NO842572L

NO842572L - Fremgangsmaate for fremstilling av humantumornekrosefaktor og humaniterferon med virkning paa human-kreftceller

Info

Publication number: NO842572L
Application number: NO842572A
Authority: NO
Inventors: Lloyd J Old; Elizabeth Carswell Richards; Berish Y Rubin; Barbara D Williamson; Jay S Prendergast
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1983-06-27
Filing date: 1984-06-26
Publication date: 1984-12-28
Also published as: HUT34775A; ES8608885A1; CA1265444A; AU2933784A; DD241271A5; DD241268A5; ZA844377B; EP0131789A3; FI842560L; FI842560A7; NZ208648A; HU197358B; ES545258A0; GR82260B; PT78773A; KR850000528A; FI842560A0; DK311984D0; DK311984A; EP0131789A2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for behandling av humancanser i mennesker ved bruk av renset humantumornekrosefaktor (hTNF) alene, eller hTNF i for-bindelse med humaninterferon (hlFN).

Det beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av hTNF.

TNF: Historien om tumornekrosefaktoren, TNF, begynner for mer enn hundre år siden med det funn at under visse bakterielle infeksjoner i mennesker var det en samtidig regresjon av tilstedeværende humantumor in vivo. I over 40 år behandlet Coley og andre humansykdommer med bakterielle cellefrie filtrater eller blandede bakterielle vaksiner, ofte med positive resultater.

Studier på marsvin og mus ble også gjennomført. Anti-tumorvirkningen i forsøksdyrene er en alvorlig hemorragisk reaksjon i kjernen av tumoren innen fire timer efter bakteriell administrering til en prøveperson eller et dyr. Dette følges av en langsommere nekrotiserende som viser en voksende intensitet i løpet av de neste 48 timer. Tumormassen undergår en progressiv mørkning i farve, noe som er indikerende for død og hemorragi og fører i mange tilfeller til total tumorregresjon. Denne slående hemorragiske nekrose indusert i visse eksperimentelle tumorer ved gram negative bakterier eller ved hjelp av endotoksin (lipopolysasakkarid) avledet fra deres cellevegg, har lenge vært ansett som den eksperimentelle motpart til de ovenfor beskrevne kliniske observasjoner.

Imidlertid har arbeider ved Sloan-Kettering ført til den konklusjon at bakteriell stimulering forårsaker frigjøring av en faktor, muligens av makrofag opprinnelse, som i seg selv direkte eller indirekte er ansvarlig for tumor-celleavlivningen. En støtte for dette kommer fra arbeider som viser at serum av BCG-infisert mus injisert med endotoksin forårsaker hemorragisk nekrose av transplantert sarkoma Meth A og andre tumorer. Serum fra BCG injiserte mus eller serum fra vanlige mus gitt endotoksin er inaktivt. Endotoksin alene mangler toksiditiet for de fle-ste tumorceller in vito. Denne aktie serumkomponent er kalt tumor nekrosefaktor, TNF. TNF-aktiviteten kan ikke tilskrives gjenværende endotoksin som målt ved pyrogenid-sitet, limulusprøving og kjemisk analyse for endotoksy-deler. TNF er til forskjell fra endotoksin direkte cytotoksisk for visse tumorceller in vitro; dyrkkede celler fra vanlige kilder forblir uskadet (Lloyd J. Old, "New Developments in Cancer Therapy", MSKCC Clinical Bulletin 6:118 (1976), E.A. Carswell et al Proc.Nat'l. Acad.Sci.USA 72 3666-70 Sept 1975). Andre gnagere, dvs. rotter og kaniner, produserer TNF på samme måte , ved BCG pluss endotoksinadministrering. TNF ble først funnet i serum av mus forbehandlet med Bacillus Calmette-Guerin (BCG), og utfordret 2-3 uker senere med en endotoksin fra E. Coli. Hverken BCG eller motstykkene (se nedenfor) og heller ikke endotoksin alene produserer TNF-faktoren i museserumet; begge må være tilstede. C.Granulosum, C.Parvum,malaria eller zymosan (gjærcellevegger) induserer på samme måte som BCG massiv hyperplasi av makrofag og andre cellulære elementer av reticuloendotelialsystemet kan benyttes i stedet for BCG ved forbehandling av mus for frigjøring av TNF. Disse faktorer er BCG-motstykker. Serum oppnådd efter BCG- og endotoksinbehandling er atypisk idet den ikke totalt koagulerer. En protokoll for optimal produksjon og prøving av TNF i mus inkluderer: a) BCG: Et inokulum på 2 x 10<7>levedyktige BCGorgan- ismer for maksimal stimulerings og hyperplasiavretiku-1,oendotelialsystem, RES, b) endotoksin: 14-21 dager senere på høyden av RES-stimuleringen ved BCG, 0,25-25 mikrogram inokulum av

endotoksin (lipopolysakkarid w fra E.Coli). Den høyeste dose gir de beste TNF nivåer hos mus,

TNF-samling:

Den optimale tid er 2 timer efter endotoksinadministrering (senere tidspunkter mindre effektive p.g.a. sirkulatorisk kollaps p.g.a. sjokk), og

d) TNF-prøver:

1) In vivo; Den nekrotiske virkning av TNF positivt museserum og BALb/c Meth A ascites Sakom transplantert inn i (BALb/c x C57 BL/6) F1hybrid demonstreres på følgende måte. Efter 7 dager registreres virkningen av TNF positivt serum på subkutant transplantert tumor in vivovisuelt i løpet av 24 timer. En reaksjon sees først i løpet av 3 til 4 timer. I 7-dagers plantater tilsvarer den nekrotiske respons generelt volumet av TNF positivt serum som inngis i en mengde av ca. 0,1-0,5 ml. +++reaksjon viser at tumormassen helt eller så og si helt er ødelagt etterlatende kun en perifer kant av tilsynelatende levedyktig tumorvev. 6 dagers transplantater er mindre responsive, 5 dagers transplantater ikke i det hele tatt,

2) In vitro

TNF sensitive L-M celler ble avledet fra klonede muse L929 celler fra "American Type Culture Collection"

(ATCC). En TNF-resistent linje av L-celler ble oppnådd ved gjentatt føring av TNF sensitive L-celler i media inneholdende TNF. TNF er cytotoksisk for TNF sensitive L-celler <L(S)> men ikke for TNF resistente L-celler

<L(R)>.

Prøven gjennomføres ved å benytte 0,5 ml medium inneholdende seriefortynninger av TNF tilsatt til brøn-ner (24 brønners Costarplater) podet 2-3 timer tidligere med 50.000 typsiniserte L-celler i 0,5 ml Eagle's minimal essensielt medium og bestemmelse av mengden protein som resulterte i 50% celleavlivning anslått ved 48 timer ved fasemikroskopi eller trypanblå ekslusjon. F. eks. er for en standard sats 1 enhet in vitro partielt renset muse-TNFekvivalent 58 ng eller en spesifikk aktivitet på 20.000 enheter pr. mg. protein. Dette partielt rensede muse-TNF inneholder intet IFN. Originalserumet før rensing har noe interferon, IFN.

Ved siden av BCG, kan C.Granulosum, C. Parvum, malaria eller Zymosan (gjærcellevegg) også benyttes som forbehandlingsmiddel. Green et al., rapporterer i J.Nat'1. Cancer Inst. 59:1519 (12977) at mus når en maksimal hypersensitivitet overfor endotoksin 6 dager efter C. Parvuminjeksjon. Ved den metode begynner endotoksinadmini-streringen 4 dager efter C. Parvum. Endotoksindosene er så små som 0,25 mikrogram men 25 mikrogram benyttes for å elicitere TNF-frigjøring. TNF-frigjøringen er maksimal 90 minutter efter intravenøs injeksjon av 1 mikrofram endotoksin. TNF produksjonen varierer med forskjellige musestammer.

Endotoksin fra enhver fram negativ bakterie slik som E. Coli er det mest effektive middel som er funnet til idag for å frigjøre TNF in vivo. (Carswell et al, Supra). Virkningen av TNF sees i et spektrum av tumor (muse) systemer, nemlig: Sarcomas S-180 (CD-1 Swiss),BP8 (C3H); Leukemi EL4 (C57B1/6), ASL1 (A Strain), RADA-1 (AStrain), RLol (BALB/c), og mastocytoma P815 (DBA/2). Meth A er meget sensitiv overfor TNF når tumoren injiseres intradermalt slik som in vivo prøven. Tumorer med mindre respons er også angitt: reticulum-cellesarcom RCS5 (SJL) var resistent, Brysttumorer av C3H/An x I) F-^var kun minimalt responsive og AKR spontantleukemi var av midlere sensi-tivitet. Således har muse-TNF klart en terapeutisk virkning på musetumorer. (Carswell et al, Supra).

In vitro vartranformerte murinfibroblaster (L-celler)i kultur høyst sensitive overfor TNF sammenlignet med Meth A sarcomaceller eller museembryofibroblastere(MEF). Levedyktige celler telles efter 48 timers eksponering til TNF. Virkningen her er cytotoksisk såvel som cytostatisk men forsinket, fordi det ikke sees de første 16 timer. Virkningen i Meth A in vivo prøven er en nekroseprosess som begynner i sentrum av Meth A tumor og sprer seg utover og efterlater en kant av åpenbart ikke-påvirket tumorvev. Tumoren kan så begynne å vokse igjen fra denne rest. Behandling med en optimal dose TNF ville forårsake total regresjon i en god prosentandel av de således behandlede dyr. L-cellevirkningen er basis for in vitro prøven Supra. En resistent linje L-celler er likeledes utviklet, oppnådd ved gjentatt føring av TNF-sensitive L-celler i media inneholdende TNF. TNF er cytotoksisk for sensitive L-celler

<L(S)> men ikke for risistente L-celler <(R)>. Disse prø-ver benyttes også for utprøving av hTNF slik det skal beskrives nedenfor.

Indirekte indikasjoner så langt peker mot makrofager som en celle-kilde for TNF i mus og kaniner fordi lever- og miltmakrofag undergår massive hyperplasi når de er under påvirkning av BCG (eller motstykker) plus endotoksin.

Som en oppsummering: 1) midler som foranlediger TNF fri-gjøring forårsaker markert markofaghyperplasi, 2) selektiv lyse av miltmakrofager sees kort efter endotoksininjeksjon i BCG-primede mus, 3) serum inneholdende TNF er rikt på enzymer av lysosomal opprinnelse og aktiverte makrofager er karakteristisk rike på slike lysosomer.

Klonede linjer av musehistiocytoma (J774 og PU5-1,8) produserer konstitutivt TNF, hvilken produksjon sterkt økes efter eksponering til endotoksin. (Mannel et al (1980) Infect. Immun 30, 523-530, og Williamson et al ikke publi-sert) .

Isolert fra serum er muse-TNF et glykoprotein som eksisterer i minst to former, en 40-60.000- og en 150.000 molekylvektform. <Mannel et al (1980) Infect. Immun. 28, 204-211; Kull et al. (1981) J. Immunol. 126, 1279-83; Haranaka, K, et al., (1981) Jpn J. Exp. Med., 51, 191-194; Green, S. et al (1976) Proe. Nat'l. Acad. Sei. USA 73, 381-385 og ikke publisert>. TNF er stabilt i frosset tilstand, fortrinnsvis under -70°C. Aktiviteten ødelegges ved 70°C i 30 minutter. Den er pyrogen i kaniner i området 5-500 mikrogram/kg og ikke-pyrogen ved 5 mikrogram/kg. Kanin-TNF er angitt å ha et molekylvektsområde på ca. 39 til 68 k dalton. <Ruff, M.R. et al. (1980) Br. J. Cancer 42 416-422; Matthews, N. et al. (1978) Brit. J. Cancer 38, 302-309; Ostrove, J.M. et al. (1979) Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 354-358>.

Proteinholdig interferon fremstilles av vertsdyr som et resultat av en tidligere virusinfeksjon. Det produserte vertsinterferon beskytter dyret mot en etterfølgende viralinfeks jon. IFN har vist seg å spille en viktig rolle i det immunoregulatoriske system. Interferon er funnet å bevirke følgende cellefunksjoner: Det inhiberer celle-deling, tumorvekt, antistoffdannelse, erytroid differensiering og adipocytdifferensiering mens den øker makrofaget fagocytose, lymfocyttoksitet, NK-celleakti-vitet, celleoverflateantigenekspressjon og antistoff-produksjon. IFN er nylig funnet også å være et mulig antikreftmiddel.

Det er tre hovedinterferontyper, nemlig alfa, beta og gamma, adskilt av de antigeniske og biokjemiske egenskaper. Alfa utskilles av leukocyt hvite blodceller, beta av fibroblaster og begge disse kan induseres viralt. Gamma-IFN utskilles av lumfoidceller og er kjent som "immun" interferon. <Sewart, W.E. II, et al., Natyre 286, 110

(1980)>. Hovedsakelig antigeniske differenser danner primærbaser for differensiering blant disse tre IFN-typer. I tillegg skiller disse typer seg fra hverandre når det gjelder et antall biologiske og fysiokjemikalske egenskaper. Humanalfa- og - beta-IFN er renset og deres aminosyresekvenser er stemt delvis ved direkte amino- syresekvensering <Knight, E. Jr., et al., Science 207, 525-526 (1980);Zoon, K.C.,Science 207, 527-528 (1980) og mere selvstendig ved analyse av de klonede komplementære DNA-sekvenser <Mantei, N., et al. Gene 10, 1-10 (1980); Taniguchi, T., et al., Gene 10, 11-15 (1980). Sammenligning av klonede alfa- og -beta-IFN-DNA-sekvenser indikerte kun 29% homologi mellom de to IFNs-typer på aminosyrenivået <Taniquichi, T., Mantei, N., et al., Nature 285, 547-549m (1980)>. Innen hver av de tre hoved-IFN-typer kan det være molekylære undergrupper med en mindre grad av heterogenitet. Flere undergrupper av humanalfa-IFN er kjent så langt ved sammenligning av klonede DNA-sekvenser. <Nagata, S., et al., Nature 287 401-408 (1980)>.

Meget mindre informasjon er tilgjengelig når det gjelder gamma-IFN. Dette IFN finnes vanligvis i supernatanter av lymfocytkulturer eksponert til mitogener - slik som forskjellige lektiner eller spesifikke antigener i kulturer av sensitiserte celler. Definisjonen av gamma-IFN hviler på to hovedkriterier: (i) til forskjell fra alfa-og beta-IFN ødelegges den biologiske virkning av gamma-IFN i sterk grad ved eksponering til pH 2, og (ii) antisera fremstilt mot alfa- og beta-IFN kryssreagerer ikke med gamma-IFN. I tillegg antyder forsøk gjennomført med relativt urene preparater av gamma-IFN et antall biologiske forskjeller. F.eks. ble gamma-IFN påvist å indusere den antivirale tilstand meget langsommere enn alfa- eller beta-IFN <Dianzani, F., et al., Nature 283, 400-402 (1980)>. Omvendt, kan gamma-IFM være mere aktivt som cellevekstinhiberende og anti-tumormiddel <Crane, J.L.Jr., et al., J. Nat. Cancer Insti. 61 871-874 (1973) Gupta et al, Proe. Nat'l. Acad. Sei. USA 76, 4817 (1979) Blalock et al, Cellular Immunology 49:390-394 (1980).

Kliniske prøver på IFN med henblikk på cancerterapi er hindret fordi ikke nok kunne fremstilles. Genetiske tek- nikker har overvunnet dette problem og "National Cancer Institute" gjennomfører utprøving av humaninterferon, hlFN, i stor målestokk. Således er både naturlig og rekombinant hiFN kjent og benyttet klinisk.

Foreliggende oppfinnelsetilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling og rensing av hTNF for første gang. En slik prosesskan brukes for klinisk prøving. Over 30 humancellelinjer i vevkultur ble prøvet for evnen til å fremstille TNF. Forbol 12-myriståt, 13-acetat (PMA) er også funnet å være nødvendig for å fremme hTNF-produksjonen. PMA er kjent som et tumorfremmende middel. B-cellelinjer med eller uten PMA er de mest lovende kilder for hTNF-produksjon på det nuværende tidspunkt. Standard TNF-prøver som beskrevet ovenfor benyttes for prøving på hTNF, dvs. in vivo prøven påtumornekrose og in vitro prøven på L-cellecytostase- cytotoksisitet. T-celler, monocyt- og promylocytcellelinjer produserer lite eller intet TNF. Hverken eksogent BCG eller eksogent endotoksin er nødvendig for hTNF produksjon ved denne metode. En overraskende synergiskisk anti-tumorcellevirkning finnes når hTNF og enten rekombinant eller naturlig hlFN benyttes sammen for å drepe eller inhibere humantumorceller. hlFN eller hTNF viser individuell antitumorvirkning, men virkningen av hTNF brukt sammen med hlFN er større enn summen av deres separate antitumorvirkninger.

Ifølge oppfinnelsen finnes det at humancellelinjer kan tjene som kilde for hTNF. Fremgangsmåte for fremstilling av muse-TNF synes å være mest avhengig av virkningen av BCG og endotoksin. Foreliggende metode for fremstilling fra human B-celler gir TNF uten tilsatt BCG eller endotoksin. Således er dette TNF i det vesentlige fritt for eksogent endotoksin, bakterier såvel som serum-kontaminanter. Som vist i tabell I, er blant de prøvede hematopoietiske celler B-cellene de beste produsenter av TNF. Høye nivåer av TNF-produksjon uten nærvær av hverken eksogent BCG eller eksogent endotoksin er et uventet resultat. Små eller spormengder av hTNF finnes i supernatanter av celle-linjer av T-celle-, monocyt- eller pro-myelocytisk opprinnelse. In vitro L-celleprøven (Carswell et al, Supra) betemte nivåer av TNF produsert av celler av humanopprinnelse. Således var for første gang TNF-nivåer funnet i dette studium frie for enhver eksogenendotoksinforurensning fordi det ikke er noen endotoksin tilsetning til kultursystemet som beskrevet nedenfor. Tidligere studier av andre i mus finner nærvær av endotoksin et problem da det kan være vanskelig å få endotoksin ut av systemet.

EBV-transformerte B-cellelinjer oppnås fra pasienter med melanom. Andre cellelinjer stammer fra cellebanksamling til Dr. Lloyd Old, Dr. Jorgen E. Fogh eller Dr. Peter Ralph i Sloan-Kettering Institutet. Lukll-celler oppnås fra dr. W.Stewart (Pickering et al (1980) Proe. Nat'l. Acad. Sei. USA 77, 5938-5942. EBV-transformerte B-cellelinjer oppnås fra pasienter med melanom (Houghton et al, Proe. Nat'l. Acad.Sei. USA, 77 4260 (1980). Ved under-søkelse av humanceller av hematopoietisk opprinnelse for TNF-produks jon (se tabell 1) ble 5x IO<5>celler pr. ml dyrket i RPMI 1640 inneholdeende 8% fetale kalveserum, FCS, med og uten PMA <10ng/ml (Sigma Chemical Co.,St/ Louis, Mo)>. Tabell 2 viser sammensetningen av RPMI 1640. Efter inkubering i 48 timer i 37°C samles cellene ved sentrifugering og suspenderes igjen i en mengde av 1 x 10 ml i RPMI 1640 medium uten PMA i yderligere 48 timer. Cellefrie supernatanter samles ved sentrifugering av cellekulturene. Disse supernatanter fryses ved -20°C før TNF aktiviteten bestemmes ved L-celleprøven benyttet på supernatanter fortynnet til det halve.

I in vitro prøven blir muse-L-M-celler som er avledet fra NCTC klone 929 L-linjen oppnådd fra ATCC og dyrket i Eagle's Minimum Essensielt medium, MEM, (GIBCO, Grand Island, N.Y.), supplementert med ikke-essensiell aminosyre, penicillin (100 U/ml),treptomycin (100 g/ml) og 8% vareinert fetal kalveserum ved 37°C. En muse TNF-resistent L-cellelinje L(R)ble avledet fra sensitiv L-celler L(S) ved gjentatt føring i muse TNF-holdig medium. Aktiviteten av hTNF prøves ved tilsetning av like volumer medium (slik som 0,5 ml) inneholdende seriefortynninger av TNF til brønner (24-brønners Costar-plater) podet tre timer tidligere med 50.000 trypsiniserte L-celler ( i 0,5 ml medium) og ved bestemmelse av mengden protein som resulterer i 50% celleavlivning bedømt efter 48 timer ved fasemikroskopi, eller trypanblåeksklusjon.

Slik det fremgår av tabell I, er hTNF fremstilt av human B-celler cytotoksisk for muse-L(S)-celler men ikke muse-L(R)-celler i standard muse TNF in vitro prøven som beskrevet ovenfor. Celler som undersøkes på hTNF dyrkes med og uten tumorvekstf remmende midler. PMA er f. eks. ef-fektiv til å øke flere ganger hTNF responsen til B-celler som vist i L(S)-kolonnen i tabell I (se kolonne-headingen " intet PMA"). PMA er også kjent som TPA.

Dyrkede muse-L-M-celler avledet fra L(929) (ATCC) gjort resistente mot hTNF ved gjentatt føring i medium inneholdende hTNF (2-3 mikrogram hver uke kontinuerlig til ca. 10^ celler) er også helt kryssresistente mot muse-TNF. Dette er en interessant kryss-resistenseffekt.

For prøving av hTNF in vivo ble <BALB/c x C57BL/6>F1hunn-mus fra Jackson Labs, injisert inntradermalt 7 dager før med 5 x 10 5 Meth A sarkom-celler, gitt en enkelt intrave-nøs dose hTNF. Efter 24 timer ble tumorhemorragisk nekrose gradert som: ingen virkning-, lett +, moderat ++ eller utstrakt +++, den siste involvert i 90% av tumoroverflaten (se Carswell Supra). Således viser hTNF en tilsvarende virkning på standard TNF prøver in vivo og in vitro, selv om hTNF generelt har en høyere spesifikk aktivitet på hu-

mancellemål sammenlignet med muse-TNF.

Endotoksin bestemmes ved limulus ambocytlysat (Micro-biological Associates).

Fordi klonede linjer av musehistiocytter produerer TNF, må yderligere studier av normal og malisiøs humanhistiocyter åpenbart skje for å bestemme produksjonen av hTNF av disse celler i mennesker. Eksemplene på B-cellene fra tabell I antyder at normale B-celler har denne evne også.

Eksempel på fremstilling og konsentrering av hTNF (fra lukll celler).

5 x IO<5>Lukllceller pr.ml dyrkes i RPMI 1640 inneholdende 5% FCS og 10 ng pr. ml PMA og inkuberes i 48 timer ved 37°C. Efter 48 timer samles cellene ved sentrifugering og suspenderes igjen i 8-10 x 10<5>/ml i serum-fri R-ITS PREMIX

<Insulin _(5 mikrogram pr.ml.). Transferrin (5 mikrogram/ml), selenum (5ng/ml) serum erstatning (Colla-borative Research, Waltham Mass)> og 2 nM etanolamin og inkubert yderligere 48 timer. Supernatantene spinnes frie for celler og fryses ved -20°C. Lukll supernatantene konsentreres ved amiconrørte celler ((PM 10 membran) og bringes til en DEAE-Sephadex A-50-kolonne (40 x 2,6 cm) bragt i likevekt med tris 0,05M, NaCl 0,15 M buffer, pH 7,3 til 5°C. 5 ml fraksjoner elueres med den samme buffer. TNF-aktiviteten påvises i de opprinnelige gjennom-strømmende fraksjoner og slike toppfraks joner samles. Denne prosedyre resulterer i en 25 gangers økning i spesifikk aktivitet (2 -5 x 10^ enheter pr. mg protein). hTNF-aktive fraksjoner, bestemt ved L-celle in vitro-prøven samles og konsentreres ved hjelp av Amicon-celler.

Denne spesifikke aktivitet for de samlede fraksjoner hTNF ligger i det omtrentlige område 1x10^-1x10^ når det gjelder celler dyrket i media supplementer med fetal kalveserum. Den spesifikke aktivitet for de samlede fraksjoner av hTNF ligger i det omtrentlige område 2-5x10^ mikrogram når det gjelder celler dyrket serum-frie media.

Intravenøs injeksjon av DEAE fraksjonert hTNF forårsaket hemorragisk nekrose av Meth A tumorer ved in vivo prøven supra. 300 mikrogram ga +++ nekrose i 1/5 av musene og ++ nekrose i de gjenværende 4/5. 150 mikrogram hTNF ga ++ nekrose i 5/7 av museneog + nekrose i 2/7. 75 mikrogram hTNF ga ++ nekrose i 1/5 av musene og + nekrose i 4/5. Det ble ikke observert necrose i 3 av 3 kontrolldyr efter injeksjon av sammenlignbare DEAE fraksjoner av kultur-medium (RPMI 1640). Således er hTNF fullt aktivt in vivo og in vitro i stanardprøver som benyttes for å bestemme TNF-aktiviteten.

Uansett dyrking med eller uten FCS, er molekylvekten for hTNF ca. 70.000 dalton, bestemt ved sefacryl S-200 kolon-nekromatograf i. Høy eller lav pH i f. eks. 12 timer ødelegger virkningen av hTNF; f.eks. 90% aktivitetstap ved pH 4,0, 55% aktivitetstap ved pH 4,0, og ca. 45% tap ved pH 10. Aktiviteten til hTNF er stabil i pH-området ca. 6-8. Hva angår varmestabiliteten ødelegges hTNF aktiviteten ved eksponering til 70°Ci 60 minutter men forbindelsen er stabil ved 56°C i 60 minutter. Aktiviteten bevares sogar efter lange lagringstidsrom ved -78°C eller -20°C.

IFN-aktiviteten av 100 enheter pr. ml finnes i den ikke-fraksjonerte supernatante fra PMA-stimulerte LUKII-celler. Det påvises ingen interferonaktivitet i samlede fraksjoner av renset hTNF oppnådd ved DEAE kromatografi, eller i det benyttede rensede muse-TNF. Human interferonaktivitet måles ved inhibering av den cytopatiske virkning av vesikulær stomatitt virus på WISH eller GM 2767-celler

<Stewart W.E.II (12979) The Interferon System (Springer Wien> og sammenlignes med en internasjonal standard når det gjelder rekombinant human alfa-IFN (Hoffman- La Roche)

og laboratoriestandarden når det gjelder human naturlig gamma-IFN. Rekombinante alfa-hlFN (2-4 x 108 enheter/mg protein) oppnås fra Hoffman-La Roche, naturlig alfa-hlFN (leukocyt-avledet) (0,64 x 106 enheter/mg protein) fremstilles for Sloan-Kettering Institute bedømmelsespro-grammet av Kocher Laboratory, i Bern Sveits, naturlig beta-hlFN (1x10 enheter/mg proteiner) oppnås fra Roswell Park Memorial Institue) (1x10 enheter/mg proteiner) og naturlig gamma hlFN (leukocyt-avledet) (1x10 enheter/mg proteiner) oppnås fra Dr. Berish Rubin,Sloan-Kettering Institute. Hverken mus- eller human TNF i partielt renset tilstand har påvisbar IFN-aktivitet. De forskjellige hlFN typer mangler påvisbar nTNF aktivitet som påvist ved mangelen på cytotoksisitet eller cytostse på L(S) celler i den ovenfor angitte in vitro prøve.

hTNF som fremstilt har forskjellig virkninger på forskjellige cellelinjer som vist i tabell 3. Cytotoksisitet angis ved bruk av en 35% eller større reduksjon i cellelevedyktigheten efter 7 dager mens cytostase bemerkes ved bruk av en 35% eller større reduksjon i celletallet efter 7 dager. For dette studium og for alle yderligere studier som vist i beskrivelsen benyttes hTNF som fremstilt ved LUKII cellelinje som beskrevet ovenfor. Dette spesifikke sett av eksempler er kun for refe-ranseformål og ikke ment å begrense oppfinnelsen. Andre B-cellelinje hTNF såvel som TNF fra andre celle-kilder i mennesker kan åpenbart benyttes og en varietet av humanceller in vivo og in vitro. Det vil være klart for fagmannen å se virkningen av BCG og dens motstykker såvel som endotoksin og TNF produksjonen av humanceller in vitro og in vivo.

Virkningen av hTNF på humanbrystcellelinjer (tabellene 3 og 4) er tilsvarende den til muse-TNF fordi begge ercytotoksiske for en majoritet av de prøvede cellelinjer av brystkreftopprinnelse. Lunge- og meanomceller påvirkes også av hTNF men den overveiende virkning er cytostatisk. Av de fire normale cellelinjer som prøves ved hTNF, lunge, nyre, fetallunge og fetalhud, er ingen sensitive overfor hTNF. Derfor synes den cytotoksiske, cytostatiske eller hemorragiske nekrosevirkning av hTNF på humanceller å være begrenset til humanturmorceller. hTNF har en høyere spesifikk aktivitet på humancellemål sammenlignet med muse-TNF.

Humaninterferon, rekombinant eller naturlig alfa, beta eller gamma, har en inhiberende virkning på tumorcelle-vekst slik det er velkjent og, slik det her vises, ved hjelp av eksempler, for fire tumor cellelinjer tabellene 5, 6 og 9. Generelt er antallet antiviralenheter av IFN som er nødvendig for å forårsake en 35% eller høyere cytotoksisk eller cytostatisk virkning høyere med alfa-hlFN enn med beta- eller gamma-hlFN. Ingen av IFN-preparatene viste cytotoksisitet eller cytostase på L(S)-museceller in vitro, indikerte derved fravær av hTNF-aktivitet. Dog viste disse to cellulære produkter når de ble renset og brukt sammen, en effekt større enn summen av deres separate virkninger slik det fremgår av eksemplene som vises i tabell 7 og 8. Den kombinerte cytotoksiske virkning av IFN og hTNF finnes også å være cynergistisk ved den metode som foreslåes av Clark, D.A. (1958) Ann. N.Y.Acad.Sei. 76 915-921) dvs. en farmakologisk synergisme. Se tabellene 10, 11 og 12. Dette uventede resultat kan være av enorm verdi ved behandling av humantumorer.

Et eksempel på en metode som benyttes for å vise virkningen av hTNF, hlFN eller en kombinasjon av de to er som følger. Cellene trypsiniseres, skylles to ganger, bringes på plate med 4-5 x 10<4>pr. brønn (24 brønners Costarplater)i MEM inneholdende 8% FCS og inkubert ved 37°C. Efter 16-24 timer aspireres mediet og 1 ml fortynning av DEAE-fraksjonert hTNF, eller IFN, eller hTNF pluss IFN tilsettes. Total celletelling (levedyktig og ikke-levedyktig) bestemmes efter 3, 5 og 7 dager ved fasemikroskopi. Kulturene gis den 5. dag fristmedium inneholdende de samme konsentrasjoner hTNF og/eller hlFN. Denne metode benyttes for resultatene i tabellene 3-9. Protokollen i henhold til Clark ovenfor for bedømmelse av medikamentsynergisme eller potensiering er å prøve to faktorer, X og Y, heri hIFN(X) og hTNF (Y) alene og i kombinasjon. Øket tumorinhibering eller celletoksisitet fører til bedømmelser av en 1/4 X eller 1/4 Y eller heri 1/4 OIFN +l/4hTNF for å se om denne kvartdosekombinasjon er sammenlignbar med den fulle dose av hver av dem alene, og hvis den er, om synergisme av de to faktorer X og Y her hlFN og hTNF vises. Dette ser vi i tabellene 10, 11 og 12 der den samme metode som for tabelleksemplene 4-8 benyttes kun på dagene 3 og 5. Klart vises cynergisme ved en 1/4 hlFN +l/4hTNF, hvilken virkning er større enn både TNF alene og hlFN alene for de tre cellelinjer i tabellene 10, 11 og 12.

Således kan de to, hTNFog hlFN, benyttes alene eller sammen i forskjellige kombinasjoner for å behandle humantumorer og kreft fordi de viser en større cytotoksisk virkning på kreft sammen enn noen av dem alene. Således er det klart at for å oppnå maksimal terapeutisk effekt bør kreftpasienter stimuleres til å produsere både TNF og/eller IFN, eller behandles med forskjellige kombinasjoner av disse terapeutiske arter (TNF og IFN), muligens å alternere dem for maksimal fordel, eller benytte forskjellig tidsregulerte sekvenser osv. Hvis andre faktorer slik som TNF er nødvendige for maksimal IFN-virkning kan en tilførsel av denne mangel føre til øket IFN-virkning mot kreft. IFN forbedret virkning kan skyldes at hTNF virker som et biologisk responsmodifiserende middel for immunsystemet. Det er så åpenbart for fagmannen å prøve hlFN-virkningen mot humankreftceller i for-bindelse med andre biologiske responsmodifiserende midler alene eller i kombinasjon slik som hormoner, eller andre immunresponsmodifiserende molekyler som er hormonlignende slik som IL-2, eller andre cytokiner, eller lymfokiner eller lymfotoksin. Således indikerer prøver med varierende kombinasjoner av de forskjellige typer IFN og slike molekyler en virkning mot kreft. Til disse metoder kan man føye prøving av hTNF eller hlFN fra forskjellige celle-kilder mot kreft.

Claims

1. Renset hTNF.

2. hTNF ifølge krav 1, karakterisert ved at den har en molekylvekt innen området ca. 70.000 dalton.

3. hTNF ifølge krav 1, karakterisert ved at den er stabil i det omtrentlige pH-område 6-8.

4. hTNF ifølge krav 1, karakterisert ved en spesifikk aktivitet innen området 2-5 x 104 enheter/mg protein, bestemt ved muse-L-celle in vitro-prøven.

5. hTNF ifølge krav 1, karakterisert ved at den er stabil ved -78°C og -20°C.

6. hTNF ifølge krav 1, karakterisert ved at den er stabil ved 56°C i 60 minutter.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av renset hTNF, karakterisert ved at den omfatter (i) og inkubere humanhematopoietiske celler til å begynne med i vevkultur; (ii) separering av cellekultursupernatanten fra cellene, (iii) oppsamling av cellene, (iv) resuspendering av cellene og (v) reinkubering av dem; (vi) oppsamling av celle supernatanten, og (vii) frysing av supernatanten uten cellene.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det første inkaa— beringstrinn (i) skjer i RPMI 1640 medium inneholdende FCS i et område på 0-8%.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at den første inkuføer-ing skjer i 48 timer ved 37°C.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at separeringen i. trinn (ii) skjer ved sentrifugering.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at cellene reinkuberes; i trinn (iv) i RPMI 1640 medium.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at cellene reinktåbsares; i trinn (v) i 48 timer ved 37°C .

13. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at de hematopoLs&i.s&e celler er human B-celler.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at human B-oæSJbesais velges blant BE, BI, CL, CW, DE, DM, DS, EJ, EL, E©,, iSL„ FC, FD, FG, ARH77, DAUD I, LUKII, RPMI 1788, RPMI 8322$, RPMI 8866 og ARA-10.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at cellene dyrkes i trinn (i) i nærvær av PMA.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at DMA-konsentrasjonen er 10 ng/ml.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at ca. 5 x 10 celler pr.ml inkuberes til å begynne med i trinn (i).

18. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at cellene efter den første inkubering i trinn (i) resuspenderes i serumfritt R-ITS PREMIX og 2nM etanolamin, at cellefrie supernatanter samles .g konsentreres, at konsentrert celle-supernatant bringes i kontakt med en separasjonskolonne bragt i likevekt med buffer og at de hTNF-aktive fraksjoner som oppnås fra kolonnen slåes isammen og konsentreres .

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at 8-10^ celler resuspenderes pr. ml.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den cellefrie supernatant og hTNF-aktive fraksjoner konsentreres i en omrørt amikoncelle med et PMlO-membran.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at separas jocisi&aÆs&^seii er en DEAE sefadex- A-50 kolonne.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at DEAE SefaaSes: AV-5© kolonnen måler 40 x 2,6cm.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at buffereæ ear: fctriis: 0,05M, Nacl 0,15M ved pH 7,3.

24. Preparat omfattende hTNF og hlFN.

25. Preparat ifølge 24, karakterisert ved at hTNF frenvsritJJJIDÆæ ved fremgangsmåten ifølge krav 7.

26. Preparat ifølge krav 24, karakterisert ved at hTNF fræmffiicfiljlliiss ved fremgangsmåten ifølge krav 15.

27. Preparat ifølge krav 25, karakterisert ved at hTNF f remsti.M.«s< ved fremgangsmåten ifølge krav 18.

28. Preprat ifølge krav 24, karakterisert ved at hlFN er valajjti.. Mjausttt. alfa-hlFN, beta-hlFN, gamma-hlFN samt blandinger sitemsiwv,

29. Preparat ifølge "krav 24, karakterisert ved at hl FN er naturlig hl FN.

30. Preparat ifølge krav 24, karakterisert ved at hlFN er naturlig rekombinant hlFN.

31. Fremgangsmåte for adskillelse av normale fra maliniøse celler i en blanding som er karakterisert ved at den omfatter å bringe cellene i kontakt med hTNF og å observere en vektinhiberende virkning på de maliniøse celler.

32. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at hTNF fremstilles ved fremgangsmåten ifølge krav 7.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at hTNF fremstilles ved fremgangsmåten ifølge krav 15.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at hTNF fremstillesved fremgangsmåten ifølge krav 18.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 31, karakterisert ved at den vekstinhiberende virkning velges blant cytostase, cytotoksisitet, hemmoragisk nekriose, veks tinhiber ing og kombissaisjcrøer derav.

36. Fremgangsmåte for adskillelse av normale framBJ/aEuJ.#se celler i en blanding, karakterisert ved at den omffkvittfoesr å bringe cellene i kontakt med et preparat omfatteæxH te; MffiSlF og hlFN og å observere en vekstinhiberende virkning på «fle. maleniøse celler.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at hTNF f remsti.SJ.æs! ved fremgangsmåten ifølge krav 7.

38. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at hTNF frsras*jL]i.l.es; ved fremgangsmåten ifølge krav 15.;

39. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at hTNF f reartssti-JJ.S.eæ ved fremgangsmåten ifølge krav 18.;

40. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at den omfea-fesssa: å bringe cellene i kontakt med et preparat omfattemså© ' fflMF og hlFN og å observere en vekstinhiberende virkniogj gså Æte maleniøse celler.;

41. Fremgangsmåte ifølge krav 36, karakterisert ved at hlFN er valgjfc te* alfa-hlFN, beta-hlFN, gamma-hlFN samt blandinger åææzxw»

42. Fremgangsmåte ifølge krav 41, karakterisert ved at hlFN er naturlig hlFN.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 41. karakterisert ved at hlFN er rekombinant hl FN.

44. Muse-L(R)-celler, karakterisert ved at de er resistente overfor hTNF.

45. Fremgangsmåte for fremstilling av muse-L(R)-celler som er resistente overfor hTNF, karakterisert ved at de er fremstilt ved gjentatt føring av muse-L(S)-celler gjennom medium inneholdende hTNF.

46. Fremgangsmåte ifølge krav 45, karakterisert ved at hTNF fremstilles ved fremgangsmåten ifølge krav 7.

47. Fremgangsmåte ifølge krav 44, karakterisert ved at hTNF fremstilles ved fremgangsmåten ifølge krav 15.

48. Framgangsmåte ifølge krav 45, karakterisert ved at hTNF fremstilles ved fremgangsmåten ifølge krav 18.

49. Fremgangsmåte for inhibering av veksten av humanitoed^ÆJ elL-ler, karakterisert ved at den cmÆaajtfcesr å eksponere de humane kreftceller til mengder av hSSJiF ssram ar tilstrekkelig til å inhibere veksten av cellene.

50. Fremgangsmåte ifølge krav 49, karakterisert ved at hTNF freims83JJ.es ved fremgangsmåten ifølge krav 7.

51. Fremgangsmåte ifølge krav 49, karakterisert ved at hTNF f reiasji-.li JJ.es ved fremgangsmåten ifølge krav 15.

52. Fremgangsmåte ifølge krav 49, karakterisert ved at hTNF f remsttiJJesj ved fremgangsmåten ifølge krav 18.

53. Fremgangsmåte for inhibering av veksten av humanvs IfczærfS:.— celler, karakterisert ved at deise, amÆait— ter å eksponere kreftcellene til et preparat omføiiifcE ssaae hTNF og hlFN tilstrekkelig til å inhibere . veOkæstoam sw cellene.

54. Fremgangsmåte ifølge krav 53, karakterisert ved at den vekstJiiiMIb-ear— ende virkning er synergistisk.

55. Fremgangsmåte ifølge krav 53, karakterisert ved at hTNF f ræarcs&mliJ-Æssi ved fremgangsmåten ifølge krav 7.

56. Fremgangsmåte ifølge krav 53, karakterisert ved at hTNF fremstilles ved fremgangsmåten ifølge krav 15.

57. Fremgangsmåte ifølge krav 53, karakterisert ved at hTNF fremstilles ved fremgangsmåten ifølge krav 18.

58. Fremgangsmåte ifølge krav 53, karakterisert ved at hlFN er valgt blant alfa-hlFN, beta-hlFN, gamma-hlFN samt blandinger derav.

59. Fremgangsmåte ifølge krav 58, karakterisert ved at hlFN er naturlig hlFN.

60. Fremgangsmåte ifølge krav 58, karakterisert ved at hlFN er rekombinant hlFN.