DE3935132A1

DE3935132A1 - Antitumormittel, mittel zum unterdruecken von tumorzellmetastasen und verfahren zum behandeln von krebs und zum kontrollieren von tumorzellmetastasen

Info

Publication number: DE3935132A1
Application number: DE3935132A
Authority: DE
Inventors: Koji Fukushima; Tsutomu Honjo; Tomonobu Fujita; Haruhisa Fujita; Toshiharu Sakurai
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 1989-05-19
Filing date: 1989-10-18
Publication date: 1990-11-22
Also published as: GB8924450D0; GB2231793B; JPH02306922A; FR2647017A1; JP2842888B2; US5175005A; GB2231793A; FR2647017B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Antitumor- oder anti neoplastisches Mittel und ein Mittel zum Unterdrücken von Tumorzellmetastasen (im weiteren als antimetastatisches Mittel bezeichnet) sowie Verfahren zu deren Anwendung.

Gegenwärtig umfassen die Verfahren für die Krebsbehandlung chirurgische Behandlung (Chirurgie), Strahlenbehandlung, Chemotherapie und Immunotherapie. Von diesen sind die Chirurgie und die Strahlenbehandlung als am stärksten vernichtende Behandlungen bedeutungsvoll. Da jedoch die Chirurgie und Strahlenbehandlung beide Lokalbehandlungen sind, sind sie nur solange sinnvoll, wie Tumore auf einen lokalen Bereich beschränkt sind, aber es besteht eine ernstzunehmende Grenze, wenn Tumore progessiver Natur sind und sich über den lokalen Bereich hinaus ausbreiten oder Erkrankungen systemisch sind. Andererseits haben die Chemotherapie und die Immunotherapie das Kennzeichen systemischer Behandlungen. Beide gehören zu Behandlungen eines relativ neuen Gebiets, aber sie machen so beachtliche Fortschritte, daß sie einem Bereich zuzuordnen sind, in dem man auch in Zukunft weitere Fortschritte erwarten kann.

Die Chirurgie, Strahlenbehandlung und Immuno-Chemotherapie sind Behandlungen mit voneinander unterschiedlichen Prinzipien und weisen daher Wirkungen und Beschränkungen auf, die jeweils verschiedenartig sind. Daher kann eine geeignete Kombination dieser unterschiedlichen Behandlungen sinnvoll sein, um als Ergebnis einer gegenseitigen Zusammenwirkung und gegenseitigen Kompensation jeweiliger Mängel die Heilwirkung zu verbessern. Solch eine mehrschichtige intensive Kombinationstherapeutik könnte zum erstenmal eine Verbesserung bei der Behandlung von bösartigen Tumoren mit sich bringen. Bei einer solchen Kombinationstherapeutik erfordert es dann sofortige Aufmerksamkeit, die Therapeutik so aufzubauen, daß sie auf einem neuen Standpunkt der Unterdrückung der Neovaskularisierung von Tumorzellen beruht.

Herkömmliche Chemotherapie von Krebs ist überwiegend unter Verwendung einer Mehrfachwirkstoff-Kombinationstherapeutik durchgeführt worden, bei der hauptsächlich ein Wirkstoff verwendet wird, der die Synthese von Nukleinsäure oder Protein hemmt, wofür 5-Fluorouracil (5-FU), Mitomycin (MMG), Cisplatin (CDDP) oder Adriamycin (ADR) typische Beispiele sind. Diese haben jedoch so starke Nebenwirkungen, daß die Chemotherapie auf das Gebiet einer Hilfsbehandlung beschränkt bleibt, und in Anbetracht der Nebenwirkungen ist ihre Verwendung auch mengenmäßig sehr beschränkt. Unter den bestehenden Bedingungen können somit keine befriedigenden therapeutischen Ergebnisse erzielt werden.

In den letzten Jahren ist andererseits ein Versuch unternommen worden, Krebs dadurch zu behandeln, indem ein Fremdkörper ausschaltungsmechanismus gestärkt wird, der einen immunologischen Verteidigungsmechanismus darstellt, der den Organismen selbst innewohnt. Typische Medikamente, die für diesen Zweck eingesetzt worden sind, umfassen bekannterweise verschiedenartige Lymphokine, einschließlich Interferonen und Interleukinen. Von der Natur werden diese Substanzen jedoch nur dann lokal hergestellt, wenn ein Fremdkörper in einen Organismus eingedrungen ist, um lokal unterschiedliche biologische Antworten hervorzurufen, so daß es oft vorgekommen ist, daß als Ergebnis einer allgemeinen Verabreichung dieser Substanzen zum Zweck ihrer Anwendung für die Krebsbehandlung Nebenwirkungen, wie etwa Thermacogenese, auftreten. Überdies sind, vermutlich weil Krebszellen von dem Organismus nur unter Schwierigkeiten als Fremdkörper erkannt werden, die Krebsarten, auf welche die Behandlung angewendet werden kann, sehr beschränkt. Die therapeutischen Ergebnisse können daher unter den bestehenden Bedingungen nicht als besonders gut eingestuft werden.

Wie oben besprochen, besitzen die herkömmlicherweise klinisch eingesetzten Antitumormittel, die einen Wirkstoff enthalten, der die Synthese von Nukleinsäure oder Protein hemmt, starke Nebenwirkungen und sind daher vom Standpunkt der Wirkung her ebenfalls nicht befriedigend.

Antitumormittel, die sich die immunsteigernde Wirkung auf Organismen zunutze machen und als Modifikatorpräparate der biologischen Antwort (BRM-Präparate) bezeichnet werden, besitzen ebenfalls Nebenwirkungen, wie etwa Thermacogenese, und unterliegen überdies großen Beschränkungen hinsichtlich der zu behandelnden Tumorarten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Antitumormittel und ein antimetastatisches Mittel zur Verfügung zu stellen, welches eine Substanz mit niedriger Toxizität verwendet, die aus Organismusbestandteilen stammt, um eine Krebsbehandlung zu ermöglichen, die sich den dem Organismus innewohnenden Kontroll mechanismus zunutze macht.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die vorliegende Erfindung ein Antitumormittel und ein antimetastatisches Mittel zur Verfügung stellt, das einen Ribo nukleasehemmer als eine wirksame Komponente enthält, wobei diese Substanz insbesondere als ein Antitumormittel für die Behandlung von lymphozytärer Leukämie, Gehirntumor, Lungenkrebs, Brustkrebs, Leberkrebs, Magenkrebs und Dickdarmkrebs sowie von Melanomzellen usw. und als ein antimetastatisches Mittel gegen Metastasen in der Lunge und in den Lymphknoten wirksam ist.

Die erfindungsgemäße Substanz besitzt eine hohe Antitumorwirksamkeit und zeigt eine beachtliche Wirkung auf geschlossenen Krebs, wie etwa Brustkrebs und Dickdarmkrebs. Sie ist auch wirksam gegen Metastasen in der Lunge und Metastasen in den Lymphknoten, die auftreten, wenn der geschlossene Krebs in diesen Primärnestern chirurgisch entfernt worden ist, so daß sie die nachoperative Matastasenabwehr gut bewältigen kann. Überdies besitzt sie auch aufgrund einer sehr niedrigen Toxizität die Eigenschaft, über einen langen Zeitraum einsetzbar zu sein. Zusätzlich ist sie aufgrund ihrer wasser löslichen Natur einfach zu handhaben und kann auch zu einem sehr stabilen Präparat verarbeitet werden.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung sowie der Zeichnung. Dabei zeigt

Fig. 1 ein Diagramm, um die Antitumorwirksamkeit von Ribonukleasehemmern gegen die Vermehrung von menschlichen Dickdarm-Tumorzellen (Co-4), die in Nacktmäuse verpflanzt worden sind, dar zustellen.

Der Ribonukleasehemmer ist eine Substanz, die in der Lage ist, zusammen mit einem RNA-Inzisionsenzym, d. h. Ribonuklease, einen Komplex zu bilden, um dessen Wirksamkeit spezifisch zu hemmen. Er wird als eine Substanz angesehen, die grundsätzlich in allen Organen und Geweben von Organismen vorkommt und an der Synthese von Proteinen der Organismen teilnimmt und so tiefgreifend die Vermehrungskontrolle von Zellen betrifft. Gegenwärtig wird der Ribonukleasehemmer auf dem Gebiet der Gentechnologie als ein Reagenz verwendet, das verhindert, daß eine mRNA von Ribonuklease abgebaut wird, wenn die nRNA aus einer Zelle gesammelt wird.

Man nimmt an, daß der Ribonukleasehemmer eine schnelle Vermehrungsfähigkeit besitzt, wie sie Tumorzellen haben, aber im Unterschied zu Tumorzellen in großer Menge in einem hochkontrollierten Gewebe enthalten ist. Als Materialien für seine Darstellung wird vorzugsweise menschliche Placenta verwendet. Genauer gesagt, kann der Ribonukleasehemmer aus menschlicher Placenta durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ribonuklease-Sepharose gemäß dem Verfahren nach Blackburn (J. Biol. Chem., Vol. 252, pp. 5904-5910, 1977) rein dargestellt werden. Der Ribonukleasehemmer ist auch kommerziell erhältlich, wie z. B. RNasin (Promega Biotec Co., U. S. A.), Ribonukleasehemmer aus menschlicher Placenta (Amersham Co., Großbritannien) und Ribonukleasehemmer (Takara Shuzo K. K.).

Der Ribonukleasehemmer ist eine Substanz, deren Primärstruktur von der Gruppe der Erfinder im vorliegenden Fall und der Gruppe von Vellee et al. bestimmt worden ist, obwohl seine N-terminale Struktur noch nicht vollständig identifiziert ist (Biochemistry, Vol. 27, pp. 8545-8553, 1988).

Bei der vorliegenden Erfindung wird dieser Ribonukleasehemmer als das Antitumormittel und das antimetastatische Mittel verwendet, und die Darreichungsform kann sowohl intravenös, subkutan, intramuskulär als auch intratumorös sein. Als Träger für die Verabreichung des Ribonukleasehemmers ist z. B. eine sterilisierte mit Natriumphosphat gepufferte Kochsalzlösung geeignet, die Glutathion enthält, von einem 10mM reduzierten Typ.

Es gibt keine besonderen Beschränkungen für die Dosis des Ribonukleasehemmers. Wie in den später beschriebenen Beispielen gezeigt werden wird, erbringt jedoch eine Dosis von 5 bis 1000 ng/Maus eine Wirkung. Die Wirkung kann daher bei seiner Verwendung in einer sehr kleinen Menge erzielt werden. Diese kann errechnet werden als 0,25 bis 50 µg/kg als Dosis pro 1 kg Körpergewicht. Diese Dosis erbringt auch bei Menschen eine hinreichende Wirkung.

Hinsichtlich der Toxizität des Ribonukleasehemmers wird, wie in den später beschriebenen Beispielen gezeigt werden wird, weder eine Abnahme des Körpergewichts noch eine Veränderung des Haarglanzes in allen Beispielen innerhalb des Dosisbereiches beobachtet, in dem Experimente mit Mäusen gemacht wurden. Es hat sich also bestätigt, daß der Ribonukleasehemmer eine sehr niedrige Toxizität besitzt. Somit wird erwartet, daß innerhalb des Bereichs der wirksamen Dosis nur geringe Nebenwirkungen hervorgerufen werden.

Die erfindungsgemäße Substanz ist insbesondere als ein Antitumormittel zur Behandlung von lymphozytärer Leukämie, Gehirntumor, Lungenkrebs, Brustkrebs, Leberkrebs, Magenkrebs und Dickdarmkrebs sowie von Melanomzellen usw. und als antimetastatisches Mittel gegen Metastasen in der Lunge und Metastasen in den Lymphknoten wirksam. Die erfindungsgemäße Substanz kann ihre Antitumorwirkung auch steigern, wenn sie in Kombination mit bekannten wirksamen Substanzen verwendet wird.

In der vorliegenden Erfindung ist die Wirkungsweise und der Mechanismus, wie der Ribonukleasehemmer die Antitumorwirkung und die Unterdrückung von Tumorzellmetastasen entfalten kann, nicht aufgeklärt worden. Dennoch kann die folgende Vermutung angestellt werden.

Der Ribonukleasehemmer ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 und bildet einen 1 : 1-Komplex mit Angiogenin. Andererseits berichten Lobb et al. (in Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 84, p. 2338, 1987), daß der Ribonukleasehemmer die Wirksamkeit des Angiogenin, das Neovaskularisierung bewirken kann, stark unterdrücken kann und die Möglichkeit besitzt, gleichzeitig die Ausdehnung der neu gebildeten Gefäße für die Zufuhr von Nährstoffen zu den Tumorzellen zu hemmen. Es wird daher angenommen, daß der Ribonukleasehemmer die Neovaskularisierung, die Angiogenin zuzuschreiben ist, und dadurch die Ribonukleasewirksamkeit hemmt und daß eine solche Wirkung die Antitumorwirkung und Unterdrückung von Tumorzellmetastasen entfaltet.

Gemäß den von den Erfindern im vorliegenden Fall durchgeführ ten Experimente hat der Ribonukleasehemmer keinen Einfluß auf die Reduplikation von kultivierten Brusttumorzellen und normalen Endothelzellen, so daß man auch annehmen kann, daß die Substanz keine direkte Wirkung auf die Zellen zeigt.

Die Wirkung, Tumorzellvermehrung zu unterdrücken und die Lebensdauer zu verlängern, kann jedoch in beachtlichem Umfang beobachtet werden, und manche Tiere zeigten vollständige Heilung als Ergebnis einer geringen Menge intraperitonealer, subkutaner oder intratumoröser Verabreichung an mit Krebs befallene Tiere, wie etwa Mäuse, mit Meth A-Sarkomzellen, Brusttumorzellen oder Melanomzellen und Menschen mit Brusttumorzellen, Dickdarmtumorzellen oder Lungentumorzellen. Es ist weiterhin möglich, die Substanz als antimetastatisches Mittel einzusetzen, was eine Möglichkeit darstellt, Tumor zellmetastasen nach chirurgischen Eingriffen zu verhindern. Bei einem Modellsystem von Metastasen in der Lunge unter Verwendung von Lewis-Lungentumorzellen einer Maus führt eine Behandlungskombination mit Einsatz des Ribonukleasehemmers und chirurgischer Entfernung eines Primärnestes zu einer signifikanten Unterdrückung der Metastasen in der Lunge und der Metastasen in den Lymphknoten.

Der in den folgenden Beispielen verwendete Ribonukleasehemmer wurde aus menschlicher Placenta durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Ribonuklease-Sepharose gemäß dem Verfahren nach Blackburn (J. Biol. Chem., Vol. 252, pp. 5904-5910, 1977) rein dargestellt. Bei Verabreichung des Ribonukleasehemmers wurde eine sterilisierte mit Natriumphosphat gepufferte Kochsalzlösung, die Glutathion einer 10mM reduzierten Form und 1 mg/ml BSA enthält, als Trägersubstanz verwendet.

Beispiel 1 (Unterdrückung der Tumorvermehrung und Lebensverlängerung durch Ribonukleasehemmer gegenüber Meth A-Sarkomzellen in Mäusen)

Meth A-Sarkomzellen in einer Anzahl von 2,0×10⁵ wurden weiblichen Balb/c-Mäusen (6 Wochen alt) intradermal verpflanzt, und der Ribonukleasehemmer wurde intratumorös oder intraperitoneal in einer Dosis von 10 ng/Maus, 100 ng/Maus und 1000 ng/Maus kontinuierlich 7 mal nach dem 10. Tag bis zum 16. Tag verabreicht, währenddessen die Sarkomzellen ein Tumorvolumen von 200 bis 300 mm³ erreichten, und anschließend wurden die Veränderungen im Tumorvolumen und die mittlere Anzahl der Überlebenstage beobachtet. Zum Vergleich wurden ähnliche Experimente mit dem bekannten karzinostatischen Mittel 5-FU bei intraperitonealer Verabreichung in einer Dosis von 20 mg/kg/Tag durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.

Im Ergebnis konnte eine Unterdrückung der Tumorvermehrung bei Verabreichung in verschiedenen Dosen beobachtet werden. Hinsichtlich einer optimalen Dosis wurde jedoch eine maximale Wirkung bei intratumoröser Verabreichung in einer Dosis von 100 ng/Maus erzielt, und es ergab sich eine bessere Antitumorwirkung als bei dem bekannten karzinostatischen Mittel 5-FU (20 mg/kg/Tag, ip×7). Selbst bei intratumoröser Verabreichung in einer Dosis von 10 ng/Maus wurde eine Unterdrückung der Tumorvermehrung beobachtet, die mit derjenigen von 5-FU übereinstimmte, und es wurde überhaupt keine Toxizität beobachtet. Andererseits wurde eine signifikante Wirkung im Hinblick auf die Lebensverlängerung nur bei intratumoröser Verabreichung von 100 ng/Maus und intraperitonealer Verabreichung von 1000 ng/Maus beobachtet, im Vergleich mit dem Kontrollversuch.

In der Gruppe der intratumorösen Verabreichung von 100 ng/Maus überlebten 1/8 der getesteten Mäuse 90 Tage oder länger, wobei vollständige Heilung der Tumore beobachtet wurde. Dies sind signifikante Ergebnisse, die aussagen, daß eine therapeutische Wirkung durch die Verabreichung von Ribonukleasehemmer erreicht werden kann, selbst bei Tumoren, die bereits in einem Stadium sind, in dem sie sich bis zu einem gewissen Maße vermehrt haben.

Beispiel 2 (Unterdrückung der Tumorvermehrung durch Verabreichung von Ribonukleasehemmer gegenüber MM46-Brusttumorzellen in Mäusen)

MM46-Brusttumorzellen in einer Anzahl von 5×10⁵ wurden weiblichen C3H/He-Mäusen intradermal verpflanzt, und der Ribonukleasehemmer wurde intratumorös oder intraperitoneal in einer Dosis, die von 50 bis 1000 ng/Maus reichte, kontinuierlich 9mal vom 10. Tag bis zum 18. Tag nach der Verpflanzung verabreicht. Die Mäuse wurden am 42. Tag nach der Verpflanzung der Tumore getötet, und die tatsächlichen Tumore wurden entfernt, um das Gewicht der Tumore zu bestimmen. Zum Vergleich wurden ähnliche Experimente mit dem bekannten karzinostatischen Mittel Nimustin bei intraperitonealer Verabreichung in einer Dosis von 5 mg/kg/Tag durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Bei intratumoröser Verabreichung von 50, 100, 500 ng/Maus von Ribonukleasehemmer zeigte sich eine Unterdrückungswirkung in der Größenordnung von 72,9% bis 88,9% als Unter drückungsrate der Tumorvermehrung. Andererseits zeigte sich auch eine Unterdrückungsrate von 80,3% bei intraperitonealer Verabreichung von 500 ng/Maus. Andererseits zeigte sich kein signifikanter Unterdrückungseffekt der Tumorvermehrung bei Nimustin (5 mg/kg/Tag, ip×9). Aus dieser Tatsache wird bestätigt, daß der Ribonukleasehemmer sowohl bei intratumoröser als auch bei intraperitonealer Verabreichung wirksam ist.

Beispiel 3 (Unterdrückung der Tumorvermehrung und Lebensverlängerung durch Verabreichung von Ribonukleasehemmer gegenüber MM46-Brusttumorzellen in Mäusen)

MM46-Brusttumorzellen in einer Anzahl von 2×10⁵ wurden weiblichen C3H/He-Mäusen (6 Wochen alt) subkutan verpflanzt, und der Ribonukleasehemmer wurde in einer Dosis, die von 10 bis 1000 ng/Maus reicht, kontinuierlich 9mal vom 1. Tag bis zum 9. Tag nach der Verpflanzung intraperitoneal verabreicht. Das Tumorvolumen am 14. Tag nach der Verpflanzung der Tumore wurde gemessen, und die mittleren Überlebenstage wurden beobachtet. Zum Vergleich wurden ähnliche Experimente mit dem bekannten karzinostatischen Mittel Nimustin bei intraperitonealer Verabreichung in einer Dosis von 5 mg/kg/Tag durchgeführt. Die erhaltenen Resultate sind in den Tabellen 4 und 5 dargestellt.

Bei der intratumorösen Verabreichung von 10 ng/Maus von Ribonukleasehemmer wurde eine nicht so starke Wirkung in der Größe von 35,7% als Unterdrückungsrate der Tumorvermehrung erzielt. Eine Unterdrückungsrate von 75% oder mehr zeigte sich, wenn die intraperitoneale Verabreichung in Dosen von 50 ng/Maus, 500 ng/Maus und 1000 ng/Maus vorgenommen wurde. Wie beim Unter drückungseffekt der Tumorvermehrung zeigte sich eine Lebensver längerungswirkung von 166,8% oder mehr bei Verabreichung in einer Dosis von nicht weniger als 50 ng/Maus, was der mit Nimustin (5 mg/kg/Tag, ip×9) erhaltenen Wirkung überlegen war. Insbesondere in der Gruppe, in der der Ribonukleasehemmer intraperitoneal in einer Dosis von 50 ng/Maus verabreicht wurde, überlebten 7/9 der getesteten Mäuse 60 Tage oder länger, und alle überlebenden Mäuse waren vollständig geheilte Tiere. Somit haben sich auch die MM46-Brusttumorzellen in Mäusen als ein Tumorzellstamm herausgestellt, der eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der intraperitonealen Verabreichung des Ribonukleasehemmers besitzt.

Beispiel 4 (Unterdrückung der Tumorvermehrung und Lebensverlängerung durch Verabreichung von Ribonukleasehemmer gegenüber B16-Melanomzellen in Mäusen)

Melanomzellen in einer Anzahl von 1×10⁵ wurden weiblichen BDFI-Mäusen (6 Wochen alt) subkutan verpflanzt, und der Ribonukleasehemmer wurde in einer Dosis, die von 5 bis 500 ng/Maus reichte, kontinuierlich 20mal vom 1. Tag bis zum 20. Tag nach Verpflanzung intraperitoneal verabreicht. Das Tumorvolumen am 21. Tag nach der Verpflanzung der Tumore wurde gemessen, und die mittleren Überlebenstage wurden beobachtet. Zum Vergleich wurden ähnliche Experimente mit den bekannten karzinostatischen Mitteln Cisplatin und Cortisonacetat bei Verabreichung in den angegebenen Dosen durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 dargestellt.

Bei der Verabreichung des Ribonukleasehemmers in einer Dosis von 5 bis 500 ng/Maus wurde lediglich eine Unterdrückungsrate der Tumorvermehrung von etwa 50% erhalten, die die Wirkung von Cisplatin (1 mg/kg/Tag, ip×20) und Cortinsonacetat (50 mg/kg/Tag, sc×20) nicht übersteigt. Bei der Verabreichung von Ribonukleasehemmer in Dosen von 50 ng/Maus/Tag, ip×20 und 100 ng/Maus/Tag, ip×20, wurde jedoch eine signifikante Lebensverlängerungswirkung festgestellt, obwohl diese im Vergleich mit derjenigen von Cisplatin und Cortisonacetat leicht unterlegen war.

Tabelle 6

Antitumorwirkung von Ribonukleasehemmer gegenüber B16-Melanom in Mäusen

Tabelle 7

Lebensverlängerungswirkung von Ribonukleasehemmer gegenüber B16-Melanom in Mäusen

Beispiel 5 (Unterdrückung der Tumorvermehrung durch Ribonukleasehemmer gemäß subrenikapsulärer Transplantation gegenüber menschlichen Dickdarm tumorzellen (Co-4))

Eine Zellmasse von 10 mm³ eines menschlichen Dickdarmtumorzellstamms wurde subrenikapsulär in weibliche BDFI-Mäuse (6 Wochen alt) verpflanzt, und der Ribonukleasehemmer wurde in einer Dosis, die von 10 bis 1000 ng/Maus reichte, kontinuierlich 5mal vom 1. Tag bis zum 5. Tag nach Verpflanzung intraperitoneal verabreicht. Die Mäuse wurden am 6. Tag nach der Verpflanzung der Tumore getötet, und die Neben- und Hauptachsen der Tumore wurden unter Verwendung eines Stereoskopiemikroskops vermessen, um das Tumorvolumen zu berechnen. Zum Vergleich wurden ähnliche Experimente mit den bekannten karzinostatischen Mitteln 5-FU, Mitomycin C, Nimustin, Adriamycin und Cisplatin bei Verabreichung in angegebenen Dosen durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.

Der Ribonukleasehemmer ergab eine Hemmungsrate, die von etwa 30 bis 35% bei Verabreichung in jeder Dosierung reichte, wobei er eine Unterdrückung der Tumorvermehrung zeigte, die derjenigen der bekannten karzinostatischen Mitteln nur leicht unterlegen war. Bei Verabreichung in einer Dosis von 1000 ng/Maus, ip×5, zeigte er jedoch eine mit Nimustin (10 mg/kg/Tag, ip×2) vergleichbare Wirkung.

Beispiel 6 (Antitumorwirksamkeit von Ribonukleasehemmer gegenüber der Vermehrung von menschlichen Dickdarmtumorzellen (Co-4), die in Nacktmäuse verpflanzt sind)

Co-4-Tumorstücke, Tumore von 200 bis 250 mm³, wurden in weibliche Balb/c nu/nu(-)-Mäuse verpflanzt, und eine Vergleichsuntersuchung wurde zwischen der Gruppe, in der der Ribonukleasehemmer 8mal in Intervallen von einem Tag vom 2. Tag bis zum 16. Tag nach der Verpflanzung der Tumore intraperitoneal verabreicht wurde, und der Gruppe, in der der Ribonukleasehemmer jeden Tag vom 25. Tag bis zum 34. Tag nach der Verpflanzung intraperitoneal verabreicht wurde, durchgeführt. Die erhaltenen Resultate sind in Fig. 1 dargestellt. Der Ribonukleasehemmer wurde in einer Dosis von 250 ng/Maus oder 500 ng/Maus verabreicht.

Es wurde nachgewiesen, daß sich bei beiden Dosierungen bei der anfänglichen Verabreichung eine beachtliche Unterdrückung der Vermehrung zeigte, und die Unterdrückung der Tumorvermehrung wurde selbst in den Fällen der Verabreichung im späteren Stadium, die am 25. Tag begann, gehalten, solange der Ribonukleasehemmer fortgesetzt intraperitoneal verabreicht wurde. Dies legt die Möglichkeit nahe, daß es eine Korrelation zwischen der Unterdrückung der Vermehrung von menschlichen Dickdarmtumorzellen und dem Vorhandensein von Ribonukleasehemmer in Organismen gibt.

Beispiel 7 (Antitumorwirksamkeit von Ribonukleasehemmer gegenüber der Vermehrung von menschlichen Brusttumorzellen (MX-1), die in Nacktmäuse verpflanzt sind)

MX-1-Tumorstücke von 2×2 mm wurden in weibliche Balb/c nu/nu(-)-Mäuse verpflanzt, und die Untersuchung wurde unter den Bedingungen durchgeführt, daß der Zeitpunkt, zu dem das Tumorvolumen 532±139 mm³ am 13. Tag nach der Verpflanzung erreichte, als 1. Tag angenommen wurde, und der Ribonukleasehemmer 6mal wöchentlich in einer Dosis von 5 bis 500 ng/Maus intraperitoneal verabreicht wurde, wobei diese Verabreichung über 4 Wochen fortgesetzt wurde. Die Resultate sind in Tabelle 9 dargestellt, wobei diese durch Messen der Tumorgewichte am 28. Tag nach Verabreichung erhalten wurden, in den Gruppen, in denen der Ribonukleasehemmer intraperitoneal verabreicht wurde. Zum Vergleich wurden ähnliche Experimente mit den bekannten karzinostatischen Mitteln Cortisonacetat und Nimustin durchgeführt, die in angegebenen Dosen verabreicht wurden. Die erhaltenen Resultate sind ebenfalls zusammen in Tabelle 9 dargestellt.

In der Gruppe, in der der Ribonukleasehemmer in einer Dosis von 100 ng/Maus/Tag intraperitoneal verabreicht wurde, wurde eine bessere Antitumorwirkung festgestellt, als in den Gruppen, in denen Cortisonacetat (50 mg/kg/Tag, ip×24) und Nimustin (2 mg/kg/Tag, ip×24) verabreicht wurden.

Tabelle 10 zeigt typische Veränderungen im Tumorvolumen in der Gruppe, in der der Ribonukleasehemmer in einer Dosis von 100 ng/Maus/Tag intraperitoneal verabreicht wurde. In dieser Tabelle ist eine Tumorvermehrungskurve als Verhältnis eines Tumorvolumens (T₀) vor der Verabreichung zu einem Tumorvolumen (T _t) nach der Verabreichung dargestellt.

Wie aus Tabelle 10 deutlich wird, hat die intraperitoneale Verabreichung von 100 ng/Maus während der Verabreichung eine beachtliche Unterdrückung der Tumorvermehrung mit sich gebracht, wenn diese mit der Kontrollgruppe verglichen wird.

Tabelle 9

Antitumorwirkung von Ribonukleasehemmer gegenüber menschlichem Brusttumorzellstamm (MX-1) transplantiert in Nacktmäuse

Beispiel 8 (Antimetastatische Wirkung von Ribonukleasehemmer gegenüber Lewis- Lungentumorzellen)

Lewis-Lungentumorzellen wurden in die rechten Ohren von weiblichen BDFI-Mäusen (5 Wochen alt) intradermal verpflanzt, und der Ribonukleasehemmer wurde in einer Dosis von 10 bis 1000 ng/Maus kontinuierlich über 10 Tage vom ersten Tag nach der Verpflanzung der Tumore intraperitoneal verabreicht. Die Primärneste wurden am 14. Tag nach der Verpflanzung der Tumore chirurgisch entfernt. Danach wurden die Mäuse am 21. Tag getötet, und die Metastasen von Tumorzellen in der Lunge und den Brustkorb-Lymphknoten wurde durch Messung des metastatischen Gewichts der Lymphknoten und die Anzahl der lungenmetastasierten Knoten aufgeklärt. Zum Vergleich wurden ähnliche Experimente mit den bekannten karzinostatischen Mitteln 5-FU, Lentinan und Cortisonacetat durchgeführt, die in den angegebenen Dosen verabreicht wurden. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 11 dargestellt.

Bei der Verabreichung von Ribonukleasehemmer in einer Dosis von 10 bis 1000 ng/Maus wurde keine Unterdrückung der Tumorvermehrung am 14. Tag festgestellt und unter optimalen Verabreichungsbedingungen von 50 ng/Maus/Tag wurden 51,7% Unterdrückung von Lungenmetastasen und 56,0% Unterdrückung von Lymphknotenmetastasen beobachtet. Andererseits wurden bei Verabreichung von 5-FU (5 mg/kg/Tag, ip×10) 49,5% Unterdrückung von Lungenmetastasen festgestellt, aber die Metastasen in den Lungen nahmen bei Verabreichung von Cortisonacetat (50 mg/kg/Tag, ip×10) um das 2fache zu. Der Grund für diese Zunahme der Metastasen in den Lungen ist unklar, aber es besteht auch die Möglichkeit, daß die Zunahme von einer durch Cortisonacetat induzierten immunitätshemmenden Wirkung abhängt. Auch angesichts der Tatsache, daß überhaupt keine Unterdrückung von Lungenmetastasen bei Verabreichung von Lentinan festgestellt wurde, das ein sogenanntes immunstärkendes Mittel ist (1 mg/kg/Tag, ip×10), wird vermutet, daß die Unterdrückung der Lungen- und Lymphknotenmetastasen, die dem Ribonukleasehemmer zuzuschreiben ist, nicht ausschließlich vom Mechanismus der immunstärkenden Wirkung herrührt.

Claims

1. Antitumormittel, gekennzeichnet durch einen Ribonukleasehemmer als einen wirksamen Bestandteil.

2. Antitumormittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Behandlung von lymphozytärer Leukämie verwendet wird.

3. Antitumormittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Behandlung von Gehirntumor verwendet wird.

4. Antitumormittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Behandlung von Lungenkrebs verwendet wird.

5. Antitumormittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Behandlung von Brustkrebs verwendet wird.

6. Antitumormittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Behandlung von Leberkrebs verwendet wird.

7. Antitumormittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Behandlung von Magenkrebs und Dickdarmkrebs verwendet wird.

8. Antitumormittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Behandlung von Melanomzellen verwendet wird.

9. Antimetastatisches Mittel, gekennzeichnet durch einen Ribonukleasehemmer als einen wirksamen Bestandteil.

10. Antimetastatisches Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es verwendet wird, um Metastasen in den Lungen und Metastasen in den Lymphknoten zu unterdrücken.

11. Verfahren zur Behandlung von Krebs, dadurch gekennzeichnet, daß man einem menschlichen Körper eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Ribonukleasehemmers verabreicht.

12. Verfahren zur Behandlung von Krebs nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Ribonukleasehemmer dem menschlichen Körper in einer Menge von 0,25 bis 50 µg/kg verabreicht wird.

13. Verfahren zur Behandlung von Krebs nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es bei lymphozytärer Leukämie eingesetzt wird.

14. Verfahren zur Behandlung von Krebs nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Gehirntumor eingesetzt wird.

15. Verfahren zur Behandlung von Krebs nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Lungenkrebs eingesetzt wird.

16. Verfahren zur Behandlung von Krebs nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Brustkrebs eingesetzt wird.

17. Verfahren zur Behandlung von Krebs nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Leberkrebs eingesetzt wird.

18. Verfahren zur Behandlung von Krebs nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Magenkrebs und Dickdarmkrebs eingesetzt wird.

19. Verfahren zur Behandlung von Krebs nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Melanomzellen eingesetzt wird.

20. Verfahren zum Kontrollieren von Tumorzellmetastasen, dadurch gekennzeichnet, daß einem menschlichen Körper eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Ribonukleasehemmers verabreicht wird.

21. Verfahren zum Kontrollieren von Tumorzellmetastasen nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Ribonukleasehemmer dem menschlichen Körper in einer Menge von 2,5 bis 5 µg/kg verabreicht wird.

22. Verfahren zur Kontrolle von Tumorzellmetastasen nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Metastasen in der Lunge und Metastasen in den Lymphknoten eingesetzt wird.