JPS6036420A - ヒトのがん細胞に対するヒト腫瘍壊死因子およびヒト・インタ−フエロンの作用および方法 - Google Patents
ヒトのがん細胞に対するヒト腫瘍壊死因子およびヒト・インタ−フエロンの作用および方法Info
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61K38/21—Interferons [IFN]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
背 景
TNF
腫瘍壊死因子(TNF)の歴史は、1世紀以上前に、ヒ
トがある種の細菌感染を受けた際に、in vlvo
に存在するいくつかのヒト腫瘍も同゛ 時に退行するこ
とを発見した時点からはじtR040年間以上にわたり
、Ool@yその他の人は細菌細胞を含まない消液また
は混合細菌ワクチンによってヒトの悪性腫瘍を処置し、
しばしば良好な成績を得た。
トがある種の細菌感染を受けた際に、in vlvo
に存在するいくつかのヒト腫瘍も同゛ 時に退行するこ
とを発見した時点からはじtR040年間以上にわたり
、Ool@yその他の人は細菌細胞を含まない消液また
は混合細菌ワクチンによってヒトの悪性腫瘍を処置し、
しばしば良好な成績を得た。
研究は、モルモットおよびマウスで同じように実施され
た。実験動物における抗腫瘍効果は、被験体すなわち動
物に細菌を投与してから4時間以内に現れる腫瘍の中心
における激しい出血性反応として認められる。それに続
いて比較的遅い壊死形成効果が生じるが、それはその後
48時間はその程度が次第に激しくなる。腫瘍塊は色が
次第に黒ずみ、壊死と出血の存在を示し、多くの場合に
腫瘍は完全に退行する。ある種の実験的1114Nにお
いてグラム陰性細菌によるか、あるいはその細胞壁から
誘導された内毒素(リポIリサツカライド)によって誘
発されるこの顕著な出血性壊死は、長いあいだ前述の臨
床的観察に対応する実験的事実であると考えられていた
。
た。実験動物における抗腫瘍効果は、被験体すなわち動
物に細菌を投与してから4時間以内に現れる腫瘍の中心
における激しい出血性反応として認められる。それに続
いて比較的遅い壊死形成効果が生じるが、それはその後
48時間はその程度が次第に激しくなる。腫瘍塊は色が
次第に黒ずみ、壊死と出血の存在を示し、多くの場合に
腫瘍は完全に退行する。ある種の実験的1114Nにお
いてグラム陰性細菌によるか、あるいはその細胞壁から
誘導された内毒素(リポIリサツカライド)によって誘
発されるこの顕著な出血性壊死は、長いあいだ前述の臨
床的観察に対応する実験的事実であると考えられていた
。
しかしながら、5lon −Ketterlng (研
究所)における研究によって次のように結論されるに到
った。すなわち細菌の刺激によって、おそらく大食細胞
に由来するとみられるある種の因子が遊離され、こめ因
子自体が直接または間接に腫瘍細胞を殺す能力を持って
いるとされた。この結論は、内毒素(ニドキシン)′f
:注射されたBOG感染マウスの血清によって、M@t
h A移植肉腫やその他の腫瘍に出血性壊死が生じると
いう研究成績によって証明された。BOGを注射された
マウスの血清あるいは内毒素を投与された正常なマウス
の血清には効果はない。内毒素自体は、11 vltr
oではほとんどの腫瘍細胞に対し母性を示さない。仁の
活性のある血清成分は腫m壊死因子(TNF)と呼ばれ
ている。
究所)における研究によって次のように結論されるに到
った。すなわち細菌の刺激によって、おそらく大食細胞
に由来するとみられるある種の因子が遊離され、こめ因
子自体が直接または間接に腫瘍細胞を殺す能力を持って
いるとされた。この結論は、内毒素(ニドキシン)′f
:注射されたBOG感染マウスの血清によって、M@t
h A移植肉腫やその他の腫瘍に出血性壊死が生じると
いう研究成績によって証明された。BOGを注射された
マウスの血清あるいは内毒素を投与された正常なマウス
の血清には効果はない。内毒素自体は、11 vltr
oではほとんどの腫瘍細胞に対し母性を示さない。仁の
活性のある血清成分は腫m壊死因子(TNF)と呼ばれ
ている。
TNFの活性は、発熱性、Limulus (カブトガ
ニ)テスト(パイロジエンの試論法)、内毒素部分に対
する化学分析などによって測定されるTNF中に残存す
る内毒素によるものではありえない。内毒素とはことな
、り、TNFはjnvitroである種の腫瘍細胞に対
して直接の細胞毒性をもっているが、正常な出発材料か
ら培養された細胞はそれによって損傷を受けることはな
い[Lloyd J、 01d+ N@w Devel
opm@nt 1nOancer Therapy+
MSK’ 00 011nlcalBulletin
6211B (1976)、 E、A、0arsvel
lら、Proc、 Nat ’ 1. Acad、 8
ei、 USA 723666〜705ept 1!1
175)。その他の罰歯動物、すなわちラットやウサギ
なども、内毒素とともにB OGを投与されると、同じ
ようにTNFを産生ずる。TNFは、Bacillus
Oalmette −Guerin (B OG )
によって初めて抗原刺激を受け、2〜3週間後に大腸菌
からの内毒素によって誘発刺激されたマウスの血清のな
かにはじめて発見された。BOGないしそれと同等のも
の(下記)も、あるいは内毒素単独でも、マウスの血i
’7のなかにTNF因子を産生させず、この両者が存在
することがその産生に必要である。大食細胞や細網内皮
系のその他の細胞要素の顕著な過形成を、BOGと同じ
ように誘発するClgranu” 1101u + O
−Parvum * マラリア(原虫)またはザイモサ
ン(酵母細胞壁)なども、TNFを遊離させるためにマ
ウスを抗原*Jaする場合にBCGの代用とな9うる。
ニ)テスト(パイロジエンの試論法)、内毒素部分に対
する化学分析などによって測定されるTNF中に残存す
る内毒素によるものではありえない。内毒素とはことな
、り、TNFはjnvitroである種の腫瘍細胞に対
して直接の細胞毒性をもっているが、正常な出発材料か
ら培養された細胞はそれによって損傷を受けることはな
い[Lloyd J、 01d+ N@w Devel
opm@nt 1nOancer Therapy+
MSK’ 00 011nlcalBulletin
6211B (1976)、 E、A、0arsvel
lら、Proc、 Nat ’ 1. Acad、 8
ei、 USA 723666〜705ept 1!1
175)。その他の罰歯動物、すなわちラットやウサギ
なども、内毒素とともにB OGを投与されると、同じ
ようにTNFを産生ずる。TNFは、Bacillus
Oalmette −Guerin (B OG )
によって初めて抗原刺激を受け、2〜3週間後に大腸菌
からの内毒素によって誘発刺激されたマウスの血清のな
かにはじめて発見された。BOGないしそれと同等のも
の(下記)も、あるいは内毒素単独でも、マウスの血i
’7のなかにTNF因子を産生させず、この両者が存在
することがその産生に必要である。大食細胞や細網内皮
系のその他の細胞要素の顕著な過形成を、BOGと同じ
ように誘発するClgranu” 1101u + O
−Parvum * マラリア(原虫)またはザイモサ
ン(酵母細胞壁)なども、TNFを遊離させるためにマ
ウスを抗原*Jaする場合にBCGの代用とな9うる。
これらの因子はBOGと同等のものである。BOGおよ
び内協素処置のあとで調製された血清は、完全に凝塊を
形成しない点で非定型的である。マウスにおけるTNF
の最適産生条件および測定法についての実験記録(プ目
トコール)は次のようである: a)BOG:細網内皮系(RB8)に最大の刺激を与え
、過形成をおこさせるには、2×101個の生育可能の
BOG菌体を接種材料とする、 b)内毒素=14〜21日後に、BOGにょるRES刺
激が最高に達している時点で内毒素(大腸菌からのりボ
ポリサッヵライドW)0.25〜25μgを接種する。
び内協素処置のあとで調製された血清は、完全に凝塊を
形成しない点で非定型的である。マウスにおけるTNF
の最適産生条件および測定法についての実験記録(プ目
トコール)は次のようである: a)BOG:細網内皮系(RB8)に最大の刺激を与え
、過形成をおこさせるには、2×101個の生育可能の
BOG菌体を接種材料とする、 b)内毒素=14〜21日後に、BOGにょるRES刺
激が最高に達している時点で内毒素(大腸菌からのりボ
ポリサッヵライドW)0.25〜25μgを接種する。
最大の用量を投与した場合に、マウスでのTNF濃度は
最大となる、 c)TNF回収を 最適時間は内毒素投与よt)2時間後である(それ以後
になると、ショックによって循1f、l虚脱が生じるた
め効率が低下する)、d)TNF検定: 1) in vlvo : (+’1ALb/’eXO57BL/6)ハイブリッド
に杉植されたTIA、Lb / a Moth A腹水
肉腫に対する’l’ N F li+1性マウス血清の
壊死形成作用は次のような方法で明らかにされる。7日
後にin vlv。
最大となる、 c)TNF回収を 最適時間は内毒素投与よt)2時間後である(それ以後
になると、ショックによって循1f、l虚脱が生じるた
め効率が低下する)、d)TNF検定: 1) in vlvo : (+’1ALb/’eXO57BL/6)ハイブリッド
に杉植されたTIA、Lb / a Moth A腹水
肉腫に対する’l’ N F li+1性マウス血清の
壊死形成作用は次のような方法で明らかにされる。7日
後にin vlv。
での皮下移植腫瘍に対するTNF陽性血清の効果を肉眼
によ924時間にわたって採点する。
によ924時間にわたって採点する。
反応は3〜4時間ではじめて認められる。−7日後の移
植片(がんの)では、一般に壊死反応は、約o1mlか
らo、 s mlまでの投与されたTNF陽性血清1d
に比例する。十+十反応は、−見生存可能のようにみえ
る腫瘍組織の周縁部のみを残して、腫瘍塊が完全ないし
ほとんど完全に破壊されたことを示1−ている。6日後
の移植片の反応はよシ弱く、5日後の移植片では全く反
応はみられない。
植片(がんの)では、一般に壊死反応は、約o1mlか
らo、 s mlまでの投与されたTNF陽性血清1d
に比例する。十+十反応は、−見生存可能のようにみえ
る腫瘍組織の周縁部のみを残して、腫瘍塊が完全ないし
ほとんど完全に破壊されたことを示1−ている。6日後
の移植片の反応はよシ弱く、5日後の移植片では全く反
応はみられない。
2) in vitr。
TNF感受性のII−M、?!11胞は、A、merl
canType Cu1ture 0olleetio
n (アメリカ標べへ培養収集; ATOO)のクロー
ンマウス L929細胞から誘導された。L細胞の’r
N F耐性系統は、TNF感受性り細胞をT N F
を含有する培地で反復継代接種することによって誘導さ
れた。
canType Cu1ture 0olleetio
n (アメリカ標べへ培養収集; ATOO)のクロー
ンマウス L929細胞から誘導された。L細胞の’r
N F耐性系統は、TNF感受性り細胞をT N F
を含有する培地で反復継代接種することによって誘導さ
れた。
TNFは、TNF感受性り細胞CL (S) )に対し
て細胞毒性を示すが、TNF耐性■、細胞〔■、(6)
〕に対してはそれを示さない。
て細胞毒性を示すが、TNF耐性■、細胞〔■、(6)
〕に対してはそれを示さない。
測定は、各測定孔にI;;agleの最低必須培地o、
s ml を加え、それにトリプシン処理をした50
.000個のL細胞を接f31 L 、その2〜3時間
後に測定孔(24孔0ostor板)に、TNFの逐次
希釈液を含む培地o、 s mlを加え、48時間後に
位相差顕微鏡またはトリノξンブリュー排除法によって
細胞死滅を推定し、50%死滅が起こりたたんば< j
tを決定することで実施した。たとえば、一つの標準仕
込に対して、In マitr。
s ml を加え、それにトリプシン処理をした50
.000個のL細胞を接f31 L 、その2〜3時間
後に測定孔(24孔0ostor板)に、TNFの逐次
希釈液を含む培地o、 s mlを加え、48時間後に
位相差顕微鏡またはトリノξンブリュー排除法によって
細胞死滅を推定し、50%死滅が起こりたたんば< j
tを決定することで実施した。たとえば、一つの標準仕
込に対して、In マitr。
で部分的に精製されたマウスTNFI単位は、たんば(
58ngまたは20.000単位/たんば< ngの比
活性に等しい。この部分的に精製されたマウスTNFに
は、IFNは含まれていない。イ1゛!製前の元の血清
には、若干のインターフェロン(IFN)が含まれてい
る。
58ngまたは20.000単位/たんば< ngの比
活性に等しい。この部分的に精製されたマウスTNFに
は、IFNは含まれていない。イ1゛!製前の元の血清
には、若干のインターフェロン(IFN)が含まれてい
る。
BOG以外に、O,granulosum+ O,Pa
rvum+マラリア原虫またはサイモザン(酵母細胞壁
)なども、感作剤として使用できる。Green ら[
:J、 Nat’1. Canc@r Inat、59
: 1519(1977)]は、マウスはO,Par
vum注射後6日注射後6素目対して最高の過敏性を示
すと報告している。
rvum+マラリア原虫またはサイモザン(酵母細胞壁
)なども、感作剤として使用できる。Green ら[
:J、 Nat’1. Canc@r Inat、59
: 1519(1977)]は、マウスはO,Par
vum注射後6日注射後6素目対して最高の過敏性を示
すと報告している。
その方法では、内毒素投与はO,Parvum投与から
4日後に開始されている。内氾素用散は0.25μgと
いう少社であるが、TNF遊離を誘発させるために25
μgが使用されている。内毒素1μgを静注したあと、
90分後にTNF遊離は最大となる。TNF産生敏はマ
ウスの株によって変化する。
4日後に開始されている。内氾素用散は0.25μgと
いう少社であるが、TNF遊離を誘発させるために25
μgが使用されている。内毒素1μgを静注したあと、
90分後にTNF遊離は最大となる。TNF産生敏はマ
ウスの株によって変化する。
大腸菌のようなグラム陰性菌から得られた内参素は、1
nv1マOでTNFを遊離させるのに、これまでに見出
され迄最も効果的な薬剤である。
nv1マOでTNFを遊離させるのに、これまでに見出
され迄最も効果的な薬剤である。
(Or、ravrellら、前記、)TNFの効果は各
種の腫瘍(マウス)系において認められている。すなわ
ち、肉腫8−180(OD−1スイス)、BF2 (0
3)()i白血病EL4(057B1/6 )、ASL
I (A株)、RADA−1(A株)、RLO1(BA
LB/e )、肥満細胞腫ps ls (DBA/2.
)などである。腫瘍(細胞)がinマivo測定の場合
のように皮内に注射される場合には、M@thAはTN
Fに対して高い感受性を示す。反応がもっと弱い腫瘍も
報告されている。すなわち、細網細胞肉腫几0SS(S
JL)は耐性を示し、F1乳腺腫瘍(03H/ An
X 1 )はきわめてわずかな反応を示すだけであυ、
AK几特発性白血病は中程度の感受性を示した。したが
って、マウスのTNFは、マウス腫瘍に対して明らかな
治療効果をもっている( Oarswellら、前記)
。
種の腫瘍(マウス)系において認められている。すなわ
ち、肉腫8−180(OD−1スイス)、BF2 (0
3)()i白血病EL4(057B1/6 )、ASL
I (A株)、RADA−1(A株)、RLO1(BA
LB/e )、肥満細胞腫ps ls (DBA/2.
)などである。腫瘍(細胞)がinマivo測定の場合
のように皮内に注射される場合には、M@thAはTN
Fに対して高い感受性を示す。反応がもっと弱い腫瘍も
報告されている。すなわち、細網細胞肉腫几0SS(S
JL)は耐性を示し、F1乳腺腫瘍(03H/ An
X 1 )はきわめてわずかな反応を示すだけであυ、
AK几特発性白血病は中程度の感受性を示した。したが
って、マウスのTNFは、マウス腫瘍に対して明らかな
治療効果をもっている( Oarswellら、前記)
。
in vitroでは、培養基中の変換ネズミ線維芽細
胞(L細胞)は、MethA 肉腫細胞またはマウス胎
児PJm芽細胞(MBF)と比較して最も強い感受性を
示した。TNF曝露よ948時間後に生存可能の細胞を
計数する。この場合、その効果は細胞毒性的あると同時
に細胞増殖抑制的でもあるが、最初の16時間以内では
効果が認められないので遅効性である。M@thAのi
n vlvoテストでの効果は、懐死プロセス(変化)
であり、それはM@thA腫瘍の中心ではじまり、次第
に外側へ拡大するが、周辺に変化を受けていないように
みえる腫瘍組織を残す。次に昨瘍はこの残存部からふた
たび成長を開始することがありうる。最適用量のTNF
で処置したJ、+3合には、処置された動物の完全退行
の割合は良好である。L細胞効果に基づいて一堕v1票
測定が実施される(前記)。TNFを含む培地中でTN
F感受性り細胞を反復継代接種法で誘導することにより
、L細胞の耐性系統も育成された。TNFは感受性L
III胞(L (8) 〕に対して細胞毒性を示すが、
耐性り細胞〔L(6)〕に対しては毒性を示さない。こ
れらの検定法は、hTNFの検定にも使用される(後記
)。
胞(L細胞)は、MethA 肉腫細胞またはマウス胎
児PJm芽細胞(MBF)と比較して最も強い感受性を
示した。TNF曝露よ948時間後に生存可能の細胞を
計数する。この場合、その効果は細胞毒性的あると同時
に細胞増殖抑制的でもあるが、最初の16時間以内では
効果が認められないので遅効性である。M@thAのi
n vlvoテストでの効果は、懐死プロセス(変化)
であり、それはM@thA腫瘍の中心ではじまり、次第
に外側へ拡大するが、周辺に変化を受けていないように
みえる腫瘍組織を残す。次に昨瘍はこの残存部からふた
たび成長を開始することがありうる。最適用量のTNF
で処置したJ、+3合には、処置された動物の完全退行
の割合は良好である。L細胞効果に基づいて一堕v1票
測定が実施される(前記)。TNFを含む培地中でTN
F感受性り細胞を反復継代接種法で誘導することにより
、L細胞の耐性系統も育成された。TNFは感受性L
III胞(L (8) 〕に対して細胞毒性を示すが、
耐性り細胞〔L(6)〕に対しては毒性を示さない。こ
れらの検定法は、hTNFの検定にも使用される(後記
)。
これまでの所見から、間接的にマウスやウサギにおいて
は大食細胞がTNFの一つの細胞性の出発材料であるこ
とが示唆される。というのは、肝や牌の大食細胞は、B
OG(ないしそれと同等のもの)および内毒素の作用に
よって顕著な過形成を示すからである。
は大食細胞がTNFの一つの細胞性の出発材料であるこ
とが示唆される。というのは、肝や牌の大食細胞は、B
OG(ないしそれと同等のもの)および内毒素の作用に
よって顕著な過形成を示すからである。
要約すると、1)TNF遊なのための感作剤は大食細胞
に顕著な過形成をひき起こす、2)牌の大食細胞の選択
的溶解は、BOG感作マウスに内毒素を注射したあとま
もなく認められる、3)TNFを含む血清は、ライリゾ
ーム由来の酵素を多量に含んでおり、活性化された大食
細胞はその種の2イリゾームを多量に含んでいることが
特徴である。
に顕著な過形成をひき起こす、2)牌の大食細胞の選択
的溶解は、BOG感作マウスに内毒素を注射したあとま
もなく認められる、3)TNFを含む血清は、ライリゾ
ーム由来の酵素を多量に含んでおり、活性化された大食
細胞はその種の2イリゾームを多量に含んでいることが
特徴である。
マウス組織球腫のクローン系統(J774およびPU5
−1.8)はTNFを不質的に産生するが、その産生量
は内毒素に曝露されたあと著しく増加する( mann
elら(1980) Int@et。
−1.8)はTNFを不質的に産生するが、その産生量
は内毒素に曝露されたあと著しく増加する( mann
elら(1980) Int@et。
Immun、30.523〜530.およびWilli
amsonら未発表〕。
amsonら未発表〕。
血清から分離されたので、マウスTNFは糖たんばくで
あり、4〜6万の分子量と15万の分子量の、少なくと
も2種の形態で存在する( mannalら(1980
) Intact、 Immun、 28 。
あり、4〜6万の分子量と15万の分子量の、少なくと
も2種の形態で存在する( mannalら(1980
) Intact、 Immun、 28 。
204〜211 ;Kullら(1981) J、 I
mmunol。
mmunol。
126 、1279〜831Haranaka+ K、
ら、(1981)Jpn J* Wxp、 Mad、、
51 + 191〜194 ;Gre@n。
ら、(1981)Jpn J* Wxp、 Mad、、
51 + 191〜194 ;Gre@n。
S、ら(1976) Free、 Nat’1. Aa
ad、 8ci、 USA73.381〜385および
未発表〕。TNFは、凍結させ、特に−7OC以下に保
っておくと安定である。その活性は、70C30分間で
破壊される0それは、5〜500μg/ k!’の範囲
でウサギに対し発熱作用を示し、5μg /kfのレベ
ルでは発熱性はもたない。ウサギTNFは約39〜68
キロダルトンの分子黛範囲をもって報告されている(
Rutt 、 M、 Roら(1980,)J。
ad、 8ci、 USA73.381〜385および
未発表〕。TNFは、凍結させ、特に−7OC以下に保
っておくと安定である。その活性は、70C30分間で
破壊される0それは、5〜500μg/ k!’の範囲
でウサギに対し発熱作用を示し、5μg /kfのレベ
ルでは発熱性はもたない。ウサギTNFは約39〜68
キロダルトンの分子黛範囲をもって報告されている(
Rutt 、 M、 Roら(1980,)J。
Immut+ol、125. 1671〜1677;M
atthevs。
atthevs。
N、ら(1980) Br、 J、 0anoor 4
2 416〜422; Matthevs + N、ら
(1978) Br、 J、 Cancer3B +
302〜30910strove + J、 M、ら(
1979)Proc、 See、 EXp、 B101
. Mad、160 、 354〜358〕。
2 416〜422; Matthevs + N、ら
(1978) Br、 J、 Cancer3B +
302〜30910strove + J、 M、ら(
1979)Proc、 See、 EXp、 B101
. Mad、160 、 354〜358〕。
インターフェロン
たんばく性のインターフェロンは、先行するウィルス感
染の結果として、宿主動物によって産生される。産生さ
れた宿主のインターフェロンは、その後のウィルス感染
からその動物を保護する。IFNは免疫調節系において
重要な役割を果すことが明らかにされている。インター
フェロンは次に示すような機能を果すことが明らかにさ
れた。すなわちそれは細胞分裂、腫瘍発育、抗体形成、
赤血球系の分化、脂肪細胞の分化などを抑制するが、一
方で大食細胞の食作用、リンフ9球毒性、NK(ナチュ
ラルキラー)細胞活性、細胞表面抗原表現、抗体産生な
どを亢進させる。最近、インターフェロン(I FN)
も抗がん剤になシうることが発見された。
染の結果として、宿主動物によって産生される。産生さ
れた宿主のインターフェロンは、その後のウィルス感染
からその動物を保護する。IFNは免疫調節系において
重要な役割を果すことが明らかにされている。インター
フェロンは次に示すような機能を果すことが明らかにさ
れた。すなわちそれは細胞分裂、腫瘍発育、抗体形成、
赤血球系の分化、脂肪細胞の分化などを抑制するが、一
方で大食細胞の食作用、リンフ9球毒性、NK(ナチュ
ラルキラー)細胞活性、細胞表面抗原表現、抗体産生な
どを亢進させる。最近、インターフェロン(I FN)
も抗がん剤になシうることが発見された。
インターフェロンにはα、β、γ型の3種の基本形態が
あり、その抗原的性質と生化学的性質によって分類され
る。α型は白血球すなわち白色血液細胞によって分泌さ
れ、β型は線維芽細胞によって分泌され、これらはいず
れもウィルスによって誘発されうる。r−IFNはリン
パ球様細胞によって分泌され”免疫性”インターフェロ
ンとして知られている( Stewart、 W。
あり、その抗原的性質と生化学的性質によって分類され
る。α型は白血球すなわち白色血液細胞によって分泌さ
れ、β型は線維芽細胞によって分泌され、これらはいず
れもウィルスによって誘発されうる。r−IFNはリン
パ球様細胞によって分泌され”免疫性”インターフェロ
ンとして知られている( Stewart、 W。
E、IIら、Nature 286.110(1980
)]。
)]。
抗原性の大きな相違点が、これらのIFH種の僧別のた
めに主として利用されている。さらに、IFNは多数の
生物学的や物理化学的な性質においても相違がみられる
。ヒトのαおよびβ型のIFNが精製され、そのアミノ
酸配列が部分的に直接アミノ酸配列決定法によって決定
され(Knight、 E、 Jr、ら、5cienc
e 207 、 525〜526 (1980) ;
Zoon、 K、 O,、5cience 207 r
527〜528(1980)’)、またよシ完全にクロ
ーン袖体DNA配列分析によって決定された( Man
tel、 N、ら、Gone 10,1〜10(198
0); Taniguchl+ T、ら、Gone 1
0 、 11〜15(1980))。クローンα−IN
Fおよびβ−INF DNA 配列を比較することによ
って、アミノ酸し4ルでの2種のIFHのあいだには、
29%の相同性しかないことが明らかにされた( Ta
n1guchl+ T、) Mantal+ N、ら、
Natur@285.547−549(1980))。
めに主として利用されている。さらに、IFNは多数の
生物学的や物理化学的な性質においても相違がみられる
。ヒトのαおよびβ型のIFNが精製され、そのアミノ
酸配列が部分的に直接アミノ酸配列決定法によって決定
され(Knight、 E、 Jr、ら、5cienc
e 207 、 525〜526 (1980) ;
Zoon、 K、 O,、5cience 207 r
527〜528(1980)’)、またよシ完全にクロ
ーン袖体DNA配列分析によって決定された( Man
tel、 N、ら、Gone 10,1〜10(198
0); Taniguchl+ T、ら、Gone 1
0 、 11〜15(1980))。クローンα−IN
Fおよびβ−INF DNA 配列を比較することによ
って、アミノ酸し4ルでの2種のIFHのあいだには、
29%の相同性しかないことが明らかにされた( Ta
n1guchl+ T、) Mantal+ N、ら、
Natur@285.547−549(1980))。
3種類のIFNの主要型のそれぞれには、異質性の程度
がよシ少ない分子亜種が存在する可能性がある。ヒトα
−IFNの数種の亜種がこれまでにクローンDNA配列
を比較することによって認められている( Nagat
a、 S、ら、Nature 287 40i 〜40
8(1980))。
がよシ少ない分子亜種が存在する可能性がある。ヒトα
−IFNの数種の亜種がこれまでにクローンDNA配列
を比較することによって認められている( Nagat
a、 S、ら、Nature 287 40i 〜40
8(1980))。
r−IFHに関して入手できる情報は、はるかに少ない
。このIFNはマイトジェン(有糸分裂誘発因子)に曝
露されたリンパ球培養の上清液中に通常見出されるが−
マイトジエンとは感作細胞の培養中に存在する各種のレ
クチンまたは特異的抗原のようなものである。r−I
FNは、主として次に示す判定規QISに基づいて決定
されている。すなわち(1)α−IFNやβ−IFNと
はことなり、r−IFNの生物学的活性は、pn 2に
なるとほとんど破懐され、(11)α型やβ型のT F
Nに対してG1,1製された抗血清は、γ−IFNと
は交差反応しない。なおまた、比較的純度の低いγ−I
FN製剤を使用して実施された実r5′!成と、+1は
、生物学的にみてさまざまな違いがあることを示唆して
いる。たとえば、r−IFNの抗ウイルス状態を誘発す
る速度は、α−IFNまたはβ−IFNよυはるかに遅
いことが明らかにされた[ Dlanzanl+ F、
ら、Nature283.400〜402(1980)
)。それに反して、r−IFNの細胞成長抑制剤や抗腫
瘍剤としての作用ははるかに強いようである( Cra
ne、 J。
。このIFNはマイトジェン(有糸分裂誘発因子)に曝
露されたリンパ球培養の上清液中に通常見出されるが−
マイトジエンとは感作細胞の培養中に存在する各種のレ
クチンまたは特異的抗原のようなものである。r−I
FNは、主として次に示す判定規QISに基づいて決定
されている。すなわち(1)α−IFNやβ−IFNと
はことなり、r−IFNの生物学的活性は、pn 2に
なるとほとんど破懐され、(11)α型やβ型のT F
Nに対してG1,1製された抗血清は、γ−IFNと
は交差反応しない。なおまた、比較的純度の低いγ−I
FN製剤を使用して実施された実r5′!成と、+1は
、生物学的にみてさまざまな違いがあることを示唆して
いる。たとえば、r−IFNの抗ウイルス状態を誘発す
る速度は、α−IFNまたはβ−IFNよυはるかに遅
いことが明らかにされた[ Dlanzanl+ F、
ら、Nature283.400〜402(1980)
)。それに反して、r−IFNの細胞成長抑制剤や抗腫
瘍剤としての作用ははるかに強いようである( Cra
ne、 J。
L、Jr、ら、J、 Nat、 0aneer In@
tl、 61 871〜874(1973)、Gupt
aら、Proe、 Nat’l 。
tl、 61 871〜874(1973)、Gupt
aら、Proe、 Nat’l 。
Acad、 Sci、 U、 S、 A、76 、48
17 (1979) 。
17 (1979) 。
Blalockらs 0ellular Immuno
logy 49 + 390〜394(1980))。
logy 49 + 390〜394(1980))。
がん治療に対するINFの臨床試験は、製造量が不十分
であったので、制約を受けていた。
であったので、制約を受けていた。
遺伝子工学技術によって、この問題が打開され、Nat
ional 0ancer In5tituteは、ヒ
トインターフェロン(hIpN)の大規模試験を実施中
である。したがって、天然型、組み換え型いずれのhI
FNも、よく知られておシ、臨床的に使用されている。
ional 0ancer In5tituteは、ヒ
トインターフェロン(hIpN)の大規模試験を実施中
である。したがって、天然型、組み換え型いずれのhI
FNも、よく知られておシ、臨床的に使用されている。
要約
杢発明は、ヒ)TNF (hTNF)の製造および精製
のためのプロセスをはじめて明らかにしたものである。
のためのプロセスをはじめて明らかにしたものである。
このようなプロセスは臨床試験に有用なものとなろう。
30種以上の細胞系統が組織培養においてTNFを産生
ずる能力をもつかどうかスクリーニングされる。フォル
セール、12−ミリスチン酸エステル、13−+tmエ
ステル(PMA)も、hTNF産生を促進するのに必要
であることが見出される。PMAは腫瘍促進因子として
知られている。現時点くおいては、B細胞系統はPMA
を加えた場合も、加えない場合も、hTNF製造のため
の最も見込のある出発原料である。上記の標準的なTN
F検定法は、hTNFを検定するため、たとえば腫瘍壊
死のIn v1マ0検定やL細胞の細胞抑制作用ないし
細胞毒性のln vltro検定のために使用される。
ずる能力をもつかどうかスクリーニングされる。フォル
セール、12−ミリスチン酸エステル、13−+tmエ
ステル(PMA)も、hTNF産生を促進するのに必要
であることが見出される。PMAは腫瘍促進因子として
知られている。現時点くおいては、B細胞系統はPMA
を加えた場合も、加えない場合も、hTNF製造のため
の最も見込のある出発原料である。上記の標準的なTN
F検定法は、hTNFを検定するため、たとえば腫瘍壊
死のIn v1マ0検定やL細胞の細胞抑制作用ないし
細胞毒性のln vltro検定のために使用される。
T細胞、単球、前骨髄球細胞系統はTNFをほとんど産
生しないか、あるいは全く産生じない。本法によるhT
NF産生のためには、外因性BOGも、外因性内毒素も
必要としない。ヒト腫瘍細胞を死滅ないし発育抑制する
ために、h TNFと組み換え型ないし天然型いずれか
のhIFNを併用した場合には、驚くべき相乗作用的抗
腫瘍効果が認められる。hIFNないしhTNFは、そ
れぞれ抗腫瘍効果を示すが、hTNFをhIFNと併用
した場合の効果は、それらの個別的抗j重瘍効果の和よ
シ大きい。
生しないか、あるいは全く産生じない。本法によるhT
NF産生のためには、外因性BOGも、外因性内毒素も
必要としない。ヒト腫瘍細胞を死滅ないし発育抑制する
ために、h TNFと組み換え型ないし天然型いずれか
のhIFNを併用した場合には、驚くべき相乗作用的抗
腫瘍効果が認められる。hIFNないしhTNFは、そ
れぞれ抗腫瘍効果を示すが、hTNFをhIFNと併用
した場合の効果は、それらの個別的抗j重瘍効果の和よ
シ大きい。
説 明
本発明は、ヒト細胞系統がhTNFのソースとして役立
つことを明らかにしている。マウスTNFの産生方法は
、主としてBOGや内毒素の効果に依存しているようで
ある。ヒ)B細胞からTNFを産生するこの方法では、
BOGまたは内毒素の添加を必要としないoしたがって
、本法で得られるTNFは、本質的に外因性内毒素、細
菌性汚染物、ならびに血清汚染物も含まない。filに
示されているように、試験された造血系細胞のうちB細
胞は、TNFを最もよく産生ずるものである。
つことを明らかにしている。マウスTNFの産生方法は
、主としてBOGや内毒素の効果に依存しているようで
ある。ヒ)B細胞からTNFを産生するこの方法では、
BOGまたは内毒素の添加を必要としないoしたがって
、本法で得られるTNFは、本質的に外因性内毒素、細
菌性汚染物、ならびに血清汚染物も含まない。filに
示されているように、試験された造血系細胞のうちB細
胞は、TNFを最もよく産生ずるものである。
なお、表1をも含め後出の表はすべて(12表)本文末
に順次描記しである。外因性BOGないし外因性内毒素
のいずれも添加しないで、高濃度でTNFが産生された
のは、予期しない結果で条る。Tl[胞、単球tたは前
骨髄球などに由来する細胞系統の上清(液)中には、少
欲ないし微量のh TNFが認められる。1n vit
r。
に順次描記しである。外因性BOGないし外因性内毒素
のいずれも添加しないで、高濃度でTNFが産生された
のは、予期しない結果で条る。Tl[胞、単球tたは前
骨髄球などに由来する細胞系統の上清(液)中には、少
欲ないし微量のh TNFが認められる。1n vit
r。
L細胞検定法(0arsv・11ら一前出)によって\
ヒト由来の細胞によって産生されたTNFの濃度が決定
された。したがってはじめてのことであるが、以下に説
明される培養系には、内毒素は添加されていないので、
本研究で認められたTNF中には全く外因性内毒素汚染
物は存在していない。マウスにおけるその他の研究者に
よる従来の研究では内毒素の存在を認めているが、それ
は系から内毒素を除去することは困難なことであるので
大きい問題となる。
ヒト由来の細胞によって産生されたTNFの濃度が決定
された。したがってはじめてのことであるが、以下に説
明される培養系には、内毒素は添加されていないので、
本研究で認められたTNF中には全く外因性内毒素汚染
物は存在していない。マウスにおけるその他の研究者に
よる従来の研究では内毒素の存在を認めているが、それ
は系から内毒素を除去することは困難なことであるので
大きい問題となる。
Bnvで(形質)転換されたB細胞系統は、黒色腫患者
から誘導さ糺る。その他の細胞系列は、5loan −
Ketterlng In5t1tut*のDr、 L
loyaOld、 Dr、 Jorgen E、 Fo
ghItたはDr、 P@ter11alphの細胞ノ
ζンク収集からえられる。Lukll細胞は、Dr、
W、 Stewartから入手される( Plcker
ingら(1980) Free、 Nat’l Ae
ad。
から誘導さ糺る。その他の細胞系列は、5loan −
Ketterlng In5t1tut*のDr、 L
loyaOld、 Dr、 Jorgen E、 Fo
ghItたはDr、 P@ter11alphの細胞ノ
ζンク収集からえられる。Lukll細胞は、Dr、
W、 Stewartから入手される( Plcker
ingら(1980) Free、 Nat’l Ae
ad。
8ei、 USA 77 、5938〜5942)。
EBV転換B細1I11系統は黒色腫患者から誘導され
る( Iloughtohらs Proc、Nat’l
、Aead、8ai、U8A+77.4260(198
0))。
EBV転換B細1I11系統は黒色腫患者から誘導され
る( Iloughtohらs Proc、Nat’l
、Aead、8ai、U8A+77.4260(198
0))。
’r N Fを産生させるために、造血系出所のヒト細
胞をスクリーニングするには、(表1参照)mlあたシ
5X10’個の細胞を、胎児仔ウシ血清(FOR)8%
を含有し、PMA(10ng/+aj(81gma O
hemiaal Oo、、 SL、 Louts、 M
o ) :]を含むか、PMAを含まない几PMI 1
640(培地)中で培養する。RPMI 1640の組
成は表2に示されている。37Cで48時間インキュベ
ートしたあと、遠沈によって細胞を集め、PMAを含ま
ないRPMI 1640培地中にdあたシlXl0”個
の濃度で、さらに48時時間開垂させておく。細胞培養
(液)?:遠沈して細胞を含まない上清を分離する。こ
れらの上清は検定まで一2OCで凍結させておき、TN
F活性を2倍に希釈した上清液上用いてL細胞検定法に
よって決定する。
胞をスクリーニングするには、(表1参照)mlあたシ
5X10’個の細胞を、胎児仔ウシ血清(FOR)8%
を含有し、PMA(10ng/+aj(81gma O
hemiaal Oo、、 SL、 Louts、 M
o ) :]を含むか、PMAを含まない几PMI 1
640(培地)中で培養する。RPMI 1640の組
成は表2に示されている。37Cで48時間インキュベ
ートしたあと、遠沈によって細胞を集め、PMAを含ま
ないRPMI 1640培地中にdあたシlXl0”個
の濃度で、さらに48時時間開垂させておく。細胞培養
(液)?:遠沈して細胞を含まない上清を分離する。こ
れらの上清は検定まで一2OCで凍結させておき、TN
F活性を2倍に希釈した上清液上用いてL細胞検定法に
よって決定する。
ln vitro検定ではs Amerlcan Ty
pe 0ultur+5Oo11ectlon (AT
OO)より、N0TOクローン929(6)系統から誘
導されたマウスL−M細胞を入手し、必須ではないアミ
ン噛、ペニシリン(xoou/TLl)、ストレプトマ
イシン(10(1/ツ)、熱失活胎児仔クシ血清8%な
どを補充したBagl・の最低必須培地(MBM)(G
IBOO。
pe 0ultur+5Oo11ectlon (AT
OO)より、N0TOクローン929(6)系統から誘
導されたマウスL−M細胞を入手し、必須ではないアミ
ン噛、ペニシリン(xoou/TLl)、ストレプトマ
イシン(10(1/ツ)、熱失活胎児仔クシ血清8%な
どを補充したBagl・の最低必須培地(MBM)(G
IBOO。
Grand l5lan4+ N、 Y、 )中で、3
7Cで発育させた。マウスTNF耐性り細胞系統L(6
)は、マウス’I’ N Fを含む培地中で継代接種を
反復して感受性り細胞から誘導した。hTNFの活性の
検定は次のようにしておこなった。すなわち検定の3時
間前にあらかじめトリゾシン処理をしたL細胞50,0
00個を接種しておいた培養基(o、 5ml ) f
加えである孔(24孔(ostar板)に、TNFを逐
次希釈した培養液等量(ここでは6.5 ml )を添
加し、48時間後に位相差顕微鏡観察またはトリパンゾ
リュー排除によって、細)j3 fts o%死滅させ
るたんばく社を測定して検定する。
7Cで発育させた。マウスTNF耐性り細胞系統L(6
)は、マウス’I’ N Fを含む培地中で継代接種を
反復して感受性り細胞から誘導した。hTNFの活性の
検定は次のようにしておこなった。すなわち検定の3時
間前にあらかじめトリゾシン処理をしたL細胞50,0
00個を接種しておいた培養基(o、 5ml ) f
加えである孔(24孔(ostar板)に、TNFを逐
次希釈した培養液等量(ここでは6.5 ml )を添
加し、48時間後に位相差顕微鏡観察またはトリパンゾ
リュー排除によって、細)j3 fts o%死滅させ
るたんばく社を測定して検定する。
表1に示したように、上記のような標準的なマウスTN
Pのin vltro検定では、ヒトB細uaK、tつ
−ci生さn*h TNFu、マウ、X、 L (S)
に対して細胞毒性を示すが、マウスL(6)に対しては
毒性を示さない。h TNFの几めにスクリーニングに
かけられる細胞は、腫瘍成長促進因千全加えたり、ある
いは加えないで培養する。
Pのin vltro検定では、ヒトB細uaK、tつ
−ci生さn*h TNFu、マウ、X、 L (S)
に対して細胞毒性を示すが、マウスL(6)に対しては
毒性を示さない。h TNFの几めにスクリーニングに
かけられる細胞は、腫瘍成長促進因千全加えたり、ある
いは加えないで培養する。
たとえばPM人は、表I Q) L (S)[に示し、
たように、B細胞のhTNF反応を数倍に亢進させるP
M、AはまたTPAとしても知られている。
たように、B細胞のhTNF反応を数倍に亢進させるP
M、AはまたTPAとしても知られている。
hTNF(週ごとに約io’個の細胞に対して2〜3μ
gをつづけて加える)を含む培養基中で継代接種を反復
して、hTNFに対する耐性を持つように、L (92
9)(ATOO)から誘導、培養されたマウスL−M細
胞が、マウスTNFに対しても完全な交差耐性を示す。
gをつづけて加える)を含む培養基中で継代接種を反復
して、hTNFに対する耐性を持つように、L (92
9)(ATOO)から誘導、培養されたマウスL−M細
胞が、マウスTNFに対しても完全な交差耐性を示す。
これは興味のある交差耐性効果でおるO
In vlvoでbTNle検定するには、(BALB
/cXO57BL/6)Fl♀マウス(Jackson
Laba)に7日前にM・th A肉腫細胞5X10
’個を皮内注射しておき、それからh TNFの1回静
脈投与をおこなった。24時間後に、腫瘍出血性壊死を
次のように分類した:効果なしく−)、軽度(ト)、中
等度(十+)、高度(++十)であるが、最後の段階は
腫瘍表面の90%に及ぶものである(参照・Oarsw
ell前記)。し念がって、一般には、ヒト細胞標的に
対してhTNFは、マウスTNFに比べてより高い比活
性を示すものでちるが、Kn vivoと in vL
troの標準TNF検定では、よく似た効果を示してい
る。
/cXO57BL/6)Fl♀マウス(Jackson
Laba)に7日前にM・th A肉腫細胞5X10
’個を皮内注射しておき、それからh TNFの1回静
脈投与をおこなった。24時間後に、腫瘍出血性壊死を
次のように分類した:効果なしく−)、軽度(ト)、中
等度(十+)、高度(++十)であるが、最後の段階は
腫瘍表面の90%に及ぶものである(参照・Oarsw
ell前記)。し念がって、一般には、ヒト細胞標的に
対してhTNFは、マウスTNFに比べてより高い比活
性を示すものでちるが、Kn vivoと in vL
troの標準TNF検定では、よく似た効果を示してい
る。
内澄素は、カブトガニアメ−/9様細胞溶解液によって
測定される( MicrobiologicalAvs
oclate+s ) 。
測定される( MicrobiologicalAvs
oclate+s ) 。
マウス組織球のクローン系統はTNFを産生ずるので、
これらの細胞によるヒトでのhTNFの産生を決定する
ために、さらに正常および悪性のヒトの絹織球について
研究を実施しなければならないことは明らかである。表
1に示したB細胞の例は、正常のBfgfU胞もこの能
力を同じようにもっていること全示唆しているOh T
NFの調製と濃縮の実施例(Luk I!細胞より)
、 T、uk I! 細胞5 X 10mlmlをFO
85%およびP M A 10 ng/mlを含有する
RPM11640中で培養し、37Cで48時間インキ
ュベートする。48時間の時点で、遠沈によってjll
l 112 f 集メ、m、9たp 8〜10X10’
の濃度に血清を含まないR−ITS PI’1.BMI
X(配合清液)〔インスリン(5μg/ml) 、)9
ンスフエリン(5μg/ml)、セレン(5ng/ゴ)
代用血清(0ollaborattve IL*s@a
reh r Waltham Mass) )およびエ
タノールアミンZ nM中に再懸垂し、さらに48時間
インキュベートする。
これらの細胞によるヒトでのhTNFの産生を決定する
ために、さらに正常および悪性のヒトの絹織球について
研究を実施しなければならないことは明らかである。表
1に示したB細胞の例は、正常のBfgfU胞もこの能
力を同じようにもっていること全示唆しているOh T
NFの調製と濃縮の実施例(Luk I!細胞より)
、 T、uk I! 細胞5 X 10mlmlをFO
85%およびP M A 10 ng/mlを含有する
RPM11640中で培養し、37Cで48時間インキ
ュベートする。48時間の時点で、遠沈によってjll
l 112 f 集メ、m、9たp 8〜10X10’
の濃度に血清を含まないR−ITS PI’1.BMI
X(配合清液)〔インスリン(5μg/ml) 、)9
ンスフエリン(5μg/ml)、セレン(5ng/ゴ)
代用血清(0ollaborattve IL*s@a
reh r Waltham Mass) )およびエ
タノールアミンZ nM中に再懸垂し、さらに48時間
インキュベートする。
遠沈して細胞を含まない上清を分離し、−2OCで凍結
しておく o Luk II上清はAm1e++)n攪
拌式セル(E’MIO膜)によって濃縮し、トリメ0.
05 M 、 Mail 0.15M緩衝液(pH7,
3)で50で平衡状態とし7’CD B A B 8e
phadex A−50カラム(4oX2.6crn)
に加える。同じ緩衝液で溶出させ、5mlに分画した。
しておく o Luk II上清はAm1e++)n攪
拌式セル(E’MIO膜)によって濃縮し、トリメ0.
05 M 、 Mail 0.15M緩衝液(pH7,
3)で50で平衡状態とし7’CD B A B 8e
phadex A−50カラム(4oX2.6crn)
に加える。同じ緩衝液で溶出させ、5mlに分画した。
TNF活性は、初期の流出分画中に検出されるが、これ
らの分画はプールした。この操作によって、比活性は2
5倍に増加した(2〜5X10’単位/たんば< #
) o L mBa in vitro検定法によって
h TNF活性があると決定された分画をプールし、A
m 1 c o nセルで濃縮する。
らの分画はプールした。この操作によって、比活性は2
5倍に増加した(2〜5X10’単位/たんば< #
) o L mBa in vitro検定法によって
h TNF活性があると決定された分画をプールし、A
m 1 c o nセルで濃縮する。
細胞を胎児仔ウシ血清(FO8)を追加した培地中で増
殖させた場合には、プールした分画のh’rNFCD比
活性は、オオむねlX10” NlX104の範囲内に
ある。細胞が血清を含まない培地で発育した場合には、
プールした分画の1+ T N Fの比活性は、おおむ
ね2〜5X10’μgの範囲内にある。
殖させた場合には、プールした分画のh’rNFCD比
活性は、オオむねlX10” NlX104の範囲内に
ある。細胞が血清を含まない培地で発育した場合には、
プールした分画の1+ T N Fの比活性は、おおむ
ね2〜5X10’μgの範囲内にある。
1) E A、 Eで分画されたhTNF’i静注する
と、In vlvo試験(前出)によってMethA腫
瘍に出血性壊死がひき起される。300μgによってマ
ウスの115に++十壊死が起こシ、残シの415に+
十懐死が発生した0150μgのh T N I”では
、マクスの5/7に+十壊死が生じ、マウスの2/7に
十壊死が発生した。h TNF76μgでは、マウスの
115に+十壊死が発生し、マウスの415には十壊死
がみられた。培地(RPMI 1640)の相当するT
) E A E分画を注射されたあとの対照マウス3匹
中の3匹(、3/3 )には、壊死は観察されなかった
。したがって、TNF活性を検定するのに用いられた標
準試験ずれでも十分な活性を示している。
と、In vlvo試験(前出)によってMethA腫
瘍に出血性壊死がひき起される。300μgによってマ
ウスの115に++十壊死が起こシ、残シの415に+
十懐死が発生した0150μgのh T N I”では
、マクスの5/7に+十壊死が生じ、マウスの2/7に
十壊死が発生した。h TNF76μgでは、マウスの
115に+十壊死が発生し、マウスの415には十壊死
がみられた。培地(RPMI 1640)の相当するT
) E A E分画を注射されたあとの対照マウス3匹
中の3匹(、3/3 )には、壊死は観察されなかった
。したがって、TNF活性を検定するのに用いられた標
準試験ずれでも十分な活性を示している。
培地にFO8が添加されても、添加されなくても、8e
phaeryl 8−200カラムクロマトグラフイー
による測定では、hTNFの分子量は約70.000ダ
ルトンである。高いpHまたは低いpHで、たとえば1
2時間以上処理すると、h TNF活性は破壊される:
たとえば、PI 2.0では活性は約90%消失し、p
H4,0では55%の活性が破壊され、puioでは約
45%の活性が失われる。約6〜BのpH範囲ではh
TNF活性は安定である。熱安定性については、70r
に60分間曝露すると、hTNF活性は破壊されるが、
56tl:’、60分では安定である。−73Cまたは
一2OCで長期間保存しても、活性は失われない。
phaeryl 8−200カラムクロマトグラフイー
による測定では、hTNFの分子量は約70.000ダ
ルトンである。高いpHまたは低いpHで、たとえば1
2時間以上処理すると、h TNF活性は破壊される:
たとえば、PI 2.0では活性は約90%消失し、p
H4,0では55%の活性が破壊され、puioでは約
45%の活性が失われる。約6〜BのpH範囲ではh
TNF活性は安定である。熱安定性については、70r
に60分間曝露すると、hTNF活性は破壊されるが、
56tl:’、60分では安定である。−73Cまたは
一2OCで長期間保存しても、活性は失われない。
PMAで刺激したLUKII細胞から得た分画前の上清
中にZoo単位/ゴのIFN活性が詔められる。DEA
Eクロマトグラフィーによって誘導された精製h TN
Fのプール分画中にも、使用した精製マウスTNF中に
も、インクーフエロン活性は検出されない。ヒトインタ
ーフェロン活性は、wIsHまたはG’M2767細胞
に対する水痘性口内炎ウィルスの細胞変性作用の抑制度
によって測定され(St@wart W。
中にZoo単位/ゴのIFN活性が詔められる。DEA
Eクロマトグラフィーによって誘導された精製h TN
Fのプール分画中にも、使用した精製マウスTNF中に
も、インクーフエロン活性は検出されない。ヒトインタ
ーフェロン活性は、wIsHまたはG’M2767細胞
に対する水痘性口内炎ウィルスの細胞変性作用の抑制度
によって測定され(St@wart W。
(8pringsr r Vi@nna ) ) +組
み換えヒトα−I F N (Hoffman −La
Roehe )の場合は国際基準と〜またヒト天然r
−IFNの場合は実験室基バへと比較される。組み換え
α−hIFN(2〜4X1G”単位/たんば<m9)は
Hoffman −LaRoah・から入手され、天然
α−hIFN(白血球よ勺誘導されたもの)(0,64
X10’単位/たんば< m9 ) Koeher L
aboratory (Borne tスイス)によっ
て5loan −I(etterlng Ingtlt
uteの評価計画のために調製されたものであシ、天然
β−hIFN(xxto’単位/たんばくダ)はRos
well Park Memorial In5tlt
ute (RPMI)から入手され、天然r−hIpr
l白血球より誘導されたもの)(lxu□y単位/たん
ば<IR9)は81oan −Kettering I
n5tltuLeのDr、B@rimhRubinから
入手される。マウス型、ヒト型いずれのT’ N Fも
、若干精製を実施すると、IFN活性はもはや認められ
ない。in vltro検定(前出)で、L(S)に対
する細胞毒性または細胞増殖抑制作用の消失によって示
されるように、各種のhIFNは検出可能な程度のhT
NF活性をもっていない。
み換えヒトα−I F N (Hoffman −La
Roehe )の場合は国際基準と〜またヒト天然r
−IFNの場合は実験室基バへと比較される。組み換え
α−hIFN(2〜4X1G”単位/たんば<m9)は
Hoffman −LaRoah・から入手され、天然
α−hIFN(白血球よ勺誘導されたもの)(0,64
X10’単位/たんば< m9 ) Koeher L
aboratory (Borne tスイス)によっ
て5loan −I(etterlng Ingtlt
uteの評価計画のために調製されたものであシ、天然
β−hIFN(xxto’単位/たんばくダ)はRos
well Park Memorial In5tlt
ute (RPMI)から入手され、天然r−hIpr
l白血球より誘導されたもの)(lxu□y単位/たん
ば<IR9)は81oan −Kettering I
n5tltuLeのDr、B@rimhRubinから
入手される。マウス型、ヒト型いずれのT’ N Fも
、若干精製を実施すると、IFN活性はもはや認められ
ない。in vltro検定(前出)で、L(S)に対
する細胞毒性または細胞増殖抑制作用の消失によって示
されるように、各種のhIFNは検出可能な程度のhT
NF活性をもっていない。
表3に示されているように、産生されたh TNFが細
胞に与える影響は、細胞系統が異なると、作用も変化し
てくる。細II8毒性は、7日後に細胞生存率に35%
以上の減少を示した場合に陽性とされるが、それに対し
て細胞増殖抑制性は、7日後に細胞数に35%以上の減
少を示し念場合に陽性とする。この研究に対しても、ま
たこの説明において示される今後のすべての研究に対し
ても、上記のようなLUKII細胞系統によって産生さ
れたh TNFが使用される。実施例の特異の組合せは
、比較の目的だけに示したものであり、この発明を制限
するためのものではない。その他のB1a胞系統のhT
NFは、ヒトでのその他の細胞を出発点として得られた
TNFと同じように、1n vlv。
胞に与える影響は、細胞系統が異なると、作用も変化し
てくる。細II8毒性は、7日後に細胞生存率に35%
以上の減少を示した場合に陽性とされるが、それに対し
て細胞増殖抑制性は、7日後に細胞数に35%以上の減
少を示し念場合に陽性とする。この研究に対しても、ま
たこの説明において示される今後のすべての研究に対し
ても、上記のようなLUKII細胞系統によって産生さ
れたh TNFが使用される。実施例の特異の組合せは
、比較の目的だけに示したものであり、この発明を制限
するためのものではない。その他のB1a胞系統のhT
NFは、ヒトでのその他の細胞を出発点として得られた
TNFと同じように、1n vlv。
およびin vltroで各種のヒト細胞に対して使用
できることは明らかである。1n vttroおよびi
n vivoでヒトの細胞のTNF産生に対して1BO
(]やその痔刷物ならびに内毒末が効果を持っているこ
とをセ8めるのは、当業者にとっては明白なことであろ
う。
できることは明らかである。1n vttroおよびi
n vivoでヒトの細胞のTNF産生に対して1BO
(]やその痔刷物ならびに内毒末が効果を持っているこ
とをセ8めるのは、当業者にとっては明白なことであろ
う。
h T N Ii’とマウスTNFは、いずれも試験さ
れた乳がん由来の細胞系統の大部分に対して細11+l
y!7性を示しているから、ヒト乳(がん)細胞系統
(表3と4)に対するbTN、Fの効果は、マウスTN
Fの効果と同程度のものである。肺や黒色腫の細胞も、
h T N Fによって影gを受けるが、この場合の効
果は主として細胞増殖抑制的なものである。hTNFで
試験された4種の正常細胞系統、すなわち肺、腎、胎児
肺、胎児皮h!のうち、hTNFに対して感受性を示し
たものはなかった。したがって、hTNFのヒト細胞に
対する細胞毒性、細胞増殖抑制性、または出血性壊死の
各効果は、ヒトの腫瘍細胞に限られるようである。h
TNFは、マウスTNFに比べると、ヒト細胞標的に対
して高い比活性を示す。
れた乳がん由来の細胞系統の大部分に対して細11+l
y!7性を示しているから、ヒト乳(がん)細胞系統
(表3と4)に対するbTN、Fの効果は、マウスTN
Fの効果と同程度のものである。肺や黒色腫の細胞も、
h T N Fによって影gを受けるが、この場合の効
果は主として細胞増殖抑制的なものである。hTNFで
試験された4種の正常細胞系統、すなわち肺、腎、胎児
肺、胎児皮h!のうち、hTNFに対して感受性を示し
たものはなかった。したがって、hTNFのヒト細胞に
対する細胞毒性、細胞増殖抑制性、または出血性壊死の
各効果は、ヒトの腫瘍細胞に限られるようである。h
TNFは、マウスTNFに比べると、ヒト細胞標的に対
して高い比活性を示す。
ヒトインターフェロンは、組み換え型でも、天然型でも
、tea、β、γのいずれの型でも、腫瘍細胞成長に抑
制効果をもっているが、それは一般によく知られており
、またここでは4種の腫瘍細胞系統の実施例によって、
表5,6゜9に示されている。一般に、35%以上の細
胞毒性または細胞増殖抑制性の効果をひき起こすのに必
要とされるIFNの抗ウイルス単位数は、βおよびrの
hIFNの場合よシ、α−hIFNの場合のほうが大き
い。in vitroでは〜IF’N製剤はL (S)
マウス細胞に対して細胞毒性作用または細胞増殖抑制作
用を示さず、したがってhTNF活性の欠如を示してい
る。しかし表7と8に示され几実施例にみられるように
、これらの2つの細胞性産物を精製し、両者を併用する
と、それらの個々の効果の和よシ大きい効果を示す。I
FNとhTNFの組み合せ細胞毒性効果も、01ark
によって示唆された方法(C1ark。
、tea、β、γのいずれの型でも、腫瘍細胞成長に抑
制効果をもっているが、それは一般によく知られており
、またここでは4種の腫瘍細胞系統の実施例によって、
表5,6゜9に示されている。一般に、35%以上の細
胞毒性または細胞増殖抑制性の効果をひき起こすのに必
要とされるIFNの抗ウイルス単位数は、βおよびrの
hIFNの場合よシ、α−hIFNの場合のほうが大き
い。in vitroでは〜IF’N製剤はL (S)
マウス細胞に対して細胞毒性作用または細胞増殖抑制作
用を示さず、したがってhTNF活性の欠如を示してい
る。しかし表7と8に示され几実施例にみられるように
、これらの2つの細胞性産物を精製し、両者を併用する
と、それらの個々の効果の和よシ大きい効果を示す。I
FNとhTNFの組み合せ細胞毒性効果も、01ark
によって示唆された方法(C1ark。
D、 A、 (1958) 、 Ann、 N、 Y、
Acad、 Sol、 76゜915〜921)によ
って共力作用性、すなわち薬理学的に共力作用性である
ことが明らかにされる。表10.11.12参照。この
予想外の成績は、ヒト腫瘍の治療にきわめて大きな価値
全もちつる。
Acad、 Sol、 76゜915〜921)によ
って共力作用性、すなわち薬理学的に共力作用性である
ことが明らかにされる。表10.11.12参照。この
予想外の成績は、ヒト腫瘍の治療にきわめて大きな価値
全もちつる。
bTNF 、h IFN、あるいは雨音の併用の各効果
を示すのに使用された方法の実施例を以下に示す。細胞
をトリプシンで処理し、2回水洗し、FC88%を含む
M E M中に4〜5×10番個/孔(24孔0ost
ar枚)の縄胞ヲ加え、37Cでインキュベートする。
を示すのに使用された方法の実施例を以下に示す。細胞
をトリプシンで処理し、2回水洗し、FC88%を含む
M E M中に4〜5×10番個/孔(24孔0ost
ar枚)の縄胞ヲ加え、37Cでインキュベートする。
16〜24時間後に、培地を吸引し、DFiAEで分画
したhTNF。
したhTNF。
またはIFN、ちるいはbTNF+IFNのいずれかの
希釈液1 mlを添加する。3,5.7日後に、位相差
顕微鏡によって総細胞数(生育可能および生育不能のも
の)f、決定する。5日後に、同じ濃度のhTNFおよ
び(tたは)hIFNを含有する新鮮な培養基によって
培養を硫加した。この方法は表3〜9の成績を得るのに
使用されている。薬物共力作用ないし相乗作用をスクリ
ーニングするための01ark (前記)のゾロトコー
ルは、2つの因子、XとY、この場合はhIFN(X)
とhTNF(1)を単独および併用で検討することであ
る。腫瘍増殖抑制まICは細胞毒性の亢進がみられるな
らば、1/4 X +1/4 Y 、すなわちこの場合
には1/4hIFN+1/4 h T N Fでの試験
を実施して、この1/4用量の併用がそれぞれ単独の全
用班の成績と同程度のものであるかどうかを調べ、もし
そうであれば、2つの因子XとYlこの場合にはhIF
NとhTNFの共力作用の存在が明らかにされる。
希釈液1 mlを添加する。3,5.7日後に、位相差
顕微鏡によって総細胞数(生育可能および生育不能のも
の)f、決定する。5日後に、同じ濃度のhTNFおよ
び(tたは)hIFNを含有する新鮮な培養基によって
培養を硫加した。この方法は表3〜9の成績を得るのに
使用されている。薬物共力作用ないし相乗作用をスクリ
ーニングするための01ark (前記)のゾロトコー
ルは、2つの因子、XとY、この場合はhIFN(X)
とhTNF(1)を単独および併用で検討することであ
る。腫瘍増殖抑制まICは細胞毒性の亢進がみられるな
らば、1/4 X +1/4 Y 、すなわちこの場合
には1/4hIFN+1/4 h T N Fでの試験
を実施して、この1/4用量の併用がそれぞれ単独の全
用班の成績と同程度のものであるかどうかを調べ、もし
そうであれば、2つの因子XとYlこの場合にはhIF
NとhTNFの共力作用の存在が明らかにされる。
この共力作用が表10.11.12に認められるが、こ
れらでは、(上記と)同じ方法は、表の実施例4〜8に
ついては、3日後と5日後だけで使用されている。明ら
かに、1/4 h I F N + 1/4hTNFに
おいて、TNF単独またはhIFN単独よシ大きい効果
を示した共力作用が、表10.11.12の3種の細胞
系統について認められる。
れらでは、(上記と)同じ方法は、表の実施例4〜8に
ついては、3日後と5日後だけで使用されている。明ら
かに、1/4 h I F N + 1/4hTNFに
おいて、TNF単独またはhIFN単独よシ大きい効果
を示した共力作用が、表10.11.12の3種の細胞
系統について認められる。
し友がって、この両者、すなわちhTNF’とhIFN
は、併用するとそれぞれの単独の場合よシがんに対して
よシ強力な細胞毒性活性をひき出すから、ヒトの腫瘍や
がんを治療するために、前述のような方法あるいは種々
の量比で併用して使用することが可能である。実際に、
最大の治療効果をあげるためには、がん患者がTNF
、IFNの両者またはいずれかを産生ずるように、患者
に刺激を与えたシ、上記の治療桑種(TNFとIFN)
t一種の割合で併用し、おそらくその割合を最大薬効を
あげるために変更したり、異なった時間的順序で使用し
たりなどすることで患者を治療しなければならないこと
は言うまでもない。もしTNFのようなその他の因子が
IFN作用を最大にするために必要であるとすれば、こ
の欠如を補うことによって、がんに対するIFNの作用
を向上させることが可能となろう。IFN増強作用は、
免疫系の生物学的反応変更因子として作用するh TN
Fの働きによるものであろう。さらに、当業者にとって
は、ヒトがん細胞に対抗するhIFNの作用を、ホルモ
ンのような生物学的反応変更因子の単独または併用と、
あるいはIL−2、またはその他のサイトカイニン類、
またはリンホカイン、またはリンフォトキシンのような
、ホルモン類似のその他の免疫反応変更因子分子との組
合せを試みることは自明のことである。実際に、異なっ
たIFNや抗がん性のそのような種々の分子とのいろい
ろ、な併用を試験することが指摘されている。これらの
方法に対して、抗がん性のいろいろな細胞ソースからの
hTNFまたはhIFNの試験も追加することも可能で
あるO (以下余白) −求職 京 吠 京υ 釈求 請求 請求υ狭 V 載
承 釈cs o co ao口ωトロ OCo to口
0ロ ω■■ ω: +−1w−−x ++1 +4
x −x −擲 I酩 表 7 (制廟111始時に、5X10’個の勿y抱にhTNF
やIFNを加えて)hTNF+IFN 26 6 5 hTNF4U 746462 IIT−20IFN 3125U 837465対照
95 93 97 h’ll’NP+IFN” 532520hTNF16
U 858270 MT’1−180 TFN 3125U 909187
対照 98 98 98 hTNF+TFN” 33 19 258に−MEL−
’hTNF33U 969696109 IFN701
U 796974X=1照 97 98 98 hTNF+IFN” 079385 hT’NF 33U 9g 958B ” ” IFN781 U 949590対 照 (1
80693 じ各細胞系統に対して単独投与と併用投与の場合のhT
NFfflやhIFN、5には同量である)。 U=単
位。
は、併用するとそれぞれの単独の場合よシがんに対して
よシ強力な細胞毒性活性をひき出すから、ヒトの腫瘍や
がんを治療するために、前述のような方法あるいは種々
の量比で併用して使用することが可能である。実際に、
最大の治療効果をあげるためには、がん患者がTNF
、IFNの両者またはいずれかを産生ずるように、患者
に刺激を与えたシ、上記の治療桑種(TNFとIFN)
t一種の割合で併用し、おそらくその割合を最大薬効を
あげるために変更したり、異なった時間的順序で使用し
たりなどすることで患者を治療しなければならないこと
は言うまでもない。もしTNFのようなその他の因子が
IFN作用を最大にするために必要であるとすれば、こ
の欠如を補うことによって、がんに対するIFNの作用
を向上させることが可能となろう。IFN増強作用は、
免疫系の生物学的反応変更因子として作用するh TN
Fの働きによるものであろう。さらに、当業者にとって
は、ヒトがん細胞に対抗するhIFNの作用を、ホルモ
ンのような生物学的反応変更因子の単独または併用と、
あるいはIL−2、またはその他のサイトカイニン類、
またはリンホカイン、またはリンフォトキシンのような
、ホルモン類似のその他の免疫反応変更因子分子との組
合せを試みることは自明のことである。実際に、異なっ
たIFNや抗がん性のそのような種々の分子とのいろい
ろ、な併用を試験することが指摘されている。これらの
方法に対して、抗がん性のいろいろな細胞ソースからの
hTNFまたはhIFNの試験も追加することも可能で
あるO (以下余白) −求職 京 吠 京υ 釈求 請求 請求υ狭 V 載
承 釈cs o co ao口ωトロ OCo to口
0ロ ω■■ ω: +−1w−−x ++1 +4
x −x −擲 I酩 表 7 (制廟111始時に、5X10’個の勿y抱にhTNF
やIFNを加えて)hTNF+IFN 26 6 5 hTNF4U 746462 IIT−20IFN 3125U 837465対照
95 93 97 h’ll’NP+IFN” 532520hTNF16
U 858270 MT’1−180 TFN 3125U 909187
対照 98 98 98 hTNF+TFN” 33 19 258に−MEL−
’hTNF33U 969696109 IFN701
U 796974X=1照 97 98 98 hTNF+IFN” 079385 hT’NF 33U 9g 958B ” ” IFN781 U 949590対 照 (1
80693 じ各細胞系統に対して単独投与と併用投与の場合のhT
NFfflやhIFN、5には同量である)。 U=単
位。
表 8
(mW!t$、5 ×10 ’ @f)@’mfc h
TNFオヨヒh I FN e加エル)hTNF+I
FN” 11 10 6 hTNF25U S6 46 31 B’l’−201FN31.25U 84 86 79
対照 95 97 97 hTNF+IFN中 2 4 5 bTNP50TJ 77 、72 60M1i)−18
0IFN125U 69 56 26対照 98 98
.96 hTNF+IFN” 9 62 8に−MEI/−hTNF100U 95 93 92
109 IFN125U 67 61 38対照 9g
’118 96 hTNF+IFN” 99 94 94bTNF200
U 97 97 95 T−24IFN125U 99 97 93対照 99
98 93 (2各細胞系統に対して単独投与と併用投与の場合の1
1TNFffiやhIFN量は同量である)。 U=単
位畳】に)てsr−:g 瞬乃の 噂トへ −H8! 一一一+−167 4噂噴 の 箇In クト のロト ヘ啼の ヘト eJt。
TNFオヨヒh I FN e加エル)hTNF+I
FN” 11 10 6 hTNF25U S6 46 31 B’l’−201FN31.25U 84 86 79
対照 95 97 97 hTNF+IFN中 2 4 5 bTNP50TJ 77 、72 60M1i)−18
0IFN125U 69 56 26対照 98 98
.96 hTNF+IFN” 9 62 8に−MEI/−hTNF100U 95 93 92
109 IFN125U 67 61 38対照 9g
’118 96 hTNF+IFN” 99 94 94bTNF200
U 97 97 95 T−24IFN125U 99 97 93対照 99
98 93 (2各細胞系統に対して単独投与と併用投与の場合の1
1TNFffiやhIFN量は同量である)。 U=単
位畳】に)てsr−:g 瞬乃の 噂トへ −H8! 一一一+−167 4噂噴 の 箇In クト のロト ヘ啼の ヘト eJt。
−H8−へ― 〜O
+7110 +n cQLl’l IQ I−、Nトト
ト 田トド φト ψ〇 x ト のQΦ のψΦ の−寸■ in の の へ の 咀0 へ 0田■ CD■Φ ψ0 φ− “ 寸 Q) N e IN to の O’l eJ x 1
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+011’)eQN、10C’StoOn第1頁の続き
0発 明 者 エリザベス カースウ
ェル リチャーズ
[株]発明者 ベリツシュ ワイ・ル
ーピン
0発 明 者 バーバラ ディー、ウ
ィリアムソン
0発 明 者 ジエイ ニス、プレン
ダーギャスト
アメリカ合衆国、 06880 コネチカット、ウェス
トポート、オツター トレイル 1幡地 アメリカ合衆国? 11218 ニーL−ヨーク、 ニ
ュー ヨーり、イースト 8スストリート 53幡地ア
メリ力合衆国、 06870 コネチカット、オールド
グリーンウィッチ、ショワーロード 3幡地アメリ力
合衆国、 10538 ニュー ヨーク、ラーチモント
、メープル アヴエニュ 9番地
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メリ力合衆国、 06870 コネチカット、オールド
グリーンウィッチ、ショワーロード 3幡地アメリ力
合衆国、 10538 ニュー ヨーク、ラーチモント
、メープル アヴエニュ 9番地
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、 精製されたhTNFo 2 約70.000ダルトン程度の分子鼠をもつ特I′
11請求の範囲第1項記載のh T N F 。 3 約6〜8のp■範囲で安定な特許請求の範囲第1項
記載のhTNFo 4 マウスL細胞in Vltyo検定法によって測定
したとき、2〜5X10’単位/たんば<1n9の範囲
の比活性をもつ特許請求の範囲第1項記載のbTN、F
。 5、 −780および一2OCにおいて安定である特F
F 請求CD fan tEB第1 項記RE< ノh
T N F 。 6.56Cで60分間安定である特許請求の範囲第1項
記載のhTNFo 7 次の各項よシなる精製hTNFを製造する方法:(
1)組織培養において、まずヒトの造血系細胞をインキ
ュベートする; (tl)前記の細胞から細胞培養上清
を分離する; (lit)前記の細胞を採集する。 (
IV)前記の細胞を再懸垂し。 M)それらを再インキュベートする; (vl)細胞上
清を採集する; (vil)前記の細胞を含まない上清
を凍結する。 8、 工程(1)の初期インキュ(−ジョンが約0〜8
%の範囲のFO8を含有する几PM11640培地内で
おこなわれる特¥’fB?l求の範囲第7項記載の方法
。 9、’fJJ期インΦユペーションが37rで約48時
間おこなわれる特許請求の範囲第7項記載の方法。 10、工程(11)の分離が遠沈による特許請求の範囲
第7項記載の方法。 11、細胞が工程(1■)にオイてIt、PMI 16
40培地において再インキュベートされる特許請求の範
囲第7項記載の方法。 12、細Hさが工程切において37Cで48時間再イン
キュベートされる特許請求の範囲第7項記載の方法。 13. 造血系細胞がヒ)B細胞である特許請求の範囲
第7項記載の方法。 14、ヒトB細胞がBP、BI、OL、OW。 DFi、DM、DS、EJ、PL、EQ、BR,FO。 FD、FG、ARH−77、DAUDI、LUKII。 RPMI 178B、几PMI 8226.RPMI8
866 、ARA−10の群から選択される特許請求の
範囲第13項記載の方法。 15、細胞を工程(1)においてPMAの存在下に成長
させる特許請求の範囲第7項記載の方法。 16、P M A濃度が10ng/witである特許請
求の範囲第15項記載の方法。 17、工程(1)において1mlあたシ約5×10σ個
の細胞をインキュベートする特許請求の範囲第7項記載
の方法。 18、工程(1)の初期インキュベーションのあと、上
記の細胞を血清を含まないR−ITSP IL EM
I Xおよび2nMのエタノールアミン中に町懸垂し、
細胞を含まない上清を採取し、濃縮し、前記の濃縮した
細胞上清液を緩衝液で平衡化した分離カラムに接触させ
、前記力2ムから得たhTNF活性を示す分画をプール
し、濃縮することを特徴とする特許請求の範囲第15項
記載の方法。 19.1プあたり8〜l0XIO’個の細胞を再懸垂さ
せる特許請求の範囲第18項記載の方法。 20、細胞を含まない上清およびhTNF活性を示す分
画を、PMIO膜を装着した攪拌式Ayn 1 c o
nセルによって濃縮することを特徴とする特許請求の
範囲第、18項記載の方法。 21、分難カラムとしてD E A ESephade
x A −50カラムを使用する特許請求の範囲第18
項記載の方法。 22、使用するDEAB 8ephad@x A −5
0カラムの大きさが4o)<2.6zである特許請求の
範囲第21項記載の方法。 23、使用する緩衝液がpH7,3のトリス0.05
M。 食塩0.15 Mである%許請求の範囲第18項記載の
方法。 24、hTNFおよびhIFNからなる組成物。 25、、hTNFが特許請求の範囲第7項記載の方法に
よって製造されたものである特許請求の範囲第24項記
載の組成物。 26、hTNFが特許請求の範囲第15項記載の方法に
よって製造されたものである特許請求の範囲第24項記
載の組成物。 27、hTNFが特許請求の範囲第18項記載の方法に
よって製造されたものである0It′1′請求の範囲第
24項記載の組成物。 28、hIFNが、α−hIFN、β−hIFN。 r−hIFN、それらの混合物の群から選択されたもの
である特許請求の範囲第24項記載の組成物。 29、そこで使用されるhIFNが天然型のhIFNで
ある特許請求の範囲第24項記載の組成物。 30、そこで使用されるhIFNが組み換え型hIFN
である特許請求の範囲第24項記載の組成物。 31、混合物中の細胞をhTNFと接触させ、悪性細胞
に対する成長抑制効果を観察することからなる混合物中
の悪性細胞と正常細胞を区別する方法。 32、そこで使用されるh TNFが特許請求の範囲第
7項記載の工程にしたがってg造されている特許請求の
範囲第31項記載の方法。 33、そこで使用されるh TNFが特許請求の範囲第
15項記載の工程にしたがって製造されている特許請求
の範囲第31項記載の方法。 34、そこで使用されるhTNFが特許請求の範囲第1
8項記載の工程にしたがって製造されている特許請求の
範囲第31項記載の方法。 35、そこで利用される成長抑制効果が、細胞増殖抑制
作用、細Kt毒性、出血性壊死、成長抑制作用、および
以上の組み合せの群から選択されている%FF請求の範
囲第31項記載の方法。 36、混合物中の細胞をhTNFおよびhIFNからな
る組成物と接触させ、悪性細胞に対する成長抑制効果を
観察することからなる混合物中の悪性細胞と正常細胞を
区別する方法。 38 そこで使用されるhTNFが特許請求の範囲第1
5項に記載の工程にしたがって製造されている特許請求
の範囲第36項記載の方法。 39 そこで使用されるh TNFが特許請求の範囲第
18項記載の工程にしたがって製造されている特許請求
の範囲第36項記載の方法040 そこで利用される成
長抑制効果が、細胞増殖抑制作用、細胞毒性、出血性壊
死、成長抑制作用、および以上の組み合せの群から選択
されている特許請求の範囲第36項記載の方法。 41、そこで使用されるhIFNがα−hIFN。 β−hIFN、γ−hIFN、およびそれらの混合物か
らなる群から選択されている特許請求の範囲第36項記
載の方法。 42、そこで使用されるhIFNが天然型hIFNであ
る特許請求の範囲第41項記載の方法。 43、そこで使用されるhIFNが組み換え型hIFN
である特許請求の範囲第41項記載の方法。 44、hTNpに対して耐性を示すマウスL(6)細胞
。 45、h T N Fを含む培地上でマウスL (S)
細胞の継代接種を反復することによりて、h TNFに
対する耐性を示すマウスL (R)細胞を製造する方法
。 46、そこで使用されるhTNFが特許請求の範囲第7
項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲第
45項記載の方法。 47、その場合のhTNFが特許請求の範囲第15項記
載の方法によって製造されている特許請求の範囲第44
項に記載の方法。 48、そこで使用されるhTNFが特許請求の範囲第1
8項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲
第45項記載の方法。 49、ヒトがん細胞に、この細胞の成長を抑制するのに
十分な量のhTNFf:作用させるコトからなるヒトが
ん細胞の成長を抑制する方法。 50 そこで使用されるhTNFが特許請求の範囲第7
項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲第
49項記載の方法。 51、 そこで使用されるhTNFがl特許請求の範囲
第15項記載の方法によって製造されている特許請求の
範囲第49項記載の方法。 52、そこで使用されるhTNFが特許請求の範囲第1
8項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲
第49項記載の方法。 53 ヒトがん細胞に、この細胞の成長を十分に抑制で
きるhTNFおよびhIFNからなるir、lI成物を
作用させることからなるヒトがん細IJFlの成長全抑
制する方法。 54 その場合の成長抑制作用が共力作用性である特i
1’F i!i’をの範囲第53項記載の方法。 55 そこで使用されるh TNFが特許請求の範囲第
7項記載の工程にしたがって製造されている特許請求の
範囲第53項記載の方法。 56、そこで使用されるhTNFが特許請求の範囲第1
5項記載の方法によって製造されている特許請求の範囲
第53項記載の方法。 57、そこで使用されるり、 T N Fが特許請求の
範囲第18項記載の方法によって製造されている特許請
求の範囲第53項記載の方法。 5B そこで使用されるhIFNがα−り工FN。 β−hIFN、γ−hIFN、およびそれらの混合物か
らなる群から選択されている特許請求の範囲第53項記
載の方法。 59 そこで使用されるhIFNが天然型のhIFNで
ある特許請求の範囲第58項記載の方法。 60、そこで使用されるhIFNが組み換え型hIFN
である特許請求の範囲第58項記載の方法。
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