CN104087683A - 微卫星不稳定性多重检测体系及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微卫星不稳定性多重检测体系及试剂盒，本发明的检测体系包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物。通用—特异嵌合引物对分别针对单核苷酸微卫星位点BAT-26、BAT-25、NR22、NR24及NR21；通用引物是Flu-UP，通用—特异嵌合引物对中的各个上游引物5’端设有Flu-UP的序列；所述通用引物Flu-UP为荧光标记引物。本发明的微卫星不稳定性多重检测体系及其检测试剂盒克服了不同引物需多种荧光标记的不足，在同一个PCR反应体系中检测5个微卫星基因位点，结果直观可靠，省时高效，节省成本，可有效的对MSI基因位点进行检测分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种多重检测体系及其检测产品，尤其是一种微卫星不稳定性多重检测体系以及应用该体系的检测产品，属于生物技术领域。
背景技术
微卫星不稳定（Microsatallite Instability，MSI）指DNA甲基化或基因突变致错配修复基因缺失,从而导致微卫星重复序列长度的改变，表现为同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位的数目不同，从而使其不能正常地发挥调控作用，导致细胞增殖及分化异常，促发恶性肿瘤形成。大量研究表明，MSI与结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等发生密切相关。
MSI的检测具有多重临床病理意义。大约15%的结直肠癌中存在MSI现象，其中典型的遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditarynon-polyposis colorectal cancer，HNPCC）患者90%以上为MSI瘤。与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌其预后较好，并且二者药物反应也不一样。
1997年美国国家肿瘤研究所（National Cancer Institute，NCI）举办会议颁布了Bethesda 指导纲要，确定了用来检测MSI的参考panel（NCI panel），推荐应用5个微卫星位点来进行结直肠癌的检测,即单碱基重复序列BAT-25和BAT-26、双碱基重复序列D2S123、D5S346和D17S250,并对MSI作出了定义。比较肿瘤和匹配的正常DNA,5个位点中有2个或2个以上位点有重复序列长度变化者为高度MSI(highfrequency MSI,MSI-H),若只有1个位点有长度变化者为低度MSI(lowfrequency MSI,MSI-L),无任何位点的变化称为微卫星稳定(microsatellite stable, MSS)。2002年NCI会议对其中3个双碱基重复位点用来评估微卫星不稳定状态的局限性提出争议。同期Suraweera N等人的研究指出对于MSI-H患者，5个准单态性单核苷酸重复位点的panel组（BAT-25、BAT-26、NR21、NR22及NR24）比其它微卫星标记更敏感。2007年Rosa M.xicola等比较出5个准单态性单核苷酸重复位点的panel组（BAT-26、BAT-25、NR21、NR22及NR24）比NCI推荐组在检测1058例肿瘤组织微卫星状态时具有更高的敏感性和阳性预测值。
在2011年关于结直肠癌筛查的国际肿瘤综合网（National Comprehensive cancer Network,NCCN）指南中，MSI已成为首要检测项目。①MSI检测可用于HNPCC的筛查。超过90%的HNPCC患者肿瘤组织表现MSI，MSI在HNPCC中已经成为的重要标志物；当高度怀疑HNPCC时，需检测MSI。②MSI-H的结直肠癌患者预后良好的标志物。MSI-H结肠癌患者生存期更长，较少复发，被认为是预后好的标志之一。③MSI检测可用于氟尿嘧啶类药物的辅助疗效预测。
现有技术的微卫星不稳定性一般可通过如下2种方法检测：
1）PCR法：选定特异的引物，以自身正常组织作对照，在体外对微卫星位点进行PCR扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，经各种显示系统（放射自显影、银染等）分析有无迁移率的改变。
2）基因检测，即对相关的DNA直接进行测序。但因进行基因检测价格昂贵，所需试验条件较高，在临床应用尚未普及。
PCR法已成为目前常用检测方法并已被证明是最有效的初筛手段。但普通PCR分管检测五个微卫星基因，产物做凝胶电泳的方法，存在操作繁琐、成本高等诸多缺陷。多重PCR检测微卫星基因，引物间的竞争与干扰因素较为复杂，扩增产物不容易错开，会直接导致检测结果的不确定性，因此，多重PCR检测产品对于反应体系中引物序列的特异性和引物的浓度都有很高的要求。目前只有8个准单态性单核苷酸重复位点采用3种荧光标记物的多重扩增检测的方案公布。例如：中国专利201110152226.X公开了一种肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒，选取了8个准单态性单核苷酸重复位点（NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、MONO-27、CAT-25）对MSI进行PCR多重扩增检测，为有效区分采用了3种荧光标记物，相当于三组三重PCR反应。而进行多种荧光标记造成实验成本高昂，且只能在多通道的荧光定量PCR仪上进行检测；加入性别决定位点对于防止实验操作员混淆样本方面的作用也是非常的有限，对于来自同性别之间的标本的区分完全没有帮助却增加了不必要的实验花费。而多重PCR实验的主要目的之一就是出于成本的考虑，只是通过增加花费不菲的荧光标记引物进行三重PCR反应，并不能发挥多重PCR实验在成本上优势。并且8个准单态性单核苷酸重复位点在预测微卫星不稳定状态方面的优势也尚无足够的临床数据支持。
鉴于上述情况，提供一种改良的、便捷的、高灵敏度、低成本的MSI多重检测产品势在必行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种包括特定核苷酸序列的通用—特异嵌合引物及通用引物组合，可以有效地减弱引物间的竞争与干扰因素，使得扩增产物大小错开，只依靠一种荧光标记即可保证检测结果准确、灵敏度高的微卫星不稳定性多重检测体系及试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：提供一种微卫星不稳定性多重检测体系，包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物，
所述通用—特异嵌合引物对分别针对微卫星位点BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21；
所述通用—特异嵌合引物对中，针对所述BAT-26的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对所述BAT-26的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；针对所述BAT-25的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对所述BAT-25的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；针对所述NR22的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对所述NR22的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；针对所述NR24的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对所述NR24的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；针对所述NR21的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对所述NR21的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述通用引物是Flu-UP，所述通用—特异嵌合引物对的各上游引物的5’端设有所述Flu-UP的核苷酸序列，所述Flu-UP为5’端荧光标记引物。
上述技术方案的一种优选是：上述Flu-UP的终浓度是0.8μM～1.2μM；针对所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21的下游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶3至1∶2；针对所述BAT-26的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶85至1∶65；针对所述BAT-25的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶140至1∶110；针对所述NR22的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶220至1∶180；针对所述NR24的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶30至1∶20；针对所述NR21的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶6至1∶4。
上述技术方案的一种进一步的优选是：反应体系为10μl或20μl，所述Flu-UP的终浓度是1μM；针对所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21的下游引物的终浓度是0.4μM；针对所述BAT-26的上游引物的终浓度是0.013μM；针对所述BAT-25的上游引物的终浓度是0.008μM；针对所述NR22的上游引物的终浓度是0.005μM；针对所述NR24的上游引物的终浓度是0.04μM；针对所述NR21的上游引物的终浓度是0.2μM。
上述技术方案的一种进一步的优选是：上述通用引物Flu-UP的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
上述通用引物Flu-UP的荧光标记为Cy5、Cy3或FAM。
上述微卫星不稳定性多重检测体系还包括阴性对照液和阳性对照液。
上述微卫星不稳定性多重检测体系还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5mM的dNTPs和5U/μl的Taq DNA聚合酶；
所PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3；
所述2.5mM的dNTPs包括2.5mM的dATP、2.5mM的dGTP、2.5mM的dCTP和2.5mM的dTTP。上述阳性对照液是含所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21位点靶序列的质粒混合水溶液。
上述阴性对照液是纯水。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述多重检测体系的微卫星不稳定性检测试剂盒。
本发明的积极效果在于：
1）本发明的微卫星不稳定性多重检测体系和试剂盒将通用引物荧光标记、多重PCR及毛细管电泳技术融合于一体，可以实现在一个PCR体系内采用单荧光标记一次检测5个准单态性单核苷酸微卫星位点。本发明包括具有特定核苷酸序列的通用—特异嵌合引物及通用引物组合的多重扩增体系，引物的巧妙设计，既减弱了引物间的竞争与干扰因素，又使扩增产物片段大小错开，从而使得单色荧光标记成为可能，克服了现有技术普通PCR只能在一个反应体系内检测一个微卫星基因位点的繁琐费时及成本问题，检测结果准确、灵敏度高，并且大大节省了成本，提高了效率。
2）本发明的微卫星不稳定性多重检测体系和试剂盒的片段分析应用的毛细管电泳片段分析技术不同于传统凝胶电泳分析模式，使PCR结果分析更直观、简洁、可靠，易于识别判断，更有利于标准化操作。
3）本发明的微卫星不稳定性多重检测试剂盒结构简单、操作便捷、使用条件模式化，便于大规模推广应用。
附图说明
图1是本发明的检测试剂盒的多重PCR反应原理示意图；
图2是实施例1的检测试剂盒检测样本1的血样的分型图谱；
图3是实施例1的检测试剂盒检测样本1的肿瘤组织DNA的分型图谱；
图4是实施例1的检测试剂盒检测样本1的血样和肿瘤组织DNA叠加的分型图谱；
图5是实施例1的检测试剂盒检测样本2的血样的分型图谱；
图6是实施例1的检测试剂盒检测样本2的肿瘤组织DNA的分型图谱；
图7是实施例1的检测试剂盒检测样本2的血样和肿瘤组织DNA叠加的分型图谱。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成。
本实施例的微卫星不稳定性检测试剂盒包括PCR反应液、引物混合液、热启动酶、阳性对照液和阴性对照液，PCR反应液、引物混合液、热启动酶、阳性对照液和阴性对照液分别置于不同的试管中，如表1所示。
表1 试剂盒组成表
PCR反应液由10×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶配制而成。10×PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3。dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP，dATP、dGTP、dCTP和dTTP的使用浓度为2.5mM，在反应体系中终浓度0.2mM。热启动酶是使用浓度为5U/μl 的Taq DNA聚合酶，在反应体系中终浓度0.05U/μl。引物混合液是通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物。阳性对照液是含各微卫星位点靶序列的质粒混合水溶液，质粒混合物的制备是采用临床样本的DNA储备液，经PCR扩增获得相应位点的靶序列，再与载体连接制备相应质粒。阴性对照液是无核酸酶纯水。
通用—特异嵌合引物对分别针对五个微卫星位点BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21。通用引物是Flu-UP，通用—特异嵌合引物对的各上游引物的5’端设有通用引物Flu-UP的核苷酸序列。通用—特异嵌合引物对和通用引物的核苷酸序列以及各引物的优选终浓度，如表2所示。
表2 引物特征表
通用引物Flu-UP的5’端设有荧光标记引物Cy5（可以用FAM或Cy3代替）。
表2中，针对各微卫星位点的通用—特异嵌合引物对的扩增产物片段大小错开。通用—特异嵌合引物对中的各上游引物（Up-STR-F）的终浓度明显小于通用引物Flu-UP的终浓度和各下游引物（STR-R）的终浓度。通用—特异嵌合引物对（Up-STR-F和STR-R）在热启动酶（Taq DNA聚合酶）作用下首先对MSI基因进行5～10个循环的扩增，产生5’端带有Flu-Up的互补片段；之后通用引物Flu-UP和下游引物STR-R在热启动酶作用下对PCR扩增得到的带有Flu-Up的产物再进行后续35～40个循环的扩增，产生5’端带有Cy5标记的互补MSI基因片段。上述PCR反应的原理如图1所示。
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的微卫星不稳定性多重检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1、DNA的提取。
采用试剂盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit）分别提取样本1和样本2的全血和肿瘤组织DNA，具体操作步骤参见试剂盒产品说明书。
2、样本DNA质量控制。
获得样本1或样本2的DNA后，通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量。加入反应体系中的样本，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间，的可获得最优反应结果，浓度为20～50ng/μl。
3、PCR反应。
1)配制引物混合液，如表3所示：
表3 引物混合液成分表
2）配制反应体系混合液： 取10×PCR缓冲液2μl，2.5mM的dNTPs 1.6μl和5U/μlTaq DNA酶0.2 μl，引物混合液8μl，混合，加入样本1或样品2的DNA（浓度20～50 ng/μl）2μl，再加水补足至20μl。另平行用阳性对照液和阴性对照液做对照实验。
2）进行PCR反应：
PCR反应程序如表4所示。
表4 PCR反应程序表
以上PCR反应在实时荧光定量PCR仪（Roche Light Cycler-Nano thermocycler）上进行。
4、PCR结果分析。
所得PCR产物置于多重基因表达遗传分析系统（Beckman GenomelabTM GeXP）上，按仪器使用说明进行毛细管电泳，每个CE体系总体积为20 μl。具体步骤为：
1）配制上样缓冲液（Sample Loading Solution，SLS）和DNA标准分子量参照物（DNA size standard 400）的混合液：向样品板中每孔加入24.7μl的SLS和0.3μl的DNA size standard 400。
2）加样：向已含SLS和DNA size standard 400混合液的样品板中加入待测样本1～1.5μl（注意避免产生气泡），并滴加一滴矿物油；与样品板对应，向buffer板中加入Separation Buffer，约为孔体积的1/2～3/4。
3）按仪器使用说明进行毛细管电泳：新建数据库、设置样本检测各项参数，之后上机开始电泳检测分析。分析步骤为：
a．选择“Fragment Analysis”程序进行分析；
b. 选择“RAW DATA”；
c. 在样本列表中选择检测样本；
d. 选择已经事先设置好各参数的程序“fra”；
e. 选择Next直至Finish；
f. 查看分析结果；
g. 在样品列表中同时选中要查看的一组样本，右击选择“overlay Graph”，点击其中一个样本的电泳图谱，设置显示颜色以与另一样本区分；
h. 按“Print Screen”键截取目的片段以制作检测报告。
5、MSI结果判定。
1）MSI判定标准：
与正常组织（血液）相比，肿瘤组织中扩增产物出现条带增多或移位，则判断该位点不稳定。五个位点有两个或以上位点改变判断为微卫星高不稳定状态（MSI-H），只有一个位点改变则为微卫星低不稳定状态（MSI-L），没有位点改变则为微卫星稳定（MSS）状态。
2）样本1或2的MSI结果判定：
将上述样本1或2的全血和肿瘤组织样本CE图谱进行基因片段分析，根据图谱中标示的基因片段大小和荧光峰值峰形作同步比较，如图2至图7所示，横坐标为基因片段碱基数值，纵坐标为荧光数值，横坐标从左到右的基因片段顺序依次为针对微卫星位点BAT26、BAT-25、NR22、NR24及NR21的扩增片段。其中，图2和图5为全血样本基因片段分析图，图3和图6为肿瘤组织样本片段分析图，图4和图7为叠加后的比较图。其中，样本1均未出现基因片段的移位现象，故判定为微卫星稳定（MSS）；样本2肿瘤组织样本BAT26、BAT-25、NR22、NR24及NR21 基因片段相比血样均出现条带移位现象，故此被检测者为高度微卫星不稳定（MSI-H）。
对样本1和2的血样和肿瘤组织样本，分别采用：（1）BAT26引物+通用引物；（2）BAT25引物+通用引物；（3）NR22引物+通用引物；（4）NR24引物+通用引物；（5）NR21引物+通用引物，进行单重PCR扩增后采用毛细管电泳分析，判定结果与上述多重PCR结果一致。
本实施例通过优化引物浓度使各位点扩增片段的峰型之间达到了平衡。若不同组织基因扩增效率相当，可以将电泳图叠加在一起以便分析，如图4和图7；若其中某一组织扩增效率较低，可以相应放大若干倍数以便分析，放大倍数以目的片段清晰可辨识为标准。
实施例2
本实施例的微卫星不稳定性检测试剂盒其余部分与实施例1相同，不同之处在于：PCR反应液和引物混合液事先混合在一起置于同一试管中。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种微卫星不稳定性多重检测体系，包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物，其特征在于：
所述通用—特异嵌合引物对分别针对微卫星位点BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21；
所述通用—特异嵌合引物对中，针对所述BAT-26的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对所述BAT-26的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；针对所述BAT-25的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对所述BAT-25的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；针对所述NR22的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对所述NR22的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；针对所述NR24的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对所述NR24的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；针对所述NR21的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对所述NR21的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述通用引物是Flu-UP，所述通用—特异嵌合引物对的各上游引物的5’端设有所述Flu-UP的核苷酸序列，所述Flu-UP为5’端荧光标记引物。
2.根据权利要求1所述的微卫星不稳定性多重检测体系，其特征在于：所述Flu-UP的终浓度是0.8μM～1.2μM；针对所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21的下游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶3至1∶2；针对所述BAT-26的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶85至1∶65；针对所述BAT-25的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶140至1∶110；针对所述NR22的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶220至1∶180；针对所述NR24的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶30至1∶20；针对所述NR21的上游引物的终浓度与所述Flu-UP的终浓度的比值为1∶6至1∶4。
3.根据权利要求2所述的微卫星不稳定性多重检测体系，其特征在于：反应体系为10μl或20μl，所述Flu-UP的终浓度是1μM；针对所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21的下游引物的终浓度是0.4μM；针对所述BAT-26的上游引物的终浓度是0.013μM；针对所述BAT-25的上游引物的终浓度是0.008μM；针对所述NR22的上游引物的终浓度是0.005μM；针对所述NR24的上游引物的终浓度是0.04μM；针对所述NR21的上游引物的终浓度是0.2μM。
4.根据权利要求1至3之一所述的微卫星不稳定性多重检测体系，其特征在于：所述通用引物Flu-UP的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
5.根据权利要求4所述的微卫星不稳定性多重检测体系，其特征在于：所述通用引物Flu-UP的荧光标记为Cy5、Cy3或FAM。
6.根据权利要求5所述的微卫星不稳定性多重检测体系，其特征在于：还包括阴性对照液和阳性对照液。
7.根据权利要求6所述的微卫星不稳定性多重检测体系，其特征在于：还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、2.5mM的dNTPs和5U/μl的Taq DNA聚合酶；
所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、500mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3；
所述2.5mM的dNTPs包括2.5mM的dATP、2.5mM的dGTP、2.5mM的dCTP和2.5mM的dTTP。
8.根据权利要求6所述的微卫星不稳定性多重检测体系，其特征在于：所述阳性对照液是含所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21位点靶序列的质粒混合水溶液。
9.根据权利要求6所述的微卫星不稳定性多重检测体系，其特征在于：所述阴性对照液是纯水。
10.一种采用如权利要求1所述的检测体系的微卫星不稳定性检测试剂盒。
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