21 + 17.890 - 0 + 12.897 - 0 + 36.482 -
1육안 관찰;2덴시토미터; 및3두 밴드 관찰됨
하기의 표 2b는 위궤양 환자 및 정상인에 대한 결과를 요약한 것이다.
구 분 hEST2 ANGPT2 TIE2 TEM2 EphB3 EphA2
궤양1 -1 0.4932 - 0 - 0 +3 1.892 + 24.388 +
궤양2 - 0 - 0 - 0 - 0 + 11.875 -
궤양3 - 0 - 0 - 0 - 1.046 + 49.382 +
궤양4 - 0 - 0 - 2.471 +3 32.009 + 64.833 +
궤양5 - 0 - 0 - 0 - 0.407 ++ 89.767 +
궤양6 - 0 - 0 + 19.928 -3 0.348 ++ 89.402 +
궤양7 - 0 - 0 - 0 - 0 + 13.471 +
궤양8 - 0 - 0 - 2.664 - 0 + 8.477 +
정상1 - 0 - 0 - 1.741 - 0 ++ 32.134 +
정상2 - 0 - 0 - 0 - 0 ++ 42.516 +
정상3 - 0 - 0 - 3.571 -3 1.866 + 30.837 +
정상4 - 0 - 0 - 0.981 - 0 + 9.595 -
정상5 - 0 - 0 - 1.207 - 0.563 ++ 45.617 +
정상6 - 0 - 0 - 0 - 0.362 ++ 84.531 +
정상7 - 0 - 0 - 0.807 -3 0.813 ++ 63.531 +
1육안 관찰;2덴시토미터; 및3두 밴드 관찰됨
우선, hEST2에 대한 결과를 살펴보면 다음과 같다: 거의 모든 위암 환자에서 확실한 밴드들이 관찰되었고, 궤양 환자 및 정상인에서는 밴드들이 전혀 관찰되지 않았으며, 덴시토미터로 측정한 결과에서도 거의 값을 나타내지 않았다. 따라서, hEST2는 말초혈액 시료 내의 내피 세포를 이용하는 본 발명의 진단방법에 적합하게 매우 바람직한 발현 양상을 나타냄을 알 수 있다.
또한, TEM2에 대한 RT-PCR 결과를 살펴 보면, 거의 모든 위암 환자에서 밴드들이 관찰되었고, 5개의 아주 강한 밴드들이 관찰되었다. 그러나, 위궤양 환자에서는 밴드들이 거의 관찰되지 않았고, 1개의 밴드만이 어느 정도 강도로 나타났을 뿐이었다. 또한, 정상인에서는 거의 밴드들이 관찰되지 않았다. 따라서, TEM2는 말초혈액 시료 내의 내피 세포를 이용하는 본 발명의 진단방법에 적합하게 매우 바람직한 발현 양상을 나타냄을 알 수 있다.
한편, ANGPT2에 대한 RT-PCR 결과를 살펴 보면, 거의 모든 위암 환자에서 밴드들이 관찰되었다. 위궤양 환자 및 정상인에서는 전혀 밴드들이 관찰되지 않았다. 따라서, ANGPT2는 말초혈액 시료 내의 내피 세포를 이용하는 본 발명의 진단방법에 적합하게 매우 바람직한 발현 양상을 나타냄을 알 수 있다.
TIE2에 대한 결과를 살펴보면, 거의 모든 위암 환자에서 밴드들이 관찰되었고, 밴드들이 세기가 대체적으로 컸다. 한편, 몇몇의 위궤양 환자에서도 밴드들이 관찰되었으나, 그 세기가 작았으며, 정상인에서는 밴드가 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, TIE2는 말초혈액 시료 내의 내피 세포를 이용하는 본 발명의 진단방법에 적합하게 매우 바람직한 발현 양상을 나타냄을 알 수 있다.
EphB3에 대한 결과를 살펴보면, 모든 위암 환자에서 밴드들이 관찰되었고, 밴드들이 세기가 대체적으로 컸다. 그러나, 위궤양 환자 및 정상인에서도 밴드들이 관찰되었으며, 대체적으로 밴드들의 세기가 컸다. 따라서, EphB3는 위암 환자에서 발현 양상이 아주 우수하나, 위궤양 환자 및 정상인에서도 유사한 발현 양상을 나타내어, 말초혈액 내 위암 마커로서 적절하지 않음을 알 수 있다. EphB3는 말초혈액 시료 내의 내피 세포를 이용하는 본 발명의 진단방법에는 진단학적 가치가 없다.
한편, EphA2에 대한 결과를 살펴보면, 거의 모든 위암 환자에서 밴드들이 관찰되었고, 다수의 위궤양 환자 및 정상인에서도 밴드들이 관찰되었다. 따라서, EphA2는 위암 환자에서 발현 양상이 아주 우수하나, 위궤양 환자 및 정상인에서도유사한 발현 양상을 나타내어, 말초혈액 내 위암 마커로서 적절하지 않음을 알 수 있다. 상술한 바와 같이 EphA2는 말초혈액 시료 내의 내피 세포를 이용하는 본 발명의 진단방법에는 진단학적 가치가 없다.
결론적으로, 말초혈액 시료 내의 내피 세포를 이용하는 본 발명의 진단방법에는 hEST2, ANGPT2, TIE2 및 TEM2가 개별적으로 또는 그 조합으로 전이성 암에 대한 마커의 역할을 할 수 있음을 확인할 수 있다.
Ⅱ-3:본 발명의 진단방법의 특이성 및 민감도
상기 표 2a 및 2b에 기재된 데이터를 기초로 하여, 말초혈액 내에 포함된 hEST2, ANGPT2, TIE2 또는 TEM2를 이용한 본 발명의 진단방법의 위암에 대한 민감도 (sensitivity) 및 특이성 (specificity)을 계산하였다. 계산은 Aviva Petrie 및 Caroline Sabin,Medical Statistics at a Glance, Blackwell Science Co., p. 90에 기재된 방법에 따라 하였고, 그 값들은 다음 표 3과 같다.
구 분 hEST2 ANGPT2 TIE2 TEM2
민감도 위암 단계 Ⅰ 88.90% 77.80% 77.80% 77.80%
위암 단계 Ⅲ 100% 80% 100% 80%
위암 단계 Ⅳ 100% 100% 100% 100%
GIST 66.70% 100% 100% 100%
모든 위암 단계 90.50% 85.7% 85.70% 85.70%
특이성 100% 100% 100% 100%
상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 진단방법은 위암의 모든 단계에 대하여 민감도가 매우 크다. 또한, 특이성은 100%로 계산되어 우수한 진단방법임을 알 수 있다.
본 발명은 말초 혈액을 이용한 전이성 암의 진단방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 진단방법은 비교적 용이하게 얻을 수 있는 말초 혈액을 이용하므로, 시료를 얻는 데 문제점이 없고, 전이성 단계에 있는 다양한 암의 진단에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 다음과 같은 단계를 포함하는 전이성 암의 진단 방법:
    (a) 검체로부터 말초 혈액을 얻는 단계; 및
    (b) 상기 말초 혈액에 함유된 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합의 전사체 또는 단백질의 발현 정도를 측정하여 전이성 암의 존재를 결정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 전사체의 발현 정도는 상기 전사체의 일부 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는 방사선 또는 형광 표지된 핵산 분자와의 혼성화 반응에 의해 측정됨을 특징으로 하는 전이성 암의 진단 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 전사체의 발현 정도는 RT-PCR에 의해 측정됨을 특징으로 하는 전이성 암의 진단방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질의 발현 정도는 상기 단백질에 대한 항체를 이용하는 ELISA 또는 방사선 면역분석에 의해 측정됨을 특징으로 하는 전이성 암의진단방법.
  5. 다음과 같은 단계를 포함하는 전이성 암의 진단방법:
    (a) 검체로부터 말초 혈액을 얻는 단계; 및
    (b) 상기 말초 혈액으로부터 hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합에 대한 전사체의 발현 정도를 RT-PCR로 측정하여 전이성 암의 존재를 결정하는 단계.
  6. 다음과 같은 단계를 포함하는 전이성 암의 진단방법:
    (a) 검체로부터 말초 혈액을 얻는 단계;
    (b) 상기 말초 혈액으로부터 내피 세포를 분리하는 단계; 및
    (c) 상기 내피 세포 내에 존재하는 TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합에 대한 전사체의 발현 정도를 RT-PCR로 측정하여 전이성 암의 존재를 결정하는 단계.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 위암, 폐암, 유방암 및 간암으로부터 선택되는 1 종 이상의 암을 진단하는 데 이용됨을 특징으로하는 전이성 암의 진단방법.
  8. hEST2, TEM2, 안지오포이에틴-2, TIE2 또는 이들의 조합에 대한 전사체에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머; dATP, dGTP, dCTP와 dTTP의 혼합물; 그리고 열안정성 중합효소와 열안정성 역전사효소의 혼합물을 포함하는 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 hEST2의 전사체에 대한 RT-PCR 용 프라이머는 서열 1 및 2에 기재된 염기서열을 갖는 것 또는 이의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 TEM2의 전사체에 대한 RT-PCR 용 프라이머는 서열 3 및 서열 4에 기재된 염기서열을 갖는 것 또는 이의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 안지오포이에틴-2의 전사체에 대한 RT-PCR 용 프라이머는 서열 5 및 서열 6에 기재된 염기서열을 갖는 것 또는 이의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 TIE2의 전사체에 대한 RT-PCR 용 프라이머는 서열 7 및 서열 8에 기재된 염기서열을 갖는 것 또는 이의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 열안정성 중합효소와 열안정성 역전사효소의 혼합물은 Tth DNA 중합효소, AMV 역전사효소와 Taq DNA 중합효소의 혼합물; AMV 역전사효소 및 Tfl DNA 중합효소의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 전이성 암의 진단용 RT-PCR 반응 전혼합물.
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KR100475642B1 (ko) * 2001-12-29 2005-03-10 한국생명공학연구원 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단킷트

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