JP2004121205A - 環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】環境有害物質によるストレスに特異的に反応する環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析法の提供。
【解決手段】メダカ（学名：Ｏｒｚｙｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）内で環境有害物質によるストレスに特異的に反応するｃＤＮＡ ｐｏｏｌｓを選定し、基板に固着化して環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップを製作し、これを用いて環境有害物質に対する水中生物体の生理的な反応を迅速に検索するための環境有害性分析方法である。メダカｃＤＮＡチップ及びこれを用いた環境有害性分析方法は、特異的に有害性に発現する２２種の遺伝子を含めているため、２２種の遺伝子発現可否及び定量的な分析を一回で実行することができる。また内分泌系混亂効果、細胞毒性効果、癌発生効果、及び生体発生関連毒性効果の生体ストレス形態区分が可能になる。
【選択図】 図１
【解決手段】メダカ（学名：Ｏｒｚｙｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）内で環境有害物質によるストレスに特異的に反応するｃＤＮＡ ｐｏｏｌｓを選定し、基板に固着化して環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップを製作し、これを用いて環境有害物質に対する水中生物体の生理的な反応を迅速に検索するための環境有害性分析方法である。メダカｃＤＮＡチップ及びこれを用いた環境有害性分析方法は、特異的に有害性に発現する２２種の遺伝子を含めているため、２２種の遺伝子発現可否及び定量的な分析を一回で実行することができる。また内分泌系混亂効果、細胞毒性効果、癌発生効果、及び生体発生関連毒性効果の生体ストレス形態区分が可能になる。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は環境有害物質に特異的に反応するメダカ遺伝子種を選定してチップに固着させた環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ（ｃｈｉｐ）及びこれを用いた環境有害性分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、環境有害物質（内分泌系障害物質−環境ホルモン）が生態系及び人間の生殖機能低下、奇形、成長障害及び癌などを誘発し、全ての生物種に威しになることができるという認識が提起されてからオゾン層の破壊及び地球温暖化問題とともに新たな環境問題として擡頭されている。
【０００３】
環境有害物質として推定される物質などは、各種の産業用化学物質（原料物質）、殺虫剤、及び除草剤などの農薬類、有機重金属類、ダイオキシン類、植物に存在する植物性エストロゲンなどのホルモン類似物質、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）のような医薬品として使用される合成エストロゲン類及び食品添加物があり、このような環境有害物質の計測方法を開発し利用することは、環境有害物質の発見及びこれらの毒性学的意味の定量的分析において必要である。
【０００４】
なお、環境有害物質の超高感度機器分析技法開発やバイオマーカーの確認及び計測法開発は、生態系内で環境有害物質の実態を解明するのに極めて重要である。
【０００５】
特に、最近まで環境ホルモンとして知られているノニルフェノール（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ）、ビスフェノールＡ（ｂｉｓｐｈｅｎｏｌＡ）、ベーターエストラジオール（ｂｅｔａ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、フタル酸（ｐｈｔｈａｌａｔｅ）、及びダイオキシン（ｄｉｏｘｉｎ）などの有害物質と、細胞毒性を誘発するものとして知られているフェノール（ｐｈｅｎｏｌ）類など、そして、メチルビオロゲン（ｍｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ）、アルドリン（ａｌｄｒｉｎ）、及びイソドリン（ｉｓｏｄｒｉｎ）などの農薬類のストレス分類及び水中生物体の生理的な反応を遺伝子水準で迅速に検索するための方法が要求される。
【０００６】
一方、従来ヒューマンゲノムプロジェクトを含んだ多い有機体のゲノムプロジェクトが遂行されて数多い遺伝情報が沢山出てくることによって、これをどのように解析し、互いに連関つけることができるかに対して多い関心と研究とがなされている。そのうち、最近に開発されたＤＮＡチップは、短い時間に大量の情報を分析でき、自動化が容易であるため、多くのゲノムプロジェクトから蓄積された膨大な量の遺伝情報を用いて試料を効率的に分析する方法として最も注目を浴びている。
【０００７】
ＤＮＡチップは、付ける遺伝物のサイズによってオリゴヌクレオチドチップ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９）とｃＤＮＡチップ（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）とに区分できる。オリゴヌクレオチドチップには約１５〜２５個の塩基などからなったオリゴヌクレオチドが付けられており、塩基の序列を知っているから、一つの塩基変化による多様性に対する研究（ ＳＮＰｓ， ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）が可能である。しかしながら、必ず序列情報が必要であり、実際にいくｋｂになる遺伝子からごく一部の塩基のみを窺ってみることであるため、どの部分を選択することに問題が残る。これと異なってｃＤＮＡチップはＳＮＰｓを見ることはできないが、塩基その自体が大きく、序列情報が必須的ではないため、遺伝子の発現分析に強力し、且つ有用な道具になる。
【０００８】
既存に便利性、価格及び敏感度においてそれぞれ異なる多様な技術などが遺伝子発現を分析するために用いられてきた。例えば、差別的展示（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）、 索引化（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）、控除混成化（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、及び多くのＤＮＡフィンガープリンティング技術など、例えば、Ｖｏｓなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：４４０７−４４１４ （１９９５）；Ｈｕｂａｎｋなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：５６４０−５６４８（１９９４）； Ｌｉｎｇｏなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９６７−９７１（１９９２）；Ｅｒｌａｎｄｅｒなど、国際特許出願 ＰＣＴ／ＵＳ９４／１３０４１；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄなど、米国特許第５，４３７，９７５号；Ｕｎｒａｕなど、 Ｇｅｎｅ，１４５：１６３−１６９（１９９４）； などが含まれる。また、ｍＲＮＡ水準における遺伝子発現を分析する方法は、Ｎｏｒｔｈｅｎ−ｂｌｏｔｔ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ（Ｌｉａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ， １９９２）、ｄｏｔｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｌｅｎｎｏｎ ａｎｄ Ｌｅｈｒａｃｈ， １９９１）、Ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５）などが含まれる。
【０００９】
しかし、既存の方式で大量の遺伝子を同時に分析するには、技術的な限界があり、どの供給源から得られた知られているか知られていないかの遺伝子などの分析を許容する遺伝子発現を分析するための便利で敏感な技術の必要性は依然として存在する。
【００１０】
特に、生体環境毒性分野において、環境有害物質による遺伝子発現程度分析に使用されたＤＤＲＴ−ＰＣＲ及びｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔの場合、多量のサンプルが要求され、実験上の条件維持が難しく、同時に様々な遺伝子を分析するのが不可能な問題点がある。
【００１１】
これにより、本発明者などは環境有害物質によって水中生物体が受けられる有害性及びストレスを迅速に確認しようとして高感度の方法で様々な遺伝子を迅速正確に定量化できる方法を鋭意研究してきた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、環境有害物質によるストレスに特異的に反応する遺伝子を選定して基板に固着させた環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の目的の他の一面はストレスに特異的なバイオマーカーの確認及び環境バイオセンサーの開発に使用可能な環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記遺伝子チップを用いて既存に環境有害物質による遺伝子発現程度分析のために使用されたＤＤＲＴ−ＰＣＲ及びｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔなどに比べて高感度、且つ迅速であり、遺伝子発現可否及び定量的な分析を一回で実行することができるため、正確な環境有害物質及びその他のストレスによる水中生物体の生理的な反応を遺伝子水準で定量化できる環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、前記メダカ遺伝子チップを用いて遺伝子発現程度の定量的な比較を介して特定環境有害物質に対する生体ストレスの形態区分が可能な環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は前記のような目的及び他の目的を達成するために、
メダカ（学名：Ｏｒｚｙｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）内で環境有害物質によるストレスに特異的に反応するｃＤＮＡ ｐｏｏｌｓを用いて基板に固着させた環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供する。
【００１７】
詳細には、エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子としてビテロゲニン（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アリールハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コリオゲニンハイ（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｈｉｇｈ）、コリオゲニンロー（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｌｏｗ）、及びゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｅ）からなったグループから選択された少なくとも１種以上を含み；生体毒性関連遺伝子としてシトクロムｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０）、ヒートショック７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０）、エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、グアニルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、及びストロマイセーリン−３（ｓｔｒｏｍｙｓｅｌｉｎ−３）からなったグループから選択された１種以上を含み；癌誘発遺伝子としてブイ−ポース（ｖ−ｆｏｓ）、アレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）、ラス−２−プロチュンコゲン（ｒａｓ−２−ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ｐ５３、アポトーシスＲＶＰ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＲＶＰ１）、ブイ−ミック（Ｖ−ｍｙｃ）、及びレチノブラストーマ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）からなったグループから選択された１種以上を含み；生体発生関連遺伝子としてベータ−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）、発生転写因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、グルタチオン−エス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びサイクリン２（ｃｙｃｌｉｎ２）からなったグループから選択された１種以上を含む環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供する。
【００１８】
更に詳細には、エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子としてビテロゲニン（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アリールハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コリオゲニンハイ（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｈｉｇｈ）、コリオゲニンロー（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｌｏｗ）、及びゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｅ）の６種から構成され；生体毒性関連遺伝子としてシトクロムｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０）、ヒートショック７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０）、エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、グアニルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、及びストロマイセーリン−３（ｓｔｒｏｍｙｓｅｌｉｎ−３）の５種から構成され；癌誘発遺伝子としてブイ−ポース（ｖ−ｆｏｓ）、アレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）、ラス−２−プロチュンコゲン（ｒａｓ−２−ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ｐ５３、アポトーシスＲＶＰ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＲＶＰ１）、
ブイ−ミック（Ｖ−ｍｙｃ）、及びレチノブラストーマ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）の７種から構成され；生体発生関連遺伝子としてベータ−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）、発生転写因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、グルタチオン−エス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びサイクリン２（ｃｙｃｌｉｎ２）の４種から構成される環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供する。
【００１９】
本発明は前記のような更に他の目的を達成するために、
内分泌系混乱効果、細胞毒性効果、癌発生効果、及び生体発生関連毒性効果の４種類で環境有害物質に対する生体ストレス形態を区分するメダカ遺伝子チップを用いた環境有害性分析方法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法に対して詳細に説明する。
【００２１】
本発明に提供される遺伝子は、現在までメダカに対して全体塩基序列に明かされた全体遺伝子中に環境ストレスによって合成が誘導されると知られた遺伝子を全て選定した。従って、向後環境ストレスに反応する新たな遺伝子の塩基序列が明かされると本発明上のメダカ遺伝子チップに追加的に添加してメダカ遺伝子チップの製作が可能であり、これにより、ストレス形態の追加的な分類も可能である。
【００２２】
本発明のメダカ遺伝子チップは、メダカゲノム遺伝子の７０％以上を製作されたプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ方法で増幅し、ピンスポッティング方法によりチップ上に固着させた。
【００２３】
本発明のメダカ遺伝子チップの製作時、ｃＤＮＡが直接に取り付けられるガラススライドの表面は、結合を易くするために化学的で処理されるが、ポリーエルーリジン（ｐｏｌｙーＬーｌｙｓｉｎｅ）、アミン（ａｍｉｎｅ）、アルデヒド（ａｌｄｈｙｄｅ）などが用いられる（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９５；Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。このように処理されたガラススライドの表面とｃＤＮＡ切れとは易く結合を形成する。この他にもガラススライドの表面は、ポリアクリルアミドゲルパッド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｐａｄ）、ナイロン膜（ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、その他のポリマー（ｏｔｈｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いてコーティングが可能である（Ｐｒｏｕｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【００２４】
本発明のメダカ遺伝子チップを用いて水中生物体に対するストレス効果を迅速に把握するためにストレス効果分類を内分泌系混乱効果分類、細胞毒性効果分類、癌発生効果分類、及び生体発生関連毒性効果分類に分け、遺伝子発現程度を分析した。
【００２５】
以下、本発明を下記の実施例により更に詳細に説明しようとし、下記の実施例によって本発明が制限されない。
【００２６】
［実施例１］
望ましい実施例によると、本発明はメダカ遺伝子チップとして１種の対照遺伝子とともに２２種の環境有害性反応遺伝子を含めている。前記の遺伝子は、現在までメダカに対して全体塩基序列に明かされた全体遺伝子中に環境ストレスによって合成が誘導されると知られた遺伝子である。
【００２７】
即ち、エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子６種としてビテロゲニン（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アリールハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コリオゲニンハイ（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｈｉｇｈ）、コリオゲニンロー（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｌｏｗ）、及びゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｅ）；生体毒性関連遺伝子５種としてシトクロムｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０）、ヒートショック７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０）、エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、グアニルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、及びストロマイセーリン−３（ｓｔｒｏｍｙｓｅｌｉｎ−３）；癌誘発遺伝子７種としてブイ−ポース（ｖ−ｆｏｓ）、アレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）、ラス−２−プロチュンコゲン（ｒａｓ−２−ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ｐ５３、アポトーシスＲＶＰ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＲＶＰ１）、ブイ−ミック（Ｖ−ｍｙｃ）、及びレチノブラストーマ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）；生体発生関連遺伝子４種としてストレスに関係なく常に発現するベータ−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）、発生段階に異常が生じた時、発生が誘導される発生転写因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、酸化的損傷が発生した時に合成されるグルタチオン−エス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びセルサイクル（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）に異常が生じた時、発生するサイクリン２（ｃｙｃｌｉｎ２）を選定した。
【００２８】
前記選定されたメダカゲノム遺伝子２２種の７０％以上を製作されたプライマーを用いてＲｔ−ＰＣＲ方法で増幅し、ピンスポッティング方法によりチップ上に固着させた。
【００２９】
次の〔表１〕は、メダカ遺伝子チップとして１種の対照遺伝子とともに２２種のメダカ遺伝子のｃＤＮＡを確保するためのプライマー序列を説明している。
【００３０】
【表１】
【００３１】
図１は、１種の対照遺伝子と２２種のメダカ遺伝子とのｃＤＮＡチップの構成図である。２回の繰り返す結果のためにチップ上のスポット（ｓｐｏｔ）を２回繰り返して固着化した。チップ上で表しているＮは陰性的調節（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子を表示し、酵母菌のＡＣＴ遺伝子を使用した。チップの構成はエストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子６種、生体毒性関連遺伝子５種、癌誘発遺伝子７種、及び生体発生関連遺伝子４種の順で固着化された。
【００３２】
環境ホルモンといて知られているノニルフェノールに対するメダカ遺伝子チップ適用を実施した。２５ｐｐｂ（μｇ／ｍｌ）のノニルフェノールに露出された雌メダカの肝組織から分離されたＲＮＡサンプルを用いて開発されたメダカ遺伝子チップへのハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を実施した。結果は図２の通りである。環境ホルモンとして知られているノニルフェノールに露出された雌メダカの肝組織から分離されたＲＮＡサンプルとの反応でエストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）と関連された１番目の遺伝子グループから反応性を表す赤い信号が表れるのが確認された。
【００３３】
次の〔表２〕は、図２の結果を数値変形したものである。対照遺伝子としてチップ上に固着化させたスポット（ｓｐｏｔ）では反応が全く生じられなかったし、数値上で比較して見るとき、やはりノニルフェノールによってエストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）と関連された遺伝子が多量合成されることを確認した。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【発明の効果】
本発明は、特定ストレスに反応する遺伝子を選定して基板に固着化することにより、既存に環境有害物質による遺伝子発現程度分析のために使用されたＤＤＲＴ−ＰＣＲ及びｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔなどに比べて高感度の方法で様々な遺伝子を迅速正確に定量化できるようになり、これは生体毒性分野の全く新たな試みである。
【００３６】
特に、本発明のメダカｃＤＮＡチップ及びこれを用いた環境有害性分析方法は、特異的に有害性に発現する２２種の遺伝子を含めているため、分析時、敏感度が卓越し、２２種の遺伝子発現可否及び定量的な分析を一回で実行することができ、正確な分析が可能である。
【００３７】
なお、本発明のメダカｃＤＮＡチップを用いて遺伝子発現程度の定量的な比較を遂行することにより内分泌系混乱効果、細胞毒性効果、癌発生効果、及び生体発生関連毒性効果の生体ストレス形態区分が可能になる。
【００３８】
さらに、本発明のメダカｃＤＮＡチップは、ストレスに特異的なバイオマーカーの確認及び環境バイオセンサーの開発に使用可能である。
【００３９】
たとえ本発明が前記言及された望ましい実施例と関連して説明されたが、発明の要旨及び範囲からはずれることなく多様な修正や変形をすることが可能である。従って、添付された特許請求の範囲は本発明の要旨に属するこのような修正や変形を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】メダカｃＤＮＡチップの設計及び構成図を示す模式図である。
【図２】ノニルフェノールの２５ｐｐｂ（μｇ／ｍｌ）に関する雌メダカの肝組織から抽出したＲＮＡに対するｃＤＮＡチップの反応性及び２２種遺伝子の反応程度に対する分析結果に関する写真である。
【発明が属する技術分野】
本発明は環境有害物質に特異的に反応するメダカ遺伝子種を選定してチップに固着させた環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ（ｃｈｉｐ）及びこれを用いた環境有害性分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、環境有害物質（内分泌系障害物質−環境ホルモン）が生態系及び人間の生殖機能低下、奇形、成長障害及び癌などを誘発し、全ての生物種に威しになることができるという認識が提起されてからオゾン層の破壊及び地球温暖化問題とともに新たな環境問題として擡頭されている。
【０００３】
環境有害物質として推定される物質などは、各種の産業用化学物質（原料物質）、殺虫剤、及び除草剤などの農薬類、有機重金属類、ダイオキシン類、植物に存在する植物性エストロゲンなどのホルモン類似物質、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）のような医薬品として使用される合成エストロゲン類及び食品添加物があり、このような環境有害物質の計測方法を開発し利用することは、環境有害物質の発見及びこれらの毒性学的意味の定量的分析において必要である。
【０００４】
なお、環境有害物質の超高感度機器分析技法開発やバイオマーカーの確認及び計測法開発は、生態系内で環境有害物質の実態を解明するのに極めて重要である。
【０００５】
特に、最近まで環境ホルモンとして知られているノニルフェノール（ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ）、ビスフェノールＡ（ｂｉｓｐｈｅｎｏｌＡ）、ベーターエストラジオール（ｂｅｔａ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）、フタル酸（ｐｈｔｈａｌａｔｅ）、及びダイオキシン（ｄｉｏｘｉｎ）などの有害物質と、細胞毒性を誘発するものとして知られているフェノール（ｐｈｅｎｏｌ）類など、そして、メチルビオロゲン（ｍｅｔｈｙｌ ｖｉｏｌｏｇｅｎ）、アルドリン（ａｌｄｒｉｎ）、及びイソドリン（ｉｓｏｄｒｉｎ）などの農薬類のストレス分類及び水中生物体の生理的な反応を遺伝子水準で迅速に検索するための方法が要求される。
【０００６】
一方、従来ヒューマンゲノムプロジェクトを含んだ多い有機体のゲノムプロジェクトが遂行されて数多い遺伝情報が沢山出てくることによって、これをどのように解析し、互いに連関つけることができるかに対して多い関心と研究とがなされている。そのうち、最近に開発されたＤＮＡチップは、短い時間に大量の情報を分析でき、自動化が容易であるため、多くのゲノムプロジェクトから蓄積された膨大な量の遺伝情報を用いて試料を効率的に分析する方法として最も注目を浴びている。
【０００７】
ＤＮＡチップは、付ける遺伝物のサイズによってオリゴヌクレオチドチップ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９）とｃＤＮＡチップ（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９５）とに区分できる。オリゴヌクレオチドチップには約１５〜２５個の塩基などからなったオリゴヌクレオチドが付けられており、塩基の序列を知っているから、一つの塩基変化による多様性に対する研究（ ＳＮＰｓ， ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）が可能である。しかしながら、必ず序列情報が必要であり、実際にいくｋｂになる遺伝子からごく一部の塩基のみを窺ってみることであるため、どの部分を選択することに問題が残る。これと異なってｃＤＮＡチップはＳＮＰｓを見ることはできないが、塩基その自体が大きく、序列情報が必須的ではないため、遺伝子の発現分析に強力し、且つ有用な道具になる。
【０００８】
既存に便利性、価格及び敏感度においてそれぞれ異なる多様な技術などが遺伝子発現を分析するために用いられてきた。例えば、差別的展示（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）、 索引化（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）、控除混成化（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、及び多くのＤＮＡフィンガープリンティング技術など、例えば、Ｖｏｓなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：４４０７−４４１４ （１９９５）；Ｈｕｂａｎｋなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：５６４０−５６４８（１９９４）； Ｌｉｎｇｏなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９６７−９７１（１９９２）；Ｅｒｌａｎｄｅｒなど、国際特許出願 ＰＣＴ／ＵＳ９４／１３０４１；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄなど、米国特許第５，４３７，９７５号；Ｕｎｒａｕなど、 Ｇｅｎｅ，１４５：１６３−１６９（１９９４）； などが含まれる。また、ｍＲＮＡ水準における遺伝子発現を分析する方法は、Ｎｏｒｔｈｅｎ−ｂｌｏｔｔ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ（Ｌｉａｎｇ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ， １９９２）、ｄｏｔｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｌｅｎｎｏｎ ａｎｄ Ｌｅｈｒａｃｈ， １９９１）、Ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．， １９９５）などが含まれる。
【０００９】
しかし、既存の方式で大量の遺伝子を同時に分析するには、技術的な限界があり、どの供給源から得られた知られているか知られていないかの遺伝子などの分析を許容する遺伝子発現を分析するための便利で敏感な技術の必要性は依然として存在する。
【００１０】
特に、生体環境毒性分野において、環境有害物質による遺伝子発現程度分析に使用されたＤＤＲＴ−ＰＣＲ及びｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔの場合、多量のサンプルが要求され、実験上の条件維持が難しく、同時に様々な遺伝子を分析するのが不可能な問題点がある。
【００１１】
これにより、本発明者などは環境有害物質によって水中生物体が受けられる有害性及びストレスを迅速に確認しようとして高感度の方法で様々な遺伝子を迅速正確に定量化できる方法を鋭意研究してきた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、環境有害物質によるストレスに特異的に反応する遺伝子を選定して基板に固着させた環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の目的の他の一面はストレスに特異的なバイオマーカーの確認及び環境バイオセンサーの開発に使用可能な環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記遺伝子チップを用いて既存に環境有害物質による遺伝子発現程度分析のために使用されたＤＤＲＴ−ＰＣＲ及びｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔなどに比べて高感度、且つ迅速であり、遺伝子発現可否及び定量的な分析を一回で実行することができるため、正確な環境有害物質及びその他のストレスによる水中生物体の生理的な反応を遺伝子水準で定量化できる環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、前記メダカ遺伝子チップを用いて遺伝子発現程度の定量的な比較を介して特定環境有害物質に対する生体ストレスの形態区分が可能な環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は前記のような目的及び他の目的を達成するために、
メダカ（学名：Ｏｒｚｙｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）内で環境有害物質によるストレスに特異的に反応するｃＤＮＡ ｐｏｏｌｓを用いて基板に固着させた環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供する。
【００１７】
詳細には、エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子としてビテロゲニン（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アリールハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コリオゲニンハイ（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｈｉｇｈ）、コリオゲニンロー（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｌｏｗ）、及びゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｅ）からなったグループから選択された少なくとも１種以上を含み；生体毒性関連遺伝子としてシトクロムｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０）、ヒートショック７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０）、エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、グアニルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、及びストロマイセーリン−３（ｓｔｒｏｍｙｓｅｌｉｎ−３）からなったグループから選択された１種以上を含み；癌誘発遺伝子としてブイ−ポース（ｖ−ｆｏｓ）、アレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）、ラス−２−プロチュンコゲン（ｒａｓ−２−ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ｐ５３、アポトーシスＲＶＰ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＲＶＰ１）、ブイ−ミック（Ｖ−ｍｙｃ）、及びレチノブラストーマ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）からなったグループから選択された１種以上を含み；生体発生関連遺伝子としてベータ−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）、発生転写因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、グルタチオン−エス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びサイクリン２（ｃｙｃｌｉｎ２）からなったグループから選択された１種以上を含む環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供する。
【００１８】
更に詳細には、エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子としてビテロゲニン（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アリールハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コリオゲニンハイ（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｈｉｇｈ）、コリオゲニンロー（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｌｏｗ）、及びゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｅ）の６種から構成され；生体毒性関連遺伝子としてシトクロムｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０）、ヒートショック７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０）、エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、グアニルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、及びストロマイセーリン−３（ｓｔｒｏｍｙｓｅｌｉｎ−３）の５種から構成され；癌誘発遺伝子としてブイ−ポース（ｖ−ｆｏｓ）、アレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）、ラス−２−プロチュンコゲン（ｒａｓ−２−ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ｐ５３、アポトーシスＲＶＰ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＲＶＰ１）、
ブイ−ミック（Ｖ−ｍｙｃ）、及びレチノブラストーマ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）の７種から構成され；生体発生関連遺伝子としてベータ−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）、発生転写因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、グルタチオン−エス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びサイクリン２（ｃｙｃｌｉｎ２）の４種から構成される環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法を提供する。
【００１９】
本発明は前記のような更に他の目的を達成するために、
内分泌系混乱効果、細胞毒性効果、癌発生効果、及び生体発生関連毒性効果の４種類で環境有害物質に対する生体ストレス形態を区分するメダカ遺伝子チップを用いた環境有害性分析方法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ及びこれを用いた環境有害性分析方法に対して詳細に説明する。
【００２１】
本発明に提供される遺伝子は、現在までメダカに対して全体塩基序列に明かされた全体遺伝子中に環境ストレスによって合成が誘導されると知られた遺伝子を全て選定した。従って、向後環境ストレスに反応する新たな遺伝子の塩基序列が明かされると本発明上のメダカ遺伝子チップに追加的に添加してメダカ遺伝子チップの製作が可能であり、これにより、ストレス形態の追加的な分類も可能である。
【００２２】
本発明のメダカ遺伝子チップは、メダカゲノム遺伝子の７０％以上を製作されたプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ方法で増幅し、ピンスポッティング方法によりチップ上に固着させた。
【００２３】
本発明のメダカ遺伝子チップの製作時、ｃＤＮＡが直接に取り付けられるガラススライドの表面は、結合を易くするために化学的で処理されるが、ポリーエルーリジン（ｐｏｌｙーＬーｌｙｓｉｎｅ）、アミン（ａｍｉｎｅ）、アルデヒド（ａｌｄｈｙｄｅ）などが用いられる（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９５；Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。このように処理されたガラススライドの表面とｃＤＮＡ切れとは易く結合を形成する。この他にもガラススライドの表面は、ポリアクリルアミドゲルパッド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｐａｄ）、ナイロン膜（ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ニトロセルロース（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、その他のポリマー（ｏｔｈｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒ）を用いてコーティングが可能である（Ｐｒｏｕｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【００２４】
本発明のメダカ遺伝子チップを用いて水中生物体に対するストレス効果を迅速に把握するためにストレス効果分類を内分泌系混乱効果分類、細胞毒性効果分類、癌発生効果分類、及び生体発生関連毒性効果分類に分け、遺伝子発現程度を分析した。
【００２５】
以下、本発明を下記の実施例により更に詳細に説明しようとし、下記の実施例によって本発明が制限されない。
【００２６】
［実施例１］
望ましい実施例によると、本発明はメダカ遺伝子チップとして１種の対照遺伝子とともに２２種の環境有害性反応遺伝子を含めている。前記の遺伝子は、現在までメダカに対して全体塩基序列に明かされた全体遺伝子中に環境ストレスによって合成が誘導されると知られた遺伝子である。
【００２７】
即ち、エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子６種としてビテロゲニン（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アリールハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コリオゲニンハイ（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｈｉｇｈ）、コリオゲニンロー（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｌｏｗ）、及びゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｅ）；生体毒性関連遺伝子５種としてシトクロムｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０）、ヒートショック７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０）、エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、グアニルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、及びストロマイセーリン−３（ｓｔｒｏｍｙｓｅｌｉｎ−３）；癌誘発遺伝子７種としてブイ−ポース（ｖ−ｆｏｓ）、アレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）、ラス−２−プロチュンコゲン（ｒａｓ−２−ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ｐ５３、アポトーシスＲＶＰ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＲＶＰ１）、ブイ−ミック（Ｖ−ｍｙｃ）、及びレチノブラストーマ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）；生体発生関連遺伝子４種としてストレスに関係なく常に発現するベータ−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）、発生段階に異常が生じた時、発生が誘導される発生転写因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、酸化的損傷が発生した時に合成されるグルタチオン−エス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びセルサイクル（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）に異常が生じた時、発生するサイクリン２（ｃｙｃｌｉｎ２）を選定した。
【００２８】
前記選定されたメダカゲノム遺伝子２２種の７０％以上を製作されたプライマーを用いてＲｔ−ＰＣＲ方法で増幅し、ピンスポッティング方法によりチップ上に固着させた。
【００２９】
次の〔表１〕は、メダカ遺伝子チップとして１種の対照遺伝子とともに２２種のメダカ遺伝子のｃＤＮＡを確保するためのプライマー序列を説明している。
【００３０】
【表１】
図１は、１種の対照遺伝子と２２種のメダカ遺伝子とのｃＤＮＡチップの構成図である。２回の繰り返す結果のためにチップ上のスポット（ｓｐｏｔ）を２回繰り返して固着化した。チップ上で表しているＮは陰性的調節（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子を表示し、酵母菌のＡＣＴ遺伝子を使用した。チップの構成はエストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子６種、生体毒性関連遺伝子５種、癌誘発遺伝子７種、及び生体発生関連遺伝子４種の順で固着化された。
【００３２】
環境ホルモンといて知られているノニルフェノールに対するメダカ遺伝子チップ適用を実施した。２５ｐｐｂ（μｇ／ｍｌ）のノニルフェノールに露出された雌メダカの肝組織から分離されたＲＮＡサンプルを用いて開発されたメダカ遺伝子チップへのハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を実施した。結果は図２の通りである。環境ホルモンとして知られているノニルフェノールに露出された雌メダカの肝組織から分離されたＲＮＡサンプルとの反応でエストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）と関連された１番目の遺伝子グループから反応性を表す赤い信号が表れるのが確認された。
【００３３】
次の〔表２〕は、図２の結果を数値変形したものである。対照遺伝子としてチップ上に固着化させたスポット（ｓｐｏｔ）では反応が全く生じられなかったし、数値上で比較して見るとき、やはりノニルフェノールによってエストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）と関連された遺伝子が多量合成されることを確認した。
【００３４】
【表２】
【発明の効果】
本発明は、特定ストレスに反応する遺伝子を選定して基板に固着化することにより、既存に環境有害物質による遺伝子発現程度分析のために使用されたＤＤＲＴ−ＰＣＲ及びｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔなどに比べて高感度の方法で様々な遺伝子を迅速正確に定量化できるようになり、これは生体毒性分野の全く新たな試みである。
【００３６】
特に、本発明のメダカｃＤＮＡチップ及びこれを用いた環境有害性分析方法は、特異的に有害性に発現する２２種の遺伝子を含めているため、分析時、敏感度が卓越し、２２種の遺伝子発現可否及び定量的な分析を一回で実行することができ、正確な分析が可能である。
【００３７】
なお、本発明のメダカｃＤＮＡチップを用いて遺伝子発現程度の定量的な比較を遂行することにより内分泌系混乱効果、細胞毒性効果、癌発生効果、及び生体発生関連毒性効果の生体ストレス形態区分が可能になる。
【００３８】
さらに、本発明のメダカｃＤＮＡチップは、ストレスに特異的なバイオマーカーの確認及び環境バイオセンサーの開発に使用可能である。
【００３９】
たとえ本発明が前記言及された望ましい実施例と関連して説明されたが、発明の要旨及び範囲からはずれることなく多様な修正や変形をすることが可能である。従って、添付された特許請求の範囲は本発明の要旨に属するこのような修正や変形を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】メダカｃＤＮＡチップの設計及び構成図を示す模式図である。
【図２】ノニルフェノールの２５ｐｐｂ（μｇ／ｍｌ）に関する雌メダカの肝組織から抽出したＲＮＡに対するｃＤＮＡチップの反応性及び２２種遺伝子の反応程度に対する分析結果に関する写真である。
Claims (13)
- 環境有害物質に特異的に反応するメダカ遺伝子種から構成されたことを特徴とする環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。
- 前記の遺伝子種は（ａ）エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子種、（ｂ）生体毒性関連遺伝子種、（ｃ）癌誘発遺伝子種、及び（ｄ）生体発生関連遺伝子種から構成されたことを特徴とする請求項１に記載の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。
- 前記（ａ）エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子は、ビテロゲニン（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アリールハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コリオゲニンハイ（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｈｉｇｈ）、コリオゲニンロー（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｌｏｗ）、及びゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｅ）からなったグループから選択された少なくとも１種以上を含むことを特徴とする請求項２に記載の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。
- 前記（ｂ）生体毒性関連遺伝子は、シトクロムｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０）、ヒートショック７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０）、エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、グアニルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、及びストロマイセーリン−３（ｓｔｒｏｍｙｓｅｌｉｎ−３）からなったグループから選択された１種以上を含むことを特徴とする請求項２に記載の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。
- 前記（ｃ）癌誘発遺伝子は、ブイ−ポース（ｖ−ｆｏｓ）、アレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）、ラス−２−プロチュンコゲン（ｒａｓ−２−ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ｐ５３、アポトーシスＲＶＰ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＲＶＰ１）、ブイ−ミック（Ｖ−ｍｙｃ）、及びレチノブラストーマ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）からなったグループから選択された１種以上を含むことを特徴とする請求項２に記載の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。
- 前記（ｄ）生体発生関連遺伝子は、ベータ−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）、発生転写因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、グルタチオン−エス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びサイクリン２（ｃｙｃｌｉｎ２）からなったグループから選択された１種以上を含むことを特徴とする請求項２に記載の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。
- 前記（ａ）エストロゲニックポテンシャル（ｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）関連遺伝子は、ビテロゲニン（Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、アリールハイドロカーボン受容体（ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、コリオゲニンハイ（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｈｉｇｈ）、コリオゲニンロー（ｃｈｏｌｉｏｇｅｎｉｎ ｌｏｗ）、及びゴナドトロピン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎｅ）から構成され；
前記（ｂ）生体毒性関連遺伝子は、シトクロムｐ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０）、ヒートショック７０（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ７０）、エンドセリン受容体（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、グアニルシクラーゼ（ｇｕａｎｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）、及びストロマイセーリン−３（ｓｔｒｏｍｙｓｅｌｉｎ−３）から構成され；
前記（ｃ）癌誘発遺伝子は、ブイ−ポース（ｖ−ｆｏｓ）、アレスチン（ａｒｒｅｓｔｉｎ）、ラス−２−プロチュンコゲン（ｒａｓ−２−ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ｐ５３、アポトーシスＲＶＰ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＲＶＰ１）、ブイ−ミック（Ｖ−ｍｙｃ）、及びレチノブラストーマ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）から構成され；
前記（ｄ）生体発生関連遺伝子は、ベータ−アクチン（ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ）、発生転写因子（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、グルタチオン−エス−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、及びサイクリン２（ｃｙｃｌｉｎ２）から構成されることを特徴とする請求項２に記載の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。 - 前記メダカ遺伝子チップは、更に陰性的調節（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子を含むことを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。
- 前記陰性的調節（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子は、酵母菌のＡＣＴ遺伝子であることを特徴とする請求項８に記載の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップ。
- 請求項第１項乃至第７項の環境ストレス分析のためのメダカ遺伝子チップうち、いずれかに記載のメダカ遺伝子チップを用いたことを特徴とするメダカ遺伝子チップを用いた環境有害性分析方法。
- 前記メダカ遺伝子チップは、更に陰性的調節（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子を含むことを特徴とする請求項１０に記載のメダカ遺伝子チップを用いた環境有害性分析方法。
- 前記陰性的調節（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）遺伝子は、酵母菌のＡＣＴ遺伝子であることを特徴とする請求項１１に記載のメダカ遺伝子チップを用いた環境有害性分析方法。
- 前記の分析方法は、ストレス効果分類として（ａ）内分泌系混乱効果分類、（ｂ）細胞毒性効果分類、（ｃ）癌発生効果分類、及び（ｄ）生体発生関連毒性効果分類を含むことを特徴とする請求項１０に記載のメダカ遺伝子チップを用いた環境有害性分析方法。
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