ES2249443T3 - Actividad anticancerigena de compuestos de chalcona hidroxilada extraidos de raiz de regaliz. - Google Patents
Actividad anticancerigena de compuestos de chalcona hidroxilada extraidos de raiz de regaliz.Info
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Abstract
Una composición que comprende 1-propanona-1-(2,4-dihidroxifenil)-3-hidroxi-3-(4¿-hidroxifenilo).
Description
Actividad anticancerígena de compuestos de
chalcona hidroxilada extraídos de raíz de regaliz.
Esta solicitud reivindica el beneficio de
prioridad de la Solicitud Provisional de nº de serie 60/211.266
presentada el 13 de Junio de 2000.
Los productos herbales han ganado popularidad
para su uso en el tratamiento de enfermedades en seres humanos.
Aunque el efecto clínico de la mayoría de los productos herbales es
desconocido, muchas hierbas contienen derivados con actividad
biológica. Una hierba de este tipo es la raíz de regaliz. Se ha
descrito que los extractos de raíz de regaliz tienen actividad
biológica que incluye actividad antioxidante (Palagina, M.V. y
otros, 1999, Ter. Arkh. 71:45-48), inhibición
de síntesis de melanina (Yokota, T. y otros, 1998, Pigment Cells
Res. 11:355-361), inhibición de angiogénesis
(Kobayashi, S. y otros, 1995, Biol. Phar. Bull.
18:1382-1386), actividad antimicrobiana (Mitcher,
L.A. y otros, 1980, J. Nat. Prod.
43:259-269), actividad antiparasitaria (Zhai, L. y
otros, 1995, Antimicrob. Agents Chemotherap.
39:2742-2748) y actividad antitumoral (Shibata, S.
1994, Stem Cells 12:44-52). Se han aislado
varios compuestos responsables de diversos efectos biológicos.
Ejemplos de compuestos de este tipo incluyen glabridin (Yokota, T. y
otros, 1998, Pigment Cells Res. 11:355-361),
isoliquiritin (Kobayashi, S. y otros, 1995, Biol. Pharm.
Bull. 18:1382-1386), glicirrina (Raggi, M.A. y
otros, 1995, Boll. Chim. Farm. 134:634-638),
y licochalcona A, un compuesto de chalcona no hidroxilada (Shibata,
S. 1994, Stem Cells 12:44-52).
Recientes estudios con una combinación de ocho
hierbas, que incluían raíz de regaliz, denominada
PC-SPES, han descrito que tienen potente actividad
clínica y biológica (DiPaola, R.S. y otros, 1998, N. Engl. J.
Med. 339:785-791). PC-SPES
mostró actividad anti-cáncer de próstata que fue
atribuible a fitoestrógenos que producían una castración química.
Otro estudio demostró que la raíz de regaliz sola era capaz de
disminuir los niveles de testosterona en circulación en hombres
(Armanini, D. y otros, 1999, N. Engl. J. Med. 341:1158).
Estudios adicionales en pacientes han demostrado que
PC-SPES tiene actividad anti-tumoral
refractaria a la castración química, indicando con ello que otros
mecanismos pueden ser responsables de la actividad
anti-tumorigénica en esta terapia de raíz de
regaliz-combinación herbal (Small, E. y otros, 1999,
N. Engl. J. Med. 340(7):785-791).
También se ha descrito que los extractos de
PC-SPES inducen apoptosis en líneas de células
tumorales y disminuyeron la expresión de bcl-2.
Bcl-2 es una proteína 26 kDa que bloquea la muerte
celular inhibiendo la liberación de citocromo c de mitocondrias, un
acontecimiento crítico en el camino apoptótico. La
sobre-expresión bcl-2 protege a las
células de la muerte fomentando estímulos, mientras que la
disminución de los niveles de bcl-2 aumenta la
muerte celular y la sensibilidad a la quimioterapia (Reed, J.C.
1997, Nature 387:773-776). Recientes estudios
sugieren que los fármacos que disminuyen la expresión
bcl-2, o inactivan la molécula por medio de
fosforilación, inducen apoptosis. Por ejemplo, paclitaxel,
docetaxol, vincristina y vinblastina alteran la estructura
microtubular e inducen apoptosis en asociación con fosforilación de
bcl-2 (Hadlar, S. y otros, 1996, Cancer Res.
56:1235; Haldar, S. y otros, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 92:4507-4511).
Se ha encontrado ahora que compuestos extraídos
de raíz de regaliz, en particular chalconas hidroxiladas, tienen
actividad coherente con inducción de apoptosis y actividad potencial
como agentes anti-tumorigénicos y
anti-carcinogénicos.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un compuesto de chalcona hidroxilada extraído y
purificado de Glycyrrizha glabra, compuesto que es
1-propanona-1-(2,4-dihidroxifenil)-3-hidroxi-3-(4'-hidroxifenilo),
y composiciones que comprenden dicho compuesto.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método de inducir la fosforilación de
bcl-2 que comprende poner en contacto células o
tejidos con dicho compuesto de chalcona hidroxilada.
Todavía otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método de inducir apoptosis en células o tejidos que
comprende poner en contacto células o tejidos con dicho compuesto de
chalcona hidroxilada.
También se incluye en la presente invención la
preparación de una composición farmacéutica para inhibir el
crecimiento de células tumorales y prevenir y tratar el cáncer por
la vía de poner en contacto células o tejidos tumorales con una
cantidad eficaz de un compuesto de chalcona hidroxilada.
La Figura 1 representa estructuras de varias
chalconas hidroxiladas de la presente invención que se identificaron
por espectroscopía de masas y NMR. La Figura 1A es la estructura del
compuesto padre,
1-propanona-1-(2,4-dihidroxifenil)-3-hidroxi-3-(4'-hidroxifenilo).
La Figura 1B representa un derivado glicosilado del compuesto padre
al que se hace referencia aquí como
1-propanona-1-(2,4-dihidroxifenil)-3-hidroxi-3-(4'-hidroxifenil-4'o-beta-D-glucopiranósido).
La Figura 1C es un segundo derivado glicosilado del compuesto padre
al que se hace referencia aquí como
1-propanona-1-(2,4-dihidroxifenil-4'o-beta-D-glucopiranósido)-3-hidroxi-3-(4'-hidroxifenilo).
Se ha identificado ahora que un componente
específico del extracto de raíz de regaliz, una chalcona
hidroxilada, tiene actividad biológica coherente con efectos
anti-tumorigénicos en animales, que incluyen seres
humanos. Se cree que este componente del extracto de raíz de regaliz
se puede usar como agente anti-cáncer en la
prevención y el tratamiento del cáncer en animales, que incluyen
seres humanos.
Las chalconas hidroxiladas de la presente
invención se identificaron extrayendo raíz de regaliz con metanol,
etanol, DMSO y acetato de etilo. Se recogieron fracciones de
extracto bruto y se evaluaron por inmunotransferencia los efectos de
diversas fracciones de la raíz de regaliz entera. La raíz de regaliz
extraída con acetato de etilo, DMSO, o etanol indujo fosforilación
de bcl-2 según se demostró por una banda de
migración más lenta en comparación con el vehículo de control
(etanol solo) o un extracto acuoso.
Estudios previos han confirmado una asociación
entre la fosforilación de bcl-2 y la parada del
ciclo celular en G2/M. Por consiguiente, también se evaluaron los
efectos de diversos extractos de raíz de regaliz sobre el ciclo
celular. El extracto de raíz de regaliz indujo la parada del ciclo
celular G2/M de una manera similar a paclitaxel (control). Así,
estos resultados demuestran que el extracto de raíz de regaliz tiene
actividad biológica similar a la de conocidos fármacos
anti-microtubulares.
Para identificar el componente activo en el
extracto de raíz de regaliz capaz de fosforilación de
bcl-2, se recogieron fracciones y se evaluaron por
HPLC. Los extractos contenían muchos derivados. Por consiguiente, se
colocó el foco en los tres picos principales determinados por HPLC.
Se observó que las fracciones eluídas a partir de los picos
principales 1, 2, y 3 inducían fosforilación de
bcl-2 de una manera similar a los controles tratados
con paclitaxel. Los análisis por NMR y espectrometría de masas
revelaron que el pico 3 contenía un compuesto de chalcona
hidroxilada (al que se hace referencia en los sucesivo como DC y se
representa en la Figura 1A). Los picos 1 y 2 eran dos derivados
glicosilados de DC (Figuras 1B y 1C, respectivamente). Se han
sugerido otras estructuras polifenólicas encontradas en diversos
alimentos, tales como resveratrol, un compuesto estrógeno aislado en
el vino tinto (Goldberg, D.M. y otros, 1996, Am. Jour. of Enol.
Vitic. 47:415-420) como potenciales agentes
anti-cáncer y quimio-preventivos. Un
compuesto de tipo DC también se ha aislado a partir de un producto
natural, Rosa cymosa (Yoshida y otros, 1993,
Phytochemistry 32:1033-1036). Sin embargo, no
se ha determinado la actividad biológica de este compuesto de tipo
DC.
La actividad de DC purificada se determinó en
ensayos adicionales. Se observó que DC inducía la fosforilación de
bcl-2 en células tumorales tanto
MCF-7 como DUPro-1. Además, la DC
pura inducía la parada del ciclo celular G2/M de modo similar a los
extractos enteros de raíz de regaliz. En estos experimentos las
células tumorales MCF-7 fueron tratadas con DC y
evaluadas por citometría de flujo. La DC indujo una parada del ciclo
celular G2/M de una manera similar al conocido agente
anti-microtubular paclitaxel. Sin embargo, se
observó que DC inducía fragmentación microtubular de una manera
similar a vinblastina, mientras que se observó que paclitaxel
inducía haces microtubulares. Por lo tanto, DC es realmente un
desestabilizador microtubular, más similar a vinblastina. Estos
datos demuestran que un compuesto de chalcona hidroxilada sin grupos
metoxi tiene todavía una significativa actividad
anti-microtubular similar a estructuras de chalconas
con múltiples grupos metoxi (Edwards, M.L. y otros, 1990, J. Med.
Chem. 33:1948-1954).
Se evaluó, a continuación, la citotoxicidad de DC
en un ensayo de apoptosis. En este ensayo, se trataron células
tumorales con DC pura y se evaluaron la viabilidad celular y las
respuestas de apoptosis. La DC indujo apoptosis en células
MCF-7, como se demostró por la detección de
fosfatidilserina extracelular, que se redistribuye a la capa
exterior de la membrana durante la apoptosis. Las células
apoptóticas tempranas demostraron fluorescencia verde bajo el
microscopio. Se identificaron células necróticas por su aspecto de
manchado intracelular amarillo-rojo. La DC indujo
apoptosis de una manera similar a la de camptotecina 10 \muM
(compuesto de control). La DC también disminuyó la viabilidad
celular en células MCF-7 de una manera dependiente
de la dosis (IC_{50} de 13 \muM).
Estos datos de actividad biológica demuestran que
un extracto específico de raíz de regaliz, DC, tiene actividad
biológica que es indicativa de potenciales efectos
anti-tumorigénicos en seres humanos.
Específicamente, DC induce apoptosis y fosforilación de
bcl-2.
Así, la presente invención se refiere a
composiciones que comprenden un compuesto de chalcona hidroxilada
pura de Glycirrhiza glabra. Estos compuestos pueden ser
extraídos y purificados a partir de Glycirrhiza glabra.
Alternativamente, los compuestos de chalcona hidroxilada se pueden
preparar sintéticamente usando métodos bien conocidos por los
expertos en la técnica. Adicionalmente, un experto en la técnica
puede desarrollar ahora nuevos compuestos con estructura y actividad
similares a los compuestos de chalcona hidroxilada de la presente
invención basado en métodos rutinarios para ensayos de compuestos
clínicos potenciales. Composiciones de la presente invención
comprenden además preferiblemente un vehículo farmacéuticamente
aceptable para la administración del compuesto de chalcona
hidroxilada pura. La selección de vehículos farmacéuticamente
aceptables se lleva a cabo rutinariamente por los expertos en la
técnica y se suministran múltiples ejemplos de formulaciones en
referencias de textos normales tales como Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mark Publishing Co., Easton, PA,
1985.
Como se demuestra aquí, composiciones que
comprenden un compuesto de chalcona hidroxilada pura de
Glycirrhiza glabra inducen fosforilación de bcl-2 en tejidos y células, en particular células y tejidos tumorales, de animales, que incluyen seres humanos. Composiciones de la presente invención también son útiles en la inducción de apoptosis en células y tejidos, en particular células y tejidos tumorales, de animales, que incluyen seres humanos. Así, se cree que las composiciones de la presente invención son útiles en métodos para la prevención y tratamiento de cáncer en animales, que incluyen seres humanos. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a métodos para la prevención y tratamiento de cáncer y crecimiento de células tumorales en animales, que incluyen seres humanos, que comprende administrar al animal una cantidad eficaz de una composición que contiene un compuesto de chalcona hidroxilada pura de Glycirrhiza glabra. En el contexto de la presente invención, por "cantidad eficaz" se quiere dar a entender una cantidad de compuesto de chalcona hidroxilada pura de Glycirrhiza glabra capaz de producir una respuesta farmacológica que incluye, pero no se limita, inducción de fosforilación de bcl-2, inducción de apoptosis, inhibición de tumorigénesis, o prevención o tratamiento de cáncer. Las cantidades eficaces de compuestos que se han de administrar se pueden determinar rutinariamente por los expertos en la técnica sobre la base de datos de respuesta farmacológica tales como los que se proporcionan aquí. Por ejemplo, las dosis que se han de administrar se determinan rutinariamente por los expertos en la técnica sobre la base de datos de ensayos in vitro tales como determinaciones de IC_{50} según se proporcionan en la aplicación instantánea. Las vías de administración, así como los regímenes de dosificación también se pueden determinar rutinariamente por un experto en la técnica sobre la base de la experiencia anterior con compuestos similares, tales como resveratrol.
Glycirrhiza glabra inducen fosforilación de bcl-2 en tejidos y células, en particular células y tejidos tumorales, de animales, que incluyen seres humanos. Composiciones de la presente invención también son útiles en la inducción de apoptosis en células y tejidos, en particular células y tejidos tumorales, de animales, que incluyen seres humanos. Así, se cree que las composiciones de la presente invención son útiles en métodos para la prevención y tratamiento de cáncer en animales, que incluyen seres humanos. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a métodos para la prevención y tratamiento de cáncer y crecimiento de células tumorales en animales, que incluyen seres humanos, que comprende administrar al animal una cantidad eficaz de una composición que contiene un compuesto de chalcona hidroxilada pura de Glycirrhiza glabra. En el contexto de la presente invención, por "cantidad eficaz" se quiere dar a entender una cantidad de compuesto de chalcona hidroxilada pura de Glycirrhiza glabra capaz de producir una respuesta farmacológica que incluye, pero no se limita, inducción de fosforilación de bcl-2, inducción de apoptosis, inhibición de tumorigénesis, o prevención o tratamiento de cáncer. Las cantidades eficaces de compuestos que se han de administrar se pueden determinar rutinariamente por los expertos en la técnica sobre la base de datos de respuesta farmacológica tales como los que se proporcionan aquí. Por ejemplo, las dosis que se han de administrar se determinan rutinariamente por los expertos en la técnica sobre la base de datos de ensayos in vitro tales como determinaciones de IC_{50} según se proporcionan en la aplicación instantánea. Las vías de administración, así como los regímenes de dosificación también se pueden determinar rutinariamente por un experto en la técnica sobre la base de la experiencia anterior con compuestos similares, tales como resveratrol.
Los siguientes ejemplos no limitativos se
presentan para ilustrar mejor la presente invención.
Ejemplo
1
Se extrajeron con metanol raíces pulverizadas de
Glycirrhiza glabra y se concentraron bajo vacío usando
evaporación rotatoria (Rotavapor R-110, Buchi,
Suiza). El concentrado que quedó se sometió a extracción con acetato
de etilo acidificado (3% HCl). El extracto de acetato de etilo seco,
se cromatografió a continuación sobre una columna de gel de sílice
de fase inversa funcionalizada con octadecilo, tal que se podía
llevar a cabo el bio-ensayo dirigido al
fraccionamiento. Se hizo la elución usando una mezcla de disolventes
de agua/metanol con una concentración creciente de metanol (90:10,
80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 0:100; 500
ml de cada una). Se recogieron las fracciones sucesivas y se
ensayaron respecto a su actividad biológica.
La fracción más activa fue recromatografiada
sobre una columna de HPLC de fase inversa semipreparativa Zorbax
Rx-C18 (9,4 mm x 240 mm, 5 \mum) comprada a
Mac-Mod Analytical (Chadds Ford, PA). Los compuestos
fueron eluídos por un sistema de gradiente de disolvente (A: agua y
0,05% de ácido fórmico; B: acetonitrilo). El programa de elución a 3
ml/min fue como sigue: 80% A a 40% B (0 a 45 minutos). La longitud
de onda examinada fue de 254 nm. Se recogieron fracciones sucesivas
y se enviaron para ensayos biológicos adicionales.
Se clasificaron las fracciones respecto a su
pureza usando una columna de HPLC de fase inversa Discovery C18 (250
mm x 4,6 mm, 5 \mum) con una guarda columna comprada a Supelco
(Bellefonte, PA). El programa de disolvente fue un sistema de
gradiente (A: agua y 0,05% de ácido fórmico; B: 100% acetonitrilo;
35 a 55 minutos). El programa de elución a 1 ml/min fue como sigue:
100% A a 100% B (0 a 35 minutos); 100% B (35 a 55 minutos). Las
longitudes de onda examinadas fueron de 220 nm a 320 nm con un
dispositivo detector de diodo Varían 9065. La separación final de
compuestos puros se obtuvo usando HPLC semipreparativa sobre una
columna de fase inversa Zorbax Rx-C18 (9,4 mm x 240
mm, 5 \mum) comprada a Mac-Mod Analytical. Los
compuestos fueron eluídos con un sistema de disolvente isocrático
que contenía 82% de agua con 0,05% de ácido fórmico, 18%
acetonitrilo.
Ejemplo
2
Se obtuvieron los dos espectros de NMR ^{1}H y
^{13}C sobre un instrumento VXR-200. Se llevó a
cabo la espectroscopia de masas sobre un sistema Micromat Platform
II provisto de un ordenador Digital DECPc XL560 para análisis de
datos. Se obtuvieron los espectros de masas usando ionización
química a presión atmosférica (APCI) en el modo de ión negativo. La
temperatura de la fuente iónica se ajustó a 150ºC y la de la sonda
se ajustó a 450ºC. El voltaje del cono de muestra fue 10 V y la
descarga de corona fue 3,2 kV. El análisis de HPLC se llevó a cabo
en una bomba de cromatografía líquida Varían Vista 5500 acoplada a
un dispositivo detector de diodo Varían 9065 Polychrom. Se obtuvo un
fraccionamiento semi- preparativo de compuestos purificados sobre
una bomba de HPLC Varían 9012 acoplada a un espectrofotómetro Waters
Lambda-Max Modelo 481 LC. Para la cromatografía de
columna se usó gel de sílice (tamaño de partícula 60A)
funcionalizada con octadecilo. El empaquetamiento de la columna se
compró a Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Todos los
disolventes usados para la extracción y el aislamiento fueron de
calidad de HPLC.
\newpage
Ejemplo
3
El análisis de la expresión de proteína
bcl-2 se llevó a cabo usando un ensayo Western blot
según se ha descrito previamente (Haldar, S. y otros, 1996,
Cancer Res. 56:1253; Haldar, S. y otros, 1995, Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 92:4507-4511). La
identificación de proteína se hizo usando un anticuerpo primario
monoclonal de bcl-2 (DAKO Corporation) y
secundariamente anticuerpo conjugado de peroxidasa de rábano picante
anti-ratón de cabra (Bio-Rad
Laboratories, Richmond, CA). La fosforilación de
bcl-2 se determinó por los cambios de movilidad en
el Western bolt según se describe por Haldar (Haldar, S. y otros,
1996, Cancer Res. 56:1253; Haldar, S. 1995, Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU. 92:4507-4511).
Ejemplo
4
Se trataron las células durante 24 horas, se
incubaron con BrdU 10 \muM durante 45 minutos a 37ºC. Luego se
lavaron las células con PBS enfriado con hielo, se resuspendieron en
200 \mul de PBS y se fijaron con etanol al 70% frío. Las células
se resuspendieron, se incubaron durante 30 minutos en HCl 2 N/
Triton X-100 al 0,5% en PBS, y se neutralizaron
enjuagándolas una vez en tetraborato de sodio 1 M (pH 8,5). Se
añadió anticuerpo anti-BrdU conjugado con
isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Becton Dickinson) (10
\mug/muestra) en 50 \mul de Twin 20 al 0,5%/BSA al 1% en PBS y
se incubaron durante 30 minutos. Se lavaron las células y se
resuspendieron en 1 ml de PBS que contenía 5 \mug/ml de yoduro de
propidium. Se determinó la intensidad de fluorescencia por
citometría de flujo cuantitativa y se generaron perfiles en un
FACScan Becton Dickinson. Se analizó un mínimo de 10.000
células.
Ejemplo
5
Se usó el método de Apoalert Annexin
V-EGFP (CLONTECH, Palo Alto, CA) para evaluar
apoptosis. Brevemente, se trataron células tumorales durante 2 horas
y se lavaron las células con solución fijadora y se tiñeron con
Annexin V-EGFP y yoduro de propidium durante 15
minutos en la oscuridad. Se visualizaron las células usando un
microscopio de fluorescencia invertida Nikin Eclipse
TE-200 (Nikon Corporation, Tokio, Japón). Se tomaron
fotografías usando una cámara digital SPOT (Diagnostic, Inc.,
Sterling Heights, MI) en combinación con marcador SPOT con un
conjunto
APO-BR-DU(Pharmingen, San
Diego, CA). Se trataron células (1 x 10^{6} por platillo) durante
12 horas, se lavaron con PBS, y se fijaron en paraformaldehído al 1%
en hielo durante 30 minutos. Después de la fijación, se lavaron dos
veces las células con PBS y se fijaron en etanol al 70%. Se lavaron
los gránulos y se resuspendieron en 50 \mul de solución marcadora
de DNA que contenía BrdUTP y enzima TdT y se incubaron durante 60
minutos a 37ºC. Después de la incubación, se lavaron los gránulos,
se incubaron con anticuerpo anti-BrdU marcado con
FITC en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente y se
tiñeron con yoduro de propidium y RNasa. Las células teñidas se
analizaron por citometría de flujo después de 30 minutos. Se evaluó
la viabilidad celular por el método del colorante de tetrazolium
según se ha descrito previamente (Scudiero, D.A. y otros, 1988,
Cancer Res. 48:4827-4833). Las células se
pusieron en placas con 96 pocillos por placa y se incubaron con
diversos agentes durante 72 horas. Se midió la absorbancia a 570 nm
usando un lector de microplaca Dyatech.
Claims (6)
1. Una composición que comprende
1-propanona-1-(2,4-dihidroxifenil)-3-hidroxi-3-(4'-hidroxifenilo).
2. Un método in vitro de inducir
fosforilación de bcl-2 en células o tejidos que
comprende poner en contacto células o tejidos con la composición de
la reivindicación 1.
3. Un método in vitro de inducir apoptosis
en células o tejidos que comprende poner en contacto células o
tejidos con la composición de la reivindicación 1.
4. Un método in vitro de inhibir el
crecimiento de células tumorales que comprende poner en contacto
células tumorales con la composición de la reivindicación 1.
5. La composición de la reivindicación 1, en la
que dicha composición es una composición farmacéutica.
6. Uso de
1-propanona-1-(2,4-dihidroxifenil)-3-hidroxi-3-(4'-hidroxifenilo)
para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir o
tratar cáncer o crecimiento de células tumorales.
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