JP2004503503A - カンゾウ根から抽出した抗腫瘍活性を有するヒドロキシル化カルコン化合物 - Google Patents
カンゾウ根から抽出した抗腫瘍活性を有するヒドロキシル化カルコン化合物 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、癌を予防および治療するための組成物および方法を提供する。この組成物は、１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）を含むグリシリザ・グラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ）由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物を含有する。
Description
【０００１】
緒言
本願は、２０００年６月１３日に提出した仮出願Ｎｏ． ６０／２１１，２６６による優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
ハーブ製品は、ヒトの疾患治療での使用に対して人気を博している。ほとんどのハーブ製品の臨床効果は未知であるけれども、多くのハーブは、生物活性を有する誘導体を含有する。そのようなハーブのひとつがカンゾウ根（ｌｉｃｏｒｉｃｅ ｒｏｏｔ）である。カンゾウ根抽出物は生物活性を有することが示されており、例えば、その生物活性としては、抗酸化活性（Ｐａｌａｇｉｎａ， Ｍ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｔｅｒ Ａｒｋｈ ７１：４５−４８）、メラニン合成阻害（Ｙｏｋｏｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １１：３５５−３６１）、血管新生阻害（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒ，． Ｂｕｌｌ． １８：１３８２−１３８６）、抗菌活性（Ｍｉｔｓｃｈｅｒ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． １９８０． Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ． ４３：２５９−２６９）、抗寄生虫活性（Ｚｈａｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ．３９：２７４２−２７４８）、および抗腫瘍活性（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｓ． １９９４． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：４４−５２）等が挙げられる。様々な生物学的効果を担ういくつかの化合物が単離されている。そのような化合物としては、例えば、グラブリジン（Ｙｏｋｏｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １１：３５５−３６１）、イソリクイリチン（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １８：１３８２−１３８６）、グリチルリチン（Ｒａｇｇｉ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂｏｌｌ． Ｃｈｉｍ． Ｆａｒｍ． １３４：６３４−６３８）、およびリコカルコンＡ（非ヒドロキシル化カルコン化合物）（Ｓｈｉｂａｔａ， Ｓ． １９９４． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２：４４−５２）等が挙げられる。
【０００３】
カンゾウ根を含むＰＣ−ＳＰＥＳと呼ばれる８種類のハーブの組合せに関する最近の研究によって、ＰＣ−ＳＰＥＳが強力な臨床活性および生物活性を有することが示されている（ＤｉＰａｏｌａ， Ｒ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３９：７８５−７９１）。ＰＣ−ＳＰＥＳは、化学的去勢を生じる植物性エストロゲンによる抗前立腺癌活性を示した。別の研究によって、カンゾウ根単独で男性における循環テストステロンレベルを減少させることが可能であることが示された（Ａｒｍａｎｉｎｉ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４１：１１５８）。患者でのさらなる研究によって、ＰＣ−ＳＰＥＳは化学的去勢に対して不応の場合も抗腫瘍活性を有することが示されており、このことは他のメカニズムがこのカンゾウ−ハーブ併用療法の抗腫瘍活性の原因でありうることを示している（Ｓｍａｌｌ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４０（７）：７８５−７９１）。
【０００４】
さらにＰＣ−ＳＰＥＳ抽出物は、腫瘍細胞系統におけるアポトーシスおよびｂｃｌ−２の発現の減少を誘導することが示されている。Ｂｃｌ−２は２６ ｋＤａのタンパク質であって、アポトーシス経路における重要な事象であるミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を抑制することによって細胞死を防ぐ。ｂｃｌ−２の過剰発現は、細胞死を促進する刺激から細胞を保護する一方、ｂｃｌ−２レベルの低下は細胞死および化学療法に対する感受性を増加させる（Ｒｅｅｄ， Ｊ．Ｃ． １９９７． Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７７３−７７６）。最近の研究により、ｂｃｌ−２発現を減少させるまたはリン酸化によってｂｃｌ−２を不活化する薬剤はアポトーシスを誘導することが示唆されている。例えば、パクリタキセル、ドセタキソール、ビンクリスチンおよびビンブラスチンは、微小管の構造を変化させ、ｂｃｌ−２のリン酸化に関連してアポトーシスを誘導する（Ｈａｄｌａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：１２５３； Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４５０７−４５１１）。
【０００５】
現在、カンゾウ根から抽出された化合物、特にヒドロキシル化カルコン化合物が、アポトーシスの誘導と一貫する活性ならびに抗腫瘍剤および抗癌剤としての強力な活性を有することが見出されている。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、グリシリザ・グラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ）から抽出・精製したヒドロキシル化カルコン化合物を提供することである。好ましい実施形態において、該化合物は１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）を含む。
【０００７】
本発明の別の目的は、ヒドロキシル化カルコン化合物と細胞または組織とを接触させることを含むｂｃｌ−２のリン酸化を誘導する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、ヒドロキシル化カルコン化合物と細胞または組織とを接触させることを含む、細胞または組織におけるアポトーシスを誘導する方法を提供することである。
【０００９】
さらに本発明には、有効量のヒドロキシル化カルコン化合物と腫瘍細胞または組織とを接触させることによる、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法ならびに癌を予防および治療する方法が含まれる。
【００１０】
詳細な説明
カンゾウ根抽出物の特定の成分としてヒドロキシル化カルコンを同定した。ヒドロキシル化カルコンは、動物（ヒトを含む）における抗腫瘍効果と一貫する生物活性を有する。このカンゾウ根抽出物の成分は、動物（ヒトを含む）の癌の予防および治療における抗癌剤として使用することができると考えられる。
【００１１】
本発明のヒドロキシル化カルコン化合物は、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯまたは酢酸エチルでカンゾウ根を抽出することにより同定した。粗抽出物画分を回収し、カンゾウ根全体の種々の画分の効果をイムノブロッティングにより評価した。酢酸エチル、ＤＭＳＯ、またはエタノールで抽出されたカンゾウ根抽出物は、ビヒクル対照（エタノールのみ）または水による抽出物と比較してより緩やかに移動するバンドによって示されるように、ｂｃｌ−２のリン酸化を誘導した。
【００１２】
今までの研究によって、ｂｃｌ−２のリン酸化とＧ２／Ｍ期における細胞周期停止（ａｒｒｅｓｔ）との関連が確認された。したがって、さまざまなカンゾウ根抽出物の細胞周期に及ぼす効果も評価した。カンゾウ根抽出物は、パクリタキセル（対照）と同様にＧ２／Ｍ期における細胞周期停止を誘導した。したがって、これらの結果から、カンゾウ根抽出物が既知の抗微小管薬剤と類似した生物活性を有することが示される。
【００１３】
ｂｃｌ−２のリン酸化が可能なカンゾウ根抽出物における活性成分を同定するために、抽出画分を回収し、ＨＰＬＣによって評価した。該抽出物は、複数の誘導体を含有していた。したがって、ＨＰＬＣによって測定された３つの主要なピークに焦点を置いた。主要ピーク１、２および３から溶出した画分は、パクリタキセル処理した対照と同様にｂｃｌ−２のリン酸化を誘導することが示された。ＮＭＲ解析および質量分析により、ピーク３はヒドロキシル化カルコン化合物を含むことが判明した（本明細書中ではＤＣと表わし、図１Ａに示す）。ピーク１および２は、ＤＣの２つのグリコシル化された誘導体であった（それぞれ図１Ｂおよび図１Ｃ）。赤ワインから単離されたエストロゲン化合物であるレスベラトロール（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ａｍ． Ｊｏｕｒ． ｏｆ Ｅｎｏｌ． Ｖｉｔｉｃ． ４７：４１５−４２０）のような、様々な食物で見つけられた他のポリフェノール構造体が、可能性のある抗癌剤および化学予防剤として提案されている。ＤＣタイプ化合物は、別の天然物ロサ・シモサ（Ｒｏｓａ ｃｙｍｏｓａ）からも単離されているが（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９３． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２： １０３３−１０３６）、このＤＣタイプ化合物の生物活性については調べられていない。
【００１４】
精製されたＤＣの活性は、さらなる試験において測定した。ＤＣは、ＭＣＦ−７およびＤＵＰｒｏ−１の両腫瘍細胞において、ｂｃｌ−２のリン酸化を誘導することが示された。さらに、純粋なＤＣは、カンゾウ根抽出物全体と同様にＧ２／Ｍ期における細胞周期停止を誘導した。これらの実験において、ＭＣＦ−７腫瘍細胞はＤＣで処理され、フローサイトメトリーによって評価された。ＤＣは、公知の抗微小管剤パクリタキセルと同様にＧ２／Ｍ期における細胞周期停止を誘導した。しかしながら、ＤＣはビンブラスチンと同様に微小管の断片化を誘導することが示されており、一方、パクリタキセルは微小管が束状になるのを誘導することが示されている。したがって、ＤＣは実際にはビンブラスチンとより類似した微小管の不安定化剤である。これらのデータからは、メトキシ基を全くもたないヒドロキシル化カルコン化合物が依然として複数のメトキシ基をもつカルコン構造体と同様の有意な抗微小管活性を有することが示される（Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９９０． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３３：１９４８−１９５４）。
【００１５】
次いで、ＤＣの細胞傷害性をアポトーシスアッセイで評価した。このアッセイでは、腫瘍細胞を純粋なＤＣで処理し、細胞生存度およびアポトーシス反応を評価した。アポトーシス中に細胞膜の外層に再分配される細胞外ホスファチジルセリンの検出によって示されるように、ＤＣはＭＣＦ−７細胞のアポトーシスを誘導した。初期アポトーシス細胞は、顕微鏡下で緑色蛍光を示した。壊死細胞は、その黄色−赤色の細胞内の染色の様相で確認された。ＤＣは、１０μＭカンプトテシン（対照化合物）の場合と同様にアポトーシスを誘導した。さらに、ＤＣは用量依存的にＭＣＦ−７細胞の細胞生存度を減少させた（ＩＣ５０ １３μＭ）。
【００１６】
これらの生物活性データは、特定のカンゾウ根抽出物であるＤＣが、ヒトにおける抗腫瘍効果の可能性を示す生物活性を有することを示す。具体的には、ＤＣはアポトーシスおよびｂｃｌ−２のリン酸化を誘導する。
【００１７】
このように、本発明は、グリシリザ・グラブラ由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物を含む組成物に関する。これらの化合物は、グリシリザ・グラブラから抽出・精製することができる。あるいは、ヒドロキシル化カルコン化合物は、当業者に周知の方法を用いて合成により製造することができる。さらに、現在、当業者であれば、可能性がある臨床用化合物について試験するための慣例的な方法に基づいて、本発明のヒドロキシル化カルコン化合物と類似した構造および活性を有する新しい化合物を開発することが可能である。本発明の組成物は、純粋なヒドロキシル化カルコン化合物の投与のための許容される医薬用ビヒクルをさらに含むのが好ましい。許容される医薬用ビヒクルの選択は当業者によって慣例的に行われ、多数の処方例がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８５などの標準的テキストに示されている。
【００１８】
本明細書中で示すように、グリシリザ・グラブラ由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物を含む組成物は、動物（ヒトを含む）の細胞または組織、特に腫瘍細胞または組織におけるｂｃｌ−２のリン酸化を誘導する。さらに、本発明の組成物は、動物（ヒトを含む）の細胞または組織、特に腫瘍細胞または組織におけるアポトーシスの誘導に有用である。このように本発明の組成物は、動物（ヒトを含む）の癌の予防方法および治療方法に有用であると考えられる。したがって、本発明はさらに、動物（ヒトを含む）の癌および腫瘍細胞の増殖の予防および治療のための方法に関する。この方法は、グリシリザ・グラブラ由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物を含む組成物を有効量動物に投与することを含む。本発明において「有効量」とは、ｂｃｌ−２のリン酸化の誘導、アポトーシスの誘導、腫瘍形成の抑制、または、癌の予防もしくは治療（これらに限定されるものではない）のような薬理応答を生じうるグリシリザ・グラブラ由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物の量を意味する。投与すべき化合物の有効量は、本明細書中で示すような薬理応答データに基づいて、当業者によって慣例的に決定することができる。たとえば、投与すべき用量は、本明細書中で示すようなＩＣ５０測定値などのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのデータに基づいて、当業者によって慣例的に決定される。さらに、投与経路ならびに投与計画は、レスベラトロールなどの類似化合物での今までの経験に基づいて、当業者によって慣例的に決定することができる。
【００１９】
以下の実施例（これらの実施例は本発明を限定するものではない）は、本発明をさらに説明するために示すものである。
【００２０】
実施例
実施例１： カンゾウ根由来の化合物の抽出と単離
粉末状にしたグリシリザ・グラブラの根をメタノールで抽出し、ロータリー・エバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ−１１０， Ｂｕｃｈｉ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して真空化で濃縮した。次いで、残っている濃縮物を、酸性にした酢酸エチル（３％ ＨＣＬ）で抽出し、乾燥させた酢酸エチル抽出物を、バイオアッセイに関連した分画を行い得るような逆相オクタデシル官能基化シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーにかけた。溶出は、メタノールの濃度を増加させながら水／メタノールの溶媒混合物（９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、０：１００；各５００ｍｌ）を使用して行った。連続する画分を回収し、生物活性について試験した。
【００２１】
最も活性な画分を、Ｍａｃ−Ｍｏｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ （Ｃｈａｄｄｓ Ｆｏｒｄ， ＰＡ）から購入したセミ分取Ｚｏｒｂａｘ Ｒｘ−Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（９．４ｍｍ ｘ ２４０ｍｍ、５μｍ）で再度クロマトグラフィーにかけた。化合物は、勾配溶媒システム（Ａ：水と０．０５％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル）によって溶出した。溶出プログラム（３ｍｌ／分）は以下のとおりであった：８０％Ａから４０％Ｂへ（０〜４５分）。モニターした波長は２５４ｎｍであった。連続する画分を回収し、さらなる生物学的試験に付した。
【００２２】
集めた画分は、Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ， ＰＡ）から購入したカラムガードを装備したＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（２５０ｍｍ ｘ ４．６ｍｍ、５μｍ）を使用して純度についてスクリーニングを行った。溶媒プログラムは勾配システム（Ａ：水と０．０５％ギ酸、Ｂ：１００％アセトニトリル、３５〜５５分間）であった。溶出プログラム（１ｍｌ／分）は以下のとおりであった：１００％Ａから１００％Ｂへ（０〜３５分間）；１００％Ｂ（３５〜５５分間）。Ｖａｒｉａｎ ９０６５ダイオードアレイ検出器を用いてモニターした波長は２２０〜３２０ ｎｍであった。最終的に分離した純粋な化合物は、Ｍａｃ−Ｍｏｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌから購入したＺｏｒｂａｘ Ｒｘ−Ｃ１８逆相カラム（９．４ｍｍ ｘ ２４０ｍｍ、５μｍ）によるセミ分取ＨＰＬＣを利用して得られた。化合物は、０．０５％ギ酸、１８％アセトニトリルを含有する８２％水を含むアイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶媒系で溶出した。
【００２３】
実施例２：化合物の同定
１Ｈと１３Ｃの両方のＮＭＲスペクトルはＶＸＲ−２００装置で得られた。質量分析は、データ解析のためにＤｉｇｉｔａｌ ＤＥＣＰｃ ＸＬ５６０コンピューターを装備したＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＩＩ システムで実行した。質量スペクトルは、陰イオンモードで大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）を使用して得られた。イオン源温度は１５０℃に設定し、プローブは４５０℃に設定した。サンプルコーン電圧は１０Ｖであり、コロナ放電は３．２ｋＶであった。ＨＰＬＣ分析は、Ｖａｒｉａｎ ９０６５ Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍダイオードアレイ検出器を連結したＶａｒｉａｎ Ｖｉｓｔａ ５５００液体クロマトグラフィーポンプを使用して行った。精製化合物のセミ分取画分は、Ｗａｔｅｒｓ Ｌａｍｂｄａ−Ｍａｘ Ｍｏｄｅｌ ４８１ ＬＣ分光光度計を連結したＶａｒｉａｎ ９０１２ ＨＰＬＣポンプで得られた。オクタデシル官能基化シリカゲル（６０Ａ 粒径）をカラムクロマトグラフィーに使用した。充填剤はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）から購入した。抽出および単離に使用したすべての溶媒は、ＨＰＬＣ等級であった。
【００２４】
実施例３： Ｂｃｌ−２ の発現アッセイおよびリン酸化アッセイ
ｂｃｌ−２タンパク質発現の分析は、従前に記載のウエスタンブロットアッセイ（Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： １２５３ ； Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４５０７−４５１１）を利用して行った。タンパク質の同定は、モノクローナルｂｃｌ−２一次抗体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）を使用して行った。ｂｃｌ−２のリン酸化は、Ｈａｌｄａｒによって記載された（Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： １２５３ ； Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４５０７−４５１１）ウエスタンブロットにおける移動度シフトによって測定した。
【００２５】
実施例４ ： 細胞周期分析
細胞を２４時間処理し、１０μＭ ＢｒｄＵと一緒に３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、２００μｌ ＰＢＳ中に再懸濁し、７０％冷エタノールで固定した。細胞を再懸濁し、２Ｎ ＨＣｌ／０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、０．１Ｍ 四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ ８．５）で１回すすぐことにより中和した。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ＢｒｄＵ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０／１％ＢＳＡを含むＰＢＳ ５０μｌ中に添加し（１０ μｇ／サンプル）、３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳ １ｍｌ中に再懸濁した。蛍光発光強度は定量的フローサイトメトリーによって測定し、蛍光プロフィールはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎで作成した。１０，０００個の細胞の最小値を分析した。
【００２６】
実施例５ ： 細胞生存度およびアポトーシスアッセイ
Ａｐｏａｌｅｒｔ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＥＧＦＰ法（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を使用してアポトーシスを評価した。簡潔に述べると、腫瘍細胞を２時間処理し、細胞を固定化溶液で洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＥＧＦＰとヨウ化プロピジウムで暗中１５分間染色した。細胞は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ−２００倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ株式会社、東京、日本）を使用して観察した。写真は、ＡＰＯ−ＢＲＤＵキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によるＳＰＯＴ標識と組み合わせてＳＰＯＴデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， Ｉｎｃ．， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＭＩ）を使用して撮影した。細胞（ディッシュ当たり１×１０６個）を１２時間処理し、ＰＢＳで洗浄し、氷中１％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定した後、細胞はＰＢＳで２度洗浄し、７０％エタノールで固定した。ペレットは洗浄し、Ｂｒ−ｄＵＴＰとＴｄＴ酵素を含むＤＮＡ標識溶液５０μｌ中に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、ペレットを洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ＢｒｄＵ抗体と一緒に暗中３０分間室温でインキュベートし、ヨウ化プロピジウムおよびＲＮａｓｅで染色した。この染色した細胞は、３０分後にフローサイトメトリーで分析した。細胞生存度は、従前の記載（Ｓｃｕｄｉｅｒｏ Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ． １９８８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：４８２７−４８３３）のテトラゾリウム色素法によって評価した。細胞を９６ウエルプレートにプレートし、種々の薬剤と７２時間インキュベートした。吸光度は、Ｄｙａｔｅｃｈマイクロプレートリーダーを使用して、５７０ｎｍで測定した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、質量分析およびＮＭＲによって確認された、いくつかの本発明のヒドロキシル化カルコン化合物の構造を表わす。図１Ａは、親化合物１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）の構造を示す。図１Ｂは、１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル−４’−ｏ−β−Ｄ−グルカピラノシド）と本明細書中で表される、親化合物のグリコシル化誘導体を示す。図１Ｃは、１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル−４’−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）と本明細書中で表される、親化合物の第２のグリコシル化誘導体を示す。
緒言
本願は、２０００年６月１３日に提出した仮出願Ｎｏ． ６０／２１１，２６６による優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
ハーブ製品は、ヒトの疾患治療での使用に対して人気を博している。ほとんどのハーブ製品の臨床効果は未知であるけれども、多くのハーブは、生物活性を有する誘導体を含有する。そのようなハーブのひとつがカンゾウ根（ｌｉｃｏｒｉｃｅ ｒｏｏｔ）である。カンゾウ根抽出物は生物活性を有することが示されており、例えば、その生物活性としては、抗酸化活性（Ｐａｌａｇｉｎａ， Ｍ．Ｖ． ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｔｅｒ Ａｒｋｈ ７１：４５−４８）、メラニン合成阻害（Ｙｏｋｏｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １１：３５５−３６１）、血管新生阻害（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒ，． Ｂｕｌｌ． １８：１３８２−１３８６）、抗菌活性（Ｍｉｔｓｃｈｅｒ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． １９８０． Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ． ４３：２５９−２６９）、抗寄生虫活性（Ｚｈａｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ．３９：２７４２−２７４８）、および抗腫瘍活性（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｓ． １９９４． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：４４−５２）等が挙げられる。様々な生物学的効果を担ういくつかの化合物が単離されている。そのような化合物としては、例えば、グラブリジン（Ｙｏｋｏｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １１：３５５−３６１）、イソリクイリチン（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １８：１３８２−１３８６）、グリチルリチン（Ｒａｇｇｉ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｂｏｌｌ． Ｃｈｉｍ． Ｆａｒｍ． １３４：６３４−６３８）、およびリコカルコンＡ（非ヒドロキシル化カルコン化合物）（Ｓｈｉｂａｔａ， Ｓ． １９９４． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２：４４−５２）等が挙げられる。
【０００３】
カンゾウ根を含むＰＣ−ＳＰＥＳと呼ばれる８種類のハーブの組合せに関する最近の研究によって、ＰＣ−ＳＰＥＳが強力な臨床活性および生物活性を有することが示されている（ＤｉＰａｏｌａ， Ｒ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３９：７８５−７９１）。ＰＣ−ＳＰＥＳは、化学的去勢を生じる植物性エストロゲンによる抗前立腺癌活性を示した。別の研究によって、カンゾウ根単独で男性における循環テストステロンレベルを減少させることが可能であることが示された（Ａｒｍａｎｉｎｉ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４１：１１５８）。患者でのさらなる研究によって、ＰＣ−ＳＰＥＳは化学的去勢に対して不応の場合も抗腫瘍活性を有することが示されており、このことは他のメカニズムがこのカンゾウ−ハーブ併用療法の抗腫瘍活性の原因でありうることを示している（Ｓｍａｌｌ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４０（７）：７８５−７９１）。
【０００４】
さらにＰＣ−ＳＰＥＳ抽出物は、腫瘍細胞系統におけるアポトーシスおよびｂｃｌ−２の発現の減少を誘導することが示されている。Ｂｃｌ−２は２６ ｋＤａのタンパク質であって、アポトーシス経路における重要な事象であるミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を抑制することによって細胞死を防ぐ。ｂｃｌ−２の過剰発現は、細胞死を促進する刺激から細胞を保護する一方、ｂｃｌ−２レベルの低下は細胞死および化学療法に対する感受性を増加させる（Ｒｅｅｄ， Ｊ．Ｃ． １９９７． Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７７３−７７６）。最近の研究により、ｂｃｌ−２発現を減少させるまたはリン酸化によってｂｃｌ−２を不活化する薬剤はアポトーシスを誘導することが示唆されている。例えば、パクリタキセル、ドセタキソール、ビンクリスチンおよびビンブラスチンは、微小管の構造を変化させ、ｂｃｌ−２のリン酸化に関連してアポトーシスを誘導する（Ｈａｄｌａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：１２５３； Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４５０７−４５１１）。
【０００５】
現在、カンゾウ根から抽出された化合物、特にヒドロキシル化カルコン化合物が、アポトーシスの誘導と一貫する活性ならびに抗腫瘍剤および抗癌剤としての強力な活性を有することが見出されている。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、グリシリザ・グラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ）から抽出・精製したヒドロキシル化カルコン化合物を提供することである。好ましい実施形態において、該化合物は１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）を含む。
【０００７】
本発明の別の目的は、ヒドロキシル化カルコン化合物と細胞または組織とを接触させることを含むｂｃｌ−２のリン酸化を誘導する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、ヒドロキシル化カルコン化合物と細胞または組織とを接触させることを含む、細胞または組織におけるアポトーシスを誘導する方法を提供することである。
【０００９】
さらに本発明には、有効量のヒドロキシル化カルコン化合物と腫瘍細胞または組織とを接触させることによる、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法ならびに癌を予防および治療する方法が含まれる。
【００１０】
詳細な説明
カンゾウ根抽出物の特定の成分としてヒドロキシル化カルコンを同定した。ヒドロキシル化カルコンは、動物（ヒトを含む）における抗腫瘍効果と一貫する生物活性を有する。このカンゾウ根抽出物の成分は、動物（ヒトを含む）の癌の予防および治療における抗癌剤として使用することができると考えられる。
【００１１】
本発明のヒドロキシル化カルコン化合物は、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯまたは酢酸エチルでカンゾウ根を抽出することにより同定した。粗抽出物画分を回収し、カンゾウ根全体の種々の画分の効果をイムノブロッティングにより評価した。酢酸エチル、ＤＭＳＯ、またはエタノールで抽出されたカンゾウ根抽出物は、ビヒクル対照（エタノールのみ）または水による抽出物と比較してより緩やかに移動するバンドによって示されるように、ｂｃｌ−２のリン酸化を誘導した。
【００１２】
今までの研究によって、ｂｃｌ−２のリン酸化とＧ２／Ｍ期における細胞周期停止（ａｒｒｅｓｔ）との関連が確認された。したがって、さまざまなカンゾウ根抽出物の細胞周期に及ぼす効果も評価した。カンゾウ根抽出物は、パクリタキセル（対照）と同様にＧ２／Ｍ期における細胞周期停止を誘導した。したがって、これらの結果から、カンゾウ根抽出物が既知の抗微小管薬剤と類似した生物活性を有することが示される。
【００１３】
ｂｃｌ−２のリン酸化が可能なカンゾウ根抽出物における活性成分を同定するために、抽出画分を回収し、ＨＰＬＣによって評価した。該抽出物は、複数の誘導体を含有していた。したがって、ＨＰＬＣによって測定された３つの主要なピークに焦点を置いた。主要ピーク１、２および３から溶出した画分は、パクリタキセル処理した対照と同様にｂｃｌ−２のリン酸化を誘導することが示された。ＮＭＲ解析および質量分析により、ピーク３はヒドロキシル化カルコン化合物を含むことが判明した（本明細書中ではＤＣと表わし、図１Ａに示す）。ピーク１および２は、ＤＣの２つのグリコシル化された誘導体であった（それぞれ図１Ｂおよび図１Ｃ）。赤ワインから単離されたエストロゲン化合物であるレスベラトロール（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， Ｄ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ａｍ． Ｊｏｕｒ． ｏｆ Ｅｎｏｌ． Ｖｉｔｉｃ． ４７：４１５−４２０）のような、様々な食物で見つけられた他のポリフェノール構造体が、可能性のある抗癌剤および化学予防剤として提案されている。ＤＣタイプ化合物は、別の天然物ロサ・シモサ（Ｒｏｓａ ｃｙｍｏｓａ）からも単離されているが（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． １９９３． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２： １０３３−１０３６）、このＤＣタイプ化合物の生物活性については調べられていない。
【００１４】
精製されたＤＣの活性は、さらなる試験において測定した。ＤＣは、ＭＣＦ−７およびＤＵＰｒｏ−１の両腫瘍細胞において、ｂｃｌ−２のリン酸化を誘導することが示された。さらに、純粋なＤＣは、カンゾウ根抽出物全体と同様にＧ２／Ｍ期における細胞周期停止を誘導した。これらの実験において、ＭＣＦ−７腫瘍細胞はＤＣで処理され、フローサイトメトリーによって評価された。ＤＣは、公知の抗微小管剤パクリタキセルと同様にＧ２／Ｍ期における細胞周期停止を誘導した。しかしながら、ＤＣはビンブラスチンと同様に微小管の断片化を誘導することが示されており、一方、パクリタキセルは微小管が束状になるのを誘導することが示されている。したがって、ＤＣは実際にはビンブラスチンとより類似した微小管の不安定化剤である。これらのデータからは、メトキシ基を全くもたないヒドロキシル化カルコン化合物が依然として複数のメトキシ基をもつカルコン構造体と同様の有意な抗微小管活性を有することが示される（Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９９０． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３３：１９４８−１９５４）。
【００１５】
次いで、ＤＣの細胞傷害性をアポトーシスアッセイで評価した。このアッセイでは、腫瘍細胞を純粋なＤＣで処理し、細胞生存度およびアポトーシス反応を評価した。アポトーシス中に細胞膜の外層に再分配される細胞外ホスファチジルセリンの検出によって示されるように、ＤＣはＭＣＦ−７細胞のアポトーシスを誘導した。初期アポトーシス細胞は、顕微鏡下で緑色蛍光を示した。壊死細胞は、その黄色−赤色の細胞内の染色の様相で確認された。ＤＣは、１０μＭカンプトテシン（対照化合物）の場合と同様にアポトーシスを誘導した。さらに、ＤＣは用量依存的にＭＣＦ−７細胞の細胞生存度を減少させた（ＩＣ５０ １３μＭ）。
【００１６】
これらの生物活性データは、特定のカンゾウ根抽出物であるＤＣが、ヒトにおける抗腫瘍効果の可能性を示す生物活性を有することを示す。具体的には、ＤＣはアポトーシスおよびｂｃｌ−２のリン酸化を誘導する。
【００１７】
このように、本発明は、グリシリザ・グラブラ由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物を含む組成物に関する。これらの化合物は、グリシリザ・グラブラから抽出・精製することができる。あるいは、ヒドロキシル化カルコン化合物は、当業者に周知の方法を用いて合成により製造することができる。さらに、現在、当業者であれば、可能性がある臨床用化合物について試験するための慣例的な方法に基づいて、本発明のヒドロキシル化カルコン化合物と類似した構造および活性を有する新しい化合物を開発することが可能である。本発明の組成物は、純粋なヒドロキシル化カルコン化合物の投与のための許容される医薬用ビヒクルをさらに含むのが好ましい。許容される医薬用ビヒクルの選択は当業者によって慣例的に行われ、多数の処方例がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８５などの標準的テキストに示されている。
【００１８】
本明細書中で示すように、グリシリザ・グラブラ由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物を含む組成物は、動物（ヒトを含む）の細胞または組織、特に腫瘍細胞または組織におけるｂｃｌ−２のリン酸化を誘導する。さらに、本発明の組成物は、動物（ヒトを含む）の細胞または組織、特に腫瘍細胞または組織におけるアポトーシスの誘導に有用である。このように本発明の組成物は、動物（ヒトを含む）の癌の予防方法および治療方法に有用であると考えられる。したがって、本発明はさらに、動物（ヒトを含む）の癌および腫瘍細胞の増殖の予防および治療のための方法に関する。この方法は、グリシリザ・グラブラ由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物を含む組成物を有効量動物に投与することを含む。本発明において「有効量」とは、ｂｃｌ−２のリン酸化の誘導、アポトーシスの誘導、腫瘍形成の抑制、または、癌の予防もしくは治療（これらに限定されるものではない）のような薬理応答を生じうるグリシリザ・グラブラ由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物の量を意味する。投与すべき化合物の有効量は、本明細書中で示すような薬理応答データに基づいて、当業者によって慣例的に決定することができる。たとえば、投与すべき用量は、本明細書中で示すようなＩＣ５０測定値などのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのデータに基づいて、当業者によって慣例的に決定される。さらに、投与経路ならびに投与計画は、レスベラトロールなどの類似化合物での今までの経験に基づいて、当業者によって慣例的に決定することができる。
【００１９】
以下の実施例（これらの実施例は本発明を限定するものではない）は、本発明をさらに説明するために示すものである。
【００２０】
実施例
実施例１： カンゾウ根由来の化合物の抽出と単離
粉末状にしたグリシリザ・グラブラの根をメタノールで抽出し、ロータリー・エバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ−１１０， Ｂｕｃｈｉ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して真空化で濃縮した。次いで、残っている濃縮物を、酸性にした酢酸エチル（３％ ＨＣＬ）で抽出し、乾燥させた酢酸エチル抽出物を、バイオアッセイに関連した分画を行い得るような逆相オクタデシル官能基化シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーにかけた。溶出は、メタノールの濃度を増加させながら水／メタノールの溶媒混合物（９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、０：１００；各５００ｍｌ）を使用して行った。連続する画分を回収し、生物活性について試験した。
【００２１】
最も活性な画分を、Ｍａｃ−Ｍｏｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ （Ｃｈａｄｄｓ Ｆｏｒｄ， ＰＡ）から購入したセミ分取Ｚｏｒｂａｘ Ｒｘ−Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（９．４ｍｍ ｘ ２４０ｍｍ、５μｍ）で再度クロマトグラフィーにかけた。化合物は、勾配溶媒システム（Ａ：水と０．０５％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル）によって溶出した。溶出プログラム（３ｍｌ／分）は以下のとおりであった：８０％Ａから４０％Ｂへ（０〜４５分）。モニターした波長は２５４ｎｍであった。連続する画分を回収し、さらなる生物学的試験に付した。
【００２２】
集めた画分は、Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ， ＰＡ）から購入したカラムガードを装備したＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（２５０ｍｍ ｘ ４．６ｍｍ、５μｍ）を使用して純度についてスクリーニングを行った。溶媒プログラムは勾配システム（Ａ：水と０．０５％ギ酸、Ｂ：１００％アセトニトリル、３５〜５５分間）であった。溶出プログラム（１ｍｌ／分）は以下のとおりであった：１００％Ａから１００％Ｂへ（０〜３５分間）；１００％Ｂ（３５〜５５分間）。Ｖａｒｉａｎ ９０６５ダイオードアレイ検出器を用いてモニターした波長は２２０〜３２０ ｎｍであった。最終的に分離した純粋な化合物は、Ｍａｃ−Ｍｏｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌから購入したＺｏｒｂａｘ Ｒｘ−Ｃ１８逆相カラム（９．４ｍｍ ｘ ２４０ｍｍ、５μｍ）によるセミ分取ＨＰＬＣを利用して得られた。化合物は、０．０５％ギ酸、１８％アセトニトリルを含有する８２％水を含むアイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶媒系で溶出した。
【００２３】
実施例２：化合物の同定
１Ｈと１３Ｃの両方のＮＭＲスペクトルはＶＸＲ−２００装置で得られた。質量分析は、データ解析のためにＤｉｇｉｔａｌ ＤＥＣＰｃ ＸＬ５６０コンピューターを装備したＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＩＩ システムで実行した。質量スペクトルは、陰イオンモードで大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）を使用して得られた。イオン源温度は１５０℃に設定し、プローブは４５０℃に設定した。サンプルコーン電圧は１０Ｖであり、コロナ放電は３．２ｋＶであった。ＨＰＬＣ分析は、Ｖａｒｉａｎ ９０６５ Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍダイオードアレイ検出器を連結したＶａｒｉａｎ Ｖｉｓｔａ ５５００液体クロマトグラフィーポンプを使用して行った。精製化合物のセミ分取画分は、Ｗａｔｅｒｓ Ｌａｍｂｄａ−Ｍａｘ Ｍｏｄｅｌ ４８１ ＬＣ分光光度計を連結したＶａｒｉａｎ ９０１２ ＨＰＬＣポンプで得られた。オクタデシル官能基化シリカゲル（６０Ａ 粒径）をカラムクロマトグラフィーに使用した。充填剤はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）から購入した。抽出および単離に使用したすべての溶媒は、ＨＰＬＣ等級であった。
【００２４】
実施例３： Ｂｃｌ−２ の発現アッセイおよびリン酸化アッセイ
ｂｃｌ−２タンパク質発現の分析は、従前に記載のウエスタンブロットアッセイ（Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： １２５３ ； Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４５０７−４５１１）を利用して行った。タンパク質の同定は、モノクローナルｂｃｌ−２一次抗体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）を使用して行った。ｂｃｌ−２のリン酸化は、Ｈａｌｄａｒによって記載された（Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９６． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６： １２５３ ； Ｈａｌｄａｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４５０７−４５１１）ウエスタンブロットにおける移動度シフトによって測定した。
【００２５】
実施例４ ： 細胞周期分析
細胞を２４時間処理し、１０μＭ ＢｒｄＵと一緒に３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、２００μｌ ＰＢＳ中に再懸濁し、７０％冷エタノールで固定した。細胞を再懸濁し、２Ｎ ＨＣｌ／０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、０．１Ｍ 四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ ８．５）で１回すすぐことにより中和した。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ＢｒｄＵ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０／１％ＢＳＡを含むＰＢＳ ５０μｌ中に添加し（１０ μｇ／サンプル）、３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳ １ｍｌ中に再懸濁した。蛍光発光強度は定量的フローサイトメトリーによって測定し、蛍光プロフィールはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎで作成した。１０，０００個の細胞の最小値を分析した。
【００２６】
実施例５ ： 細胞生存度およびアポトーシスアッセイ
Ａｐｏａｌｅｒｔ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＥＧＦＰ法（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を使用してアポトーシスを評価した。簡潔に述べると、腫瘍細胞を２時間処理し、細胞を固定化溶液で洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＥＧＦＰとヨウ化プロピジウムで暗中１５分間染色した。細胞は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ−２００倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ株式会社、東京、日本）を使用して観察した。写真は、ＡＰＯ−ＢＲＤＵキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によるＳＰＯＴ標識と組み合わせてＳＰＯＴデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ， Ｉｎｃ．， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＭＩ）を使用して撮影した。細胞（ディッシュ当たり１×１０６個）を１２時間処理し、ＰＢＳで洗浄し、氷中１％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定した後、細胞はＰＢＳで２度洗浄し、７０％エタノールで固定した。ペレットは洗浄し、Ｂｒ−ｄＵＴＰとＴｄＴ酵素を含むＤＮＡ標識溶液５０μｌ中に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、ペレットを洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ＢｒｄＵ抗体と一緒に暗中３０分間室温でインキュベートし、ヨウ化プロピジウムおよびＲＮａｓｅで染色した。この染色した細胞は、３０分後にフローサイトメトリーで分析した。細胞生存度は、従前の記載（Ｓｃｕｄｉｅｒｏ Ｄ．Ａ． ｅｔ ａｌ． １９８８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：４８２７−４８３３）のテトラゾリウム色素法によって評価した。細胞を９６ウエルプレートにプレートし、種々の薬剤と７２時間インキュベートした。吸光度は、Ｄｙａｔｅｃｈマイクロプレートリーダーを使用して、５７０ｎｍで測定した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、質量分析およびＮＭＲによって確認された、いくつかの本発明のヒドロキシル化カルコン化合物の構造を表わす。図１Ａは、親化合物１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）の構造を示す。図１Ｂは、１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル−４’−ｏ−β−Ｄ−グルカピラノシド）と本明細書中で表される、親化合物のグリコシル化誘導体を示す。図１Ｃは、１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル−４’−ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）と本明細書中で表される、親化合物の第２のグリコシル化誘導体を示す。
Claims (6)
- グリシリザ・グラブラ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ）由来の純粋なヒドロキシル化カルコン化合物を含む組成物。
- 上記化合物が１−プロパノン−１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−３−（４’−ヒドロキシフェニル）である、請求項１に記載の組成物。
- 請求項１に記載の組成物と細胞または組織とを接触させることを含む、細胞または組織におけるｂｃｌ−２のリン酸化を誘導する方法。
- 請求項１に記載の組成物と細胞または組織とを接触させることを含む、細胞または組織におけるアポトーシスを誘導する方法。
- 請求項１に記載の組成物と腫瘍細胞とを接触させることを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
- 請求項１に記載の組成物を動物に投与することを含む、動物における癌または腫瘍細胞の増殖を予防または治療する方法。
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