CN101183067A

CN101183067A - 用于个人识别的13个snp位点多色荧光复合扩增试剂盒

Info

Publication number: CN101183067A
Application number: CNA2007100116703A
Authority: CN
Inventors: 王瑞恒
Original assignee: Liaoning Normal University
Current assignee: Liaoning Normal University
Priority date: 2007-06-11
Filing date: 2007-06-11
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2027-06-11
Also published as: CN100543450C

Abstract

本发明涉及一种用于体外一次性多色荧光复合扩增具有较高个人识别能力的13个SNP基因座的试剂盒，是由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、质控DNA样品和等位基因分型标准物混合物构成。引物混合物由13条荧光标记的共享引物和26条针对不同等位基因的长度特异性引物组成。采用本试剂盒可以快速、准确获得13个具有较高个人识别能力的SNP位点的基因型，并通过自动荧光测序仪进行检测分型，达到高自动化水平。本发明的试剂盒用于法医学个人识别具有很大的优势和潜力。

Description

用于个人识别的13个SNP位点多色荧光复合扩增试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于个人识别的体外一次性复合扩增13个SNP基因座的试剂盒，属于法医学个人识别领域的发明。

背景技术

1996年美国的E.Lander首次提出了称之为“第三代遗传标记”的“单核苷酸多态性”(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，而其中最少的一种等位基因在群体中的频率不小于1％。它包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。SNP具有如下特点：首先，SNP位点非常丰富。几乎分布于整个基因组，基因组中大约平均每1000bp就会出现1个SNP，总数约有300万个。其次，SNP的突变率较低，每代每碱基突变率约为2×10^-8。尤其是处于编码区的(coding region)SNP(又称cSNP)，是高度稳定的，而串联重复的微卫星位点的高突变率使得对群体的遗传分析出现困难。第三，具有代表性。cSNP经常引起表达蛋白的多态性变异，并进而影响他们的功能、特性。第四，扩增片断短，易于符合扩增，易实现分析的自动化。第五，每个人均有独特的SNP图谱，SNP由于其片段短、扩增效率高，对PCR的条件要求也相对较低，即使是法医学上常见的细胞已经被破坏，DNA降解严重的腐败检材或是放置时间很长的检材，同样可以用PCR技术扩增出特异的DNA片段来进行基因分型，就可以达到个人认定的目的。

SNP基因座的研究大多是逐个位点进行的，检测手段或者使用测序技术，或者采用限制性内切酶消化的方法，前者技术复杂，费用昂贵；后者操作烦琐、准确性差。复合扩增(Multiplex PCR)又称为多重PCR，即在一个反应体系中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程。它可大幅度地简化操作程序、节省时间和试剂，同时能满足同时分析不同基因位点的需要。

复合扩增(Multiplex PCR)又称为多重PCR，即在一个反应体系中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程。它可大幅度地简化操作程序、节省时间和试剂。并且满足同时分析不同DNA序列的需要，特别是在法医学鉴定中可以用极微量的检材同时扩增出多个遗传标志而更显其优越性。

基于检测体系的不同，目前世界上将复合扩增主要可以分为两大类：硝酸银染色复合扩增和荧光复合扩增。前者是复合扩增后的产物利用普通电泳槽分离，进行硝酸银染色检测的方法。方法简单，成本较低，在普遍实验室可以开展这个项目。但由于所得结果只是单种颜色，故其复合扩增试剂盒的位点数不能太多，一般1次复合扩增的位点不能超过4个，否则会因为不同位点的扩增产物互相重叠，难以区分检材的基因型。再加上所得结果是用肉眼观察，所以其灵敏度受到一定的限制。

荧光复合扩增是在普通复合扩增PCR的其中一条引物一端加上荧光标记，利用自动激光荧光遗传检测仪检测PCR扩增产物，结果准确、灵敏度高，自动化程度高、可重复性强等。用一种颜色的荧光素标记一组3或4个基因位点(其扩增片段不能相重叠)，另一种颜色的荧光素标记另一组3或4个基因位点，多种荧光素则可以标记多组不同的基因位点。目前自动激光荧光遗传检测仪可以检测几十种荧光素，但在一个反应体系中，最多可以同时检测5种荧光素，除其中一种用作内标外，其余四种荧光素可以用于标记产物，加在一起，就可以达到1次检测10个以上的基因位点的目的。

荧光复合扩增已成为目前先进的复合扩增方法。

发明内容

本发明筛选了13个在亚洲人群中具有较高多态性(其中最少的一种等位基因在群体中的频率不小于30％)的SNP基因座，根据引物特异性PCR的原理，每个SNP基因座设计了3条引物。在每一个SNP基因座侧面100-280bp范围内设计了一条引物，作为该基因座的共享引物，并在引物5’末端选用一种荧光物质标记；针对SNP基因座的不同等位基因，又设计了分别与SNP基因座不同等位基因相匹配的两条引物，作为特异引物，引物3’末端的最后一个碱基分别与SNP基因座不同等位基因的碱基匹配，但由于只有3’末端的最后一个碱基不匹配往往不能抑制扩增，所以为了防止错误性扩增，3’末端第3或4位碱基人为引入一个错配碱基，这是引物设计最为关键的部分；最后为了在检测时自动区分不同的等位基因，设计引物时两条引物长度相差4bp(如果两条引物Tm值相差过大，则人为引入TATA四个碱基，这是引物差异设计的另一个关键，因为TATA对引物的退火温度影响最小，同时又满足了扩增片断长度不同的要求)，所有引物长度18-28bp，为了便于复合扩增，所有引物的Tm值保持在60±0.5℃，为了减少引物之间的竞争抑制，对反应体系中不同SNP位点的引物浓度进行调整，获得了最佳引物浓度配比，防止了非特异性扩增片断的产生。利用该试剂盒，就能方便地同时对13个高个人识别能力的SNP基因座进行复合扩增，获得各基因座的基因型结果；同时，利用该试剂盒提供的等位基因分型标准物，利用基因分析软件(Genetyper2.5.2)，还可以方便地自动检测、分析扩增结果。

附图说明

图1为蓝色荧光标记物6-FAM的结构式；

图2位黄色荧光标记物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)的结构式；

图3为绿色荧光标记物JOE(6-carboxy-4’，5’-dichloro-2’，7’-dimethoxy-fluorescein)的结构式；

图4为红色荧光标记物6-ROX(X-RHODAMINE)的结构式。

具体实施方式

本试剂盒由是由分离包装的13个SNP位点引物混合物、DNA聚合酶、反应缓冲液(含MgCl2)、以及13个SNP位点等位基因分型标准物和质控DNA构成。13个SNP基因座的引物混合物2.0ml(不同基因座引物浓度不相同，从30nM-240nM，每个20ul的复合PCR反应体系中用量为2ul)；DNA聚合酶1000u(5u/pl每个20ul的复合PCR反应体系中用量为1u)；缓冲液2.0ml(10倍浓缩缓冲液，每个20ul的复合PCR反应体系中用量为2ul)；等位基因分型标准物混合物总量1ml(40nM，供1000次检测使用)，等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标准物等量；质控DNA0.1ml(10ng/ul)。

荧光复合扩增的技术核心主要在于引物序列与荧光标记的位置以及各种引物的浓度配比。

在本发明试剂盒中，13个SNP位点其参考序列均可通过NCBI查阅，13个SNP位点的名录为：NQO1(_Ser187Pro)，RASSF1(_Ala133Ser)，MBD4(_Glu346Lys)，XPD(_Lys751Gln)，XRCC1(_194Trp/Arg)，ADPRT(_Val762Ala)，CYP1B1(_Val432Leu)，OGG1(_Ala85Ser)，REV1(_Phe257Ser)，XPC(_Lys939Gln)，GSTM4(_T2517C)，AXIN2(_Pro50Ser)，PLOI(_Thr706Ala)。

13个高个人识别能力SNP位点引物序列为：

NQO1-pub-5’-F1-TGCGTTTCTTCCATCCTTCC-3’(NQO1位点共享引物，F1荧光素标记)

NQO1-spe1-5’-TGTGGCTTCCAAGTCTTAGCAC-3’(NQO1位点特异性引物1，针对C等位基因)

NQO1-spe2-5’-TATATGTGGCTTCCAAGTCTTAGCAT-3’(NQO1位点特异性引物2，针对T等位基因)

RASSF1-pub-5’-F1-GAAGCCCTGGGTTCCTCAA-3’(RASSF1位点共享引物，F1荧光素标记)

RASSF1-spe1-5’-GATCTTCTGCTCAATCTCGGC-3’(RASSF1位点特异性引物1，针对C等位基因)

RASSF1-spe2-5’-TATAGATCTTCTGCTCAATCTCGGA-3’(RASSF1位点特异性引物2，针对A等位基因)

MBD4-pub-5’-F1-TTTCCTGGTTGGTGAGCAGTT-3’(MBD4位点共享引物，F1荧光素标记)

MBD4-spe1-5’-GCCAAAGACTCAGAACACACCA-3’(MBD4位点特异性引物1，针对A等位基因)

MBD4-spe2-5’-TATATCCAAAGACTCAGAACACATCG-3’(MBD4位点特异性引物2，针对G等位基因)

XPD-pub-5’-F1-CGGACATCTCCAAATTCATTCA-3’(XPD位点共享引物，F1荧光素标记)

XPD-spe1-5’-CTGAGCAATCTGCTCTATCCTGTT-3’(XPD位点特异性引物1，针对T等位基因)

XPD-spe2-5’-TATACTGAGCAATCTGCTCTATCCTATG-3’(XPD位点特异性引物2，针对G等位基因)

XRCC1-pub-5’-F1-TCCAGACAAAGATGAGGCAGAG-3’(XRCC1位点共享引物，F1荧光素标记)

XRCC1-spe1-5’-CTGGGGATGTCTTGTTGAACC-3’(XRCC1位点特异性引物1，针对G等位基因)

XRCC1-spe2-5’-TATATTGGGGATGTCTTGTTGAGCT-3’(XRCC1位点特异性引物2，针对A等位基因)

ADPRT-pub-5’-F2-CAGCAGGAGGGTTTGCCA-3’(ADPRT位点共享引物，F2荧光素标记)

ADPRT-spe1-5’-AGCAGGTTGTCAAGCATTTACG-3’(ADPRT位点特异性引物1，针对C等位基因)

ADPRT-spe2-5’-TATAAGCAGGTTGTCAAGCATTTACA-3’(ADPRT位点特异性引物2，针对T等位基因)

CYP1B1-pub-5’-F2-GAGGGACCGTCTGCCTTGTA-3’(CYP1B1位点共享引物，F2荧光素标记)

CYP1B1-sep1-5’-CCGGGTTAGGCCACTTGAG-3’(CYP1B1位点特异性引物1，针对C等位基因)

CYP1B1-sep2-5’-TATACCGGGTTAGGCCACTTTAC-3’(CYP1B1位点特异性引物2，针对G等位基因)

OGG1-pub-5’-CTTATGTCCAAGAACCCTAACCC-3’(OGG1位点共享引物，F2荧光素标记)

OGG1-spe1-5’-ACGAGGAGACAAGAGCCTGG-3’(OGG1位点特异性引物1，针对G等位基因)

OGG1-spe2-5’-TGTACCGAGGAGACAAGAGCTAGT-3’(OGG1位点特异性引物2，针对T等位基因)

REV1-pub-5’-F2-AGTCAATGGCATGAACAGTTGG-3’(REV1位点共享引物，F2荧光素标记)

REV1-spe1-5’-CCTTATCCTCCTCCTGGGAAA-3’(REV1位点特异性引物1，针对T等位基因)

REV1-spe2-5’-TATACCTTATCCTCCTCCTGGGTAG-3’(REV1位点特异性引物2，针对C等位基因)

XPC-pub-5’-F2-TGATTACTAACCCTCGCCTGTG-3’(XPC位点共享引物，F2荧光素标记)

XPC-spe1-5’-GGCGCTCAGCTCACAGGTT-3’(XPC位点特异性引物1，针对A等位基因)

XPC-spe2-5’-TATAAGCGCTCAGCTCACAGTTG-3’(XPC位点特异性引物2，针对C等位基因)

GSTM4-pub-5’-F3-GGAAAGGCGTCCAAGCAGT-3’(GSTM4位点共享引物，F3荧光素标记)

GSTM4-sep1-5’-GGCCATGGTTTGTTGGACAC-3’(GSTM4位点特异性引物1，针对C等位基因)

GSTM4-sep2-5’-TATAGGCCATGGTTTGTTGGATAT-3’(GSTM4位点特异性引物2，针对T等位基因)

AXIN2-pub-5’-F4-CAGCAGCAGCTTCCGTGAG-3’(AXIN2位点共享引物，F4荧光素标记)

AXIN2-spe1-5’-CCTGGTGTTGGAAGAGACTGG-3’(AXIN2位点特异性引物1，针对C等位基因)

AXIN2-spe2-5’TATACCTGGTGTTGGAAGAGACCGA-3’(AXIN2位点特异性引物2，针对T等位基因)

PLOI-pub-5’-F4-CAGATAGCCATAAGCAAACAGTAGC-3’(PLOI位点共享引物，F4荧光素标记)

PLOI-spe1-5’-ATGTGGAAATCTGATCCGGC-3’(PLOI位点特异性引物1，针对G等位基因)

PLOI-spe2-5’-TATAATGTGGAAATCTGATCCGGT-3’(PLOI位点特异性引物2，针对A等位基因)

四种荧光素的名称和结构分别为：

F1：蓝色荧光标记物6-FAM，结构式为图1。

F2：黄色荧光标记物6-TAMRA(Tetramethyl-rhodamine)，结构式为图2。

F3：绿色荧光标记物

JOE(6-carboxy-4’，5’-dichloro-2’，7’-dimethoxy-fluorescein)，结构式为图3。

F4：红色荧光标记物6-ROX(X-rhodamine)，结构式为图4。

需要说明的是四种荧光标记物可以互换。

本发明的试剂盒中包含了上述13个SNP基因座的所有引物，每个位点3条引物，其中一条是共享引物，分别用不同的荧光素标记，另外两条引物针对不同的SNP等位基因设计，与共享引物分别配对扩增不同的等位基因，由于引物长度不同，所以不同的等位基因扩增产物长度不同，一般相差4bp，通过自动激光荧光遗传检测仪检测，就可以根据产物长度的不同区分不同的等位基因，如果是纯合子，只能得到1个产物峰；而如果是杂合子，则可以得到两个产物峰。

对于SNP等位基因的检测，最直接最准确的方法是基因测序，但这种方法只能逐个位点进行，效率低下、技术要求高而且费用昂贵；其次常用的方法是根据SNP位点的等位基因，寻找适合的限制性内切酶，根据限制性内切酶消化后产物长度的不同，区分不同的等位基因，但这种方法也只能逐个位点SNP进行检测，而且有时会由于酶的消化不完全而得出错误结论，所以具有效率低下、准确性差的缺点。本方法将13个SNP位点在一个反应管中同时扩增，同时检测，效率大大提高，结合基因分析软件(GenoTyper2.5.2)可以自动对结果进行分析，一天可以完成上百例样品的检测；由于荧光检测具有高灵敏性，所以检测所需要的样品量极其微量，一次只需要5-10ng；不同等位基因的扩增产物长度相差4bp，完全能满足检测的要求；通过调试引物浓度，获得最佳引物浓度配比，可以有效抑制非特异性扩增产物的出现。

在进行复合扩增反应时，可在PCR反应体系中同时加入本试剂盒中分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲浪和常规反应所需的四种脱氧核苷三磷酸，就可以进行有效地PCR扩增。具体反应体系如下：

样品DNA(5-10ng) 1ul

引物混合物 2ul

dNTPs 1.6ul

缓冲液 2ul

DNA聚合酶 0.2ul(1u)

无菌去离子水补充 20ul

本方明的试剂盒中还提供了用于规范不同实验室检验结果的质控DNA样品和13个SNP位点等位基因分型标准物(Ladder)，质控DNA样品是已经过测序确证了的按照本试剂盒的操作说明能够准确分型的DNA样品，可以作为阳性对照或质控DNA样品使用；等位基因分型标准物是发明人收集了所有13个SNP位点所有等位基因的扩增产物，用于基因分析软件自动分型时作为标准使用，采用该等位基因分型标准物，可以快速、准确对检测结果进行分型；同时只要将等位基因分型标准物与样本PCR扩增产物同步电泳，不同的实验室，不同的设备，不同的电泳方法，均可得到一致的可重复性结果，可以用于规范不同实验室的检测结果，避免了因电泳引起的误差。

本发明试剂盒能够高效率地对13个高识别率的SNP基因座进行复合扩增，通过自动荧光测序仪进行检测分型，达到高自动化水平，实验结果准确、可重现性好的目的，本发明的试剂盒用于法医学个人识别具有很大的优势和潜力。

Claims

1.一种13个高个人识别能力SNP位点多色荧光复合扩增试剂盒，该试剂盒包括a)引物混合物，b)DNA聚合酶，c)缓冲液(含MgCl₂)，d)质控DNA，e)等位基因分型标准物混合物，其特征是：引物混合物由13条荧光标记共享引物和26条针对不同等位基因的长度特异性引物组成；分别针对13个肺癌易感性相关SNP基因位点，分别为NQO1(Ser187Pro)，RASSF1(Ala133Ser)，MBD4(Glu346Lys)，XPD(Lys751Gln)，XRCC1(194Trp/Arg)，ADPRT(Val762Ala)，CYP1B1(Val432Leu)，OGG1(Ala85Ser)，REV1(Phe257Ser)，XPC(Lys939Gln)，GSTM4(T2517C)，AXIN2(Pro50Ser)，PLOI(Thr706Ala)。

2.根据权利要求1所述的13个高个人识别能力SNP基因位点，引物序列为：

REV1-spe2-5’-TATACCTTATCCTCCTCCTGGGTAG-3′(REV1位点特异性引物2，针对C等位基因)

四种荧光素的名称分别为：

F1：蓝色荧光标记物FAM；F2：黄色荧光标记物TAMRA；F3：绿色荧光标记物JOE；F4：红色荧光标记物ROX；四种荧光标记物可以互换。

3.权利要求1所述的试剂盒在法医学个人识别中的应用。