DE60113418T2

DE60113418T2 - Anti-karzinogene aktivität von aus der lakritzenwurzel isolierten hydroxylierten chalcon-verbindungen

Info

Publication number: DE60113418T2
Application number: DE60113418T
Authority: DE
Inventors: T. Robert ROSEN; Chi-Tang Ho; S. Robert DIPAOLA; Mohammed Rafi; C. Bret VASTANO; Geetha Ghai
Original assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 2000-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2021-06-14
Also published as: EP1296700A1; US20020022665A1; ATE304367T1; CA2412316A1; WO2001095923A1; US6498195B2; EP1296700B1; ES2249443T3; JP2004503503A; EP1296700A4; DE60113418D1; AU2001275484A1

Description

Einleitung
Die Anmeldung beansprucht den Nutzen der Priorität der Vorläufigen Anmeldung Serien-Nummer 60/211,266 vom 13. Juni 2000.
Hintergrund der Erfindung
Kräuterprodukte haben an Popularität bei der Anwendung zur Behandlung von Erkrankungen des Menschen zugenommen. Obwohl die klinische Wirkung der meisten Kräuter unbekannt ist, enthalten viele Kräuter Derivate mit biologischer Aktivität. Ein solches Kraut ist Lakritzenwurzel. Es wurde gezeigt, dass Extrakte der Lakritzenwurzel biologische Aktivität aufweisen, welche antioxidative Aktivität (Palagina, M.V. et al., 1999. Ter. Arkh. 71: 45–48), Hemmung der Melaninsynthese (Yokota, T. et al. 1998. Pigment Cell Res. 11: 355–361), Hemmung der Angiogenese (Kobayashi, S. et al. 1995. Biol. Phar. Bull. 18: 1382–1386), antimikrobielle Aktivität (Mitscher, L.A. et al. 1980. J. Nat. Prod. 43: 259–269), antiparasitische Aktivität (Zhai, L. et al. 1995. Antimicrob. Agents Chemotherap. 39: 2742–2748) und anti-Tumoraktivität (Shibata, S. 1994. Stem Cells 12: 44–52) umfassen. Einige für die verschiedenen biologischen Wirkungen verantwortliche Verbindungen wurden isoliert. Beispiele für solche Verbindungen umfassen Glabridin (Yokota, T. et al. 1998. Pigment Cell Res. 11: 355–361), Isoliquiritin (Kobayashi, S. et al. 1995. Biol. Pharm. Bull. 18:1382–1386), Glycyrrhizin (Raggi, M.A. et al. 1995. Boll. Chim. Farm. 134: 634–638) und Licochalcon A, eine nicht hydroxylierte Chalconverbindung (Shibata, S. 1994. Stem Cells 12: 44–52).
Neuere Studien mit einer Kombination von acht Kräutern, umfassend Lakritzenwurzel, genannt PC-SPES, zeigten eine potente klinische und biologische Aktivität (DiPaola, R.S. et al. 1998. N. Engl. J. Med. 339: 785–791). PC-SPES zeigte anti-Prostatakrebs-Aktivität, welche den Phytoöstrogenen zugeschrieben werden konnte, die eine chemische Kastration bewirkten. Eine andere Studie zeigte, dass Lakritzenwurzel allein in der Lage war, den Spiegel zirkulierenden Testosterons bei Männern zu senken (Armanini, D. et al. 1999. N. Engl. J. Med. 341: 1158). Zusätzliche Studien mit Patienten zeigten, dass PC-SPES für chemische Kastrierung refraktäre anti-Tumoraktivität hat, was darauf hinweist, dass andere Mechanismen für die anti-Tumoraktivität dieser Lakritzenwurzel-Kräuter-Kombinationstherapie verantwortlich sind (Small, E. et al. 1999. N. Engl. J. Med. 340 (7): 785–791).
Für PC-SPES-Extrakte wurde auch gezeigt, dass sie in Tumorzellinien Apoptose induzierten und die Expression von bcl-2 verringerten. Bcl-2 ist ein 26 kDa-Protein, welches den Zelltod durch Hemmung der Cytochrom-c-Freisetzung aus Mitochondrien, ein kritisches Ereignis im Apoptoseweg, blockiert. Die Überexpression von bcl-2 schützt Zellen vor Zelltod-fördernden Stimuli, während die Senkung des bcl-2-Spiegels den Zelltod und die Sensitivität für Chemotherapie erhöht (Reed, J.C. 1997. Nature 387: 773–776). Neueste Studien legen nahe, dass Wirkstoffe, welche die bcl-2-Expression verringern oder das Molekül durch Phosphorylierung inaktivieren, Apoptose induzieren. Zum Beispiel ändern Paclitaxel, Docetaxol, Vincristin und Vinblastin die Mikrotubulistruktur und induzieren Apoptose in Verbindung mit Phosphorylierung von bcl-2 (Haldar, S. et al. 1996. Cancer Res. 56: 1253; Haldar, S. et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4507–4511).
Es wurde nun herausgefunden, dass aus Lakritzenwurzel extrahierte Verbindungen, insbesondere hydroxylierte Chalcone, eine mit der Induktion von Apoptose konsistente Aktivität und eine potenzielle Aktivität als anti-tumorigene und anti-karzinogene Agenzien haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine hydroxylierte Chalconverbindung, extrahiert und gereinigt aus Gycyrrhiza glabra, welche 1-Propanon-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-Hydroxy-3-(4'-Hydroxyphenyl) ist, sowie Zusammensetzungen, welche die Verbindung umfassen, bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Induktion der Phosphorylierung von bcl-2, umfassend das Inkontaktbringen von Zellen oder Geweben mit der hydroxylierten Chalconverbindung, bereitzustellen.
Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Induktion der Apoptose in Zellen oder Geweben, umfassend das Inkontaktbringen von Zellen oder Geweben mit der hydroxylierten Chalconverbindung, bereitzustellen.
Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des Tumorzellwachstums und zur Vermeidung und Behandlung von Krebs über das Inkontaktbringen von Tumorzellen oder -geweben mit einer wirksamen Menge einer hydroxylierten Chalconverbindung.
Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Strukturen einiger erfindungsgemäßer hydroxylierter Chalcone dar, welche durch Massenspektrometrie und NMR identifiziert wurden. 1A ist die Struktur der Ursprungsverbindung, 1-Propanon-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-Hydroxy-3-(4'-Hydroxyphenyl). 1B stellt ein glycosyliertes Derivat der Ursprungsverbindung dar, welches hier als 1-Propanon-1-(2,4-Dihydroxyphenyl)-3-Hydroxy-3-(4'-Hydroxyphenyl-4'o-beta-D-Glucopyranosid) bezeichnet wird. 1C ist ein zweites glycosyliertes Derivat der Ursprungsverbindung, welches hier als 1-Propanon-1-(2,4-Dihydroxyphenyl-4'-o-beta-D-Glucopyranosid)-3-Hydroxy-3-(4'-Hydroxyphenyl) bezeichnet wird.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Eine spezifische Komponente des Lakritzenwurzelextraktes, ein hydroxyliertes Chalcon, wurde nun identifiziert, welches eine mit antitumorigenen Wirkungen in Tieren, einschließlich des Menschen, konsistente biologische Aktivität aufweist. Es wird angenommen, dass diese Komponente des Lakritzenwurzelextraktes als anti-Krebsmittel bei der Vermeidung und Behandlung von Krebs in Tieren, einschließlich des Menschen, verwendet werden kann.
Die erfindungsgemäßen hydroxylierten Chalcone wurden durch Extraktion der Lakritzenwurzel mit Methanol, Ethanol, DMSO oder Ethylacetat identifiziert. Rohextraktfraktionen wurden gesammelt und die Wirkungen verschiedener Fraktionen der gesamten Lakritzenwurzel wurden durch Immunblot-Verfahren untersucht. Lakritzenwurzel, extrahiert mit Ethylacetat, DMSO oder Ethanol, induzierte Phosphorylierung von bcl-2, wie durch eine langsamer wandernde Bande im Vergleich zur Vehikelkontrolle (nur Ethanol) oder einem wässrigen Extrakt gezeigt wurde.
Vorhergehende Untersuchungen bestätigten eine Assoziation zwischen bcl-2-Phosphorylierung und Zellzyklusarrest bei G2/M. Entsprechend wurden die Wirkungen von verschiedenen Lakritzenwurzelextrakten auf den Zellzyklus ebenfalls untersucht. Lakritzenwurzelextrakt induzierte einen G2/M-Zellzyklusarrest in einer ähnlichen Art und Weise wie Paclitaxel (Kontrolle). Daher zeigen diese Ergebnisse, dass der Lakritzenwurzelextrakt eine den bekannten anti-Mikrotubulus-Wirkstoffen ähnliche biologische Wirkung hat.
Um den aktiven Bestandteil in Lakritzenwurzelextrakt, der zur bcl-2-Phosphorylierung in der Lage ist, zu identifizieren, wurden Fraktionen gesammelt und mittels HPLC untersucht. Der Extrakt enthielt mehrere Derivate. Entsprechend war der Fokus auf die drei höchsten durch HPLC bestimmten Peaks gerichtet. Für die Fraktionen, die von den höchsten Peaks 1, 2 und 3 eluiert wurden, wurde gezeigt, dass sie bcl-2-Phosphorylierung ähnlich den mit Paclitaxel behandelten Kontrollen induzierten. Die Analyse durch NMR und Massenspektrometrie zeigte, dass Peak 3 eine hydroxylierte Chalconverbindung enthielt (hier als DC bezeichnet und in 1A dargestellt). Die Peaks 1 und 2 waren zwei glycosylierte Derivate von DC (1B beziehungsweise 1C). Andere in verschiedenen Lebensmitteln gefundene Polyphenolstrukturen wie Resveratrol, eine aus rotem Wein isolierte Östrogenverbindung (Goldberg, D.M. et al. 1996. Am. Jour. of Enol. Vitic. 47: 415–420), wurden als potenzielle anti-Tumor- und chemopräventative Mittel vorgeschlagen. Eine DC-Typ-Verbindung wurde ebenfalls aus einem anderen Naturprodukt, Rosa cymosa (Yoshida et al., 1993. Phytochemistry 32: 1033–1036) isoliert. Die biologische Aktivität dieser DC-Typ-Verbindung wurde jedoch nicht bestimmt.
Die Aktivität des gereinigten DC wurde in zusätzlichen Tests bestimmt. Es wurde gezeigt, dass DC die Phosphorylierung von bcl-2 sowohl in MCF-7 als auch in DuPro-1-Tumorzellen induziert. Zusätzlich induzierte das reine DC einen G2/M-Zellzyklusarrest ähnlich wie gesamte Lakritzenwurzelextrakte. In diesen Experimenten wurden MCF-7-Tumorzellen mit DC behandelt und mittels Durchflusscytometrie untersucht. DC induzierte einen G2/M-Zellzyklusarrest ähnlich wie das bekannte anti-Mikrotubulus-Agens Paclitaxel. Es wurde jedoch gezeigt, dass DC eine Mikrotubulifragmentierung ähnlich wie Vinblastin induziert, während für Paclitaxel gezeigt wurde, dass es Mikrotubulusbündel induziert. Daher ist DC tatsächlich ein Destabilisator für Mikrotubuli und ähnlicher zu Vinblastin. Diese Daten zeigen, dass eine hydroxylierte Chalconverbindung ohne Methoxygruppen immer noch signifikante anti-Mikrotubulus-Aktivität ähnlich zu Chalconstrukturen mit multiplen Methoxygruppen besitzt (Edwards, M. L. et al. 1990. J. Med. Chem. 33: 1948–1954).
Die Cytotoxizität von DC wurde dann in einem Apotposetest untersucht. In diesem Test wurden Tumorzellen mit reinem DC behandelt und die Lebensfähigkeit der Zellen und die Apoptoseantworten wurden beurteilt. DC induzierte Apoptose in MCF-7-Zellen, wie durch den Nachweis des extrazellulären Phosphatidylserins gezeigt wurde, welches sich während der Apoptose auf die äußere Membran neu verteilt. Frühe apoptotische Zellen zeigten eine grüne Fluoreszenz unter dem Mikroskop. Nekrotische Zellen wurden durch ihre gelb-rote intrazelluläre Färbeerscheinung identifiziert. DC induzierte Apoptose in einer Weise ähnlich der von 10 μM Camptothecin (Kontrollverbindung). DC verminderte auch die Lebensfähigkeit der MCF-7-Zellen in einer Dosis-abhängigen Weise (IC₅₀ von 13 μM).
Diese biologische Aktivitätsdaten zeigen, dass ein spezifischer Lakritzenwurzelextrakt, DC, eine biologische Aktivität hat, welche auf potenzielle antitumorigene Wirkungen beim Menschen hinweist. Spezifisch induziert DC Apoptose und Phosphorylierung von bcl-2.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, umfassend eine reine hydroxylierte Chalconverbindung von Gycyrrhiza glabra. Diese Verbindungen können aus Gycyrrhiza glabra extrahiert und gereinigt werden. Alternativ können die hydroxylierten Chalconverbindungen unter Verwendung von dem Fachmann wohlbekannten Verfahren synthetisch hergestellt werden. Weiterhin kann ein Fachmann nun neue Verbindungen mit ähnlicher Struktur und Aktivität wie die der erfindungsgemäßen hydroxylierten Chalconverbindungen auf Basis von Routineverfahren zur Testung potenzieller klinischer Verbindungen entwickeln. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise weiterhin einen verträglichen pharmazeutischen Träger zur Verabreichung der reinen hydroxylierten Chalconverbindung. Die Auswahl von verträglichen pharmazeutischen Trägern wird routinemäßig durch den Fachmann durchgeführt und mehrere Zubereitungsbeispiele werden in den Standardbüchern bereitgestellt, wie Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985.
Wie hier gezeigt wird, induzieren Zusammensetzungen, umfassend eine reine hydroxylierte Chalconverbindung aus Gycyrrhiza glabra, die Phosphorylierung von bcl-2 in Geweben und Zellen, insbesondere in Tumorzellen oder -geweben von Tieren einschließlich des Menschen. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind auch für die Induktion von Apoptose in Zellen oder Geweben, insbesondere in Tumorzellen oder Geweben von Tieren, einschließlich des Menschen, nützlich. Daher wird von den ertindungsgemäßen Zusammensetzungen angenommen, dass sie in Verfahren zur Vermeidung und Behandlung von Krebs in Tieren, einschließlich des Menschen, nützlich sind. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Vermeidung und Behandlung von Krebs und Tumorzellwachstum in Tieren, einschließlich Menschen, welche die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, enthaltend eine reine hydroxylierte Chalconverbindung aus Gycyrrhiza glabra, an ein Tier umfassen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird mit einer „wirksamen Menge" eine Menge einer reinen hydroxylierten Chalconverbindung aus Gycyrrhiza glabra gemeint, die in der Lage ist, eine pharmakologische Antwort hervorzurufen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Induktion der Phosphorylierung von bcl-2, Induktion von Apoptose, Hemmung der Tumorentstehung oder Vermeidung und Behandlung von Krebs. Die zu verabreichenden wirksamen Mengen der Verbindungen können routinemäßig durch den Fachmann auf Basis der Daten zur pharmakologischen Antwort wie die hier bereitgestellten bestimmt werden. Zum Beispiel werden zu verabreichende Dosen routinemäßig durch den Fachmann auf Basis der Daten aus den in-vitro-Tests wie die IC₅₀-Bestimmungen, wie in dieser Anmeldung bereitgestellt, bestimmt. Die Verabreichungswege, sowie die Dosierungsschemata können auch routinemäßig durch den Fachmann auf Basis vorheriger Erfahrungen mit ähnlichen Verbindungen wie Resveratrol bestimmt werden.
Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele werden vorgestellt, um die vorliegende Erfindung besser zu veranschaulichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Extraktion und Isolierung von Lakritzenwurzelverbindungen
Pulverisierte Wurzeln von Gycyrrhiza glabra wurden mit Methanol extrahiert und unter Vakuum unter Verwendung von Rotationsevaporation (Rotavapor R-110, Buchi, Schweiz) konzentriert. Das verbleibende Konzentrat wurde dann mit angesäuertem Ethylacetat (3% HCI) getrennt. Der trockene Ethylacetatextrakt wurde dann auf einer mit Octadecyl funktionalisierten Silikagel-Umkehrphasensäule chromatographiert, so dass eine auf einen Biotest gerichtete Fraktionierung durchgeführt werden konnte. Die Elution wurde unter Verwendung eines Lösungsmittelgemischs von Wasser/Methanol mit einer steigenden Konzentration von Methanol (90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100, je 500 ml) durchgeführt. Aufeinanderfolgende Fraktionen wurden gesammelt und auf biologische Aktivität getestet.
Die aktivste Fraktion wurde auf einer semipräparativen Zorbax Rx-C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (9,4 mm × 240 mm, 5 μm), bezogen bei Mac-Mod Analytical (Chadds Ford, PA), erneut chromatographiert. Die Verbindungen wurden durch ein Gradienten-/Lösungsmittelsystem (A: Wasser und 0,05% Ameisensäure, B: Acetonitril) eluiert. Das Elutionsprogramm bei 3 ml/min war wie folgt: 80% A nach 40% B (0 bis 45 Minuten). Die überwachte Wellenlänge war 254 nm. Aufeinanderfolgende Fraktionen wurden gesammelt und für zusätzliche biologische Tests eingeschickt.
Die Fraktionen wurden unter Verwendung einer Discovery C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule (250 mm × 4,6 mm; 5 μm) mit einer Säulenschutzvorrichtung, bezogen bei Supelco (Bellefonte, PA) auf Reinheit durchmustert. Das Lösungsmittelprogramm war ein Gradientensystem (A: Wasser und 0,05% Ameisensäure, B: 100% Acetonitril; 35 bis 55 Minuten). Das Elutionsprogramm bei 1 ml/Minute war wie folgt: 100% A bis 100% B (0 bis 35 Minuten); 100% B (35 bis 55 Minuten). Die Kontrollwellenlängen waren 220 bis 320 nm mit einem Varian 9065-Diodenarray-Detektor. Die endgültige Trennung der reinen Verbindungen wurde unter Verwendung einer semipräparativen HPLC auf einer Zorbax Rx-C18-Umkehrphasensäule (9,4 mm × 240 mm, 5 μm), bezogen bei Mac-Mod Analytical, erhalten. Die Verbindungen wurden durch ein isokratisches Lösungsmittelsystem, enthaltend 82% Wasser mit 0,05% Ameisensäure, 18% Acetonitril, eluiert.
Beispiel 2: Identifizierung der Verbindung
Sowohl ¹H- als auch ¹³C-NMR-Spektren wurden auf einem VXR-200-Instrument erhalten. Massenspektrometrie wurde auf einem Micromass Platform II-System, ausgestattet mit einem Digital-DEPc XL560-Computer zur Analyse der Daten, durchgeführt. Die Massenspektren wurden unter Verwendung chemischer Ionisierung unter atmosphärischem Druck (APCI) im Negativionen-Modus erhalten. Die Temperatur der Ionenquelle wurde auf 150°C eingestellt und die Sonde wurde auf 450°C eingestellt. Die Probenkonusspannung war 10 V und die Entladung der Corona war 3,2 kV. Eine HPLC-Analyse wurde auf einer Varian-Vista 5500-Flüssigchromatographpumpe, gekoppelt an einen Varian-9065 Polychrom-Diodenarray-Detektor, durchgeführt. Eine semipräparative Fraktionierung der gereinigten Verbindungen wurde auf einer Varian-9012 HPLC-Pumpe, gekoppelt an ein Waters-Lambda-Max Modell 481-LC-Spektrophotometer, erhalten. Octoadecylfunktionalisiertes Silikagel (Partikelgröße 60A) wurde für die Säulenchromatographie verwendet. Die Packung der Säule wurde bei Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) bezogen. Alle zur Extraktion und Isolierung verwendeten Lösungsmittel waren vom Reinheitsgrad für HPLC.
Beispiel 3: Bcl-2-Expression und Phosphorylierungstest
Die Analyse der Expression des bcl-2-Proteins wurde unter Verwendung des Western-Blot-Tests, wie zuvor beschrieben (Haldar, S. et al. 1996. Cancer Res. 56: 1253; Haldar, S. et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4507–4511), durchgeführt. Die Identifizierung des Proteins wurde unter Verwendung eines primären monoclonalen bcl-2-Antikörpers (DAKO Corporation) und eines sekundären, mit Meerrettichperoxidase konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) durchgeführt. Die Phosphorylierung von bcl-2 wurde durch Mobilitätsverschiebungstests im Western-Blot bestimmt, wie von Haldar (Haldar, S. et al. 1996. Cancer Res. 56: 1253; Haldar, S. et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4507–4511) beschrieben.
Beispiel 4: Zellzyklusanalyse
Die Zellen wurden für 24 Stunden behandelt und mit 10 μM BrdU für 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann mit eiskaltem PBS gewaschen, in 200 μl PBS resuspendiert und mit kaltem 70%-igen Ethanol fixiert. Die Zellen wurden resuspendiert, für 30 Minuten in 2 N HCI/0,5% Triton X-100 in PBS inkubiert und durch einmalige Spülung in 0,1 M Natriumtetraborat (pH 8,5) neutralisiert. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierter anti-BrdU-Antikörper (10 μg/Probe) (Becton Dickinson) wurde in 50 μl 0,5% Tween 20/1% BSA in PBS hinzugefügt und für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und in 1 ml PBS, enthaltend 5 μg/ml Propidiumjodid, resuspendiert. Die Fluoreszenzintensität wurde durch quantitative Durchflusscytometrie bestimmt und die Profile wurden auf einem Becton Dickinson-FACScan erstellt. Mindestens 10.000 Zellen wurden analysiert.
Beispiel 5: Lebensfähigkeit der Zellen und Apoptosetest
Das Apoalert-Annexin V-EGFP-Verfahren (CLONTECH, Palo Alto, CA) wurde verwendet, um auf Apoptose zu untersuchen. In Kurzform wurden Tumorzellen für 2 Stunden behandelt und die Zellen wurden mit Fixierungslösung gewaschen und mit Annexin V-EGFP und Propidiumjodid für 15 Minuten im Dunkeln gefärbt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Nikon-Eclipse TE-200-Fluoreszenz-Umkehrmikroskops (Nikon Corporation, Tokyo, Japan) betrachtet. Photographien wurden unter Verwendung einer SPOT-Digitalkamera (Diagnostic Inc., Sterling Heights, MI) in Kombination mit SPOT-Markierung mit einem APO-BRDU-Kit (Pharmingen, San Diego, CA) erstellt. Die Zellen (1 × 10⁶ pro Schale) wurden für 12 Stunden behandelt, mit PBS gewaschen und in 1 % Paraformaldehyd für 30 Minuten in Eis fixiert. Nach der Fixierung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in 70% Ethanol fixiert. Die Niederschläge wurden gewaschen und in 50 μl der DNA-Markierungslösung, enthaltend Br-dUTP und TdT-Enzym resuspendiert und für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Niederschläge gewaschen, mit FITC-markiertem anti-BrdU-Antikörper im Dunkeln für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mit Propidiumjodid und RNase gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden nach 30 Minuten mittels Durchflusscytometrie analysiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Tetrazolium-Färbeverfahren, wie zuvor beschrieben (Scudiero, D.A. et al. 1988. Cancer Res. 48: 4827–4833), untersucht.
Die Zellen wurde in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und mit verschiedenen Agenzien für 72 Stunden inkubiert. Die Absorption wurde bei 570 nm unter Verwendung eines Dynatech-Mikrotiterplattenlesegeräts gemessen.

Claims

Zusammensetzung umfassend 1-Propanon-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-3-(4'-hydroxyphenyl).
In vitro-Verfahren zur Induzierung der Phosphorylierung von Bcl-2 in Zellen oder Geweben, umfassend das Inkontaktbringen von Zellen oder Geweben mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1.
In vitro-Verfahren zur Induzierung von Apoptose in Zellen oder Geweben, umfassend das Inkontaktbringen von Zellen oder Geweben mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1.
In vitro-Verfahren zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen, umfassend das Inkontaktbringen von Tumorzellen mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ein Arzneimittel ist.
Verwendung von 1-Propanon-1-(2,4-dihydroxphenyl)-3-hydroxy-3-(4'hydroxyphenyl) für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung von Krebs oder Tumorzellwachstum.