HU197358B

HU197358B - Process for producing human antitumour substance and pharmaceuticals comprising same

Info

Publication number: HU197358B
Application number: HU842470A
Authority: HU
Inventors: J Lloyd Old; Y Berish Rubin; S Jay Prendergast; Elizabeth C Richards; D Barbara Williamson
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1983-06-27
Filing date: 1984-06-26
Publication date: 1989-03-28
Also published as: NO842572L; AU2933784A; GR82260B; FI842560A; KR850000528A; CA1265444A; ZA844377B; DD229713A5; NZ208648A; ES545258A0; ES8603949A1; DD241268A5; DK311984A; AU587959B2; JPS6036420A; DK311984D0; FI842560A0; DD241271A5; EP0131789A3; HUT34775A

Description

A találmány tárgya eljárás tisztított humán tumorellenes anyag (továbbiakban hTNF), valamint a fenti anyagot tartalmazó, humán tumorok kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására.

Több, mint egy évszázada fedezték fel, hogy bizonyos bakteriális fertőzések sorén a fertőzött emberben jelenlévő tumorok egyidejűleg visszafejlődnek in vivő. Ezzel a felfedezéssel kezdődött a tumor nekrózis faktornak (TNF) nevezett tumorellenes anyag kutatása. Coley és mások is több, mint 40 éven ét kezelték a humán rosszindulatú daganatokat bakteriális eredetű sejtmentes szűrletekkel vagy vegyes bakteriális vakcinákkal, gyakran pozitív eredménnyel.

Tengerimalacokkal és egerekkel is végeztek kísérleteket. A tumorellenes hatás a fenti kísérleti állatokban súlyos vérzéses reakciókban nyilvánul meg a tumor magjában, a bakteriális kezelést követő 4 órán belül. Ezt kővetően lassabb, nekrotizáló hatás figyelhető meg, amelynek intenzitása a következő 48 óra alatt növekszik. A tumor színe egyre erősebben sötétedik, ami elhalásra és vérzésre utal, és sok esetben a tumor teljes visszafejlődését eredményezi. A fenti meglepő vérzéses elhalást - amely bizonyos kísérletes tumorok esetén Gram-negativ baktériumokkal vagy azok sejtfalából származó lipopoliszacharid természetű endotoxinokkal idézhető elő - már régóta a fentebb említett klinikai megfigyelések kísérleti megfelelőjének tekintik.

A Sloan-Kettering Intézetben végzett kutatások azonban arra utalnak, hogy a bakteriális stimulálás hatására egy - feltehetően makrofág eredetű - anyag válik szabaddá, amely közvetlenül vagy közvetve maga felelős a tumoröló hatásért. Bizonyíték erre az a kísérlet, amelyben kimutatták, hogy a BCG-vel fertőzött, endotoxinnal injektált egerek széruma vérzéses nekrózist okoz transzplantált Meth A szarkoma sejteken és más tumorokon. Ugyanakkor a BCG-vel fertőzött egerek, vagy az endotoxinnal kezelt fertőzetlen egerek széruma hatástalan. Az endotoxin önmagában a legtöbb tumorsejtre nézve nem toxikus, in vitro kísérletekben. A hatásos szérum-komponenst nevezik tumor nekrózis faktornak (továbbiakban TNF-nek).

A TNF aktivitást nem lehet a maradék endotoxinnak tulajdonítani, amelyet az endotoxin-maradék meghatározása alkalmas pirogén hatás, Limulus teszt és kémiai analízis segítségével mértünk. A TNF - eltérően az endotoxintól - in vitro közvetlenül toxikus bizonyos tumorsejtekre; a normális eredetű, tenyésztett sejtek nem károsodnak [Lloyd J. Old: New Developments in Cancer Therapy, MSKCC Clinical Bulletin; 6, 118 (1976); E. A. Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3666-70 (1975)]. Egyéb rágcsálók - például patkányok és nyulak - is termelnek TNF-et, BCG- és endotoxin kezelés hatására. A TNF-et először elsődlegesen BCG-vel (Bacillus Calinette-Guérin) indukált, majd 2-3 hét múlva E. coliból származó endotoxinnal provokált egerek szérumában találták meg. Önmagában sem a BCG, vagy annak alább ismertetett megfelelői, sem az endotoxin hatására nem jelenik meg TNF az egérszévumban, mind a kettőnek jelenlétére szükség van. A BCG helyett a retikuloendoteliális rendszerben a BCG-hez hasonlóan erós makrofág vagy egyéb celluláris elem szaporodást kiváltó Corynebacterium granulosummal, Corynebaeterium parvummal, maláriával vagy Zymosan-nal (élesztő sejtfal) is indukálhatjuk a TNF felszabadulást egérben. Ezek a BCG megfelelői. A BCG és endotoxin kezelés utáni széruni a szokásostól eltérő annyiban, hogy nem alvad meg teljesen.

Egérben a TNF optimális termelését és annak vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük:

a) BCG: 2x10’ élő BCG-sejtet tartalmazó inokulummal érjük el a rétikuloendoteliális rendszer (RÉS) maximális stimulálását és a szövetszaporodást

b) endotoxin: 14-21 nap múlva, mikor a BCG-vel kiváltott RES-stimulálás a legnagyobb, 0,25-25 ug endotoxint (E. coliból származó lipopoliszacharidot adunk az egereknek, a legnagyobb TNF-szint a legnagyobb dózissal érhető el

c) T4F kinyerése: az optimális időpont 2 órával az endotoxin kezelés után van (későbbi időpontok kevésbé jók a sokk által kiváltott keringési elégtelenség mial t)

d) T4F vizsgálata:

1, In vivő

A TNF-pozitiv egérszérum nekrotizáló hatását (BALB/cxC57 BL/6)Fi hibridbé transzplantált BALB/c Meth A ascites sarcomén vizsgáljuk a következők szerint. Hét nappal a tumor szubkután transzplantálása után n vivő megvizsgáljuk a TNF-pozitiv szérűn hatását a transzplantátumra, a hatást vizuálisan értékeljük 24 órán át. Reakció először 3-4 óra elteltével észlelhető. 7 napos transzplantátumban a nekrotikus válaszreakció általában a beadott 0,1-0,5 ml TNF-pozitiv szérűn; térfogatának felel meg. A +++ erősségű reakció azt jelenti, hogy a tumor teljesen, vagy majdnem teljesen elpusztult, és a látszólag élő tumoros szövetből csak egy gyűrű marad vissza. A 6 napos transzplantátumok kevésbé érzékenyek, az 5 naposok egyáltalán nem reagálnak.

2) In vitro

A TNF-érzékeny L-M sejteket az American Type Culture Collection-tól származó klónozott egér 1.929 sejtekből nyertük. Az L-sejtek TNF-rezisztens sejtvonalát úgy állítottuk elő, hogy a TNF-érzékeny L-sejteket többször átoltottuk TNF-et tartalmazó táptalajba. A TNF a TNF-érzékeny L-sejtekre (L(S)] citotoxikus hatást fejt ki, míg a TNF3

-rezisztens L-sejtekkel [L>(R)1 szemben nem citotoxikus.

A vizsgálatot 24 lyukú Costar lemezen végezzük. A lyukakba 50 000 tripszinezett L-sejtet tartalmazó 0,5 ml Eagle-féle minimál táptalajt mérünk, majd 2-3 óra múlva a TNF-et sorozathigitásban tartalmazó táptalajból hozzámérűnk 0,5 ml-t. 48 óra elteltével fézis-mikroszkópos vagy tripán-kék festék kizárásos értékelés segítségével meghatározzuk az 50%-os sejtpusztulást okozó protein menynyiségét. Például egy standard sarzsra 1 egység részlegesen tisztított egér TNF 58 ng vagy 20 000 egység/mg specifikus aktivitású proteinnek felel meg. A fenti részlegesen tisztított egér TNF nem tartalmaz IFN-t. A tisztítás előtti eredeti szérumban még van kevés interferon (IFN).

A BCG helyett indukálószerként C. granulosumot C. parvumot, maláriát vagy Zymosan-t (élesztő sejtfal) is használhatunk. Green és munkatársai [J. Nat. Cancer Inst. 59, 1519 (1977)] szerint az egerekben az endotoxinnal szembeni maximális hiperszenzitivitás a C. parvum injektálása után hat nappal érhető el. Ennek megfelelően a fenti eljárás esetén az endotoxint 4 nappal a C. parvum beadása után adjuk az állatoknak. Az endotoxin dózisa 0,25 Mg, de a TNF felszabadításának fokozására 25 pg mennyiségben használjuk. A maximális TNF-felszabadulás 1 Mg endotoxin intravénás beinjektálása után 90 perccel figyelhető meg. A TNF-termelés különböző egértörzsek esetén különböző mértékű.

Jelenlegi ismereteink szerint a TNF in vivő felszabadítására a Gram-negatív baktériumokból - például E. coliból - származó endotoxinok a legalkalmasabbak [Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3666 (1975)].

A TNF hatása számos tumor (egér) rendszerben megfigyelhető, közelebbről az S-180 (CD-I Swiss), BP8 (C3H) szarkomákon; EL4 (C57B1/6), ASL1 (A törzs), RADA-1 (A törzs) és RL01 (BALB/c) leukémiákon; vagy P815 (DBA/2) masztocitomán. A Meth A erősen érzékeny a TNF-re abban az esetben, ha a tumort intradermálisan injektáltuk, mint azt a in vivő vizsgálatnál leírtuk. Kevésbé érzékenyek az alábbi tumorok: RCS5 (SJL) retikulum-sejt szarkoma rezisztensnek mutatkozott; a (C3H/An χ I) Fi emlőtumorok csak kis mértékben érzékenyek, és az AKR spontán leukémiák közepesen érzékenyek a TNF-fel szemben. Fentiek szerint az egér TNF egér-tumorokkal szembeni terápiás hatása nyilvánvaló [Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3666 (1975)].

In vitro a transzformált rágcsáló fibroblasztok (L-sejtek) szővettenyészetben sokkal érzékenyebbek voltak TNF-fel szemben, mint a Meth A szarkoma sejtek vagy az egérembrió fibroblasztok (MEF). Az élő sejtszámot 48 órás TNF-es kezelés után határoz4 zuk meg. A hatás citotoxikus és citosztatikus. de késleltetett, mivel az első 16 órában nem figyelhető meg. Az in vivő hatás Meth A sejten egy nekrotikus folyamat, amely a Meth A tumor középpontjából kiindulva kifelé terjed, és a látszólag változatlan tumorszövetből csak egy gyűrű marad vissza. A visszmaradt tumorszövetből a tumor· újra kifejlődhet. Optimális dózisú TNF-fel végzett kezelés hatására a kezelt állatok nagy százalékában teljes visszafejlődés észlelhető. Az in vitro vizsgálat alapját az L-sejtekkel végzett vizsgálatok képezik, mint azt fentebb leírtuk. Rezisztens L-sejtvonalat is kitenyésztettünk, oly módon, hogy a TNF-érzékeny L-sejteket többször átoltottuk TNF-et tartalmazó táptalajba. A TNF citotoxikus az érzékeny L-sejtekre [L(S)1, a rezisztens L-sejtekre [L(R)] azonban nem. A fenti vizsgálatokat is felhasználtuk a hTNF jellemzésére.

A vizsgálatokból közvetett módon arra következtethetünk, hogy a TNF egyik sejtforrását a makrofágok képezik egér és nyúl esetén, mivel a BCG - vagy annak megfelelői - és endotoxin hatására a máj- és lépmakrofágok erőteljes szaporodásnak indulnak.

Összegezve: 1) a TNF-felszabadulást indukáló szerek erőteljes makrofág-szaporodást okoznak; 2) a BCG-vel előkezelt egerekben röviddel az endotoxin beinjektálása után megfigyelhető a lép-makrofágok szelektív lizísű; 3) a TNF-et tartalmazó szérum lizoszomá'is eredetű enzim-tartalma magas, és az ak’.ivált makrofágok jellemző módon sok lizoszomát tartalmaznak.

A klónozott egér histiocitoma sejtvonalal· (J774 és PU5-1,8) TNF-et termelnek; ez a termelés endotoxin hatására jelentős mértékben fokozódik Mannel és munkatársai [Infect. Immun. 30, 523 (1980)] és Williamson és munkatársai nem publikált megfigyelése szerint.

Az egér TNF, szérumból izolált formájában egy glikoprotein, amelynek legalább két, egy 40-60 000 és egy 150 000 molekulatömegű formája van [Mannel és munkatársai: Infect. Immun. 28, 204 (1980); Kuli és munkatársai: J. Immunoi. 126, 1279 (1981); Haranaka K. és munkatársai: Jpn J. Exp. Med. 51, 191 (1981); Green S. és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 381 (1976), és nem publikált eredmények]. A TNP fagyasztott állapotban, előnyösen -70 °C alatt stabil. Aktivitását 70 °C-on 30 perc alatt elveszti. Nyulakban 5-500 Mg/kg dózistartományban pirogén (lázkdtő) hatást fejt ki, 5 Mg/kg dózisban nem ló '.keltő. A nyúl TNF molekulatömegé irodalmi adatok szerint 39 000 és 68 000 közötti tartományban van [Ruff M.R. és munkatársai: J. In munol. 125, 1671 (1980); Matthews N. és munkatársai: Br. J. Cancer 42, 416 (1980); Matthews N. és munkatársai: Brit. J. Cancer 38, 302 (1978); Ostrove J.M. és munkatársai: Proc. Soc. Exp. Biok Med. 160, 354 (1979)].

Humán nekrózis faktor előállítását ismertetik az INCI J. Natl. Cancer Inst. 68(6)), 997-1003 (1982), a C.R. Searches Soc. Bioi. Ser. Fii. 177(4)), 570-573 (1983) irodalmi helyeken és a 3 227 262 számú német szövetségi köztársaság beli szabadalmi leírásban. A fenti helyeken ismertetett hTNF tulajdonságai azonban eltérnek a találmány szerinti eljárással előállított hTNF-étől.

A találmány tárgya tehát eljárás a humán TNF (hTNF) előállítására és tisztítására. Az eljárás a klinikai vizsgálatokban igen hasznos lehet. Több, mint 30 humán sejtvonalat vizsgáltunk szövettenyészetben, TNF-termelő képességük szempontjából. Megállapítottuk, hogy a forbol-12-mirisztát-13-acetát (PMA) jelenléte szükséges a hTNF termelés fokozásához. A PMA mint tumort elősegítő szer ismert. Jelenlegi ismereteink szerint a B-sejtvonalak, PMA-val vagy anélkül a legígéretesebb források a hTNF előállítására. A hTNF-et a fentebb ismertetett standard TNF-vizsgálati módszerekkel - azaz a tumoröló hatást az in vivő, az L-sejtekkel szembeni citosztatikus/citotoxikus hatást in vitro módszerrel - vizsgáltuk. A T-sejtek, monociták, és promyelocita sejtvonalak csak kevés TNF-et termelnek, vagy egyáltalán nem termelnek TNF-et. A találmány szerinti eljárásban sem külső eredetű BCG, sem külső eredetű endotoxin nem szükséges a hTNF előállítására. Meglepő módon a hTNF-et rekombináns vagy természetes eredetű hIFN-nel együtt alkalmazva humán tumorsejtek elpusztítására vagy gátlására, szinergetikus tumorellenes hatást tapasztaltunk. A hIFN vagy hTNF önmagában alkalmazva is tumorellenes hatást mutat, de a hTNF hatása hIFN-nel együtt alkalmazva nagyobb, mint a fenti hatóanyagok külön-külön mért tumorellenes hatásának összege.

A találmány értelmében hTNF forrásként humán sejtvonalakat használhatunk. Az egér TNF előállítási eljárása nagy mértékben függ a BCG és az endotoxin hatásától. A találmány szerinti eljárásban a humán TNF-et humán B-sejtek termelik, BCG vagy endotoxin hozzáadása nélkül. így az előállított TNF lényegében endotoxintól, valamint bakteriális és szérum szennyeződésektől mentes. Mint az 1. táblázatban látható, a vizsgált vérképző sejtek közül a B-sejtek a legjobb TNF-termelők. Az exogén BCG vagy exogén endotoxin nélküli nagymértékű TNF-termelés igen meglepő. Kis mennyiségű, vagy nyomnyi hTNF a T-sejtek, monociták vagy pro-inyelociták sejttenyészetének felűlúszójában is található. In vitro L-sejt vizsgálattal (Carswell és munkatársai fentebb idézett cikke) meghatározták a humán eredetű sejtek által termelt TNF mennyiségét. Azonban először sikerült a találmány szerinti eljárással magas TNF-sziritet úgy előállítani, hogy a TNF minden exogén endotoxin szennyeződéstől mentes, mivel a tenyészethez - mint azt később ismertetjük egyáltalán nem adunk endotoxint. Mások korábbi kísérleteikben egér TNF esetén az endotoxin jelenlétét zavarónak találták, mivel a rendszert nehéz az endotoxintól mentesíteni.

Az EBV-transzformált B-sejtvonalak raelanómás betegektől származnak [Houghton és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77, 4260 (1980)]. A többi sejtvonalat a Sloan-Kettering Institute-tól, dr. Lloyd Old, dr. Jorgen E. Fogh és dr. Peter Ralph sejtbank-gyűjteményéből kaptuk. A LuklI sejteket dr. W, Stewart [Pickering és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77, 5938 (1980)] bocsátotta rendelkezésünkre.

A vérképző humán sejtek TNF-termelésének vizsgálatára milliliterenként 5xl0⁵ sejtet tenyésztünk 8% magzati borjúszérumot (FCS) tartalmazó RPMI 1640 táptalajban, 10 ng/ml PMA (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) jelenlétében, vagy anélkül. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. A

2. táblázatban ismertetjük az RPMI 1640 táptalaj összetételét. A sejteket 48 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd centrifugálássaí összegyűjtjük, és PMA nélküli RPMI 1640 táptalajban újraszuszpendáljuk, 1x10® sejt/ml koncentrációban. 48 óra múlva a sejttenyészeteket lecentrifugaljuk. A sejtmentes felülúszókí.t -20 °C-ra hűtjük. A TNF-aktivitást a fenti felülúszókban határozzuk meg, feles hígítás jtán, L-sejtes vizsgálati módszerrel.

Az in vitro vizsgálatban használt NCTC 929 klón (L)-sejtvonalból származó egér L-M sejteket az American Type Culture Collection-tól szereztünk be, és Eagle-féle minimál táptalajon (MÉM) (GIBCO, Grand Island, N.Y. USA) tenyésztettük, amelyet nem-esszenciális aminosavakkal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 g/ml streptomicinnel és 8% hővel inaktivált magzati borjúszérummal egészítettünk ki. A tenyésztést 37 °C-on végeztük. Az egér TNF-rezisztens L-sejtvonalat (L(R)] szenzitív L-sejtekből [L(S1] tenyésztettük ki, egér TNF-et tartalmazó táptalajba történő többszöri átoltással. A hTNF-aktivitás vizsgálatot úgy végezzük, hogy a vizsgáló lemez (24 lyukú Costar lemez) lyukaiba 0,5 ml táptalajban 50 000 tripszinezett L-sejtet mérünk, majd 3 óra múlva hozzámérünk azonos térfogatban (0,5 ml) olyan táptalajt, amely a TNF-et sorozathigításos koncentrációban tartalmazza, és meghatározzuk 48 óra elteltével fázis-mikroszkópos vagy tripán-kék kizárásos módszerrel azt a protein-mennyiséget, amely 50%-ot sejtpusztulást okoz.

kint az 1. táblázat adataiból látható, a humán B-sejtek által termelt hTNF az egér L(S) sejtekre citot.oxikus hatást fejt ki, mig az egt r L(R) sejtekkel szemben nem citotoxikus a fentebb ismertetett standard egér TNF vizsgálatban. A hTNF szempontjából vizsgált sejteket vagy tumor növekedést serkentő szer jelenlétében, vagy anélkül tenyészthetjük. A PMA például a B-sejtek hTNF-termelését többszörösére növeli, az 1. táblázat L(S) 5 oszlopában található adatok szerint (lásd PMA nélkül/PMA jelenlétében oszlop). A PMA TPA néven is ismert.

Az L(929) (ATCC) sejtvonalból származó, hTNF-fel szemben rezisztenssé tett tenyésztett egér L-M sejtek - melyeket 10® sejtre számolva 2-3 Mg HTNF-et tartalmazó táptalajba hetenként megismételt átoltással tenyésztettünk ki - teljes kereszt-rezisztenciát mutatnak az egér TNF-re. Ez a kereszt-rezisztencia nagyon figyelemreméltó.

A hTNF in vivő vizsgálatát [BALB/Lcx xC57BL/6]Fi nőstény egéren végeztük. Az állatoknak intradermálisan 5xl0⁵ Meth A szarkoma sejtet inkubáltunk, majd 7 nappal később az állatok egyetlen intravénás adagban hTNF-et kaptak. 24 óra elteltével a tumoi· vérzéses elhalását az alábbi értékelési rendszer segítségével értékeltük ki:

(-) nincs hatás (+) enyhe hatás (++) közepes hatás (+++) erős hatás, a tumor felület 90%-ára kiterjedő hatás (Carswell és munkatársai fentebb idézett cikke).

Az eredmények szerint a hTNF a standard TNF vizsgálatban in vitro és in vivő hasonló hatást mutat, noha általában a hTNF humán célsejtekkel szembeni specifikus aktivitása nagyobb, mint az egérből származó TNF-é.

Az endotoxin meghatározását Limulus Amebocyte lizátummal (Microbiological Associates) végeztük.

Mivel a klónozott egér histiocita sejtvonalak TNF-et termelnek, a normál és kóros humán histiociták vizsgálatát is célszerű elvi gezni, a fenti sejtek hTNF termelésének meghatározása céljából, emberben. Az 1. táblázatban a B-sejtekkel kapott eredményekből ai ra következtethetünk, hogy a normál B-sejteknek is van hTNF-termeló képessége.

-510

1. táblázat: Vérképző humán sejtvonalak hTNF-termelő képességének vizsgálata

Sejtvonal	Élő L-sejtek (%) in vitro
L(S)	(LR)
PMA nélkül	PMA jelen- létében	PMA nélkül/ PMA jelenlétében	PMA nélkül	PMA jelen- létében
B-sejtek
BE*	47	20	2.3	100	100
BI*	57	43	1.3	100	98
CL*	95	37	2.E	100	97
CW*	28	8	3.5	100	100
DE*	45	18	2.5	100	100
DM*	18	11	l.f	100	100
DS*	88	38	2.3	100	100
EJ*	27	16	1.7	100	100
EL*	70	16	4.4	100	100
EQ*	15	11	1.4	100	100
ER*	47	22	2.1	100	100
FC*	19	8	2.4	100	100
FD*	44	16	2.8	97	100
FG*	80	30	2.7	100	97
ARH-77	68	12	5.7	100	100
DAUDI	97	97	-	N.T.	N.T.
LuklI	20	13	1.5	100	100
RPMI 1788	78	35	2.2	100	100
RPMI 8226	96	84	1.1	100	86
RPMI 8866	32	10	3.2	100	98
SK-LY-16	98	100	-	100	100
SK-LY-18	99	100	-	100	98
ARA-10	77	39	2.0	100	97
BALL-1	100	100	-	100	100
T-sejtek
CCRF-CEM	100	100	-	100	100
P-12	95	94	-	99	98
MOLT-4	100	100	-	99	96
T-45	100	100	-	100	100
HPB-ALL	100	97	-	100	100
TALL-1	96	94	-	96	96
Monociták
Jlll	100	100	-	99	98
THP	96	80	-	99	98
U-937	100	100	-	99	99
Promyelociták
HL-60	96	97		99	98

perifériás vérből származó EBV-transzformált sejtvonalak

-612

2. táblázat: RPMI 1640 folyékony táptalaj összetétele (IX)

összetevők	Koncentráció (mg/1)
Szervetlen sók
Ca(NO3)2.4H2O	100.00
KC1	400.00
MgS04.7H20	100.00
NaCl	6000.00
NaHCO3	2000.00
Na2HPÖ4.7H2O	1512.00
Egyéb komponensek
D-glükóz	2000.00
glutation (redukált)	1.00
Aminosavak
L-arginin (szabad bázis)	200.00
L-aszparagin	50.00
L-aszparaginsav	20.00
L-cisztin	50.00
L-glutaminsav	20.00
L-glutamin	300.00
glicin	10.00
L-hisztidin (szabad bázis)	15.00
L-hidroxi-prolin	20.00
L-izoleucin (allo-mentes)	50.00
L-leucin (metionin-mentes)	50.00
L-lizin.HCl	40.00
L-metionin	15.00
L-fenilalanin	15.00
L-prolin (L-hidroxi-
-prolin-mentes)	20.00
L-szerin	30.00
L-treonin (allo-mentes)	20.00
L-triptofán	5.00
L-tirozin	20.00
L-valin	20.00
Vitaminok
biotin	0.20
D-kalcium-pantotenát	0.25
kolin-klorid	3.00
folsav	1.00
i-inozitol	35.00
nikotinamid	1.00
p-amino-benzoesav	1.00
piridoxin.HCl	1.00
riboflavin	0.20
tiamin-HCl	1.00
B12-vitamin	0.005

A találmányt közelebbről az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni.

1. példa hTNF előállítása és koncentrálása Lukll sejtekből

5% FCS-t és 10 ng/ml PMA-t tartalmazó RPMI 1640 táptalajban ml-enként 5xl0⁵ Lukll sejtet szuszpendálunk, és a tenyészetet °C-on 48 órán át inkubáljuk. Ezután a sejteket centrifugálással összegyűjtjük, és 8-10xl0⁵ sejt/ml koncentrációban szérum-mentes, 2 nmól/1 etanol-amint tartalmazó R-ITS PREMIX-ben [5 ng/ml inzulin, 5 ng/ml transzferrin, 5 ng/ml szelén szérum-pótló (Collaborative Research, Waltham Mass)] újrasz.iszpendáljuk és további 48 órán át inkubáljuk. A felülúszókat centrifugálással sejtmentesitjük, és -20 °C-on megfagyasztjuk. Az Lukll sejtek felülúszóját PM10 membránnal ellátott kevert Amicon cellában koncentráljuk, majd 40x2,6 cm-es, 0,15 mól/l nátriun.-kloridot tartalmazó 0,05 mól/l-es Tris-pufferoldattal (pH 7,3) ekvilibrált DEAE-Sephadex A-50 töltetű oszlopra visszük, 5 C-on. A fenti összetételű pufferoldattal 5 ml-es frakciókat eluálunk. A kezdeti átfolyó frakciókban meghatározzuk a TNF-aktivitást, majd a csúcs-frakciókat összegyűjtjük. A fenti eljárással a specifikus aktivitást 25-szörősére növeljük (2-5xl0⁴ egység/mg protein). Az in vitro L-sejt vizsgálattal meghatározott hTNF-aktiv frakciókat összegyűjtjük és Amicon cellában koncentráljuk.

Az összegyűjtött frakciókban a hTNF specifikus aktivitása közelítőleg lxlO³ és lxLO⁴ közötti tartományba esik abban az esetben, ha a sejteket magzati borjúszérummsl (FCS) kiegészített táptalajban tenyésztettük. Az összegyűjtött frakciókban a hTNF specifikus aktivitása közelítőleg 2xl0⁴ és 5xl0⁴ pg közötti tartományban van abban az esetben, ha a sejteket szérum-mentes táptalajban tenyésztettük.

A DEAE-oszlopon frakcionált hTNF intravénásán injektálva a fentebb ismertetett in vi’⁷o vizsgálatban Meth A tumorokon vérzéses nekrózist okozott. 300 pg hTNF 5 egér közül l-ben +++ erősségű nekrózist váltott ki, míg a fennmaradó 4 állat esetén a nekrózis ++ erősségű volt. 150 pg hTNF 7 egér közül 5 állatban ++ erősségű, 2 állatban + erősségű nekrózist okozott. 75 pg hTNF 5 állat közül 1 állatban ++ erősségű, 4 állatban + erősségű nekrózist okozott. A kontroll csoportban 3 állat közül egynél sem találtunk nekrózist, a kontroll állatoknak azonos mennyiségű, DEAE-oszlopon frakcionált RPMI 1640 táptalajt injektáltunk. A fentiek értelmében a hTNF mind az in vitro, mind az in vivő TNF meghatározásra szolgáló vizsgálatban aktívnak bizonyult.

A hTNF molekulatömege - akái· FCS-t tartalmazó, akár FCS nélküli táptalajon nyertük - közelítőleg 70 000 dalton, Sephacryl S-200 oszlopon végzett meghatározás szerint. 12 órát meghaladó savas vagy lúgos kezelés hu'ására a hTNF aktivitása csökken, például pH 2,0-nél az aktivitás 90%-a, pH 4,0-riél 55%-a, pH 10-nél közel 45%-a megsemmisül. Hő stabilitását tekintve a hTNF aktivitása 70 °C-on 60 perces kezelés hatására megsemmisül, mig 56 °C-on 60 perces kezelés után megmarad. Az aktivitás még huzamos ideig

-714 tartó -78 °C-os vagy -20 °C-os raktározás után is megmarad.

A PMA-val serkentett LuklI sejtek frakcionálatlan felülüszójában 100 egység/ml IFN-aktivitást találtunk. A DEAE-kromatográfiás 5 eljárással tisztított hTNF összegyűjtött frakcióiban nem találtunk interferon-aktivitást, sem a használt tisztított egér TNF-ben. A humán interferon aktivitást a hólyagos stomatis vírus WISH vagy GM 2767 sejtek elleni 10 hatásának gátlásával mértük [Stewart W.E. II: The Interferon System, 1979 (Springer, Vienna)], és a rekombináns humán alfa-IFN (Hoffman-La Roche) esetén nemzetközi standarddal, humán természetes gamma-IFN ese- 15 tén pedig laboratóriumi standarddal hasonlítottuk össze. A 2-4xl0⁸ egység/mg protein aktivitású rekombináns alfa-hIFN-t a Hoffman-La Roche-tól kaptuk, a leukocita eredetű természetes alfa-hIFN-t (aktivitása 0,64x10® 20 egység/mg protein) a Kocher Laboratory (Bern, Svájc) állította elő, a Sloan-Kettering Institute értékelési programja keretében, az 1x10’ egység/mg protein specifikus aktivitású természetes béta-hIFN-t a Roswell Park 25 Memóriái Institute-tól (RPMI) kaptuk, míg az lxlO⁷ egység/mg protein specifikus aktivitású leukocita eredetű természetes gamma-hIFN dr. Berish Rubin-tói (Sloan-Kettering Institute) származott. Sem az egér, sem a humán 30 TNF nem rendelkezett részlegesen tisztított állapotban kimutatható mértékű IFN-aktivitással. A különféle humán interferonok sem rendelkeztek kimutatható hTNF-aktivitással, mivel a fentebb ismertetett in vitro vizsga- 35 latban nem mutattak citotoxikus vagy citosztatikus hatást érzékeny L-sejtekkel szemben.

Mint a 3. táblázat adataiból látható, az előállított hTNF különböző sejtekkel szemben 40 különböző hatást fejt ki. Citotoxikus hatásról akkor beszélünk, ha az élő sejtszám 7 nap múlva 35%-kal, vagy annál nagyobb mértékben csökken, míg citosztatikus hatás esetén a sejtszám csökkenése 7 nap múlva 35%, 45 vagy annál nagyobb. Ebben a vizsgálatban - és a leírásban ismertetett többi vizsgálatban is - a fentebb leirt módon LuklI sejtekkel termelt hTNF-et használunk. Az adott példákkal azonban csak ismertetni kívánjuk a találmány szerinti megoldást, nem korlátozni. Más B-sejt vonalakból származó hTNF, vagy más humán sejtekből előállított TNF is használható in vivő és in vitro a különféle humf'n sejtekkel végzett vizsgálatokban.

A 3. és 4. táblázatban közölt adatokból látható, hogy a hTNF az egér TNF-hez hasonló hatást fejt ki a humán emlő-sejtvonalakra, mivel mindkettő citotoxikus hatású a vizsgált emlőrák eredetű sejtvonalak többségére- A tüdő és malanoma-sejtekre is hat a hTNF, a hatás azonban főleg citosztatikus. A vizsgált négy normál sejtvonal - tüdő-, vese-, magzati tüdő- és magzati bör-sejtvonal - közül egy sem volt érzékeny a hTNF-fel szemben. Ennek alapján úgy

3. táblázat: hTNF hatása humán sejtvonalakra

Citotoxikus hatás:

SK-MG-4 (astrocitoma) MCF-7 (emlőrák)

BT-20 (emlőrák)

SK-BR-3 (nyakrák) SK-CO-1 (vastagbél-rák) RPMI 7931 (melanóma)

Citosztatikus hatás:

SK-LU-1 (tüdőrák)

RPMI 4445 (melanóma) SK-MEL-29 (melanóma) SK-MEL-109 (melanóma) SK-OV-3 (petefészek-rák)

Hatástalan:

T-24 (hólyagrák)

5637 (hólyagrák) MDA-MB-361 (emlőrák)

S-48 (vastagbél-rák) SK-LC-4 (tüdőrák)

SK-LC-6 (tüdőrák) SK-LC-12 (tüdőrák)

SK-MEL-19 (melanóma) SK-UT-1 (méhrák)

SAOS-2 (ösztrogén szarkoma) U20S (ösztrogén szarkoma)

WI-38 (normál magzati tüdő) MY (normál vese-hám) F-136-35-56 (normál magzati tüdő)

F-136-35-56 (normál magzati bőr)

-816

4. táblázat: hTNF hatása négy humán tumor sejtvonalra (a hTNF-hez a 0. napon 5xl0⁴ sejtet mérünk)

Sejtvonal	hTNF mennyisége	3. nap	5. nap	7. nap
pg protein/ tenyészet	TNF- -egység	élő sejt (%)	sejt- szám xlO⁵	élő sejt (%)	sejt- szám xlO⁵	élő sejt (%)	sejt- szám xlO⁵
BT-20	48.0	1263	24	1.03	16	1.55	5	1.45
(emlő)	19.2	505	30	1.08	19	1.43	7	1.38
(cito-	9.6	253	45	1.05	21	1.53	10	1.30
toxikus)	4.8	126	49	1.03	30	1.60	18	1.23
	1.2	32	50	1.05	53	1.80	61	2.43
	Kontroll	0	93	0.99	94	2.23	96	3.39
ME-180	24.5	645	83	1.78	52	2.70	49	6.33
(nyak)	9.8	258	83	1.73	57	2.83	49	7.38
(cito-	4.9	129	80	1.75	70	3.48	58	8.03
toxikus)	2.45	63	81	1.73	76	4.00	63	8.23
	Kontroll	0	98	1.62	97	4.48	97	1.01
SK-MEL-109	24.5	645	91	0.80	86	1.63	72	1.68
(melanoma)	9.8	258	96	1.15	90	1.93	91	2.68
(citoszta-	4.9	129	94	1.35	93	2.13	90	2.93
tikus)	2.45	63	94	1.25	93	2.10	92	3.13
	Kontroll	0	98	2.19	98	3.89	99	9.78
T-24	48.0	1263	95	2.38	98	4.60	99	7.75
(hólyag)	19.2	505	96	2.83	97	4.55	98	8.58
(hatástalan)	9.6	253	97	2.78	98	4.65	98	8.33
	4.8	126	98	3.25	99	4.55	98	8.33
	Kontroll .	0	100	3.23	98	4.53	99	8.38

tűnik, hogy a hTNF csak tumoros humán sejteken fejti ki citotoxikus, citosztatikus vagy vérzéses nekrózist okozó hatását. A hTNF humán célsejtekkel szembeni specifikus akti- 40 vitása nagyobb, mint az égéi' TNF-é.

A hTNF különféle humán sejtvonalakra kifejtett hatását az alábbi eljárás szerint határozhatjuk meg.

A sejteket tripszinezzük, kétszer öblítjük, és 45 8% FCS-t tartalmazó táptalajban 4-5xl0⁴sejt/lyuk koncentrációban 24 lyukú Costar lemezre visszük, majd 37 °C-on inkubáljuk. 16-24 órán át tartó inkubálás után a táptalajt leszivatjuk, és a sejtekhez 1 ml-es higí- 50 tásban DEAE-frakcionélt hTNF-et mérünk. Az összes sejtszámot - azaz az élő és elpusztult sejtek számát - a 3., 5. és 7. napon fázis-mikroszkópos eljárással határozzuk meg.

A tenyészeteket az 5. napon a hTNF-et azo- 55 nos koncentrációban tartalmazó friss táptalajjal töltjük fel. A fenti eljárással kaptuk a 3-4. táblázatban ismertetett eredményeket.

A fentiek értelmében a hTNF humán tumorok és rákos rendellenességek kezelésére 60 használható. Maximális gyógyhatás elérésére a rákos betegeket nyilvánvalóan vagy a TNF termelésre kell serkenteni, vagy a fenti anyaggal kell kezelni, vagy a teljesebb hatás elérése céljából a két módszert váltogatni 65 10 leli, illetve különböző, meghatározott sorrendet kell betartani. A hTNF mint az immunrendszer biológiai válaszát módosító anyag működik.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás közelítőleg 70 000 g/mól relatív móltömegű, pH 6 és pH 8 közötti tartományban stabil, egér L-sejtekkel végzett in vitro meghatározás szerint 2-5xl0⁴ egység//mg protein specifikus aktivitású, -78 °C és -20 °C közötti hőmérséklettartományban steril, 56 °C-on 60 percen át stabil, tisztított TTNF-előállitására, azzal jellemezve, hogy ( ) humán B-sejteket szövettenyésztő tápközegben inkubálunk, ( i) a humán B-sejt-tenyészet felülúszóját elválasztjuk a humán B-sejtektöl, ( ii) a felülúszót frakcionáljuk, ( v) a hTNF-et tartalmazó frakciókat azonosítjuk és összegyűjtjük, és kívánt esetben (v) koncentráljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben az inkubálást 0-8% magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban végezzük.

-918
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben az inkubálást közelítőleg 48 órán át 37 °C-on végezzük.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (ii) lépésben az elválasztást centrifugálással végezzük.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán B-sejtként BE, BI, CL; CW, DE, DM, DS, EJ, EL, EQ, ER, FC, FD, FG, ARH-77, DAUDI, LuklI, RPMI 1788, RPMI 8226, RPMI 8866 vagy ARA-10 sejtvonalat használunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben a sejteket forbol-12-mirisztát-134-acetát jelenlétében tenyésztjük.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a forbol-12-mirisztát-13-acetátot 10 ng/ml koncentrációban használjuk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben közelítőleg 5xl0⁵ sejt/ml kiindulási koncentrációt alkalmazunk.
9. Az 1. vagy 6. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépés szerinti inkubálás és az (ii) lépés szerinti elválasztás után a sejteket 2 nmól/1 etanol-amint tartalmazó szérum-mentes R-ITS PREΜΙΧ-ben szuszpendáljuk újra, majd ismét inkubáljuk, a sejtmentes felülúszót összegyűjtjük és koncentráljuk, a koncentrált felülúszót pufferoldattal ekvilibrált elválasztó oszlopra vieszük, és az oszlopról kapott hTNF-aktiv frakciókat összegyűjtjük és koncent5 réljuk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket 8-10xl0⁵ sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk újra.
11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal 10 jellemezve, hogy a sejtmentes felülúszó és a hTNF-aktív frakciók koncentrálását PM10 membránnal ellátott kevert Amicon cellában végezzük.

2. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal 15 jellemezve, hogy elválasztó oszlopként DEAE Sephadex Α-50-nel töltött oszlopot használunk.
13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 40x2,6 cm méretű DEAE

20 Sephadex A-50 oszlopot használunk.
14. A 9. igénypont szerinti eljárés, azzal jellemezve, hogy pufferoldatként 0,15 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 mól/1 koncentrációjú Tris-puffert (pH 7,3) használunk.

25 15. Eljárás gyógyászati készítmény elóállitá iára, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hTNF-et a gyógyszerkészitésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal

30 összekeverjük és gyógyászati készítménnyé formáljuk.