HU201680B

HU201680B - Process for producing synergetic pharmaceutical compositions with antitumoural effect

Info

Publication number: HU201680B
Application number: HU885793A
Authority: HU
Inventors: Lloyd J Old; Elizabeth Carswell Richards; Berish Rubin; Barbara D Williamson; Jay S Prendergast
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1983-06-27
Filing date: 1984-06-26
Publication date: 1990-12-28
Also published as: HUT34775A; ES8608885A1; DD241271A5; HU197358B; PT78773A; GR82260B; FI842560A0; NZ208648A; EP0131789A3; AU587959B2; EP0131789A2; JPS6036420A; DD241268A5; ES545258A0; AU2933784A; ES533767A0; DK311984D0; CA1265444A; ES8603949A1; NO842572L

Description

A találmány tárgya eljárás tisztított humán tumorellenes anyagot (továbbiakban hTNF), és humán interferont (továbbiakban hIFN) tartalmazó, humán tumorok kezelésére alkalmas szinergetikus gyógyszerkészítmények előállítására.

Több, mint egy évszázada fedezték fel, hogy bizonyos bakteriális fertőzések során a fertőzött emberben jelenlévő tumorok egyidejűleg visszafejlődnek, in vivő. Ezzel a felfedezéssel kezdődött a tumor nekrózis faktornak (TNF) nevezett tumorellenes anyag kutatása. Coley és mások is több, mint 40 éven át kezelték a humán rosszindulatú daganatokat bakteriális eredetű sejtmentes szűrletekkel vagy vegyes bakteriális vakcinákkal, gyakran pozitív eredménnyel.

Tengerimalacokkal és egerekkel is végeztek kísérleteket. A tumorellenes hatás a fenti kísérleti állatokban súlyos vérzéses reakcióban nyilvánul meg a tumor magjában, a bakteriális kezelést követő 4 órán belül. Ezt követően lassabb, nekrotizáló hatás figyelhető meg, amelynek intenzitása a következő 48 óra alatt növekszik. A tumor színe egyre erősebben sötétedik, ami elhalásra és vérzésre utal, és sok esetben a tumor teljes visszafejlődését eredményezi. A fenti meglepő vérzéses elhalást - amely bizonyos kísérletes tumorok esetén Gram-negatív baktériumokkal vagy azok sejtfalából származó lipopoliszacharid természetű endotoxinokkal idézhető elő - már régóta a fentebb említett klinikai megfigyelések kísérleti megfelelőjének tekintik.

A Sloan-Kettering Intézetben végzett kutatások azonban arra utalnak, hogy a bakteriális stimulálás hatására egy - feltehetően makrofág eredetű - anyag válik szabaddá, amely közvetlenül vagy közvetve maga felelős a tumorölő hatásért. Bizonyíték erre az a kísérlet, amelyben kimutatták, hogy a BCG-vel fertőzött, endotoxinnel injektált egerek széruma vérzéses nekrózist okoz transzplantált Meth A szarkóma sejteken és más tumorokon. Ugyanakkor a BCG-vel fertőzött egerek, vagy az endotoxinnal kezelt fertőzetlen egerek széruma hatástalan. Az endotoxin önmagában a legtöbb tumorsejtre nézve nem toxikus, in vitro kísérletekben. A hatásos szcrum-komponcnst nevezik tumor nekrózis faktornak (továbbiakban TNF-nek).

A TNF aktivitást nem lehet a maradék endotoxinnak tulajdonítani, amelyet az endotoxin-maradék meghatározására alkalmas pirogén hatás, Limulus teszt és kémiai analízis segítségével mértünk. A TNF - eltérően az endotoxintól - in vitro közvetlenül toxikus bizonyos tumorsejtekre; a normális eredetű, tenyésztett sejtek nem károsodnak [Lloyd, J. Old: New Developments in Cancer Thcrapy, MSKCC Clinical Bulletin 6, 118 (1976); E. A. Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3666-70 (1975)]. Egyéb rágcsálók - például patkányok és nyulak - is termelnek TNF-et, BCG- és endotoxin kezelés hatására. A TNF-et először elsődlegesen BCG-vel (Bacillus Calmette Guérin) indukált, majd 2-3 hét múlva E. coliból származó endotoxinnal provokált egerek szérumában találták meg. önmagában sem a BCG, vagy annak alább ismertetett megfelelői, sem az endotoxin hatására nem jelenik meg TNF az egérszérumban, mind a kettőnek jelenlétére szükség van. A BCG helyett a retikuloendoteliális rendszerben a BCG-hez hasonlóan erős makrofág vagy egyéb celluláris elem szaporodást kiváltó Corynebacterium granulosummal, Corynebacterium Parvummal, maláriával vagy Zymosan-nal (élesztő sejtfal) is indukálhatjuk a TNF felszabadulást egérben. Ezek a BCG megfelelői. A BCG és endotoxin kezelés utáni szérum a szokásostól eltérő annyiban, hogy nem alvad meg teljesen.

Egérben a TNF optimális termelését és annak vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük:

a) BCG: 2 x 10⁷ élő BCG-sejtet tartalmazó inokulummal érjük el a retikuloendoteliális rendszer (RÉS) maximális stimulálását és a szövetszaporodást

b) endotoxin: 14-21 nap múlva, mikor a BCG-vel kiváltott RES-stimulálás a legnagyobb, 0,25-25 pg endotoxint (E, coliból származó lipopoliszacharidot) adunk az egereknek, a legnagyobb TNF-szint a legnagyobb dózissal érhető el.

c) TNF kinyerése: az optimális időpont 2 órával az endotoxin kezelés után van (későbbi időpontok kevésbbé jók a sokk által kiváltott keringési elégtelenség miatt)

d) TNF vizsgálata:

1. In vivő

A TNF-pozitív egérszérum nekrotizáló hatását (BALB/c x C57 BL/6)F! hibridbe transzplantált BALB/c Meth A ascites sarcomén vizsgáljuk, a következők szerint. Hét nappal a tumor szubkután transzplantálása után in vivő megvizsgáljuk a TNFpozitív szérum hatását a transzplantátumra, a hatást vizuálisan értékeljük 24 órán át. Reakció először 3-4 óra elteltével észlelhető. 7 napos transzplantátumban a nekrotikus válaszreakció általában a beadott 0,ΙΟ,5 ml TNF-pozitív szérum térfogatának felel meg. A +++ erősségű reakció azt jelenti, hogy a tumor teljesen, vagy majdnem teljesen elpusztult, és a látszólag élő tumoros szövetből csak egy gyűrű marad vissza. A 6 napos transzplantátumok kevésbbé érzékenyek, az 5 naposok egyáltalán nem reagálnak.

2. In vitro

A TNF-érzékeny L-M sejteket az American Type Culture Collection-tól származó klónozott egér L929 sejtekből nyertük. Az L-sejtek TNF-rezisztens sejtvonalát úgy állítottuk elő, hogy a TNF-érzékeny Lsejteket többször átoltottuk TNF-et tartalmazó táptalajba. A TNF a TNF-érzékeny L-sejtekre [L(S)] citotoxikus hatást fejt ki, míg a TNF-rezisztens L-sejtekkel [L(R)] szemben nem citotoxikus.

A vizsgálatot 24 lyukú Costar lemezen végezzük. A lyukakba 50 000 tripszinezett L-sejtet tartalmazó 0,5 ml Eagle-féle minimál táptalajt mérünk, majd 2-3 óra múlva a TNF-et sorozathígításban tartalmazó táptalajból hozzámérünk 0,5 ml-t. 48 óra elteltével fázismikroszkópos vagy tripán-kék festék kizárásos értékelés segítségével meghatározzuk az 50%-os sejtpusztulást okozó protein mennyiségét. Például egy standard sarzsra 1 egység részlegesen tisztított egér TNF 58 ng vagy 20 000 egység/mg specifikus aktivitású proteinnek felel meg. A fenti részlegesen tisztított egér TNF nem tartalmaz IFN-t. A tisztítás előtti eredeti szérumban még van kevés interferon (IFN). A BCG helyett indukálószerként C. granulosumot, C.

parvumot, maláriát vagy Zymosan-t (élesztő sejtfal) is használhatunk. Grecn és munkatársai [J. Nat. Cancer InsL 59, 1519 (1977)] szerint az egerekben az endotoxinnal szembeni maximális hiperszenzitivitás a C. parvum injektálása után hat nappal érhető el. Ennek megfelelően a fenti eljárás esetén az endotoxint 4 nappal a C. parvum beadása után adjuk az állatoknak. Az endotoxin dózisa 0,25 pg, de a TNF felszabadításának foko-23

HU 201 680 A zására 25 pg mennyiségben használjuk. A maximális TNF-felszabadulás 1 pg endotoxin ingavénás beinjektálása után 90 perccel figyelhető meg. A TNF-termelés különböző egértörzsek esetén különböző mértékű.

Jelenlegi ismereteink szerint a TNF in vivő felszabadítására a Gram-negatív baktériumokból - például E. coliból - származó endotoxinok a legalkalmasabbak [Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3666 (1975)].

A TNF hatása számos tumor (egér) rendszerben megfigyelhető, közelebbről az S-180 (CD-I Swiss), BP8 (C3H) szarkomákon; EL4 (C57B1/6), ASL1 (A törzs), RADA-1 (A törzs) és RL01 (BALB/c) leukémiákon; vagy P815 (DBA/2) masztocitómán. A Meth A erősen érzékeny a TNF-re abban az esetben, ha a tumort intradermálisan injektáltuk, mint azt az in vivő vizsgálatnál leírtuk. Kevésbé érzékenyek az alábbi tumorok: RCS5 (SJL) retikulum-sejt szarkóma rezisztensnek mutatkozott; a (C3H/An x I) Fi emlőtumorok csak kis mértékben érzékenyek, és az AKR spontán leukémiák közepesen érzékenyek a TNF-fel szemben. Fentiek szerint az egér TNF egér-tumorokkal szembeni terápiás hatása nyilvánvaló [Carswell és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72,3666(1975)].

In vitro a transzformált rágcsáló fibroblasztok (L-sejtek) szövettenyészetben sokkal érzékenyebbek voltak TNF-fel szemben, mint a Meth A szarkóma sejtek vagy az egérembrió fibroblasztok (MEF). Az élő sejtszámot 48 órás TNF-es kezelés után határozzuk meg. A hatás citotoxikus és citosztatikus, de késleltetett, mivel az első 16 órában nem figyelhető meg. Az in vivő hatás Meth A sejten egy nekrotikus folyamat, amely a Meth A tumor középpontjából kiindulva kifelé teljed, és a látszólag változatlan tumorszövetből csak egy gyűrű marad vissza. A visszamaradt tumorszövetből a tumor újra kifejlődhet Optimális dózisú TNF-fel végzett kezelés hatására a kezelt állatok nagy százalékában teljes visszafejlődés észlelhető. Az in vitro vizsgálat alapját az L-sejtekkel végzett vizsgálatok képezik, mint azt fentebb leírtuk. Rezisztens L-sejtvonalat is kitenyésztettünk, oly módon, hogy a TNF-érzékeny L-sejteket többször átoltottuk TNF-et tartalmazó táptalajba. A TNF citotoxikus és érzékeny L-sejtekre [L(S)], a rezisztens L-sejtekre [L(R)] azonban nem. A fenti vizsgálatokat is felhasználtuk a hTNF jellemzésére.

A vizsgálatokból közvetett módon arra következtethetünk, hogy a TNF egyik sejtforrását a makrofágok képezik egér és nyúl esetén, mivel a BCG - vagy annak megfelelői - és endotoxin hatására a máj- és lép-makrofágok erőteljes szaporodásnak indulnak.

összegezve: 1. a TNF-felszabadulást indukáló szerek erőteljes makrofág-szaporodást okoznak; 2. a BCG-vel előkezelt egerekben röviddel az endotoxin beinjektálása után megfigyelhető a lép-makrofágok szelektív lízise; 3. a TNF-et tartalmazó szérum lizoszomális eredetű enzim-tartalma magas, és az aktivált makrofágok jellemző módon sok lizoszomát tartalmaznak.

A klónozott egér histiocitoma sejtvonalak (J774 és PU5-1.8) TNF-et termelnek; ez a termelés endotoxin hatására jelentős mértékben fokozódik Mannel és munkatársai [Infect. Immun. 30,523 (1980)] és Williamson és munkatársai nem publikált megfigyelései szerint.

Az egér TNF, szérumból izolált formájában egy glikoproteint, amelynek legalább két, egy 40-60 000 és egy 150 000 molekulasúlyú formája van [Mannel és munkatársai: Infect. Immun. 28, 204 (1980); Kuli és munkatársai: J. Immunoi. 126, V219 (1981); Haranaka

K. és munkatársai: Jpn. J. Exp. Med. 51, 191 (1981); Green S. és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 381 (1976,) és nem publikált eredmények]. A TNF fagyasztott állapotban, előnyösen -70 *C alatt stabil. Aktivitását 70 *C-on 30 perc alatt elveszti. Nyulakban 5-500 pg/kg dózistartományban pirogén (lázkeltő) hatást fejt ki, 5 pg/kg dózisban nem lázkeltő. A nyúl TNF molekulasúlya irodalmi adatok szerint 39 000 és 68 000 közötti tartományban van [Ruff M. R. és munkatársai: J. Immunoi. 725,1671 (1980); Matthews N. és munkatársai: Br. J. Cancer 42, 416 (1980); Matthews N. és munkatársai: Brit. J. Cancer 38,302 (1978); Ostrove J. M. és munkatársai: Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 160,354 (1979)].

A protein-természetű interferon a gazdaállatokban előzetes vírusfertőzés eredményeként termelődik. A képződött interferon védi a gazdaállatot egy későbbi vírusfertőzéssel szemben. Az interferonnak (IFN) bizonyítottan fontos szerepe van az immunszabályozó rendszerben. Az interferon a vizsgálatok szerint a következő sejt-funkciókra hat: gátolja a sejtosztódást, a tumor növekedést, antitest-képződést, eritroid differenciálódást és adipocita differenciálódást, és serkenti a makrofág fagocitózist, limfocita toxieitást, NK sejt aktivitást, sejt felületi antigén kifejeződést és antitest termelést. Újabb eredmények szerint az IFN rákellenes szerként is szóbajöhet.

Három fő interferon típus van, mégpedig az alfa-, béta- és gamma-IFN, melyek egymástól antigén és biokémiai tulajdonságaikban különböznek. Az alfa-lFN-t a fehérvérsejt leukociták választják ki, a béta-IFN-t a fibroblasztok, és mindkettőt virálisan lehet indukálni. A gamma-IFN-t a limfoid sejtek választják ki, és mint immun-interferon ismert [Stewart W. E. II és munkatársai: Natúré 286, 110 (1980)]. A fenti három IFN-típus megkülönböztetése elsősorban az antigén tulajdonságok nagyfokú eltérésén alapul. Ezen kívül az INF-ek számos biológiai és fizikai-kémiai tulajdonságukban különböznek. A humán alfa- és béta-INF-t már sikerült megtisztítani, és aminosav-szekvenciáját meghatározni, részben közvetlen aminosav-szekvencia meghatározási módszerrel [Knight E. Jr. és munkatársai: Science 207, 525 (1980); Zoon K. C.: Science 207, 527 (1980)], és még teljesebben a klónozott komplementer DNS-szekvencia meghatározásával [Mantei N. és munkatársai: Gene 70,1 (1980); Taniguchi T. és munkatársai: Gene 70,11 (1980)]. A klónozott alfa-és béta-IFN DNS-szekvenciálat összehasonlítva csak 29%-os egyezést találtak a két fajta interferon között, aminosav-szinten [Taniguchi T., Mantei, N. és munkatársai: Natúré 285,547 (1980)]. A fenti három fő interferon-típuson belül molekuláris alcsoportokat is megkülönböztethetünk, ezek között azonban kisebb fokú az eltérés. A klónozott DNS-szekvenciák összehasonlításának segítésével ezidáig számos alcsoportot felismertek már a humán alfaIFN-en belül [Nagata S. és munkatársai: Natúré 287,401 (1980)].

A gamma-IFN-ról sokkal kevesebbet tudunk. A gamma-IFN általában a mitogéneknek - például különféle lektineknek vagy az érzékenyített sejtek tenyészetében található, specifikus antigéneknek - kitett limfocita-tenyészetek felülúszójában fordul elő. A gamma-IFN meghatározásának két fő kritériuma a következő: (i) az

HU 201 680 A alfa- és béta-IFN-től eltérően, a gamma-IFN biológiai aktivitása nagymértékben csökken savas kémhatásnak (pH 2) kitéve, és (ii) az alfa- és béta-IEN-nel szemben készített antiszérumok nem adnak keresztreakciót a gamma-IFN-nel. Fentieken kívül a viszonylag nyers gamma-IFN készítményekkel végzett kísérletekből arra következtethetünk, hogy számos biológiai különbség is van. Például Dianzani F. és munkatársai kimutatták, hogy a gamma-IFN sokkal lassabban indukálja a vírusellenes állapotot, mint a béta- vagy alfa-IFN [Natúré 283,400 (1980)]. Ezzel szemben a gamma-IFN sejtnövekedést gátló és tumorellenes szerként lehet, hogy hatásosabb [Crane J. L. Jr. és munkatársai: J. Nat. Cancer Inst. 61, 871 (1973); Gupta és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76,4817 (1979); Blalock és munkatársai: Cellular Immunology 49,390 (1980)].

Az IFN rákgyógyászati célú klinikai vizsgálatát gátolta az a tény, hogy nem tudták elegendő mennyiségben előállítani. A génsebészeti eljárások ezt a problémát megoldották, és a National Cancer Institute-ban már folynak a kísérletek a humán interferon (hIFN) nagy léptékű előállítására. így mind a természetes, mind a rekombináns hIFN-ek ismertek, és klinikai használatban vannak.

A találmány szerinti eljárásban használt humán TNF (hTNF) előállítására és tisztítására kidolgoztunk egy eljárást (lásd 197 358 lajstromszámú magyar szabadalmi leírást). Az eljárás a klinikai vizsgálatokban igen hasznos lehet Több, mint 30 humán sejtvonalat vizsgáltunk szövettenyészetben, TNF-termelő képességük szempontjából. Megállapítottuk, hogy a fórból-12-mirisztát- 12-acetát (PMA) jelenléte szükséges a hTNF termelés fokozásához. A PMA mint tumort elősegítő szer ismert. Jelenlegi ismereteink szerint a B-sejtvonalak, PMA-val vagy anélkül a legígéretesebb források a hTNF előállítására. A hTNF-et a fentebb ismertetett standard TNF-vizsgálati módszerekkel - azaz a tumorölő hatást az in vivő, az L-sejtekkel szembeni citosztatikus/citotoxikus hatást in vitro módszerrel - vizsgáltuk. A T-sejtek, monociták, és promyelocita sejtvonalak csak kevés TNF-et termelnek, vagy egyáltalán nem termelnek TNF-eL

Eljárásunk szerint sem külső eredetű BCG, sem külső eredetű endotoxin nem szükséges a hTNF előállítására.

Meglepő módon szinergetikus tumorellenes hatást tapasztaltunk, ha a hTNF-et rekombináns vagy természetes eredetű hIFN-nel együtt alkalmaztuk humán tumorsejtek elpusztítására vagy gátlására. A hIFN vagy hTNF önmagában alkalmazva is tumorellenes hatást mutat, de a hTNF hatása hIFN-nel együtt alkalmazva nagyobb, mint a fenti hatóanyagok külön-külön mért tumorellenes hatásának összege.

A találmány értelmében hTNF forrásként humán sejtvonalakat használhatunk. Az egér TNF előállítási eljárása nagymértékben függ a BCG és az endotoxin hatásától. A találmány szerinti eljárásban a humán TNF-et humán B-sejtek termelik, BCG vagy endotoxin hozzáadása nélkül. így az előállított TNF lényegében endotoxintól, valamint bakteriális és szérum szennyeződésektől mentes. Mint az 1. táblázatban látható, a vizsgált vérképző sejtek közül a B-sejtek a legjobb TNF-termelők. Az exogén BCG vagy exogén endotoxin nélküli nagymértékű TNF-termelés igen meglepő. Kis mennyiségű, vagy nyomnyi hTNF a T-sejtek, monociták vagy pro-myelociták sejttenyészetének felülúszójában is ta4 lálható. In vitro L-sejt vizsgálattal [Carswell és munkatársai fentebb idézett cikke] meghatározták a humán eredetű sejtek által termelt TNF mennyiségét. Azonban először sikerült az általunk kidolgozott eljárással magas TNF-szintet úgy előállítani, hogy a TNF minden exogén endotoxin szennyeződéstől mentes, mivel a tenyészethez - mint azt később ismertetjük - egyáltalán nem adunk endotoxint. Mások korábbi kísérleteikben egér TNF esetén az endotoxin jelenlétét zavarónak találták, mivel a rendszert nehéz az endotoxintól mentesíteni.

Az EBV-transzformált B-sejtvonalak melanómás betegektől származnak [Houghton és munkatársai: Proc. Nat Acad. Sci. USA 77,4260 (1980)]. A többi sejtvonalat a Sloan-Kettering Institute-tól, dr. Lloyd Old, dr. Jorgen E. Fogh és dr. Peter Ralph sejtbank-gyűjteményéből kaptuk. A LuklI sejteket dr. W. Stewart [Pickering és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77,5938 (1980)] bocsátotta rendelkezésünkre.

A vérképző humán sejtek TNF-termelésének vizsgálatára milliliterenként 5 x 10’ sejtet tenyésztünk 8% magzati borjúszérumot (FCS) tartalmazó RPMI 1640 táptalajban, 10 ng/ml PMA (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA) jelenlétében, vagy anélkül. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. A 2. táblázatban ismertetjük az RPMI 1640 táptalaj összetételét. A sejteket 48 órán át 37 ’C-on inkubáljuk, majd centrifugálással összegyűjtjük, és PMA nélküli RPMI 1640 táptalajban újraszuszpendáljuk, 1 x 10 ⁶ sejt/ml koncentrációban. 48 óra múlva a sejttenyészeteket lecentrifugáljuk, A sejtmentes felülúszókat-20 ’C-ra hűtjük. A TNF-aktivitást a fenti felülúszókban határozzuk meg, feles hígítás után, L-sejtes vizsgálati módszerrel.

Az in vitro vizsgálatban használt NCTC 929 klón (L)-sejtvonalból származó egér L-M sejteket az American Type Culture Collection-tól szereztük be, és Eagleféle minimál táptalajon (MÉM) (GIBCO, Grand Island, N. Y., USA) tenyésztettük, amelyet nem-esszenciális aminosavakkal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 g/ml streptomicinnel és 8% hővel inaktivált magzati borjúszérummal egészítettünk ki. A tenyésztést 37 ’C-on végeztük. Az egér TNF-rezisztens L-sejtvonalat [L(R)] szenzitív L-sejtekből [L(S)] tenyésztettük ki, egér TNFet tartalmazó táptalajba történő többszöri átoltással. A hTNF-aktivitás vizsgálatot úgy végezzük, hogy a vizsgáló lemez (24 lyukú Costar lemez) lyukaiba 0,5 ml táptalajban 50 000 tripszinezett L-sejtet mérünk, majd 3 óra múlva hozzámérünk azonos térfogatban (0,5 ml) olyan táptalajt, amely a TNF-et sorozathígításos koncentrációban tartalmazza, és meghatározzuk 48 óra elteltével fázis-mikroszkópos vagy tripán-kék kizárásos módszerrel azt a protein-mennyiséget, amely 50%-os sejtpusztulást okoz.

Mint az 1. táblázat adataiból látható, a humán B-sejtek által termelt hTNF az egér L(S) sejtekre citotoxikus hatást fejt ki, míg az egér L(R) sejtekkel szemben nem citotoxikus a fentebb ismertetett standard egér TNF vizsgálatban. A hTNF szempontjából vizsgált sejteket vagy tumor növekedést serkentő szer jelenlétében, vagy anélkül tenyészthetjük. A PMA például a B-sejtek hTNF-termelcsét többszörösére növeli, az 1. táblázat L(S) oszlopában található adatok szerint (lásd PMA nélkül/PMA jelenlétében oszlop). ΑΡΜΑTPAnéven is ismert.

Az L(929) (ATCC) sejtvonalból származó, hTNF-el szemben rezisztenssé tett tenyésztett egér L-M sejtek -47

HU 201680 A melyeket 10® sejtre számolva 2-3 pg hTNF-et tartalmazó talajban hetenként megismételt átoltással tenyésztettünk ki - teljes kereszt-rezisztenciát mutatnak az egér TNF-re. Ez a kereszt-rezisztencia nagyon figyelemre méltó.

A hTNF in vivő vizsgálatát [BALB/c x C57BL/6]F! nőstény egéren végeztük. Az állatoknak intradermálisan 5 χ 10⁵ Meth A szarkóma sejtet injektáltunk, majd 7 nappal később az állatok egyetlen intravénás adagban hTNF-et kaptak. 24 óra elteltével a tumor vérzéses elhalását az alábbi értékelési rendszer segítségével értékeltük ki:

(-) nincs hatás (+) enyhe hatás (++) közepes hatás (+++) erős hatás, a tumoros felület 90%-ára kiterjedő hatás (Carswell és munkatársai fentebb idézett cikke).

Az eredmények szerint a hTNF a standard TNF vizsgálatban in vitro és in vivő hasonló hatást mutat, noha általában a hTNF humán célsejtekkel szembeni specifikus aktivitása nagyobb, mint az egérből származó TNF-é.

Az endotoxin meghatározását Limulus Amebocyte lizátummal (Microbiological Associates) végeztük.

Mivel a klónozott egér histiocita sejtvonalak TNF-et termelnek, a normál és kóros humán histiociták vizsgálatát is célszerű elvégezni, a fenti sejtek hTNF termelésének meghatározása céljából, emberben. Az 1. táblázatban a B-sejtekkel kapott eredményekből arra következtethetünk, hogy a normál B-sejteknek is van hTNFtermelő képessége.

1. táblázat

Vérképző humán sejtvonalak hTNF-termelő képességének vizsgálata

Sejtvonal	Élű L-sejtek (%) in vitro
L(S)	L(R)
PMA nélkül	PMA jelenlétében	PMAnélkül/PMA jelenlétében	PMA nélkül	PMA jelenlétében
B-sejtek
BE*	47	20	2,3	100	100
BI*	57	43	1,3	100	98
CL*	95	37	2,6	100	97
CW*	28	8	3,5	100	100
DE*	45	18	2,5	100	100
DM*	18	11	1,6	100	100
DS‘	88	38	2,3	100	100
EJ*	27	16	1,7	100	100
EL’	70	16	4,4	100	100
EQ’	15	11	1,4	100	100
ER‘	47	22	2,1	100	100
FC*	19	8	2,4	100	100
FD‘	44	16	2.8	97	100
FG’	80	30	2.7	100	97
ARH-77	68	12	V	100	100
DAUDI	97	97	-	N.T.	N.T.
LuklI	20	13	1,5	100	100
RPMI1788	78	35	2,2	100	100
RPMI8226	96	84	1,1	100	86
RPMI 8866	32	10	3,2	100	98
SK-LY-16	98	100	-	100	100
SK-LY-18	99	100	-	100	98
ARA-10	77	39	2,0	100	97
BALL-1	100	100	-	100	100
T-sejtek
CCRF-CEM	100	100	-	100	100
P-12	95	94	-	99	98
MOLT-4	100	100	-	99	96
T-45	100	100	-	100	100

HU 201 680 A

1. táblázat folytatása

Sejtvonal	Élő L-sejtek (%) in vitro
US)	L(R)
PMA nélkül	PMA jelenlétében	PMAnélkül/PMA jelenlétében	PMA nélkül	PMA jelenlétében
HPB-ALL	100	97	-	100	100
TALL-1	96	94	-	96	96
Monociták
Jlll	100	100	-	99	98
THP	96	80	-	99	98
U-937	100	100	-	99	99
Promyclociták
HL-60	96	97	-	99	98

2. táblázat

RPMI 1640folyékony táptalaj összetétele (IX)
Összetevők	Koncentráció (mg/1)
Szervetlen sók
Ca(NO₃)₂ · 4H₂O	100,00
KC1	400,00
MgSO₄.7H2Ö	100,00
NaCl	6000,00
NaHCCb	2000,00
N_a2HPO₄.7H₂O	1512,00
Egyéb komponensek
D-glükóz	2000,00
glutation (redukált)	1,00
Aminosavak
L-arginin (szabad bázis)	200,00
L-aszp aragin	50,00
L-aszparaginsav	20,00
L-cisztin	50,00
L-glutaminsav	20,00
L-glutamin	300,00
glicin	10,00
L-hisztidin (szabad bázis)	15,00
L-hidroxi-prolin	20,00
L-izoleucin (allo-mentes)	50,00
L-leucin (metionin-mentes)	50,00
L-lizin.HCl	40,00
L-metionin	15,00
L-fenilalanin	15,00
L-prolin(L-hidroxi-prolin-mentes)	20,00
L-szerin	30,00
L-treonin (allo-mentes)	20,00
L-triptofán	5,00
L-tirozin	20,00
L-valin	20,00
Vitaminok
biotin	0,20
D-kalcium-pantotenát	0,25
kolin-klorid	3,00
folsav	1,00
i-inozitol	35,00
nikotinamid	1,00
p-amino-benzocsav	1,00
piridoxin.HCl	1,00
riboflavin	0,20
tiamin-HCl	1,00
Bt 2-vitamin	0,005

A találmányt közelebbről az alábbi példák segítségé20 vei kívánjuk ismertetni.

1. példa hTNF előállítása és koncentrálás LuklI sejtekből 5% FCS-t és 10 ng/ml PMA-t tartalmazó RPMI1640 táptalajban ml-enként 5 x 10⁵ LuklI sejtet szuszpendálunk, és a tenyészetet 37 ’C-on 48 órán át inkubáljuk. Ezután a sejteket centrifugálással összegyűjtjük, és 8-10 x 10⁵ sejt/ml koncentrációban szérum-mentes, 2 nmól/1 etanol-amint tartalmazó R-ITS PREMIX-ben [5 pg/ml inzulin, 5 pg/ml transzferrin, 5 ng/ml szelén szérum-pótló (Collaborative Research, Waltham Mass)] újraszuszpendáljuk és további 48 órán át inkubáljuk. A felülúszókat centrifugálással sejtmentesítjük, és -20 ’C-on megfagyasztjuk. A LuklI sejtek felülúszóját PM10 memb35 ránnal ellátott kevert Amicon cellában koncentráljuk, majd 40 x 2,6 cm-es, 0,15 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 mol/l-es Tris-pufferoldattal (pH 7,3) ekvilibrált DEAE-Sephadex A-50 töltetű oszlopra visszük, 5 ’C-on. A fenti összetételű pufferoldattal 5 ml-es frak40 ciókat eluálunk. A kezdeti átfolyó frakciókban meghatározzuk a TNF-aktivitást, majd a csúcs-frakciókat összegyűjtjük. A fenti eljárással a specifikus aktivitást 25-szörösére növeljük (2-5 x 10⁴ egység/mg protein). Az in vitro L-sejt vizsgálattal meghatározott hTNF-aktív frakciókat összegyűjtjük és Amicon cellában koncentráljuk. 1 egység TNF a protein azon mennyiségét jelenti, amely a standard in vitro TNF-vizsgálatban az L-sejtek 50%-os pusztulását okozza.

Az összegyűjtött frakciókban a hTNF specifikus ak50 tivitása közelítőleg 1 x 10³ és 1 x 10⁴ egység/mg protein közötti tartományba esik abban az esetben, ha a sejteket magzati borjúszérummal (FCS) kiegészített táptalajban tenyésztettük. Az összegyűjtött frakciókban a hTNF specifikus aktivitása közelítőleg 2 x 10⁴ és 5 x 10⁴ egység/mg protein közötti tartományban van abban az esetben, ha a sejteket szérum-mentes táptalajban tenyésztettük.

A DEAE-oszlopon frakcionált hTNF intravénásán injektálva a fentebb ismertetett in vivő vizsgálatban

Mclh A tumorokon vérzéses nekrózist okozott 300 pg hTNF 5 egér közül 1-ben +++ erősségű nekrózist váltott ki, míg a fennmaradó 4 állat esetén a nekrózis ++ erősségű volt. 150 pg hTNF 7 egér közül 5 állatban ++ erősségű, 2 állatban + erősségű nekrózist okozott 75 pg hTNF 5 állat közül 1 állatban -h- erősségű, 4 állatban +

-611

HU 201 680 A erősségű nekrózist okozott A kontroll csoportban 3 állat közül egynél sem találtunk nekrózist, a kontroll állatoknak azonos mennyiségű, DEAE-oszlopon frakcionált RPMI1640 táptalajt injektáltűnk. A fentiek értelmében a hTNF mind az in vitro, mind az in vivő INF meghatározásra szolgáló vizsgálatban aktívnak bizonyult

A hTNF molekulatömege - akár FCS-t tartalmazó, akár FCS nélküli táptalajon nyertük - közelítőleg 70 000 dalton, Sephacryl S-200 oszlopon végzett meghatározás szerint 12 órát meghaladó savas vagy lúgos kezelés hatására a hTNF aktivitása csökken, például pH 2,0-nél az aktivitás 90%-a, pH 4,0-nél 55%-a, pH 10-nél közel 45%-a megsemmisül. Hőstabilitást tekintve a hTNF aktivitása 70 ’C-on 60 perces kezelés hatására megsemmisül, míg 56 ’C-on 60 perces kezelés után megmarad. Az aktivitás még huzamos ideig tartó -78 ‘C-os vagy -20 *C-os raktározás után is megmarad.

A PMA-val serkentett LuklI sejtek frakcionálatlan felülúszójában 100 egység/ml IFN-aktivitást találtunk. A DEAE-kromatográfiás eljárással tisztított hTNF összegyűjtött frakcióiban nem találtunk interferon-aktivitást, sem a használt tisztított egér TNF-ben. A humán interferon aktivitást a hólyagos stomatis vírus WISH vagy GM 2767 sejtek elleni hatásának gátlásával mértük [Stewart W. E. II: The Interferon System, 1979 (Springer, Vienna)], és a rekombináns humán alfa-IFN (Hoffman-La Roche) esetén nemzetközi standarddal, humán természetes gamma-IFN esetén pedig laboratóriumi standarddal hasonlítottuk össze. A 2-4 x 10⁸ egység/mg protein aktivitású rekombináns alfa-hIFN-t a HoffmanLa Roche-tól kaptuk, a leukocita eredetű természetes alfa-hIFN-t (aktivitása 0,64 x 10⁶ egység/mg protein) a Kocher Laboratory (Bem, Svájc) állította elő, a SloanKettering Institute értékelési programja keretében, az 1 x 10⁷ egység/mg protein specifikus aktivitású természetes béta-hIFN-t a Roswell Park Memóriái Institutetól (RPMI) kaptuk, míg az 1 x 10⁷ egység/mg protein specifikus aktivitású leukocita eredetű természetes gamma-hlFN dr. Berish Rubin-tói (Sloan-Kettering Institute) származott. Sem az egér, sem a humán TNF nem rendelkezett részlegesen tisztított állapotban kimutatható mértékű IFN-aktivitással. A különféle humán interferonok sem rendelkeztek kimutatható hTNF-aktivitással, mivel a fentebb ismertetett in vitro vizsgálatban nem mutattak citotoxikus vagy citosztatikus hatást érzékeny L-sejtekkel szemben.

Mint a 3. táblázat adataiból látható, az előállított hTNF különböző sejtekkel szemben különböző hatást fejt ki. Citotoxikus hatásról csak akkor beszélünk, ha az élő sejtszám 7 nap múlva 35%-kal, vagy annál nagyobb mértékben csökken, míg citosztatikus hatás esetén a sejtszám csökkenése 7 nap múlva 35%, vagy annál nagyobb. Ebben a vizsgálatban - és a leírásban ismertetett több vizsgálatban is - a fentebb leírt módon LuklI sejtekkel termelt hTNF-et használunk. Az adott példákkal azonban csak ismertetni kívánjuk a találmány szerinti megoldást, nem korlátozni. Más B-sejtvonalakból származó hTNF, vagy más humán sejtekből előállított TNF is használható in vivő és in vitro a különféle humán sejtekkel végzett vizsgálatokban.

A 3. és 4. táblázatban közölt adatokból látható, hogy a hTNF az egér TNF-hez hasonló hatást fejt ki a humán emlő-sejtvonalakra, mivel mindkettő citotoxikus hatású a vizsgált emlőrák eredetű sejtvonalak többségére. A tüdő- és melanoma-sejtekre is hat a hTNF, a hatás azonban főleg citosztatikus. A vizsgált négy normál sejtvonal tüdő-, vese-, magzati tüdő- és magzati bőr-sejtvonal— közül egy sem volt érzékeny a hTNF-fel szemben; Ennek alapján úgy tűnik, hogy a hTNF csak tumoros humán sejteken fenti ki citotoxikus, citosztatikus vagy vérzéses nekrózist okozó hatását A hTNF humán célsejtekkel szembeni specifikus aktivitása nagyobb, mint azegérTNF-é.

A humán interferonok - mind az alfa-, béta- és gamma-interferon -, tekintet nélkül arra, hogy természetes eredetű vagy rekombináns interferonról van szó, ismert módon gátolják a tumoros sejtek növekedését, például az 5._} 6. és 9. táblázatban közölt tumor-sejtvonalak esetén. Általában a 35%-os vagy annál nagyobb citotoxikus vagy citosztatikus hatás eléréséhez szükséges vírusellenes EFN-egységek száma alfa-IFN esetén nagyobb, mint béta-IFN vagy gamma-IFN esetén. Az IFN-készítmények közül egy sem fejt ki citotoxikus vagy citosztatikus hatást L(S) egér-sejtekre in vitro, amiből a hTNF-aktivitás hiányára következtethetünk. Mégis, ha ezt a két sejtek által termelt anyagot megtisztítjuk, és együtt alkalmazzuk, a mérhető hatás nagyobb, mint a külön-külön mutatott hatásösszege, amintaz a7. és 8. táblázatban ismertetett példákból is látható. Az IFN és hTNF együttes citotoxikus hatása Clarké [Ann. N. Y. Acad. Sci. 76, 915 (1985)] módszere szerint meghatározva is szinergetikusnak, azaz farmakológiailag szinergetikusnak bizonyult, a 10., 11. és 12. táblázat eredményei szerint Ez az előre nem várt eredmény nagyon értékes lehet a humán tumorok kezelése szempontjából.

3. táblázat hTNF hatása humán sejtvonalakra

Citotoxikus hatás:

SK-MG-4 (asztrocitoma)

MCF-7 (emlőrák)

BT-20 (emlőrák)

SK-BR-3 (nyakrák)

SK-CO-1 (vastagbél-rák)

RPMI 7931 (melanoma)

Citosztatikus hatás:

SK-LU-1 (tüdőrák)

RPMI 4445 (melanoma)

SK-MEL-29 (melanoma)

SK-MEL-109 (melanoma)

SK-OV-3 (petefészek-rák)

Hatástalan:

T-24 (hólyagrák)

5637 (hólyagrák)

MDA-MB-361 (emlőrák)

S-48 (vastagbél-rák)

SK-LC-4 (tüdőrák)

SK-LC-6 (tüdőrák)

SK-LC-12 (tüdőrák)

SK-MEL-19 (melanoma)

SK-UT-1 (méhrák)

SAOS-2 (ösztiogén szarkóma)

U20S (ösztrogén szarkóma)

WI-38 (normál magzati tüdő)

MY (normál vese-hám)

F-136-35-56 (normál magzati tüdő)

F-136-35-56 (normál magzati bőr)

-713

HU 201 680 A

4. táblázat hTNF hatása négy humán tumor sejtvonalra (a hTNF-hez a 0. napon 5 xlO⁴ sejtet mérünk)

Sejtvonal	hTNF mennyisége	3. nap	5. nap	7. nap
gg protein/tenyészet	TNF-egység	élő sejt (%)	sejtszárn x 10⁵	élő sejt (%)	sejtszájn x 10⁵	élő sejt (%)	sejtsz^n x
BT-20	48,0	1263	24	1,03	16	1,55	5	1,45
(emlő)	19,2	505	30	1,08	19	1,43	7	1,38
(citoto- xikus)	9,6	253	45	1,05	21	1,53	10	130
4,8	126	49	1,03	30	1,60	18	1,23
	1,2	32	50	1,05	53	1,80	61	2,43
	Kontroll	0	93	0,99	94	2,23	96	3,39
ME-	24,5	645	83	1,78	52	2,70	49	6,33
180	9,8	258	83	1,73	57	2,83	49	7,38
(nyak) (citoto-	4,9	129	80	1,75	70	3,48	58	8,03
xikus)	2,45	63	81	1,73	76	4,00	63	8,23
Kontroll	0	98	1,62	97	4,48	97	1,01
SK-	24,5	645	91	0,80	86	1,63	72	1,68
MEL-	9,8	258	96	1,15	90	1,93	91	2,68
109 (me- lanoma) (citosz-	4,9	129	94	1,35	93	2,13	90	2,93
2,45	63	94	1,25	93	2,10	92	3,13
tatikus)	Kontroll	0	98	2,19	98	3,89	99	9,78
T-24	48,0	1263	95	2,38	98	4,60	99	7,75
(hólyag)	19,2	505	96	2,83	97	4,55	98	8,58
(hatásta- lan)	9,6	253	97	2,78	98	4,65	98	8,33
4,8	126	98	3,25	99	4,55	98	833
	Kontroll	0	100	3,23	98	4,53	99	8,38

5. táblázat

Rekombináns humán alfa-interferon hatása négy humán sejtvonalra (Az IFN-hez a 0. napont 5 xlO⁴ sejtet mérünk)

Sejtvonal	IFN egység/tenyészet	3. nap	5. nap	7. nap
élő sejt (%)	sejtszám x 10^S	élő sejt (%)	sejtszám x 10⁵	élő sejt (%)	sejtszám x 10⁵
BT-20	50 000	83	0,60	31	0,65	28	0,90
	12 500	85	0,65	47	095	38	0,925
	3 125	83	0,72	74	1,25	65	1,37
	781	83	0,75	75	1,32	70	1,40
	Kontroll	95	1,04	93	2,30	97	5,40
ME-180	50 000	85	1,02	78	1,67	62	2,00
	12 500	91	1,18	86	1,92	79	3,40
	3 125	90	1,30	91	2,02	87	4,20
	781	95	1,42	93	2,70	90	4,90
	Kontroll	98	1,87	98	5,91	98	7,80
SK-MEL-	50000	62	0,60	15	1,35	10	1,25
109	12 500	58	0,65	34	1,77	37	2,10
	3 125	67	1,12	52	1,80	54	2,40
	781	79	1,42	69	2,37	74	2,50
	Kontroll	97	2,20	98	3,60	98	6,80
T-24	50 000	95	1,60	94	4,10	83	4,80
	12 500	94	1,70	96	4,70	89	5,30
	3 125	94	1,98	95	4,80	90	5,90
	781	97	2,72	94 .	4,97	90	7,40
	Kontroll	98	3,43	96	6,05	93	7,97

-815

HU 201 680 A

6. táblázat

Természetes humán gamma-interferon hatása négy humán sejtvonalra (Az IFN-hez a 0. napon 5 x 10* sejtet adunk)

Sejtvonal	hIFN egység/tenyészet	3. nap	5. nap	7. nap
élő sejt (%)	sejtszám x 10⁵	élő sejt (%)	sejtszám x 10⁵	élő sejt (%)	sejtszám x 10⁵
BT-20	250,00	73	1,33	79	2,20	58	2,83
	125,00	81	1,43	81	2,43	66	3,15
	31,25	84	1,78	86	2,70	79	4,03
	7,80	86	1,93	93	2,78	87	3,83
	Kontroll	95	1,64	97	3,61	97	5,44
ME-180	250,00	67	1,15	49	1,23	22	1,95
	125,00	69	1,20	56	1,30	26	1,90
	31,25	72	1,32	61	1,30	34	1,78
	7,80	79	1,55	67	1,38	50	2,65
	Kontroll	98	2,45	98	5,00	96	7,75
SK-	250,00	55	1,00	51	1,73	23	2,30
MEL-109	125,00	67	1,00	61	2,00	38	2,78
	31,25	74	1,18	82	3,02	61	3,35
	7,80	85	1,15	90	3,28	77	5,45
	Kontroll	98	2,05	98	3,53	96	5,43
T-24	2000,00	100	1,75	95	2,58	93	2,48
	500,00	100	2,08	95	2,52	94	3,10
	125	99	2,40	95	2,90	96	3,52
	13,25	99	3,03	98	4,95	98	6,45
	7,80	99	3,35	98	7,00	98	9,45
	Kontroll	99	4,00	98	7,35	99	10,40

7, táblázat hTNF és rekotnbináns humán alfa-IFN hatása négy humán tumor sejtvonalra (a 0. napon 5 x 10* sejthez hTNF-et és/vagy IFN-t adunk)

Sejtvonal	hTNF mennyisége (egység)	IFN mennyisége (egység)	Élő sejt (%)
3. nap	5. nap	7. nap
BT-20	4	3125	26	6	5
	4	0	74	64	62
	0	3125	83	74	65
	Kontroll		95	93	97
ME-180	16	3125	53	25	20
	16	0	85	82	70
	0	3125	90	91	87
	Kontroll		98	98	98
SK-MEL··	33	781	33	19	25
109	33	0	96	96	96
	0	781	79	69	74
	Kontroll		97	98	98
T-24	33	781	97	93	85
	33	0	98	95	88
	0	781	94	95	90
	Kontroll		98	96	93

-917

HU 201 680 A

8. táblázat nTNF és természetes humán gamma-IFN hatása négy humán tumor sejtvonalra (aO. napon 5 x 10* sejthez hTNH-t és/vagy hlFN-t adunk)

Sejtvonal	hTNF mennyisége (egység)	IFN mennyisége (egység)	Élő sejt (%)
3. nap	5. nap	7. nap
BT-20	25	31,25	11	10	6
	25	0	56	46	31
	0	31,25	84	86	79
	Kontroll		95	97	97
ME-180	50	125	2	4	5
	50	0	77	72	60
	0	125	69	56	26
	Kontroll		98	98	96
SK-MEL-109	100	125	9	6	2
	100	0	95	93	92
	0	125	67	61	38
	Kontroll		98	98	96
T-24	200	125	99	94	94
	200	0	97	97	96
	0	125	99	97	93
	Kontroll		99	98	93

9. táblázat

Humán interferonok citotoxikus és citosztatikus hatása öt humán sejtvonalra

Humán interferon	35%-os citotoxicitást (CT) vagy citosztázist (CS) okozó antivirális egység száma
BT-20	ME-180	SK-MEU-190	T-24	WI-38
CT	CS	CT	CS	CT	CS	CT	CS	CT	CS
természetes alfa-IFN	270	25	6500	110	1250	26	>50 000	1900	>50 000	230
rekombináns alfa-IFN	3125	<781	44 000	<781	1400	<781	>50000	16 000	>50 000	>50 000
természetes béta-IFN	<49	<49	260	<49	<49	<49	>12500	<49	>25 000	160
természetes gamma-IFN	130	72	<7,8	<7,8	22	27	>2000	25	>2000	>2000

10. táblázat hTNF és természetes gamtna-hIFN szinergetikus hatása BT-20 sejtvonalra

IFN konc. (egység/tenyészet)	hTNF konc. (egység/tenyészet)	3. nap	5. nap
sejtszám χ 10⁵	élő sejt (%)	sejtszám χ 10⁵	élő sejt (%)
250 (X)*		1,08	74*	1,40	64’
125 (1/2 X)		1,03	76	1,83	79
62,5 (1/4 X)		0,95	84	1,73	83
	50 (Υ)’	1,15	48’	1,75	37’
	25 (1/2 Y)	1,10	52	1,98	47
	12,5 (1/4 Y)	0,98	59	2,28	54
250 (X)	50 (Y)	0,75	3	1,05	5
125 (1/2 X)	50 (Y)	0,75	10	1,05	5
62,5 (1/4 X)	50 (Y)	0,70	7	1,05	9

-1019

HU 201 680 A

10. táblázat folytatása

IFN konc. (egység/tenyészet)	hTNF konc. (egység/tenyészet)	3. nap	5. nap
sejtszám x 10⁵	éld sejt (%)	sejtszám x 10⁵	élő sejt (%)
250 (X)	25 (1/2 Y)	0,85	12	1,05	5
125 (1/2 X)	25 (1/2 Y)	0,73	14	1,00	7
62,5 (1/4 X)	25 (1/2 Y)	0,74	13	0,80	12
250 (X)	12,5 (1/4 Y)	0,80	22	1,13	11
325L Ο# X)	12,5 (1/4 Y)	0,75	17	1,15	11
(1/4 X)	12,5 (1/4 Y)	0,67	22’	1,15	11’
Kontroll	1,02	96	1,97	94

* Szinergizmus: 1/4 X + 1/4 Y

11. táblázat hTNF és természetes gamma-hIFN szinergetikus hatása SK-MEL-109 sejtvonalra

IFN konc. (egység/tenyészet)	hTNF konc. (egység/tenyészet)	3. nap	5. nap
sejtszámx 10⁵	élő sejt (%)	sejtszám x 10⁵	élő sejt (%)
250 (X)		1,20	58’	1,08	32’
125		1,25	70	1,15	43
62,5		1,20	72	1,50	63
	200 (Y)	0,80	87’	1,38	87’
	100	0,80	91	1,63	92
	50	1,15	91	1,73	96
250	200	0,875	8	0,90	3
125	200	0,80	12	0,85	6
62,5	200	0,775	16	0,83	6
250	100	0,825	12	0,83	3
125	100	0,80	16	0,925	6
62,5	100	0,825	18	0,95	16
250	50	0,80	19	0,85	6
125	50	1,00	32	0,90	11
62,5’	50’	0,875	31’	0,90	14’
Kontroll	1,44	96	4,12	99

* Szinergizmus: 1/4 X + 1/4 Y

72. táblázat hTNF és természetes gamma-hIFN szinergetikus hatása ME-180 sejtvonalra

IFN konc. (egység/tenyészet)	hTNF konc. (egység/tenyészet)	3. nap	5. nap
sejtszám x 10⁵	élő sejt (%)	sejtszám x 10⁵	élő sejt (%)
250* (X)		1,15	67*	1,15	56’
125		1,30	71	1,40	64
62,5		1,33	75	1,35	67
	-200* (Y)	2,48	81’	4,20	55*
	100	2,38	86	4,40	59
	50	2,40	89	4,40	63
250	200	0,775	6	1,25	4
125	200	0,775	6	1,15	2
62,5	200	0,775	6	1,25	4

-1121

HU 201 680 A

12. táblázat folytatása

IFN konc. (egység/tenyészet)	hTNF konc. (egység/tenyészet)	3. nap	5. nap
sejtszám x 10⁵	éld sejt (%)	sejtszám x 10⁵	éld sejt (%)
250	100	0,83	3	1,20	2
¹²⁵	100	0,80	3	1,23	2
62,5	100	0,80	12	1,15	2
250	50	0,875	6	1,23	0
125	50	0,85	12	1,05	2
62,5	50	0,80	16’	1,08	7’
Kontroll	2,69	98	5,61	98

* Szinergizmus: 1/4 X + 1/4 Y

A hTNF, hIFN, illetve a kettő kombinációjának különféle humán sejtvonalakra kifejtett hatását az alábbi eljárás szerint határozhatjuk meg. A sejteket tripszinezzük, kétszer öblítjük, és 8% FCS-t tartalmazó MÉM 20 táptalajban 4-5 x 10⁴ sejt/lyuk koncentrációban 24 lyukú Costar lemezre visszük, majd 37 ’C-on inkubáljuk.

16-24 órán át tartó inkubálás után a táptalajt leszivatjuk, és a sejtekhez 1 ml-es hígításban DEAE-frakcionált hTNF-et, vagy IFN-t, vagy hTNF és IFN elegyét mérjük. 25 Az összes sejtszámot - azaz az élő és elpusztult sejtek számát - a 3., 5. és 7. napon fázis-mikroszkópos eljárással határozzuk meg. A tenyészeteket az 5. napon a hTNF-et és/vagy IFN-t azonos koncentrációban tartalmazó friss táptalajjal töltjük fel. A fenti eljárással kaptuk 30 a 3-9. táblázatban ismertetett eredményeket

Két anyag együtthatását, illetve a potencírozó hatást Clark fenti irodalmi helyen ismertetett módszere szerint határozzuk meg,jelen esetben X a hIFN-t, Y a hTNF-et jelenti. A fokozott tumor-gátlást vagy sejt-toxicitást úgy 35 mutatjuk ki, hogy meghatározzuk az 1/4 X + 1/4 Y együttes hatását, és ha ez a negyed dózis kombinációval elért hatás összemérhető a külön-külön teljes dózisban mutatott hatással, a két faktor - jelen esetben a hTNF és hIFN - közötti szinergizmust bizonyítottnak tekintjük. 40 A szinergizmust a 10-12. táblázat eredményei bizonyítják. A sejtszám-meghatározást a fentebb ismertetett - a 4-8. táblázatban összefoglalt vizsgálatok során is használt - eljárással végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a sejtszámot csak a 3. és 5. napon határozzuk meg. 45 A szinergizmus világosan látszik abból az eredményből, hogy az 1/4 hIFN + 1/4 hTNF dózis esetén mért hatás nagyobb, mint ha a TNF-et vagy IFN-t külön-külön, teljes dózisban vizsgálnánk, a 10., 11. és 12. táblázatban közölt eredmények alapján, három humán sejtvonal ese- 50 tén.

A fentiek értelmében a hTNF és hIFN, önmagában, vagy kombinációban humán tumorok és rákos rendellenességek kezelésére használható, mivel a két anyag együttes alkalmazás esetén kifejtett citotoxikus aktivitá- 55 sa nagyobb, mint bármelyiküké, önmagában. Maximális gyógyhatás elérésére a rákos betegeket nyilvánvalóan vagy a TNF és/vagy IFN termelésre kell serkenteni, vagy a fenti két anyag különböző kombinációival kell kezelni, vagy a teljesebb hatás elérése céljából a két 60 módszert váltogatni kell, illetve különböző, meghatározott sorrendet kell betartani. Ha az IFN maximális hatásához egyéb faktorok - például TNF - jelenléte is szükséges, a fenti hiány megszüntetése az IFN rákellenes hatásának növekedését eredményezheti. Az IFN fokozott hatása annak tulajdonítható, hogy a hTNF mint az immunrendszer biológiai válaszát módosító anyag működik.

A gyógyászati készítményeket a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy a hIFN és hTNF hatóanyagokat 1:0,2-1:0,8 arányban egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé - például steril oldattá, tablettává, bevonatos tablettává vagy kapszulává - formáljuk, a szokásos módon.

Hordozó- és segédanyagként például keményítőt, tejcukrot, agyagot, zselatint, sztearinsavat vagy annak sóit, talkumport, növényi olajokat, gumikat és glikolokat használhatunk.

A gyógyászati készítmények orális, enterális vagy rektális úton adagolható, vagy injektálható készítmények formájában lehetnek. Készíthetünk azonban szemcseppet vagy kenőcsöt is.

A fenti gyógyászati készítményeket például úgy állítjuk elő, hogy az elegyet nedvesen granuláljuk, majd közvetlenül tablettává préseljük; vagy az elegyet kemény vagy lágy zselatinkapszulába töltjük; vagy az elegyet vízben vagy steril vizes oldatban oldjuk; vagy a kúp-alapanyagot képező zsírt megolvasztjuk és belekeverjük az elegyet; vagy a hatóanyagokat egy gumihoz vagy paraffinhoz adva kenőcsöket vagy pasztákat készítünk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás tumorgátló hatású szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy humán tumomekrózis faktort (hTNF) és humán inteferont (hIFN) 0,2: 1-0,8 :1 arányban a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverünk és gyógyszerkészítménnyé alákítunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hIFN-ként alfa-hIFN-t, béta-hIFN-t, gammahlFN-t vagy azok elegyét használjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hIFN-ként természetes hIFN-t használunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hIFN-ként rekombináns hIFN-t használunk.