CN110819706A - 单细胞测序在免疫细胞分析中的应用 - Google Patents
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Abstract
本发明提供了单细胞测序在免疫细胞分析中的应用，所述免疫细胞包括T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、巨核细胞或树突状细胞中的任意一种或至少两种的组合；所述免疫细胞分析包括对免疫细胞和/或免疫细胞亚型的种类、状态或比例中的任意一种或至少两种的组合进行分析。本发明中，将单细胞测序应用于免疫细胞分析中，首先经单细胞测序获得样本的测序结果，随后采用生物信息分析方法获得免疫细胞的分布状态、亚型组成和细胞轨迹，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞和/或免疫细胞亚型的种类、状态和比例分析。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及单细胞测序在免疫细胞分析中的应用。
背景技术
原发性肿瘤存在难以进行活组织检查的问题，穿刺作为应用最广泛的活检手段之一，在临床应用中无法保证每次都获得足够的材料，而且还存在着对操作的医生要求高、可能人为导致肿瘤细胞转移、造成病人痛苦、容易引起并发症等局限性。使用血液作为临床样本具有显著的优点：血液容易获取并且对患者几乎没有伤害，血液中的一些成分反映了不同的病理状态。因此，分析血液样本有助于对患者进行疾病诊断。
液体活检分析可应用于微小残留病(MRD)的检测和表征、癌症的检测、诊断和治疗的实时监测、肿瘤的分级与治疗干预、治疗靶点和耐药机制的研究、以及转移复发的预测(预后)等。肿瘤DNA可以从原发肿瘤、循环肿瘤细胞(CTCs)、微转移或明显转移灶中释放到癌症患者的血液中(Alix-Panabières C等，Cancer discovery，2016)。文献报道外周血的循环肿瘤DNA(ctDNA)(Ed Yong，Nature，2014；Paul T Spellman等，Nature medicine，2014)、正常细胞DNA(Shicheng Guo等，Nature genetics，2017)、血液多肽(EmanuelF.Petricoin等，Nature reviews Cancer，2006)、肿瘤RNA(Myron G.Best，Cancer cell，2017)、循环microRNA(Maleene Patel等，Lancet，2015)和外泌体等各种特异性生物标志物用于检测肿瘤。目前临床上采用的血液生物标志物的特异性较低，这是由于患者间的肿瘤分子存在异质性，同时在肿瘤位置、大小、组织学、分级和分期等方面也存在异质性(Emanuel F.Petricoin等，Nature reviews Cancer，2006；Vathany Kulasingam等，Naturereviews Cancer，2010)。根据不同起始量的无细胞DNA(cfDNA)选择不同的特异性标志物鉴定血液样本中的微量ctDNA，是目前面临的技术挑战。
液体活检领域已出现通过研究血液中的外周血单核细胞(PBMC)(Borcherding N等，Clinical cancer research，2019)和免疫组库(TCR和BCR)(Carsten Krieg等，Naturemedicine，2018；Natalie J.Miller，Journal for immunotherapy of cancer，2018)进行肿瘤检测的报道。
部分血液肿瘤被认为源自免疫细胞祖细胞，实体肿瘤切除数月或数年后又在外周血中检测到循环肿瘤细胞，说明肿瘤细胞通过再循环进入血液并移动到二级位点(MüllerV，Clinical cancer research，2005)。以上两种情况促使机体血液循环系统对病灶作出反应。肿瘤细胞还会募集血液中的免疫细胞，如T细胞和NK细胞(David Masopust等，Annualreview of immunology，2019)、单核细胞(Elizabeth M.Swisher，JAMA oncology，2016)和中性粒细胞(Catherine A.Fromen等，ACS nano，2017)到肿瘤位点，增加免疫细胞的浸润，改变血液循环系统的免疫景观，因此可以通过免疫细胞的变化来表征肿瘤细胞。
发明内容
针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了单细胞测序在免疫细胞分析中的应用，采用单细胞测序技术分析样本中免疫细胞和/或免疫细胞亚型的种类、状态或比例，在疾病的早期筛查、诊断和治疗方面具有重要贡献。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了单细胞测序在免疫细胞分析中的应用，所述免疫细胞包括T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、巨核细胞或树突状细胞中的任意一种或至少两种的组合；
所述免疫细胞分析包括对免疫细胞和/或免疫细胞亚型的种类、状态或比例中的任意一种或至少两种的组合进行分析。
本发明中，将单细胞测序应用于免疫细胞分析中，首先经单细胞测序获得样本的测序结果，随后采用生物信息分析方法获得免疫细胞的分布状态、亚型组成和细胞轨迹，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞和/或免疫细胞亚型的种类、状态和比例分析。
优选地，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞或自然杀伤性T细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种免疫细胞分析装置，所述装置包括单细胞测序单元、生物信息分析单元、细胞亚型注释单元和细胞亚型差异分析单元。
优选地，所述单细胞测序单元包括单细胞处理模块、文库构建模块或测序模块中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述文库构建模块采用SCOPE进行文库构建。
优选地，所述测序模块采用Illumina进行测序。
优选地，所述生物信息分析单元包括细胞分布分析模块、细胞亚型分析模块或细胞轨迹分析模块中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述细胞分布分析模块采用聚类算法和/或降维算法进行细胞分布分析。
优选地，所述聚类算法包括SNN模型。
优选地，所述细胞亚型分析模块采用t-SNE进行细胞亚型分析。
优选地，所述细胞轨迹分析模块采用monocle2进行细胞轨迹分析。
第三方面，本发明提供了一种免疫细胞分析方法，采用如第二方面所述的装置，所述方法包括以下步骤：
(1)单细胞测序：对样本进行单细胞处理，构建文库并测序；
(2)生物信息分析：将测序结果进行聚类运算和降维运算，获得细胞的分布状态，和/或进行t-SNE分析，获得细胞亚型组成，和/或进行细胞轨迹分析；
(3)细胞亚型注释；
(4)细胞亚型差异分析。
优选地，步骤(1)所述构建文库采用SCOPE进行，首先利用微流控芯片捕获单细胞，并将数万个具有独特的细胞标签(cell barcode)的磁珠加入到芯片微孔中，确保每孔只含有1个磁珠；细胞裂解后，带有细胞标签和独特分子标签(Unique MolecularIndex，UMI)的磁珠捕获mRNA，为来源于同一细胞的所有mRNA标记上相应的细胞标签，同时为每一条mRNA标记上独特的UMI；收集芯片中的磁珠，将磁珠捕获的mRNA反转录为cDNA并扩增；将cDNA经过片段化、连接接头等步骤构建适用于Illumina测序平台的测序文库。
优选地，步骤(1)所述测序采用Illumina进行，引物序列例如可以是SEQ ID NO:1：GATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，SEQ ID NO:2：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
优选地，步骤(2)所述聚类运算包括SNN模型。
优选地，步骤(4)所述细胞亚型差异包括细胞亚型种类差异、细胞亚型基因表达差异或细胞亚型比例差异中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，每个细胞亚型都有其特异性表达的标志物基因，根据差异基因表达列表中的标志物基因来注释细胞的亚型。
第四方面，本发明提供了一种如第二方面所述的装置在制备疾病筛查试剂盒、疾病诊断试剂盒或疾病治疗药物中的应用。
优选地，所述疾病包括血液肿瘤和/或实体瘤。
优选地，所述血液肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增值性肿瘤或淋巴细胞系肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述实体瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、少突胶质细胞瘤、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、子宫肌瘤、宫颈癌、卵巢癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明将单细胞测序应用于免疫细胞分析中，首先经单细胞测序获得样本的测序结果，随后采用生物信息分析方法获得免疫细胞的分布状态、亚型组成和细胞轨迹，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞和/或免疫细胞亚型的种类、状态和比例分析；
(2)本发明中，不同患者的免疫细胞亚型组成存在差异，存在特异性表达MNDA、NAMPT和IL1B基因的monocyte亚型的病人具有较活跃的自身免疫反应；
(3)本发明中，PD-1治疗前后免疫细胞亚型组成存在差异，治疗后的细胞亚群中CD4+T、CD8+T和NK细胞比例增加，而经典单核细胞和非经典单核细胞比例减少；
(4)本发明中，治疗后不同时间点免疫细胞亚型组成存在差异，在病人的造血干细胞移植时间最短的时间点，存在特异的中性粒细胞。
附图说明
图1(A)为实施例4的2个样本的外周血免疫细胞联合分析，按样本着色，图1(B)为实施例4的2个样本的外周血免疫细胞亚型鉴定和分析，按细胞类型着色，其中，1-CD4+初始T细胞，2-CD4+记忆T细胞，3-CD8+记忆T细胞，4-单核细胞，5-自然杀伤细胞，6-B细胞，7-活化单核细胞，8-CD8+初始T细胞，9-巨噬细胞，10-巨核细胞，11-树突状细胞，12-CD4+T细胞，13-血浆B细胞；
图2(A)为实施例5的PD-1治疗前后外周血免疫细胞联合分析，按治疗前和治疗后着色，图2(B)为实施例5的PD-1治疗前后外周血免疫细胞亚型鉴定和分析，按细胞类型着色，图2(C)为实施例5的每种细胞类型在样本中所占比例图；
图3(A)为实施例6的白血病病人造血干细胞移植后不同时间点的细胞图谱，按样本时间点着色，图3(B)为实施例6的白血病病人造血干细胞移植后不同时间点的细胞图谱，按细胞类型着色，图3(C)为实施例6的每种细胞类型在样本中所占比例图，图3(D)为实施例6的白血病病人造血干细胞移植后的细胞拟时分析；
图4(A)为实施例7的健康人PBMC的细胞图谱，按细胞类型着色，图4(B)为实施例7的每种细胞类型在样本中所占比例图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1单细胞转录组的建库和测序
(1)单细胞预处理
采用
海量单细胞mRNA测序前处理试剂盒处理单细胞，包括以下步骤：
①准备步骤：
芯片准备：芯片小孔端为进样口，大孔端为出样口，使大小口都充满0.02％PBS-Tween液体，将芯片放入真空干燥器内抽真空15分钟，取出后再于室温静置15分钟，保证芯片内彻底没有气泡；
裂解液(lysis buffer)和磁珠(beads)准备：在冰上配制裂解液，用PBS缓冲液清洗磁珠；
细胞准备：将细胞重悬于PBS，根据期望得到的细胞数，调整相应的细胞浓度；
②芯片操作：
将重悬好的细胞缓慢匀速(约15s)注入芯片；吸取重悬好的磁珠缓慢匀速(约30s)加入进样口，将磁珠灌注入芯片；吸取裂解液加于进样口，缓慢加入芯片，吸去出样口多余液体，注：裂解液较为粘稠且容易产生气泡，加样时需留意不将气泡带入芯片；
室温静置15min，用以裂解细胞并释放mRNA，让磁珠捕获mRNA，提前设置金属浴42℃，转速1200rpm；
将新格元磁力架置于芯片顶部，静置1min，保持磁力架在芯片顶部，于出样口加入250μL 6×SSC，将200μL枪头插入进样口，吸取200μL液体，将收集到的含有磁珠的液体转移至1.5mL离心管内；重复以上步骤1次，收集捕获到mRNA的磁珠；
对捕获的mRNA进行反转录和PCR，采用80％乙醇漂洗产物，并进行质检。
(2)文库构建
用
(Single Cell Omics Preparation Entity)海量单细胞测序技术进行文库构建，包括以下步骤：
将待测序的cDNA进行片段化、末端修复并加A尾，通过连接反应在DNA片段的两端加上接头，PCR扩增，对扩增产物进行质检。
(3)Illumina测序
把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序，参照Illumina上机操作手册，对文库变性稀释，混合进行上机测序，选用PE150上机模式，测序深度为50K reads/cell或者100K reads/cell。
实施例2生物信息分析
本实施例的测序数据分析方法包括：
(1)Barcode质控分析
在进行整体质控前，首先进行barcode数据质量分析，过滤掉测序质量较低的cellbarcode以保证后续分析的准确性，barcode中质量值低于14或大于1的碱基数目进行过滤；此外对于UMI之后的不含polyA的reads也进行过滤；
为了获取高质量的数据进行后续分析，使用fastp对Reads2进行trimming，对read进行过滤，过滤内容如下：
截去末端接头(adapter)序列；
去除含N(N表示无法确定碱基信息)的个数超过5个的reads；
按4碱基滑动窗口从reads5’端到3’端，截去平均质量值低于20的窗口3’端序列；
截去碱基质量值低于15位点的3’端序列；
截去有10个以上连续碱基的polyX序列；
去除reads长度小于15的序列。
(2)细胞分布分析
Seurat软件包默认使用SNN(shared nearest neighbor)模型进行聚类运算，随后通过降维运算来显示细胞的分布状态；
(3)细胞亚型分析
通过t-SNE图和柱状图显示免疫细胞亚型的组成变化；
(4)细胞轨迹分析
采用monocle2软件进行免疫细胞亚型的轨迹分析。
实施例3细胞亚型注释
利用新格元自主开发的半自动化细胞亚群注释，以及新格元数据库中参考数据集和知识库对细胞亚型进行注释，步骤如下：
(1)半自动化细胞亚群注释：根据免疫细胞的marker基因在每个cluster中的平均表达量和细胞表达百分比，得到每个cluster的细胞类型，通过跑一个脚本来完成此项工作；
(2)人工核对：
首先根据样本信息，了解样本类型(物种、组织/外周血、肿瘤/癌旁)，再根据样本相关的临床病理信息(分期、疗效等)，判断免疫细胞主要的细胞类型；
根据每个亚群差异表达基因列表中的基因表达情况，评估可能存在的亚型，免疫细胞的亚群包括T细胞、B细胞和髓系细胞，每个亚群又分了亚群，非免疫细胞亚群包括内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞等，每个亚群又根据不同的特异性marker基因分为不同的亚群；根据canonical marker绘制feature plot图；
差异基因的分析和筛选：利用新格元数据库的cell marker与每个亚群差异表达基因进行对照，确定细胞具体亚型和功能状态，识别正常和异常的细胞；
结果分析：再次结合临床信息，发现样本之间的异质性和/或相似性。
实施例4不同样本的外周血免疫细胞联合分析
本实施例对两个肺部毛玻璃样病变患者(LC1，LC2)的外周血进行了单细胞转录组的建库和测序，测序深度较浅，约为20K reads/cell，随后对测序结果进行生物信息分析，通过t-SNE图展示免疫细胞亚型的组成变化，如图1(A)所示，利用新格元自主开发的细胞注释机器学习算法，以及新格元数据库中参考数据集和知识库，对2个样本中的细胞亚型进行注释，如图1(B)所示。
可以看出，在大部分免疫细胞亚群中均存在着两个病人来源的细胞，但是比例有所差异；最大的差异在monocyte亚型中，LC2病人存在特异性被激活的monocyte亚群，该亚群特异性表达MNDA、NAMPT和IL1B等基因，参与monocyte激活和炎症反应，在干扰素IFN-alpha的刺激下释放，这个特异性亚群的存在说明病人LC2具有较活跃的自身免疫反应，这与两个病人在肺癌组织样本中观察到的现象吻合的较好。
实施例5 PD-1治疗前后外周血免疫细胞联合分析
本实施例对PD-1治疗前(before)和治疗后(after)的两组外周血样本进行了单细胞转录组的建库和测序，并对测序结果进行生物信息分析，通过t-SNE图展示免疫细胞亚群的组成变化，如图2(A)所示，利用新格元自主开发的细胞注释机器学习算法，以及新格元数据库中参考数据集和知识库，对2个样本中的细胞亚型进行注释，如图2(B)和图2(C)所示。
可以看出，在大部分免疫细胞亚群中均存在治疗前和治疗后的细胞，但比例有所不同；对比发现，治疗后的细胞亚群中CD4+T、CD8+T和NK细胞比例增加，而经典单核细胞(classical monocyte)和非经典单核细胞(non-classical monocyte)比例减少。CD4+T、CD8+T和NK细胞对肿瘤具有抑制性和杀伤性，经典单核细胞一般具有促炎作用和抗原呈递的作用，非经典单核细胞是血管巡逻，起到清除异物的作用。
实施例6治疗后不同时间点外周血免疫细胞联合分析
本实施例对4位白血病病人移植造血干细胞后的不同时间点(A01、A02、A03、A04)的细胞进行了单细胞转录组的建库和测序，随后对测序结果进行生物信息分析，通过t-SNE图展示免疫细胞亚型的时间变化和组成变化，如图3(A)、图3(B)和图3(C)所示，利用monocle2进行细胞轨迹分析，如图3(D)所示。
可以看出，在大部分免疫细胞亚群中均存在4个病人不同时间点的细胞，但是比例有所差异；cluster7是病人在A03时间点的特异性免疫细胞亚型，在A03时间点，病人的造血干细胞移植时间最短；根据细胞标志物可以确定Cluster4、5和7为中性粒细胞(Neutrophils)，中性粒细胞主要具有促炎性，诱导T细胞活化。
对细胞亚群进行拟时分析，由图3(D)可以看出细胞间呈现7→4→5的分化关系。
实施例7
本实施例对4位健康人的PBMC进行了单细胞转录组的建库和测序，随后对测序结果进行生物信息分析，通过t-SNE图展示免疫细胞亚型的组成和每种细胞亚型在每位健康人PBMC中所占的比例，如图4(A)和图4(B)所示。可以看出，健康人的PBMC免疫细胞亚型的种类具有一致性，都主要含有T细胞、B细胞、树突细胞、单核细胞、自杀细胞和浆细胞，但是健康人的免疫细胞又具有异质性，每种细胞类型在每位健康人的PBMC中所占的比例显著不同。
综上所述，本发明将单细胞测序应用于免疫细胞分析中，首先经单细胞测序获得样本的测序结果，随后采用生物信息分析方法获得免疫细胞的分布状态、亚型组成和细胞轨迹，并对细胞亚型进行注释，通过比较不同的结果实现对免疫细胞和/或免疫细胞亚型的种类、状态和比例分析，在疾病的早期筛查、诊断和治疗方面具有应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州新格元生物科技有限公司
<120> 单细胞测序在免疫细胞分析中的应用
<130> 20191113
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 38
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
Claims (10)
1.单细胞测序在免疫细胞分析中的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞、巨核细胞或树突状细胞中的任意一种或至少两种的组合；
所述免疫细胞分析包括对免疫细胞和/或免疫细胞亚型的种类、状态或比例中的任意一种或至少两种的组合进行分析。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞或自然杀伤性T细胞中的任意一种或至少两种的组合。
3.一种免疫细胞分析装置，其特征在于，所述装置包括单细胞测序单元、生物信息分析单元、细胞亚型注释单元和细胞亚型差异分析单元。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述单细胞测序单元包括单细胞处理模块、文库构建模块或测序模块中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述文库构建模块采用SCOPE进行文库构建；
优选地，所述测序模块采用Illumina进行测序。
5.根据权利要求3或4所述的装置，其特征在于，所述生物信息分析单元包括细胞分布分析模块、细胞亚型分析模块或细胞轨迹分析模块中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述细胞分布分析模块采用聚类算法和/或降维算法进行细胞分布分析；
优选地，所述聚类算法包括SNN模型；
优选地，所述细胞亚型分析模块采用t-SNE进行细胞亚型分析；
优选地，所述细胞轨迹分析模块采用monocle2进行细胞轨迹分析。
6.一种免疫细胞分析方法，其特征在于，采用如权利要求3-5任一项所述的装置，所述方法包括以下步骤：
(1)单细胞测序：对样本进行单细胞处理，构建文库并测序；
(2)生物信息分析：将测序结果进行聚类运算和降维运算，获得细胞的分布状态，和/或进行t-SNE分析，获得细胞亚型组成，和/或进行细胞轨迹分析；
(3)细胞亚型注释；
(4)细胞亚型差异分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建文库采用SCOPE进行；
优选地，步骤(1)所述测序采用Illumina进行。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述聚类运算包括SNN模型。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述细胞亚型差异包括细胞亚型种类差异、细胞亚型基因表达差异或细胞亚型比例差异中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种如权利要求3-5任一项所述的装置在制备疾病筛查试剂盒、疾病诊断试剂盒或疾病治疗药物中的应用；
优选地，所述疾病包括血液肿瘤和/或实体瘤；
优选地，所述血液肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增值性肿瘤或淋巴细胞系肿瘤中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述实体瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、少突胶质细胞瘤、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、子宫肌瘤、宫颈癌、卵巢癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
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