CN108441558A - 肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒 - Google Patents

肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒 Download PDF

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CN108441558A CN201810144792.8A CN201810144792A CN108441558A CN 108441558 A CN108441558 A CN 108441558A CN 201810144792 A CN201810144792 A CN 201810144792A CN 108441558 A CN108441558 A CN 108441558A
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肖雯
尚慧捷
舒平
王军
王军一
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Abstract

本发明提供一种易于操作、成本低、准确性高，且对试剂仪器要求低的肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒。肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系中同时扩增准单态性的单核苷酸重复位点NR21，NR22，NR24，BAT25，BAT26。检测试剂盒包括一复合扩增体系，复合扩增体系包括两组引物混合物：一组为NR21，NR22，BAT25的引物的混合物；二组为NR24，BAT26的引物的混合物。本发明便于大规模推广，可以实现自动化，节约大量检测时间，降低实验成本，提高检测效率，应用性好。

Description

肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种复合扩增体系及检测试剂盒，更具体的说，它涉及肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒。
背景技术
微卫星（microsatellites）是遍布于人类基因组中的短串联重复序列。当错配修复（mismatch repair，MMR）基因突变、缺失或者表观沉默，从而不能修复DNA复制过程中滑动链与互补碱基出现的错配时，将导致一个或几个重复的碱基插入或缺失，进而产生微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）。大量研究表明，微卫星不稳定性与肿瘤的发生密切相关，可用于癌症筛查、预后及药物敏感性预测。
微卫星不稳定性（MSI）在不同肿瘤中均有分布。微卫星不稳定性最早发现于结直肠癌患者中，但是近20多年的研究发现，微卫星不稳定性普遍存在于其他癌症类型患者中。通过利用基因组全外显子测序技术，对18种癌症5930个基因组进行分析，发现14种癌症患者癌细胞中发生微卫星不稳定性，其中子宫内膜癌微卫星不稳定性频率最高为30%，胃癌与结肠癌为19%。
微卫星不稳定性（MSI）的检测具有重要的临床意义：
1）Lynch综合征筛查，亦称遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，是由MMR基因胚系突变所致的显性遗传病。90%以上的Lynch综合征具有MSI特征，而散发性结直肠癌中只有约15%，所以临床上可用MSI检测来进行Lynch综合征的筛查。Lynch综合征患者及其家族成员常见结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌等多种Lynch综合征相关肿瘤，因此，MSI检测对于患者本人及其家族成员均有重要意义。
2）MSI检测可用于II期结直肠癌患者的预后预测及化疗药物敏感性评估。高度微卫星不稳定（MSI-H）结直肠癌II期患者5年生存率要显著高于微卫星稳定（MSS）结直肠癌，化疗药物5-FU在治疗MSI-H结直肠癌患者中并未带来明显效益；MSI-H III期结直肠癌患者愈后较差，也不能从5-FU治疗中获益，而MSS III期结直肠癌患者可从化疗中获益。
3）MSI检测可用于免疫治疗敏感性预测。NCCN指南2017版将PD-1单抗pembrolizumab和nivolumab推荐用于具有dMMR/MSI-H分子表型的mCRC的末线治疗。
4）2015年，在新英格兰医学杂志发表的研究结果表明，PD-1单抗治疗对MSI-H的实体瘤表现出高缓解率，于是在2017年5月，FDA加速批准派姆单抗用于治疗MSI-H/dMMR的所有实体瘤患者，包括结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等等。
目前临床上用于微卫星不稳定性检测的方法主要有以下3种 ：
1）PCR-琼脂糖胶电泳方法，MSI位点进行PCR后，对产物进行单一片段的琼脂糖凝胶电泳，该方法优势是对设备要求低，缺点是诊断时间长，操作繁琐、数据依赖人工判读。
2）多重荧光PCR方法，目前临床主要采用多重荧光PCR结合毛细管电泳进行MSI检测。MSI位点经过荧光标记的PCR后经遗传分析仪毛细管电泳进行基因组扫描，通过检测片段长度来判断MSI。该方法优势是可进行自动判读，可批量操作。缺点是需要专门的仪器，费用较高。
3）基因检测方法，即对相关错配修复基因的DNA序列直接进行测序。但因进行基因检测在测序位点为高重复位点时，测序错误率较高，在临床应用尚未普及。
确定高度灵敏且特异性的用来检测MSI的位点，是建立MSI检测体系的前提工作。1997年美国国家肿瘤研究所颁布了Bethesda指导，推荐应用BAT25和BAT26、双碱基重复序列D2S123、D5S346和D17S250，共5个微卫星位点来进行结直肠癌的检测，并对MSI作出了定义。2007年 Rosa M. Xicola等人研究发现全单核苷酸重复组合（BAT26、BAT 25、NR21、NR22、NR24）比 NCI推荐的单核苷酸及双核苷酸标记组合，敏感性和阳性预测值更高。
美国NCCN指南中有推荐应用PCR法进行MSI检测。Promega公司的商用MSI检测试剂盒，检测BAT25、BAT26、NR21、NR24、MONO27、Penta C、Penta D等7个位点，前5个为单核酸重复标记物用于判断是否为微卫星不稳定，后2个五核酸重复用于判断样本是否有污染，14%的MSI-H患者Penta C会不稳定，35%的MSI-H患者Penta D会不稳定，因此，应用这两个标志物来排除样本污染并不可靠，同时会额外增加成本。
中国专利201110152226. X公开了一种肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒，该试剂盒选取了8个核苷酸重复位点（NR21、NR22、NR24、NR27、BAT25、BAT26、MONO27、CAT25）进行多重荧光PCR检测，多种荧光标记成本高昂，且只能在多通道的荧光定量PCR仪上进行检测，对试剂及仪器要求较高。中国专利201410377852. 2公开了一种微卫星不稳定性多重检测体系及试剂盒，该试剂盒同样选取了5个核苷酸重复位点，且同样采用的荧光PCR的方法，对试剂及仪器要求较高。
鉴于上述情况，需要一种改良的、易于操作、成本低、准确性高，且对试剂仪器要求低的用于检测MSI方法 。
发明内容
本发明的目的是解决以上提出的问题，提供一种易于操作、成本低、准确性高，且对试剂仪器要求低的肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系，所述复合扩增体系中同时扩增准单态性的单核苷酸重复位点NR21，NR22，NR24，BAT25，BAT26。
作为优化，所述复合扩增体系中的被扩增位点，分为两组：第一组NR21，NR22，BAT25；第二组：NR24， BAT26。
作为优化，所述被扩增位点均由一对引物扩增。
作为优化，所述引物分别为：
NR21引物：
引物1：gttctatttttatatttaaatg，
引物2：cctactccgcattcacactttc；
NR22引物：
引物1：tggataatcgaggcttgtc，
引物2：ttttgttcttacaaactgcatatt；
NR24引物：
引物1：ctatttagtgaaaaattatctg，
引物2：ggcgtgaacccgggaggcggagctt；
BAT25引物：
引物1：gaagacttgctgagcttttcttac，
引物2：gcttgtactttacagcttataaattag；
BAT26引物：
引物1：tgattccaactttggacagtttg，
引物2：acagccatttaaagctagttatc。
本发明还提供一种用于检测肿瘤细胞微卫星不稳定性的试剂盒，包括一复合扩增体系，所述复合扩增体系包括两组引物混合物：一组为NR21，NR22，BAT25的引物的混合物；二组为NR24，BAT26的引物的混合物，所述引物分别为：
NR21引物：
引物1：gttctatttttatatttaaatg，
引物2：cctactccgcattcacactttc；
NR22引物：
引物1：tggataatcgaggcttgtc，
引物2：ttttgttcttacaaactgcatatt；
NR24引物：
引物1：ctatttagtgaaaaattatctg，
引物2：ggcgtgaacccgggaggcggagctt；
BAT25引物：
引物1：gaagacttgctgagcttttcttac，
引物2：gcttgtactttacagcttataaattag；
BAT26引物：
引物1：tgattccaactttggacagtttg，
引物2：acagccatttaaagctagttatc。
作为优化，所述一组将NR21，NR22，BAT25三对引物分别稀释到10μM后等量混合；所述二组将NR24，BAT26两对引物分别稀释到10μM后等量混合。
作为优化，所述复合扩增体系的一组总体积为20 μL：KAPA HiFi HotStartReadyMix体积为10 μL，引物混合物2.4 μL，去离子水5.6μL，扩增模板DNA溶液为2 μL；所述复合扩增体系的二组总体积为20 μL：KAPA HiFi HotStart ReadyMix体积为10 μL，引物混合物2 μL，去离子水6 μL，扩增模板DNA溶液为2 μL；各对PCR引物反应终浓度均为0.025 μM。
作为优化，所述复合扩增体系的扩增条件为：（1）95℃变性10min；（2）95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，共13个cycle，每cycle降温0.4℃；（3）95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共30个cycle；（4）72℃延伸10min，4℃保存。
本发明的整个方法过程：
1、引物组合的设计
首先，选择具有高度灵敏性及特异性的准单态性位点，选择的位点包括NR21，NR22，NR24，BAT25，BAT26，根据候选的位点所在基因的GeneBank序列号从NCBI核酸数据库下载基因序列，各位点所在基因的部分序列见序列表，NR21的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，NR22的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，NR24的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，BAT25的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，BAT26的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
用于扩增NR21的引物对是由位于序列1中1-300位18-30个连续碱基构成的引物，和与序列1中322-621位的互补序列的18-30个连续碱基构成的引物的组合。
用于扩增NR22的引物对是由位于序列2中1-300位18-30个连续碱基构成的引物，和与序列2中322-621位的互补序列的18-30个连续碱基构成的引物的组合。
用于扩增NR24的引物对是由位于序列3中1-300位18-30个连续碱基构成的引物，和与序列3中324-623位的互补序列的18-30个连续碱基构成的引物的组合。
用于扩增BAT25的引物对是由位于序列4中1-300位18-30个连续碱基构成的引物，和与序列4中326-625位的互补序列的18-30个连续碱基构成的引物的组合。
用于扩增BAT26的引物对是由位于序列5中1-300位18-30个连续碱基构成的引物，和与序列5中328-627位的互补序列的18-30个连续碱基构成的引物的组合。
以上引物由Primer3，Primer Premier 5和NCBI Blast等软件设计而成。设计引物时尽量确保各引物的Tm值在(60+2)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差15bp以上。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。
选用任一人源DNA模板，分别用5对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到5对引物共同的扩增条件。最终要达成的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。
然后，将满足要求的5对引物，单重扩增产物和多重扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率以及此5对引物的混合扩增是否引起非特异扩增。
最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将5对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率（反应在电泳结果的峰高上）基本一致为准。最终确定的5对引物序列分别见序列表，NR21引物对如SEQ ID NO：6和7所示，NR22引物对如SEQ ID NO：8和9所示，NR24引物对如SEQ ID NO：10和11所示，RAT25引物对如SEQ ID NO：12和13所示，BAT26引物对如SEQ ID NO：14和15所示。
2、扩增体系及条件的建立
2.1 PCR酶的选择
PCR酶是扩增体系的重要组分，多种PCR酶都满足本发明的需要，如Takara公司的rTaq和HS Taq，KAPA公司的HiFi Taq，Roche公司的AmpliTaq Gold酶等均能得到较好的扩增效率和特异性；采用热启动Taq酶相比非热启动的酶，其扩增效率和特异性均要好。本发明最终选择KAPA公司KAPA HiFi HotStart ReadyMix为反应中的PCR酶。
2.2反应体积的选择
分别采用50μL和20μL体系进行了复合扩增，结果显示：20μL的体系与50μL的体系效果基本相当。
2.3反应程序的优化
退火温度：试验退火温度从58℃到68℃之间各温度下的扩增情况，结果显示经过13个cycle的降落PCR程序之后，61℃退火可以得到理想的效果。
本发明的有益效果如下：
1、本发明用于微卫星不稳定性检测，结果更为准确，由于选用了5个有多篇文献支持的准单态性位点，在评估肿瘤MSI状态时，其结果更为准确可信。
2、本发明的试剂盒操作简单、便于大规模推广，试剂盒可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化。
3、本发明所需检测试剂廉价，实验成本显著降低。本实验只需采购常用的KAPA公司的KAPA HiFi HotStart ReadyMix，不需使用荧光染料和探针，可以完全避免现有技术荧光标记成本高昂，且只能在多通道的荧光定量PCR仪上进行检测，对试剂及仪器要求较高的问题。
4、本发明所需时间短，完成单人检测结果仅需要2.5小时左右，节约大量检测时间，提高了检测效率，应用性更好。
附图说明
图1：采用本发明检测正常组织得到的分型图谱一；
图2：采用本发明检测正常组织得到的分型图谱二；
图3：采用本发明检测同一个来源的肿瘤组织得到的分型图谱一。
图4：采用本发明检测同一个来源的肿瘤组织得到的分型图谱二。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行进一步详细说明：
实施例1
采用本发明对一例结直肠癌患者检测的具体实施情况。
1、DNA提取
采用DNA提取试剂盒（诺维赞）分别对患者的癌组织及正常组织进行DNA提取，操作步骤依照说明书，DNA提取完毕用HS Qubit试剂盒定量，并稀释成10ng/μL。
2、PCR反应
2.1反应体系：
将5个单核苷酸重复位点的共5对引物分别溶解并配置成浓度为10μM的工作液，再将5对引物分为两组。一组将NR21，NR22，BAT25这三对引物等量混合；二组将NR24，BAT26这两对引物等量混合。
复合扩增体系的一组总体积为20 μL：KAPA HiFi HotStart ReadyMix体积为10 μL，引物混合物2.4 μL，去离子水5.6μL，扩增模板DNA溶液为2 μL。复合扩增体系的二组总体积为20 μL：KAPA HiFi HotStart ReadyMix体积为10 μL，引物混合物2 μL，去离子水6 μL，扩增模板DNA溶液为2 μL。上述各对PCR引物反应终浓度均为0.025 μM。
2.2 PCR反应程序：
将PCR反应管置于扩增仪上，并设计如下程序：
（1）95℃变性10min；（2）95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，每cycle降温0.4℃；（3）13个cycle后再运行程序：95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s；（4）72℃延伸10min，4℃保存。
3、毛细管电泳检测
3.1开机预备：
打开空气压缩机、仪器、电脑；打开软件，电脑连接仪器，打开仪器顶盖，测试空气压缩机正常；放入卡夹，关好仪器顶盖，电脑上连接卡夹，能听到“卡嗒”一声；确认4个buffer槽和2管marker溶液充足，点Recalibrate进行校准，校准完毕后显示成功即可。
3.2准备样本：
使用0.2 mL PCR管检测样本体积至少10µL以上，样本珍稀则取2µL加入超微量管，瞬时离心，确定样本未漏，且管内底部无气泡；然后加入10µL矿物油，瞬时离心，确定管内底部无气泡。采用0.2 mL PCR管不加矿物油，需尽快检测。
3.3设定参数：
将准备好的样本放在转盘板上，在软件里设定待检样本位置、本次电泳文件名称、上样时间、电泳次数及时间；参数设定Baseline Factor为2500、Peak threshold为20、PeakDefinition为5；最后链接刚跑过的marker数据或创建新marker，确认无误后开始电泳。
3.4数据导出：
电泳结束后，检测结果可导出为PDF文件。
4、数据分析
根据毛细管电泳的结果，正常组织MSI检测位点NR21扩增产物大小为134bp，NR22扩增产物大小为148bp，BAT25扩增产物大小为303bp，NR24扩增产物大小为242bp，BAT26扩增产物大小为271bp（参见图1和图2）。肿瘤组织MSI检测位点 NR21扩增产物大小为131bp，NR22扩增产物大小为143bp，BAT25扩增产物大小为299bp，NR24扩增产物大小为238bp，BAT26扩增产物大小为269bp（参见图3和图4）。
5、结果判读
正常组织样本和肿瘤组织样本MSI检测位点的扩增产物片段大小有显著差异，按照NCI对肿瘤MSI的评判标准，所测肿瘤组织为高度微卫星不稳定(MSI-H)型。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域中的普通技术人员来说，在不脱离本发明核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州和壹基因科技有限公司
<120> 肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系及检测试剂盒
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
acagtttgtt tttctagaag agaagaaagt acctgaggat tgctcttttt tcctaccgtt 60
aatgaaaact acttttgtct tcatcataaa agaaaaaact aaggggaggt aaaggcagtc 120
tcctgtttta ttagggggag aggtgaaggg aaatccaggc tcactttctg aataagccac 180
tgcctggtgc acagagcaga accatcctgg tttctgaaga cacatccctt tcagcagaat 240
tccagccgga gtcgctggca cagttctatt tttatattta aatgtatgtc tcccctggcc 300
tttttttttt tttttttttt tagcaacact tttcttgttt gtaaacgcga gtgaccagaa 360
agtgtgaatg cggagtagga atatttttcg tgttctcttt tatctgcttg ccttttttag 420
agagtagcag tggttcctat ttcggaaaag gacgttctaa ttcaaagctc tctcccaata 480
tatttacacg aatacgcatt tagaaaggga ggcagctttt gaggttgcaa tcctactgag 540
aaggatggaa gaaggagcca ggcaccgaaa caacaccgaa aagaaacacc caggtggggg 600
cgagtcggac gccagccccg a 621
<210> 2
<211> 621
<212> DNA
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cagtgcttgt gtattcacag ccctaaacca ggctgcagaa cccaacataa tcctgcccac 120
tctgggtgaa tccattttag tagaaaattt ctccaaagtt gatctgattg taaatattaa 180
actgacatct ttatgttgca ggtaaaggac ctggataatc gaggcttgtc aaggacataa 240
atgtcacgtc cagctctgat atgcttcgca ctgagcacat cacatttagg acgttgaaga 300
tttttttttt tttttttttt taatatgcag tttgtaagaa caaaactgga tggcatcaga 360
attgtctgga agttttgtct tgggcagtat gggctgggcc aaatgaaatg atttttataa 420
ttctaaacag gttaccaaat gaaatgtcat ggctttactt tggtcaatta aaggggggaa 480
tttttttaaa aaatgtgcct tatttgtttt gacttataac tgatttgagg gaggcaaaag 540
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tttttttttt tttttttttt tttgtgagac agagtctcac tctgtcaccc aggttggaat 360
gcaatggcac aatctccgct cactgcaagc tccgcctccc gggttcacgc cattctcctg 420
cctcagcctc ccgaatagct gggactacag gtgcccgcca acacgcccgg ctaatttttt 480
gtatttttag tagagacggg gtttcaccgt gttagccagg atggtctcaa tctcctgacc 540
tcgtgatccg cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acagacgtaa gtcaccgtgc 600
ccggcctata tttttatttt att 623
<210> 4
<211> 625
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 4
gtgatctgcc tgcaagttca cattagttca ttcattacca gcctttggta tgtcattgcc 60
actgtctttt cctttcctga cctttatggt tgtaattgct aagaaaaatc ctctcttcct 120
cacaggctca tacatagaaa gagatgtgac tcccgccatc atggaggatg acgagttggc 180
cctagactta gaagacttgc tgagcttttc ttaccaggtg gcaaagggca tggctttcct 240
cgcctccaag aatgtaagtg ggagtgattc tctaaagagt tttgtgtttt gtttttttga 300
tttttttttt tttttttttt tttttgagaa cagagcattt tagagccata gttaaaatgc 360
agaatgtcat tttgaagtgt ggtaaccaaa agcagaggaa atttagtttc ttcatgttcc 420
aactgctgtc tctttggaat tcctgttcta atttataagc tgtaaagtac aagcctgtct 480
aaatgagttt ttctatgaat attcttttat atgcagtgaa attcttttaa aacttttggc 540
ttttaggata taggatatgt tcctagagaa cagaatcatt ttatcagtaa aagcagaggg 600
cacctcatag ttacaaggct tgggg 625
<210> 5
<211> 627
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 5
ctttagtttt cttggtttgg attgggaagg aacaccaagg aaaatgaggg acttcagaat 60
ttattttcat tttgcatttg ttttttaaaa tctttagaac tggatccagt ggtatagaaa 120
tcttcgattt ttaaattctt aattttaggt tgcagtttca tcactgtctg cggtaatcaa 180
gtttttagaa ctcttatcag atgattccaa ctttggacag tttgaactga ctacttttga 240
cttcagccag tatatgaaat tggatattgc agcagtcaga gcccttaacc tttttcaggt 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaggg ttaaaaatgt tgaatggtta aaaaatgttt 360
tcattgacat atactgaaga agcttataaa ggagctaaaa tattttgaaa tattattata 420
cttggattag ataactagct ttaaatggct gtatttttct ctcccctcct ccactccact 480
ttttaacttt ttttttttta agtcagagtc tcacttgttc cctaggccag agtgcagtgg 540
cacaatctca gcccactcta acctccacct cccaagtagt tgggattaca gttgcctgcc 600
accatgcctg gttaattttt atatttt 627
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 6
gttctatttt tatatttaaa tg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 7
cctactccgc attcacactt tc 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 8
tggataatcg aggcttgtc 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 9
ttttgttctt acaaactgca tatt 24
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 10
ctatttagtg aaaaattatc tg 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 11
ggcgtgaacc cgggaggcgg agctt 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 12
gaagacttgc tgagcttttc ttac 24
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 13
gcttgtactt tacagcttat aaattag 27
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 14
tgattccaac tttggacagt ttg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 15
acagccattt aaagctagtt atc 23

Claims (8)

1.肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系中同时扩增准单态性的单核苷酸重复位点NR21，NR22，NR24，BAT25，BAT26。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系中的被扩增位点，分为两组：第一组NR21，NR22，BAT25；第二组：NR24， BAT26。
3.根据权利要求2所述的肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系，其特征在于，所述被扩增位点均由一对引物扩增。
4.根据权利要求3所述的肿瘤细胞微卫星不稳定性的复合扩增体系，其特征在于，所述引物分别为：
NR21引物：
引物1：gttctatttttatatttaaatg，
引物2：cctactccgcattcacactttc；
NR22引物：
引物1：tggataatcgaggcttgtc，
引物2：ttttgttcttacaaactgcatatt；
NR24引物：
引物1：ctatttagtgaaaaattatctg，
引物2：ggcgtgaacccgggaggcggagctt；
BAT25引物：
引物1：gaagacttgctgagcttttcttac，
引物2：gcttgtactttacagcttataaattag；
BAT26引物：
引物1：tgattccaactttggacagtttg，
引物2：acagccatttaaagctagttatc。
5.一种用于检测肿瘤细胞微卫星不稳定性的试剂盒，包括一复合扩增体系，其特征在于，所述复合扩增体系包括两组引物混合物：一组为NR21，NR22，BAT25的引物的混合物；二组为NR24，BAT26的引物的混合物，所述引物分别为：
NR21引物：
引物1：gttctatttttatatttaaatg，
引物2：cctactccgcattcacactttc；
NR22引物：
引物1：tggataatcgaggcttgtc，
引物2：ttttgttcttacaaactgcatatt；
NR24引物：
引物1：ctatttagtgaaaaattatctg，
引物2：ggcgtgaacccgggaggcggagctt；
BAT25引物：
引物1：gaagacttgctgagcttttcttac，
引物2：gcttgtactttacagcttataaattag；
BAT26引物：
引物1：tgattccaactttggacagtttg，
引物2：acagccatttaaagctagttatc。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一组将NR21，NR22，BAT25三对引物分别稀释到10μM后等量混合；所述二组将NR24，BAT26两对引物分别稀释到10μM后等量混合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述复合扩增体系的一组总体积为20 μL：KAPA HiFi HotStart ReadyMix体积为10 μL，引物混合物2.4 μL，去离子水5.6μL，扩增模板DNA溶液为2 μL；所述复合扩增体系的二组总体积为20 μL：KAPA HiFi HotStartReadyMix体积为10 μL，引物混合物2 μL，去离子水6 μL，扩增模板DNA溶液为2 μL；各对PCR引物反应终浓度均为0.025 μM。
8.根据权利要求7所述的的试剂盒，其特征在于，所述复合扩增体系的扩增条件为：（1）95℃变性10min；（2）95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，共13个cycle，每cycle降温0.4℃；（3）95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共30个cycle；（4）72℃延伸10min，4℃保存。
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