KR100638854B1 - 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를이용한 환경 유해성 분석방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 송사리(Japanese Medaka, 학명: Orzyias latipes) 내에서 환경 유해물질로 인한 스트레스에 특이적으로 반응하는 것으로 알려진 120종의 cDNA 풀(pools)을 이용하여 유리 기판에 고착화시킨 cDNA 칩을 제작하고, 이 cDNA 칩을 이용하여 환경 유해물질에 대한 수중 생물체의 생리적인 반응을 신속하게 검색하기 위한 환경 유해성 분석방법에 관한 것이다.
환경 스트레스 분석, 송사리, 유전자 칩

Description

환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법{FISH DNA CHIPS FOR ENVIRONMENTAL STRESS ANALYSIS AND METHOD OF ENVIROMENTAL HARMFULNESS ANALYSIS THERETHROUGH}
도 1은 송사리 cDNA 칩의 설계 및 구성도를 나타내는 모식도이다.
도 2는 노닐 페놀 75 ppb(㎍/㎖)에 관한 암컷 송사리의 간 조직에서 추출한 RNA에 대한 cDNA 칩의 반응성 및 120종 유전자의 반응 정도에 대한 분석 결과에 관한 사진이다.
본 발명은 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 송사리(Japanese Medaka, 학명: Orzyias latipes) 내에서 환경 유해물질로 인한 스트레스에 특이적으로 반응하는 것으로 알려진 120종의 cDNA 풀(pools)을 이용하여 유리 기판에 고착화시킨 cDNA 칩을 제작하고, 이 cDNA 칩을 이용하여 환경 유해물질에 대한 수중 생물체의 생리적인 반응을 신속하게 검색하기 위한 환경 유해성 분석방법에 관한 것이다.
최근 환경 유해 물질(내분비계 장애 물질-환경 호르몬)이 생태계 및 인간의 생식 기능 저하, 기형, 성장 장애 및 암 등을 유발하여 모든 생물종에 위협이 될 수 있다는 인식이 제기되면서 오존층 파괴 및 지구 온난화 문제와 더불어 새로운 환경 문제로 대두되고 있다.
환경 유해 물질로 추정되는 물질로는 각종 산업용 화학물질(원료물질), 살충제 및 제초제 등의 농약류, 유기중금속류, 다이옥신류, 식물에 존재하는 식물성 에스트로젠 등이 호르몬 유사물질, 디에틸스틸베스트롤(DES)과 같은 의약품으로 사용되는 합성 에스트로젠류 및 식품첨가물이 있으며, 이러한 환경 유해 물질의 게측 방법을 개발하고 이용하는 것은 환경 유해 물질의 발견 및 이들의 독성학적 의미의 정량적 분석에 있어서 필요하다.
또한, 환경 유해 물질의 초고감도 기기분석기법 개발이나 바이오마커의 확인 및 계측법 개발은 생태계 내에서 환경 유해 물질의 실태를 해명하는데 매우 중요하다.
특히, 최근까지 환경호르몬으로 알려져 있는 노닐 페놀(nonylphenol), 비스페놀 에이(bisphenolA), 베타-에스트라디올(beta-estradiol), 프탈레이트(phthalate) 및 다이옥신(dioxin) 등의 유해 물질과 세포독성을 유발하는 것으로 알려져 있는 페놀류들 그리고 메틸 비올로겐(methyl viologen), 알드린(aldrin) 및 이소드린(isodrin) 등의 농약류의 스트레스 분류 및 수중 생물체의 생리적인 반응을 유전자 수준에서 신속하게 검색하기 위한 방법이 요구된다.
한편, 종래 휴먼 게놈 프로젝트를 포함한 많은 유기체의 게놈 프로젝트가 수행되어 수많은 유전정보가 쏟아져 나옴에 따라, 이를 어떻게 해석하고 서로 연관지을 수 있는 가에 대해 많은 관심과 연구가 이루어지고 있다. 그 중 최근에 개발된 DNA 칩은 짧은 시간에 많은 양의 정보를 분석할 수 있으며 자동화가 용이하기 때문에 여러 게놈 프로젝트로부터 축적된 방대한 양의 유전정보를 이용하여 시료를 효율적으로 분석하는 방법으로 가장 주목받고 있다.
DNA 칩은 붙이는 유전물의 크기에 따라 올리고뉴클레오티드 칩(Lipshutz et al., 1999)과 cDNA 칩(Schena et al., 1995)으로 구분할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 칩에는 약 15 ∼ 25 개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오티드가 붙여져 있고 염기의 서열을 알고 있기 때문에 하나의 염기 변화에 의한 다양성에 대한 연구(SNPs, single nucleotide polymorphisms)가 가능하다. 그러나, 반드시 서열 정보가 필요하고, 실제로 몇 kb나 되는 유전자에는 극히 일부의 염기만을 살피는 것이므로 어느 부분을 선택하느냐의 문제가 남는다. 이와 달리 cDNA 칩은 SNPs를 볼 수는 없지만, 염기 자체가 크며 서열 정보가 필수적이지 않으므로 유전자의 발현 분석에 강력하고 유용한 도구가 된다.
기존에 편리성, 가격 및 민감도에 있어서 각각 다른 다양한 기술들이 유전자 발현을 분석하기 위하여 이용되어 왔다. 예를 들어, 차별적 전시(differential display), 색인화(indexing), 공제혼성화(subtraction hybridization) 및 많은 DNA 핑거프린팅 기술 등, 예를 들어 Vos 등, Nucleic Acids Research, 23:4407-4414(1995); Hubank 등, Nucleic Acids Research, 22:5640-5648(1994); Lingo 등, Science, 257:967-971(1992); 국제특허출원 PCT/US94/13041; 미국특허 제5,437,975호; Unrau 등, Gene, 145:163-169(1994) 등이 포함된다. 또한, mRNA 수준에서의 유전자 발현을 분석하는 방법은 노던 블랏, 차별적 전시(Liang and Pardee, 1992), 닷블랏 분석(dotblot analysis)[Lennon and Lehrach, 1991], SAGE(Serial analysis of gene expression)[Velculescu et al., 1995] 등이 포함된다.
그러나, 기존의 방식으로 대량의 유전자를 동시에 분석하기에는 기술적인 한계가 있고 어떤 공급원으로부터 얻어진 알려지거나 알려지지 않은 유전자들의 분석을 허용하는 유전자 발현을 분석하기 위한 편리하고 민감한 기술의 필요성은 여전히 존재한다.
특히, 생체 환경 독성 분야에 있어, 환경 유해 물질로 인한 유전자 발현 정도 분석에 사용되었던 DDRT-PCR(Difference Display Reverse Transcription Polymerase Chain Reation) 및 노던 블랏의 경우 다량의 샘플이 요구되고 실험상의 조건 유지가 어려우며, 동시에 여러 가지 유전자를 분석하기가 불가능한 문제점이 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 환경 유해 물질로 인해 수중 생물체가 입을 수 있는 유해성 및 스트레스를 신속하게 확인하고자 고감도의 방법으로 여러 가지 유전자를 신속 정확하게 정량화할 수 있는 방법을 연구하였으며, 내분비계 혼란 효과, 세포 독성 효과, 암 발생 효과 및 생체 발생 관련 독성 효과의 4가지 환경 유해 물질에 발현하는 22종의 유전자를 포함하는 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법을 특허 출원한 바 있다[국내 특허 출원 제2002-25275호]. 그 러나, 이 DNA 칩 역시 22종의 제한된 유전자를 사용하여 제한된 환경 유해성 및 스트레스를 분석하는 한계가 있고, 널리 알려진 유전자를 사용하여서 새로운 환경유해물질에 적용시키기에 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 연구한 결과, 분석시 민감도가 탁월하고 120종의 유전자 발현 여부 및 정량적인 분석을 한번에 실행할 수 있어 정확한 분석이 가능한 cDNA 칩을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 환경 유해 물질로 인한 스트레스에 특이적으로 반응하는 유전자를 선정하여 기판에 고착시킨 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 스트레스에 특징적인 바이오마커의 확인 및 환경 바이오 센서의 개발에 사용 가능한 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 화경 유해성 분석방법을 제공하는 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 칩을 이용하여 기존에 환경 유해 물질로 인한 유전자 발현 정도 분석을 위해 사용되었던 DDRT-PCR 및 노던 블랏을 수행할 수 있어 정확한 환경 유해 물질 및 기타 스트레스로 인한 수중 생물체의 생리적인 반응을 유전자 수준에서 정량화할 수 있는 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 칩을 이용하여 유전자 발현 정도의 정량적인 비교를 통해 특정 환경 유해 물질에 대한 생체 스트레스의 형태 구분이 가능한 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방벙을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 환경 유해 물질로 인한 스트레스에 특이적으로 반응하는 유전자를 선정하여 기판에 고착시킨 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법을 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 송사리(Japanese Medaka, 학명: Orzyias latipes) 내에서 환경 유해물질로 인한 스트레스에 특이적으로 반응하는 것으로 알려진 120종의 cDNA 풀(pools)을 이용하여 유리 기판에 고착화시킨 cDNA 칩을 제작하고, 이를 이용하여 환경 유해물질에 대한 수중 생물체의 생리적인 반응을 신속하게 검색하기 위한 환경 유해성 분석방법에 관한 것이다.
본 발명은 환경 유해물질에 특이적으로 반응하는 특정 120종의 유전자를 사용하여 제작된 cDNA 칩으로, 에스트로겐 반응 유전자 6종, 에스트로제닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 수용체 유전자 8종, 감각기능 관련 수용체 유전자(Receptor genes related to the sensory function and other function) 7종, 수컷 호르몬 관련 유전자 3종, CYP 관련 유전자 4종, 히트쇼크 단백질/스트레스(Heat shock proteins/stress) 유전자 6종, 세포 물질 대사 관련 유전자 9종, 세포사멸/돌연변이 유발/암억제 및 유발 관련 유전자 22종, 생체 발생 관련 유전자 2종, 산화적 손상 관련 유전자 2종, 세포주기 관련 유전자 3종, 금속 반응(metal responsive) 유전자 6종, 면역계 관련 유전자 7종, 기본 전사 인자 유전자 11종, 신장 인자(Elongation factor) 유전자 3종, 나트륨조절 펩타이드(Natriutic peptide) 유전자 2종, RNA와 DNA 유사 도메인 관련 유전자 8종, 기타 유전자 10종 및 스트레스에 관계없이 항상 발현되는 베타-액틴(beta-actin)으로 구성되었고, 이들의 발현 정도의 정량적인 비교로 특정 환경 유해 물질에 대한 생체 스트레스의 형태 구분이 가능해 진다.
본 발명은 송사리 유전자 칩으로써 1종의 대조 유전자와 함께 120종의 환경 유해성 반응 유전자를 포함하고 있다. 이들 유전자는 에스트로겐 반응 유전자 6종으로서 비텔레오제닌(Vitellogenin), 비텔레오제닌 II, 코리오제닌(Choriogenin) L, 코리오제닌 H, bHLH(helix-loop-helix) 전사 인자 및 조나 펠루시다(zona pellucida); 에스트로제닉 포텐셜 관련 수용체 유전자 8종으로서 아릴 하이드로카본 수용체 1-알파, 아릴 하이드로카본 수용체 1-베타, 아릴 하이드로카본 수용체 2, 알파1에이-아드레노셉터(alpha1A-adrenoceptor), 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor), 엔도델린 수용체 에이(Endothelin Receptor A), 엑토다이스플라신-에이 수용체(ectodysplasin-A receptor) 및 핵 수용체 관련 I(nuclear receptor related I); 감각기능 관련 수용체 유전자 7종으로서 E1 후각 수용체(E1 olfactory receptor), Y3 후각 수용체(Y3 olfactory receptor), 로드 광 수용체의 시각 색소(visual pigment of rod photoreceptor), 타이로시나아제(Tyrosinase), 로드형 포스두신(Rod type phosducin), LDL 수용체 관련 단백질(LDL receptor-related protein) 및 섬유아제포 성장인자 수용체(fibroblast growth factor receptor); 수컷 호르몬 관련 유전자 3종으로서 성선 자극 호르몬 GnRH(Gonadotropin-releasing Hormone), GnRH-2(Gonadoropin-releasing Hormone-2) 및 GnRH 수용체(Gonadotropin-releasing hormone receptor); CYP 관련 유전자 4종으로서 시토크롬 P-450 아로마타아제(Cytochrome P-450 aromatase), 시토크롬 P4503A, CYP P450 하이드록실라아제 및 CYP P450 하이드록실라아제 C; 히트쇼크 단백질/스트레스 유전자 6종으로서 히트쇼크 단백질 70, 알파-에이-크리스탈린(alpha-A-crystallin), 당단백질(Glycoprotein), 전환체(Transformer) 2a, 전환체 2b 및 고온응집성 프로테인 65(Warm temperature acclimation related 65); 세포 물질 대사 관련 유전자 9종으로서 구아닐릴 시클라아제(Guanylyl cyclase), 멤브레인 구아닐릴 시클라아제, 가용성 구아닐릴 시클라아제 서브유닛 알파, 가용성 구아닐릴 시클라아제 서브유닛 베타, 구아닐레이트 시클라아제 아과(A subfamily of guanylate cyclase) 3종, 구아닐레이트 시클라아제 활성 단백질 1 및 구아닐레이트 시클라아제 활성 단백질 2; 세포사멸/돌연변이 유발/암억제 및 유발 관련 유전자 22종으로서 윌름스 종양 억제 1(Wilms' tumor suppressor 1), 포토라이아제(Photolyase), 스트로멜리신-3(Stromelysin-3), 브이-포스(v-fos), 리보소말 단백질 S3a(Ribosomal protein S3a), p53, 라스-2 종양 유전자(Ras-2 Protooncogene), 라스-2 종양 유전자서브유닛 2종, 아폽토시스 단백질(Apoptosis protein), 카스파아제3A(Caspase3A) 2종, 세린/트레오닌 키나아제, 아레스틴(Arrestin), 브이-믹(v-myc), 레티노블라스토마(Retinoblastoma), GPCR(G protein-coupled seven-transmembrane receptor), 잠재성 막 단백질(latent membrane protein) 2종, PPAR(peroxisome proliferator activated receptor), SHH(Sonic hedgehog) 및 톨2 트랜스포사아제(Tol2 transposase); 생체 발생 관련 유전자 2종으로서 발생 전사 인자(Developmental transcriptional factor) 및 다크쉔드(Dachshund); 산화적 손상 관련 유전자 2종으로서 글루타티온-s-트랜스퍼라아제(Glutathion-s-transferase) 및 퀴논-환원효소(Quinone-reductase); 세포주기 관련 유전자 3종으로서 시클린2(Cyclin 2), 시클린 B2 및 시클린 B1; 금속 반응(metal responsive) 유전자 6종으로서 알베올린(alveolin), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease), 코리올리신 L(Choriolysin L), 코리올리신 H, 젤라티나아제 A(Gelatinase A) 및 젤라티나아제 B; 면역계 관련 유전자 7종으로서 아포리포프로테인A-1(apolipoprotein A-1), 아포리포프로테인 Bf-C2, 아포리포프로테인 C3, MHC(Major histocompatibility complex), B2-마아크로글로불린(B2-microglobulin), 리일린(Reelin) 및 트랜스페린(Transferrin); 기본 전사 인자 유전자 11종으로서 코어 결합 단백질 인자(Core binding protein factor), 호메오도메인 전사 인자(homeodomain transcription factor), 호모복스 전사 인자(Homobox transcription factor), 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors) 2종, 성 특이성 전사 인자(Sex-specific transcription factors), 종 특이성 전사 인자(Species specific transcription factor), 감각기 관 호메오복스 알파 전사 인자(transcription factor for sensory organ homeobox alpha), 감각기관 호메오복스 베타 전사 인자(transcription factor for sensory organ homeobox beta), 산화적 손상 복귀 전사 인자(transcription factor involved in the dampening of oxidative stress) 및 이동성 특정 도메인 결합- 전사 인자(transcription factors characterized by a specific DNA-bionding region named the high-mobility-group domain); 신장 인자(Elongation factor) 유전자 3종으로서 폴리펩타이드 신장 인자 1 알파(polypeptide elongation factor 1 alpha), 폴리펩타이드 신장 인자 1 베타 및 폴리펩타이드 신장 인자 2 알파; 나트륨조절 펩타이드(natriuretic peptide) 유전자 2종으로서 C형 나트륨조절 펩타이드-1(C-type natriuretic peptide-1) 및 C형 나트륨조절 펩타이드-2; RNA와 DNA 유사 도메인 관련 유전자 8종으로서 DM-도메인 유전자(DM-domain gene), 메-탐(Me-Tam), MOG-12, RNA 결합 모티프 단백질(RNA binding motif protein), RNA 결합 단백질, Y-복스 결합 단백질(Y-box binding protein), Gi1 알파 서브유닛(Gi1 alpha subunit) 및 Gi1 베타 서브유닛; 기타 유전자 10종으로서 베타형 글로빈(beta-type globin), 바사(vasa), 스테로이도제닉 인자 1(steroidogenic factor 1), 칼모둘린(Calmodulin), 생식 세포-레스 단백질(Germ cell-less protein), SMN(Survival motor neuron) 단백질 mRNA, 인히빈 베타-B(inhibin beta-B), 막 관련 트랜스포터 단백질 B(membrane-associated transporter protein B), Gb 알파 및 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors); 및 스트레스에 관계없이 항상 발현되는 베타-액틴(beta-actin)이다.
본 발명에 제공되는 유전자는 현재까지 송사리에 대하여 전체 염기서열에 밝혀진 전체 유전자 중에 환경 스트레스에 의하여 합성이 유도된다고 알려진 유전자를 모두 선정하였다. 따라서, 향후 환경 스트레스에 반응하는 새로운 유전자의 염기 서열이 밝혀지며 본 발명상의 송사리 유전자 칩에 추가적으로 첨가하여 송사리 칩의 제작이 가능하며 이에 따라 스트레스 형태의 추가적인 분류도 가능하다.
본 발명의 송사리 유전자 칩은 송사리 게놈 유전자 120종에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 증폭하여 핀 스팟팅 방법에 의해 칩상에 고착시켰다.
본 발명의 송사리 유전자 칩 제작시 cDNA가 직접 부착되어지는 유리 슬라이드 표면은 결합을 쉽게 하기 위하여 화학적으로 처리되어지는데 폴리-L-리신, 아민, 알데하이드 등이 이용된다. 이렇게 처리된 유리 슬라이드의 표면과 cDNA 조각은 쉽게 결합을 형성한다. 이외에도 유리 슬라이드 표면은 폴리아크릴아마이드 겔 패드, 나일론 막, 니트로셀룰로오스, 기타 폴리머를 이용해 코팅이 가능하다.
본 발명의 송사리 유전자 칩을 이용하여 수중 생물체에 대한 스트레스 효과를 신속히 파악하기 위하여 스트레스 효과 분류를 환경호르몬효과, 암발생효과, 돌연변이 유발효과, 대사조절 기능장애효과, 성장저해 효과로 나누고 유전자 발현 정도를 분석하였다.
따라서, 상기 송사리 cDNA 칩을 통한 환경 유해성 분석방법은 기존의 수중 생물체의 환경 유해물질로 인한 유전자 발현 정도 분석을 위해 사용되었던 DDRT-PCR 및 노던 블랏에 비하여 고감도의 방법으로 여러 가지 유전자를 신속 정확하게 정량화할 수 있다.
특히, 본 발명의 송사리 cDNA 칩은 특이적으로 유해성에 발현하는 120종의 유전자를 포함하고 있어 분석시 민감도가 탁월하고 120종의 유전자 발현 여부 및 정량적인 분석을 한번에 실행할 수 있어 정확한 분석이 가능하다. 또한, 이 칩을 이용하여 스트레스에 특이적인 바이오마커의 확인 및 환경 바이오센서 개발에 사용할 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 발명은 송사리 유전자 칩으로서 1종의 대조 유전자와 함께 120종의 환경 유해성 반응 유전자를 포함하고 있다. 상기 유전자는 현재까지 송사리에 대하여 전체 염기서열에 밝혀진 전체 유전자 중에 환경 스트레스에 의하여 합성이 유도된다고 알려진 유전자이다.
즉, 에스트로겐 반응 유전자 6종으로서 비텔레오제닌(Vitellogenin), 비텔레오제닌 II, 코리오제닌(Choriogenin) L, 코리오제닌 H, bHLH(helix-loop-helix) 전사 인자 및 조나 펠루시다(zona pellucida); 에스트로제닉 포텐셜 관련 수용체 유전자 8종으로서 아릴 하이드로카본 수용체 1-알파, 아릴 하이드로카본 수용체 1-베타, 아릴 하이드로카본 수용체 2, 알파1에이-아드레노셉터(alpha1A-adrenoceptor), 에스프로겐 수용체(Estrogen receptor), 엔도델린 수용체 에이(Endothelin Receptor A), 엑토다이스플라신-에이 수용체(ectodysplasin-A receptor) 및 핵 수용체 관련 Ⅰ(nuclear receptor related Ⅰ); 감각기능 관련 수용체 유전자 7종으로서 E1 후각 수용체(E1 olfactory receptor), Y3 후각 수용체(Y3 olfactory receptor), 로드 광수용체의 시각 색소(visual pigment of rod photoreceptor), 타이로시나아제(Tyrosinase), 로드형 포스두신(Rod type phosducin), LDL 수용체 관련 단백질(LDL receptor-related protein) 및 섬유아제포 성장인자 수용체(fibroblast growth factor receptor); 수컷 호르몬 관련 유전자 3종으로서 성선 자극 호르몬 GnRH(Gonadotropin-releasing Hormone), GnRH-2(Gonadoropin-releasing Hormone-2) 및 GnRH 수용체(Gonadotropin-releasing hormone receptor); CYP 관련 유전자 4종으로서 시토크롬 P-450 아로마타아제(Cytochrome P-450 aromatase), 시토크롬 P4503A, CYP P450 하이드록실라아제 및 CYP P450 하이드록실라아제 C; 히트쇼크 단백질/스트레스 유전자 6종으로서 히트쇼크 단백질 70, 알파-에이-크리스탈린(alpha-A-crystallin), 당단백질(Glycoprotein), 전환체(Transformer) 2a, 전환체 2b 및 고온응집성 프로테인65(Warm temperature acclimation related 65); 세포 물질 대사 관련 유전자 9종으로서 구아닐릴 시클라아제(Guanylyl cyclase), 멤브레인 구아닐릴 시클라아제, 가용성 구아닐릴 시클라아제 서브유닛 알파, 가용성 구아닐릴 시클라아제 서브유닛 베타, 구아닐레이트 시클라아제 아과(A subfamily of guanylate cyclase) 3종, 구아닐레이트 시클라아제 활성 단백질 1 및 구아닐레이트 시클라아제 활성 단백질 2; 세포사멸/돌연변이 유 발/암억제 및 유발 관련 유전자 22종으로서 윌름스 종양 억제 1(Wilms' tumor suppressor 1), 포토라이아제(Photolyase), 스트로멜리신-3(Stromelysin-3), 브이-포스(v-fos), 리보소말 단백질 S3a(Ribosomal protein S3a), p53, 라스-2 종양 유전자(Ras-2 Protooncogene), 라스-2 종양 유전자서브유닛 2종, 아폽토시스 단백질(Apoptosis protein), 카스파아제3A(Caspase3A) 2종, 세린/트레오닌 키나아제, 아레스틴(Arrestin), 브이-믹(v-myc), 레티노블라스토마(Retinoblastoma), GPCR(G protein-coupled seven-transmembrane receptor), 잠재성 막 단백질(latent membrane protein) 2종, PPAR(peroxisome proliferator activated receptor), SHH(Sonic hedgehog) 및 톨2 트랜스포사아제(Tol2 transposase); 생체 발생 관련 유전자 2종으로서 발생 전사 인자(Developmental transcriptional factor) 및 다크쉔드(Dachshund); 산화적 손상 관련 유전자 2종으로서 글루타티온-s-트랜스퍼라아제(Glutathion-s-transferase) 및 퀴논-환원효소(Quinone-reductase); 세포주기 관련 유전자 3종으로서 시클린2(Cyclin 2), 시클린 B2 및 시클린 B1; 금속 반응(metal responsive) 유전자 6종으로서 알베올린(alveolin), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease), 코리올리신 L(Choriolysin L), 코리올리신 H, 젤라티나아제 A(Gelatinase A) 및 젤라티나아제 B; 면역계 관련 유전자 7종으로서 아포리포프로테인A-1(apolipoprotein A-1), 아포리포프로테인 Bf-C2, 아포리포프로테인 C3, MHC(Major histocompatibility complex), B2-마아크로글로불린(B2-microglobulin), 리일린(Reelin) 및 트랜스페린(Transferrin); 기본 전사 인자 유전자 11종으로서 코어 결합 단백질 인자(Core binding protein factor), 호메오도 메인 전사 인자(homeodomain transcription factor), 호모복스 전사 인자(Homobox transcription factor), 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors) 2종, 성 특이성 전사 인자(Sex-specific transcription factors), 종 특이성 전사 인자(Species specific transcription factor), 감각기관 호메오복스 알파 전사 인자(transcription factor for sensory organ homeobox alpha), 감각기관 호메오복스 베타 전사 인자(transcription factor for sensory organ homeobox beta), 산화적 손상 복귀 전사 인자(transcription factor involved in the dampening of oxidative stress) 및 이동성 특정 도메인 결합- 전사 인자(transcription factors characterized by a specific DNA-bionding region named the high-mobility-group domain); 신장 인자(Elongation factor) 유전자 3종으로서 폴리펩타이드 신장 인자 1 알파(polypeptide elongation factor 1 alpha), 폴리펩타이드 신장 인자 1 베타 및 폴리펩타이드 신장 인자 2 알파; 나트륨조절 펩타이드(natriuretic peptide) 유전자 2종으로서 C형 나트륨조절 펩타이드-1(C-type natriuretic peptide-1) 및 C형 나트륨조절 펩타이드-2; RNA와 DNA 유사 도메인 관련 유전자 8종으로서 DM-도메인 유전자(DM-domain gene), 메-탐(Me-Tam), MOG-12, RNA 결합 모티프 단백질(RNA binding motif protein), RNA 결합 단백질, Y-복스 결합 단백질(Y-box binding protein), Gi1 알파 서브유닛(Gi1 alpha subunit) 및 Gi1 베타 서브유닛; 기타 유전자 10종으로서 베타형 글로빈(beta-type globin), 바사(vasa), 스테로이도제닉 인자 1(steroidogenic factor 1), 칼모둘린(Calmodulin), 생식 세포-레스 단백질(Germ cell-less protein), SMN(Survival motor neuron) 단백질 mRNA, 인히빈 베타-B(inhibin beta-B), 막 관련 트랜스포터 단백질 B(membrane-associated transporter protein B), Gb 알파 및 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors); 및 스트레스에 관계없이 항상 발현되는 베타-액틴을 선정하였다.
상기 선정된 송사리 게놈 유전자 120종의 프라이머를 이용하여 RT-PCR방법을 다음과 같이 수행하였다.
조직(Tissue) 100 mg당 2 ㎖의 RNAzol B(Tel-Test)를 넣고 균질화(homogenization)시켜 샘플을 준비하였다. 여기에다 0.1 vol의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 흔든 다음얼음에 5분간 방치한 후 4 ℃, 12,000 g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 다른 튜브로 옮겨 동일 부피의 이소프로판올을 첨가 후 4 ℃에서 15분간 방치 후 4 ℃, 12,000 g에서 15분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 침전물에 약 1 ㎖의 75% 에탄올을 첨가하고 4 ℃, 7,500 g에서 8분간 원심분리하여 침전물을 건조시켜 20 ㎕의 DEPC 수용액에 녹여 RNA 농도를 측정하였다. 이후 mRNA 분리 킷트[Invitrogen 사]를 이용하여 제조사의 지시대로 mRNA만을 분리하였다. 차후 실험에서 분리된 이 mRNA만을 사용하였다. 이렇게 준비된 mRNA에 제작된 프라이머를 넣고 Invitrogen사에서 제시한 방법으로 역전사 중합효소 연속반응(RT-PCR))으로 증폭하여 핀 스폿팅 방법에 의해 칩상에 고착시켰다.
다음 표 1은 송사리 유전자 칩으로서 2종의 대조 유전자와 함께 120종의 송사리 유전자의 cDNA를 확보하기 위한 프라이머 서열을 나타내고 있다.
Figure 112003041980920-pat00001
(계속)
Figure 112003041980920-pat00002
(계속)
Figure 112003041980920-pat00003
(계속)
Figure 112003041980920-pat00004
도 1은 2종의 대조 유전자와 120종의 송사리 유전자의 cDNA 칩의 구성도이다[B(블랭크)는 물이 찍혀 있는 것임]. 칩 상에서 나타내고 있는 N은 음성대조군 유전자를 표시하며, 음성대조군으로 효모균의 ACT 유전자 및 rrnH(M 11, M 12)를 사용하였다.
환경 호르몬으로 알려져 있는 노닐페놀에 대한 송사리 유전자 칩 적용을 실시하였다. 75 ppb(㎍/㎖)의 노닐페놀에 노출되었던 암컷 송사리의 간 조직에서 분리된 RNA 샘플을 이용하여 개발된 송사리 유전자 칩에의 하이브리다이제이션을 실시하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 환경 호르몬으로 알려져 있는 노닐페놀에 노출된 암컷 송사리의 간 조직에서 분리된 RNA 샘플과의 반응에서 에스트로제닉 포텐셜과 관련된 유전자 그룹에서 반응성을 나타내는 과발현 신호가 나 타났고, 암과 관련된 유전자 그룹에서 반응성을 나타내는 과발현신호가 나타났다는 것이 확인되었다.
다음 표 2는 도 2의 결과를 수치 변형한 것이다. 대조 유전자로서 칩 상에 고착화시킨 스팟에서는 반응이 전혀 일어나지 않았으며, 수치상으로 비교해 볼 때 역시, 노닐페놀에 의하여 에스트로제닉 포텐셜과 관련된 유전자가 다량 합성되는 것을 확인하였다.
Figure 112003041980920-pat00005
(계속)
Figure 112003041980920-pat00006
(계속)
Figure 112003041980920-pat00007
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 환경 스트레스 분석을 위한 송사리 유전자 칩 및 이를 이용한 환경 유해성 분석방법은 기존에 환경 유해 물질로 인한 유전자 발현 정도 분석을 위해 사용되었던 DDRT-PCR 및 노던 블랏에 비하여 고감도의 방법으로 여러 가지 유전자를 신속 정확하게 정량화할 수 있다.
특히, 본 발명의 분석방법은 특이적으로 유해성에 발현하는 120종의 유전자 를 포함하고 있어 분석시 민감도가 탁월하고 120종의 유전자 발현 여부 및 정량적인 분석을 한번에 실행할 수 있어 정확한 분석이 가능하다.
또한, 본 발명의 송사리 cDNA 칩을 이용하여 유전자 발현 정도의 정량적인 비교를 수행함으로써 환경호르몬 효과, 암발생 효과, 돌연변이 유발 효과, 대사조절 기능장애 효과, 성장저해 효과의 생체 스트레스 형태 구분이 가능해진다.
또한, 본 발명의 송사리 cDNA 칩은 스트레스에 특이적인 바이오마커의 확인 및 환경 바이오 센서의 개발에 사용 가능하다.
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Claims (23)

  1. 삭제
  2. (1) 에스트로겐 반응 유전자종 프라이머, (2) 에스트로제닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 수용체 유전자종 프라이머, (3) 감각기능 관련 수용체 유전자(Receptor genes related to the sensory function and other function)종 프라이머, (4) 수컷 호르몬 관련 유전자종 프라이머, (5) CYP 관련 유전자종 프라이머, (6) 히트쇼크 단백질/스트레스(Heat shock proteins/stress) 유전자종 프라이머, (7) 세포 물질 대사 관련 유전자종 프라이머, (8) 세포사멸/돌연변이 유발/암억제 및 유발 관련 유전자종 프라이머, (9) 생체 발생 관련 유전자종 프라이머, (10) 산화적 손상 관련 유전자종 프라이머, (11) 세포주기 관련 유전자종 프라이머, (12) 금속 반응(metal responsive) 유전자종 프라이머, (13) 면역계 관련 유전자종 프라이머, (14) 기본 전사 인자 유전자종 프라이머, (15) 신장 인자(Elongation factor) 유전자종 프라이머, (16) 나트륨조절 펩타이드(Natriuretic peptide) 관련 유전자종 프라이머, (17) RNA와 DNA 유사 도메인 관련 유전자종 프라이머, (18) 기타 유전자종 프라이머 및 스트레스에 관계없이 항상 발현되는 서열번호 1과 2로 표시되는 베타-액틴(beta-actin) 유전자의 프라이머로
    비텔레오제닌(Vitellogenin), 비텔레오제닌 II, 코리오제닌(Choriogenin) L, 코리오제닌 H, bHLH(helix-loop-helix) 전사 인자 및 조나 펠루시다(zona pellucida)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 에스트로겐 반응 유전자,
    아릴 하이드로카본 수용체 1-알파, 아릴 하이드로카본 수용체 1-베타, 아릴 하이드로카본 수용체 2, 알파1에이-아드레노셉터(alpha1A-adrenoceptor), 에스프로겐 수용체(Estrogen receptor), 엔도델린 수용체 에이(Endothelin Receptor A), 엑토다이스플라신-에이 수용체(ectodysplasin-A receptor) 및 핵 수용체 관련 Ⅰ(nuclear receptor related Ⅰ)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 에스트로제닉 포텐셜(estrogenic potential) 관련 수용체 유전자,
    E1 후각 수용체(E1 olfactory receptor), Y3 후각 수용체(Y3 olfactory receptor), 로드 광수용체의 시각 색소(visual pigment of rod photoreceptor), 타이로시나아제(Tyrosinase), 로드형 포스두신(Rod type phosducin), LDL 수용체 관련 단백질(LDL receptor-related protein) 및 섬유아제포 성장인자 수용체(fibroblast growth factor receptor)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 감각기능 관련 수용체 유전자(Receptor genes related to the sensory function and other function),
    성선 자극 호르몬 GnRH(Gonadotropin-releasing Hormone), GnRH-2(Gonadoropin-releasing Hormone-2) 및 GnRH 수용체(Gonadotropin-releasing hormone receptor)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 수컷 호르몬 관련 유전자,
    시토크롬 P-450 아로마타아제(Cytochrome P-450 aromatase), 시토크롬 P4503A, CYP P450 하이드록실라아제 및 CYP P450 하이드록실라아제 C로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 CYP 관련 유전자,
    히트쇼크 단백질 70, 알파-에이-크리스탈린(alpha-A-crystallin), 당단백질(Glycoprotein), 전환체(Transformer) 2a, 전환체 2b 및 고온응집성 프로테인 65(Warm temperature acclimation related 65)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 히트쇼크 단백질/스트레스(Heat shock proteins/stress) 유전자,
    구아닐릴 시클라아제(Guanylyl cyclase), 멤브레인 구아닐릴 시클라아제, 가용성 구아닐릴 시클라아제 서브유닛 알파, 가용성 구아닐릴 시클라아제 서브유닛 베타, 구아닐레이트 시클라아제 아과(A subfamily of guanylate cyclase) 3종, 구아닐레이트 시클라아제 활성 단백질 1 및 구아닐레이트 시클라아제 활성 단백질 2로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 세포 물질 대사 관련 유전자,
    윌름스 종양 억제 1(Wilms' tumor suppressor 1), 포토라이아제(Photolyase), 스트로멜리신-3(Stromelysin-3), 브이-포스(v-fos), 리보소말 단백질 S3a(Ribosomal protein S3a), p53, 라스-2 종양 유전자(Ras-2 Protooncogene), 라스-2 종양 유전자 서브유닛 2종, 아폽토시스 단백질(Apoptosis protein), 카스파아제3A(Caspase3A) 2종, 세린/트레오닌 키나아제, 아레스틴(Arrestin), 브이-믹(v-myc), 레티노블라스토마(Retinoblastoma), GPCR(G protein-coupled seven-transmembrane receptor), 잠재성 막 단백질(latent membrane protein) 2종, PPAR(peroxisome proliferator activated receptor), SHH(Sonic hedgehog) 및 톨2 트랜스포사아제(Tol2 transposase)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 세포사멸/돌연변이 유발/암억제 및 유발 관련 유전자,
    발생 전사 인자(Developmental transcriptional factor) 및 다크쉔드(Dachshund)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 생체 발생 관련 유전자,
    글루타티온-s-트랜스퍼라아제(Glutathion-s-transferase) 및 퀴논-환원효소(Quinone-reductase)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 산화적 손상 관련 유전자,
    시클린2(Cyclin 2), 시클린 B2 및 시클린 B1로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 세포주기 관련 유전자,
    알베올린(alveolin), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease), 코리올리신 L(Choriolysin L), 코리올리신 H, 젤라티나아제 A(Gelatinase A) 및 젤라티나아제 B로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 금속 반응(metal responsive) 유전자,
    아포리포프로테인A-1(apolipoprotein A-1), 아포리포프로테인 Bf-C2, 아포리포프로테인 C3, MHC(Major histocompatibility complex), B2-마아크로글로불린(B2-microglobulin), 리일린(Reelin) 및 트랜스페린(Transferrin)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 면역계 관련 유전자,
    코어 결합 단백질 인자(Core binding protein factor), 호메오도메인 전사 인자(homeodomain transcription factor), 호모복스 전사 인자(Homobox transcription factor), 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors) 2종, 성 특이성 전사 인자(Sex-specific transcription factors), 종 특이성 전사 인자(Species specific transcription factor), 감각기관 호메오복스 알파 전사 인자(transcription factor for sensory organ homeobox alpha), 감각기관 호메오복스 베타 전사 인자(transcription factor for sensory organ homeobox beta), 산화적 손상 복귀 전사 인자(transcription factor involved in the dampening of oxidative stress) 및 이동성 특정 도메인 결합- 전사 인자(transcription factors characterized by a specific DNA-bionding region named the high-mobility-group domain)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 기본 전사 인자 유전자,
    신장 인자(Elongation factor) 유전자는 폴리펩타이드 신장 인자 1 알파(polypeptide elongation factor 1 alpha), 폴리펩타이드 신장 인자 1 베타 및 폴리펩타이드 신장 인자 2 알파로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 신장 인자(Elongation factor) 유전자,
    C형 나트륨조절 펩타이드-1(C-type natriuretic peptide-1) 및 C형 나트륨조절 펩타이드-2로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 나트륨조절 펩타이드(Natriuretic peptide) 관련 유전자,
    DM-도메인 유전자(DM-domain gene), 메-탐(Me-Tam), MOG-12, RNA 결합 모티프 단백질(RNA binding motif protein), RNA 결합 단백질, Y-복스 결합 단백질(Y-box binding protein), Gi1 알파 서브유닛(Gi1 alpha subunit) 및 Gi1 베타 서브유닛로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 RNA와 DNA 유사 도메인 관련 유전자,
    베타형 글로빈(beta-type globin), 바사(vasa), 스테로이도제닉 인자 1(steroidogenic factor 1), 칼모둘린(Calmodulin), 생식 세포-레스 단백질(Germ cell-less protein), SMN(Survival motor neuron) 단백질 mRNA, 인히빈 베타-B(inhibin beta-B), 막 관련 트랜스포터 단백질 B(membrane-associated transporter protein B), Gb 알파 및 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 기타 유전자, 및
    베타-액틴(beta-actin) 유전자를 중합효소반응(RT-PCR)으로 증폭시켜 제작한 것을 특징으로 하는 유전자 칩;
    (1) 에스트로겐 반응 유전자종 프라이머는
    서열번호 7과 8로 표시되는 비텔레오제닌(Vitellogenin) 유전자의 프라이머,
    서열번호 9와 10으로 표시되는 비텔레오제닌 II, 코리오제닌(Choriogenin) L 유전자의 프라이머,
    서열번호 11과 12로 표시되는 코리오제닌 H 유전자의 프라이머,
    서열번호 13과 14로 표시되는 bHLH(helix-loop-helix) 전사 인자 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 15와 16으로 표시되는 조나 펠루시다(zona pellucida) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (2) 에스트로제닉 포텐셜 관련 수용체 유전자종 프라이머는
    서열번호 19와 20으로 표시되는 아릴 하이드로카본 수용체 1-알파 유전자의 프라이머,
    서열번호 21과 22로 표시되는 아릴 하이드로카본 수용체 1-베타 유전자의 프라이머,
    서열번호 23과 24로 표시되는 아릴 하이드로카본 수용체 2 유전자의 프라이머,
    서열번호 25와 26으로 표시되는 알파1에이-아드레노셉터(alpha1A-adrenoceptor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 27과 28로 표시되는 에스프로겐 수용체(Estrogen receptor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 29와 30으로 표시되는 엔도델린 수용체 에이(Endothelin Receptor A) 유전자의 프라이머,
    서열번호 31과 32로 표시되는 엑토다이스플라신-에이 수용체(ectodysplasin-A receptor) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 33과 34로 표시되는 핵 수용체 관련 Ⅰ(nuclear receptor related Ⅰ) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (3) 감각기능 관련 수용체 유전자종의 프라이머는
    서열번호 35와 36으로 표시되는 E1 후각 수용체(E1 olfactory receptor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 37과 38로 표시되는 Y3 후각 수용체(Y3 olfactory receptor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 39와 40으로 표시되는 로드 광수용체의 시각 색소(visual pigment of rod photoreceptor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 41과 42로 표시되는 타이로시나아제(Tyrosinase) 유전자의 프라이머,
    서열번호 43과 44로 표시되는 로드형 포스두신(Rod type phosducin) 유전자의 프라이머,
    서열번호 45와 46으로 표시되는 LDL 수용체 관련 단백질(LDL receptor-related protein) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 47과 48로 표시되는 섬유아세포 성장인자 수용체(fibroblast growth factor receptor) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (4) 수컷 호르몬 관련 유전자종의 프라이머는
    서열번호 49와 50으로 표시되는 성선 자극 호르몬 GnRH(Gonadotropin-releasing Hormone) 유전자의 프라이머,
    서열번호 51과 52로 표시되는 GnRH-2(Gonadoropin-releasing Hormone-2) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 53과 54로 표시되는 GnRH 수용체(Gonadotropin-releasing hormone receptor) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (5) CYP 관련 유전자종의 프라이머는
    서열번호 55와 56으로 표시되는 시토크롬 P-450 아로마타아제(Cytochrome P-450 aromatase) 유전자의 프라이머,
    서열번호 57과 58로 표시되는 시토크롬 P4503A 유전자의 프라이머,
    서열번호 59와 60으로 표시되는 CYP P450 하이드록실라아제 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 61과 62로 표시되는 CYP P450 하이드록실라아제 C 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (6) 히트쇼크 단백질/스트레스 유전자종의 프라이머는
    서열번호 63과 64로 표시되는 히트쇼크 단백질 70 유전자의 프라이머,
    서열번호 65와 66으로 표시되는 알파-에이-크리스탈린(alpha-A-crystallin) 유전자의 프라이머,
    서열번호 67과 68로 표시되는 당단백질(Glycoprotein) 유전자의 프라이머,
    서열번호 69와 70으로 표시되는 전환체(Transformer) 2a 유전자의 프라이머,
    서열번호 71과 72로 표시되는 전환체 2b 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 73과 74로 표시되는 고온응집성 프로테인 65(Warm temperature acclimation related 65) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (7) 세포 물질 대사 관련 유전자종 프라이머는
    서열번호 75와 76으로 표시되는 구아닐릴 시클라아제(Guanylyl cyclase) 유전자의 프라이머,
    서열번호 77과 78로 표시되는 멤브레인 구아닐릴 시클라아제 유전자의 프라이머,
    서열번호 79와 80으로 표시되는 가용성 구아닐릴 시클라아제 서브유닛 알파 유전자의 프라이머,
    서열번호 81과 82로 표시되는 가용성 구아닐릴 시클라아제 서브유닛 베타 유전자의 프라이머,
    서열번호 83과 84로 표시되는 구아닐레이트 시클라아제 아과(A subfamily of guanylate cyclase) 유전자의 프라이머,
    서열번호 85와 86으로 표시되는 구아닐레이트 시클라아제 아과(A subfamily of guanylate cyclase) 유전자의 프라이머,
    서열번호 87과 88로 표시되는 구아닐레이트 시클라아제 아과(A subfamily of guanylate cyclase) 유전자의 프라이머,
    서열번호 89와 90으로 표시되는 구아닐레이트 시클라아제 활성 단백질 1 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 91과 92로 표시되는 구아닐레이트 시클라아제 활성 단백질 2 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (8) 세포사멸/돌연변이 유발/ 암억제 및 유발 관련 유전자종의 프라이머는
    서열번호 93과 94로 표시되는 윌름스 종양 억제 1(Wilms' tumor suppressor 1) 유전자의 프라이머,
    서열번호 95와 96으로 표시되는 포토라이아제(Photolyase) 유전자의 프라이머,
    서열번호 97과 98로 표시되는 스트로멜리신-3(Stromelysin-3) 유전자의 프라이머,
    서열번호 99와 100으로 표시되는 브이-포스(v-fos) 유전자의 프라이머,
    서열번호 101과 102로 표시되는 리보소말 단백질 S3a(Ribosomal protein S3a) 유전자의 프라이머,
    서열번호 103과 104로 표시되는 p53 유전자의 프라이머,
    서열번호 105와 106으로 표시되는 라스-2 종양 유전자(Ras-2 Protooncogene) 유전자의 프라이머,
    서열번호 107과 108로 표시되는 라스-2 종양 유전자 서브유닛 유전자의 프라이머,
    서열번호 109와 110으로 표시되는 라스-2 종양 유전자 서브유닛 유전자의 프라이머,
    서열번호 111과 112로 표시되는 아폽토시스 단백질(Apoptosis protein) 유전자의 프라이머,
    서열번호 113과 114로 표시되는 카스파아제3A(Caspase3A) 유전자의 프라이머,
    서열번호 115와 116으로 표시되는 카스파아제3A(Caspase3A) 유전자의 프라이머,
    서열번호 117과 118로 표시되는 세린/트레오닌 키나아제 유전자의 프라이머,
    서열번호 119와 120으로 표시되는 아레스틴(Arrestin) 유전자의 프라이머,
    서열번호 121과 122로 표시되는 브이-믹(v-myc) 유전자의 프라이머,
    서열번호 123과 124로 표시되는 레티노블라스토마(Retinoblastoma) 유전자의 프라이머,
    서열번호 125와 126으로 표시되는 GPCR(G protein-coupled seven-transmembrane receptor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 127과 128로 표시되는 잠재성 막 단백질(latent membrane protein) 유전자의 프라이머,
    서열번호 129와 130으로 표시되는 잠재성 막 단백질(latent membrane protein) 유전자의 프라이머,
    서열번호 131과 132로 표시되는 PPAR(peroxisome proliferator activated receptor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 133과 134로 표시되는 SHH(Sonic hedgehog) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 135와 136으로 표시되는 톨2 트랜스포사아제(Tol2 transposase) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (9) 생체 발생 관련 유전자종 프라이머는
    서열번호 137과 138로 표시되는 발생 전사 인자(Developmental transcriptional factor) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 139와 140으로 표시되는 다크쉔드(Dachshund) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (10) 산화적 손상 관련 유전자종의 프라이머는
    서열번호 141과 142로 표시되는 글루타티온-s-트랜스퍼라아제(Glutathion-s-transferase) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 143과 144로 표시되는 퀴논-환원효소(Quinone-reductase) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (11) 세포주기 관련 유전자종 프라이머는
    서열번호 145와 146으로 표시되는 시클린 2(Cyclin 2) 유전자의 프라이머,
    서열번호 147과 148로 표시되는 시클린 B2 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 149와 150으로 표시되는 시클린 B1 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (12) 금속 반응(metal responsive) 유전자종의 프라이머는
    서열번호 151과 152로 표시되는 알베올린(alveolin) 유전자의 프라이머,
    서열번호 153과 154로 표시되는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease) 유전자의 프라이머,
    서열번호 155와 156으로 표시되는 코리올리신 L(Choriolysin L) 유전자의 프라이머,
    서열번호 157과 158로 표시되는 코리올리신 H 유전자의 프라이머,
    서열번호 159와 160으로 표시되는 젤라티나아제 A(Gelatinase A) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 161과 162로 표시되는 젤라티나아제 B 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (13) 면역계 관련 유전자는
    서열번호 163과 164로 표시되는 아포리포프로테인A-1(apolipoprotein A-1) 유전자의 프라이머,
    서열번호 165와 166으로 표시되는 아포리포프로테인 Bf-C2 유전자의 프라이머,
    서열번호 167과 168로 표시되는 아포리포프로테인 C3 유전자의 프라이머,
    서열번호 169와 170으로 표시되는 MHC(Major histocompatibility complex) 유전자의 프라이머,
    서열번호 171과 172로 표시되는 B2-마아크로글로불린(B2-microglobulin) 유전자의 프라이머,
    서열번호 173과 174로 표시되는 리일린(Reelin) 유전자의 프라이머 및
    서열번호 175와 176으로 표시되는 트랜스페린(Transferrin) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (14) 기본 전사 인자 유전자종의 프라이머는
    서열번호 177과 178로 표시되는 코어 결합 단백질 인자(Core binding protein factor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 179와 180으로 표시되는 호메오도메인 전사 인자(homeodomain transcription factor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 181과 182로 표시되는 호모복스 전사 인자(Homobox transcription factor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 183과 184로 표시되는 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors) 유전자의 프라이머,
    서열번호 185와 186으로 표시되는 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors) 유전자의 프라이머,
    서열번호 187과 188로 표시되는 성 특이성 전사 인자(Sex-specific transcription factors) 유전자의 프라이머,
    서열번호 189와 190으로 표시되는 종 특이성 전사 인자(Species specific transcription factor) 유전자의 프라이머,
    서열번호 191과 192로 표시되는 감각기관 호메오복스 알파 전사 인자(transcription factor for sensory organ homeobox alpha) 유전자의 프라이머,
    서열번호 193과 194로 표시되는 감각기관 호메오복스 베타 전사 인자(transcription factor for sensory organ homeobox beta) 유전자의 프라이머,
    서열번호 195와 196으로 표시되는 산화적 손상 복귀 전사 인자(transcription factor involved in the dampening of oxidative stress) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 197과 198로 표시되는 이동성 특정 도메인 결합- 전사 인자(transcription factors characterized by a specific DNA-bionding region named the high-mobility-group domain) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (15) 신장 인자(Elongation factor) 유전자종의 프라이머는
    서열번호 199와 200으로 표시되는 폴리펩타이드 신장 인자 1 알파(polypeptide elongation factor 1 alpha) 유전자의 프라이머,
    서열번호 201과 202로 표시되는 폴리펩타이드 신장 인자 1 베타 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 203과 204로 표시되는 폴리펩타이드 신장 인자 2 알파 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (16) 나트륨조절 펩타이드(Natriuretic peptide) 유전자종의 프라이머는
    서열번호 205와 206으로 표시되는 C형 나트륨조절 펩타이드-1(C-type natriuretic peptide-1) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 207과 208로 표시되는 C형 나트륨조절 펩타이드-2 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 칩.
    (17) RNA와 DNA 유사 도메인 관련 유전자종의 프라이머는
    서열번호 209와 210으로 표시되는 DM-도메인 유전자(DM-domain gene) 유전자의 프라이머,
    서열번호 211과 212로 표시되는 메-탐(Me-Tam) 유전자의 프라이머,
    서열번호 213과 214로 표시되는 MOG-12 유전자의 프라이머,
    서열번호 215와 216으로 표시되는 RNA 결합 모티프 단백질(RNA binding motif protein) 유전자의 프라이머,
    서열번호 217과 218로 표시되는 RNA 결합 단백질 유전자의 프라이머,
    서열번호 219와 220으로 표시되는 Y-복스 결합 단백질(Y-box binding protein) 유전자의 프라이머,
    서열번호 221과 222로 표시되는 Gi1 알파 서브유닛(Gi1 alpha subunit) 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 223과 224로 표시되는 Gi1 베타 서브유닛 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상;
    (18) 기타 유전자종의 프라이머는
    서열번호 225와 226으로 표시되는 베타형 글로빈(beta-type globin) 유전자의 프라이머,
    서열번호 227과 228로 표시되는 바사(vasa) 유전자의 프라이머,
    서열번호 229와 230으로 표시되는 스테로이도제닉 인자 1(steroidogenic factor 1) 유전자의 프라이머,
    서열번호 231과 232로 표시되는 칼모둘린(Calmodulin) 유전자의 프라이머,
    서열번호 233과 234로 표시되는 생식 세포-레스 단백질(Germ cell-less protein) 유전자의 프라이머,
    서열번호 235와 236으로 표시되는 SMN(Survival motor neuron) 단백질 mRNA 유전자의 프라이머,
    서열번호 237과 238로 표시되는 인히빈 베타-B(inhibin beta-B) 유전자의 프라이머,
    서열번호 239와 240으로 표시되는 막 관련 트랜스포터 단백질 B(membrane-associated transporter protein B) 유전자의 프라이머,
    서열번호 241과 242로 표시되는 Gb 알파 유전자의 프라이머, 및
    서열번호 243과 244로 표시되는 호메오도메인 함유 전사 인자(homeodomain-containing transcription factors) 유전자의 프라이머 중에서 선택된 1종 이상임.
  3. 삭제
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  20. 삭제
  21. 제 2 항의 프라이머 외에 서열번호 3과 4로 표시되는 효모균의 ACT 유전자의 프라이머와 서열번호 5와 6으로 표시되는 rrnH 유전자의 프라이머로 효모균의 ACT 유전자와 rrnH 유전자를 증폭시켜 제작된 것을 특징으로 하는 유전자 칩.
  22. 삭제
  23. 상기 청구항 2 또는 청구항 21 중에서 선택된 유전자 칩을 이용한 것을 특징으로 하는 환경 유해성 분석방법.
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