JPH03501382A - 組換えコロニー刺激因子‐１の使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 組換えコロニー刺激因子−１の使用 亘五公互 本発明は組換生産されたヒトコロニー刺激因子−１（Ｃ５Ｆ−１）の種々の使用 に関する。

宜量狡五 種々の組織中で非常に低濃度で生産されるある種の因子の、骨髄原細胞の増殖並 びに顆粒球及び／又はマクロファージへの発達を刺激する能力はここ１５年の間 知られている。血清、尿サンプル及び多くの種からの組織抽出物中のこれらの因 子の存在は、半固形培地にプレートされた骨髄細胞によるコロニーの形成の刺激 を測定するインビトロアッセイを用いて証明される。インビボアッセイは知られ ていない。これらの因子はこの様なコロニーの形成を誘導するので、これらの因 子はコロニー刺激因子（Ｃｏｌｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ 　；　Ｃ５Ｆ）と総称されている。

さらに最近、生ずるコロニー中に見出される細胞のタイプに従って定義すること ができる少なくとも４つのサブクラスのヒトＣＳＦ蛋白質が存在することが示さ れた。１つのサブクラスであるＣ５Ｆ−１は主としてマクロファージを含有する コロニーをもたらす。他のサブクラスは、好中顆粒球及びマクロファージの両者 を含有するコロニー、主として好中顆粒球を含有するコロニー、並びに好中顆粒 球、好酸顆粒球及びマクロファージを含有するコロニーを生じさせる。

上記のヒ）　ＣＳＦに類似するネズミ因子が存在し、これにはこれらすべての細 胞形に加えて巨核球、赤血球及びマスト細胞を種々の組合わせで含有するコロニ ーを骨髄細胞から誘導するＩＬ−３と称されるネズミ因子が含まれる。これらの Ｃ５ＦははＤｅｘｔｅｒ、Ｔ、Ｍ、　、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９　：　 ７４６　；　Ｖａｄａｓ、Ｍ、Ａ、らＪ、ｒｍｍｕ−ｎｏｌ、　（１９８３）１ ３０　：　７９３　；　Ｃ１ａｒｋ、Ｓ、Ｃ，５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３ ６　：　１２２９　；及び５ａｃｈｓ、Ｌ、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８ 　：　１３７４に総説されている。

本発明は、これらのサブクラスの内の第一のものの構成員である蛋白質Ｃ５Ｆ− １の組換生産に関する。このサブクラスは特異的ラジオイムノアッセイ及びラジ オレセプターアッセイによりさらに特徴付けられそして描写されている。例えば 、精製されたＣ３Ｆ−１に対して生じた抗体は他のサブクラスの生物学的活性に 影響を与えることなく　Ｃ５Ｆ−１活性を特異的に抑制し、そしてマクロファー ジ細胞系Ｊ７７４はＣ５Ｆ−１に特異的に結合するレセプターを含有する。これ らのアッセイの記載はＤａｓ、Ｓ、に、らＢｌｏｏｄ（１９８１）５８　：　６ ３０により公表された。

−ａにＣＳＦ蛋白質にそして特にＣ５Ｆ−１になんらかの有用な機能を行わせる 場合の有意な困難性は、それらが分類された且つ特徴付けることができる形態で 、実際に又は可能性として療法的用途において使用するのに十分な量で得ること ができなかったことである。本発明は、精製されたヒト及びネズミＣ３Ｆ−１を 組換技法により有用な量で提供することによりこれらの困難を除去する。

〔異るサブクラスのＣ５Ｆ蛋白質であるネズミ及びヒトのＧＭ−ＣＳＦは精製さ れており、そしてそのｃＤＮＡはクローニングされている。この蛋白質が他のＣ ５Ｆ　、例えばＣ３Ｆ−１と異ることがＧｏｕｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４ ）３０９　：　７６３−７６７により示された。このＧＭ−ＣＳＦ蛋白質は、１ ９８７年４月９日に公開されたＷＯ８７１０２０６０において、伝統的な癌治療 の後に白血球を再生させるために癌患者を治療するため、並びにウィルス性、細 菌性、真菌性及び奇生性感染、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の可能 性を減少させるために有用なものとしてさらに記載されている。ネズミＩＬ−３ はＦｕｎｇ、ｌＩ、Ｃ０ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０７　：　２３３によ りクローニングされている。さらに、Ｙｏｋｏｔａ、Ｔ、ら、匡。

Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　（１９８５）８２　：　４３６０−４３６４　；及びＣ ａｎｔｒｅｌｌ、Ｍ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　（ＵＳ Ａ）　（１９８５）８２　：　６２５０−６２５４を参照のこと〕。

Ｃ５Ｆ−１単独、あるいはエリスロポイエチン及び／又は抗ウィルス剤及び／又 はＩＬ−２との組合わせによるＡＩＤＳ患者の治療が１９８７年６月４日に公開 されたＷＯ８７１０３２０４に報告されている。１９８４年１１月１３日発行の 米国特許局、４，４８２．４８５は、ＣＳＦが癌の治療における支持の役割のた めに使用し得ることを記載している。さらに、１９８４年９月１９日に公開され たＥＰ　１１８，９１５は癌治療を受ける患者における顆粒球減少症及びマクロ ファージ減少症の予防及び治療のため、感染予防のため、並びに骨髄が移植され た患者の治療のためのＣＳＦの生産を報告している。さらに、Ｃ３Ｆ−１は非特 異的殺腫瘍活性を刺激することが報告されている（Ｒａｌｐｈら、Ｉｍｍｕｎｏ ｂｉｏｌ、　（１９８６）１７２　：　１９４−２０４）。　Ｒａ１ｐｈら、Ｃ ｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８３）７６　：　１０−２１　は、ＣＳＦが繊 維肉腫１０２３、リンパ腫１８−８及びり、）ロピカ（Ｌ、丼」状９）無鞭毛期 （ａｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ）に対する殺腫瘍活性及び殺微生物活性のためのマク ロファージの活性化において迅速且つ直接的な役割を有しないことを報告した。

Ｒａ１ｐｈら、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

（１９８７）月匝：　２７０−２７９は、ネズミ肉腫ＴＵ５標的に対するＣ３Ｆ −１とリンホカインとの組合せの相加的効果を報告している。

さらに、Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８６）　１３７　： 　２２８１−２２８５は、Ｃ３Ｆ−１がインターフェロンの単球生産、ＴＮＦ及 びコロニー刺激活性を刺激することを開示している。ＬｅｅらＪ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ。

（１９８７）趨：　３０１９−３０３３は、ネズミマクロファージにおける一ウ ィルス感染に対するＣ５Ｆ−１により誘導される耐性を開示している。

本光里■塁！ １つの観点において、本発明は、幹細胞からの好中球を含めての白血球の生産を 増強するため、哺乳類における細菌性及びウィルス性の両方の感染性疾患の予防 的又は治療的処置のため、哺乳類における腫瘍の治療のため、腫瘍細胞に対する マクロファージの抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の刺激を増強するため、並び に創傷の治癒を促進するための組換Ｃ３Ｆ−１の組成物及び使用に関する。さら に、本発明は賦形剤、サイトカイン又はリンホカインと混合してＣ５Ｆ−１を含 んで成るこれらの医薬組成物の使用に関する。

辺１渾」Ｕ創莞礼盟 第１図は、Ｃ５Ｆ−１をコードするｃＤＮＡクローンのＤＮＡ及び推定されるア ミノ酸配列を示す。

第２図は、ヒトＣ５Ｆ−１配列をコードする３、９ｋｂ　ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片の 配列決定された部分及びエクソン領域の推定アミノ酸配列を示す。

第３図は、腫瘍細胞を殺すマクロファージの能力の増強におけるＣ５Ｆ−１及び 他のコロニー刺激因子の比較を示す。

日を　るためのヒ Ａ、定義 「コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）はＣ３Ｆ−１について当業界において理 解されている活性のスペクトルを示す蛋白質を意味する。すなわち、Ｍｅｔｃａ ｌｆ、Ｄ、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（１９７０）７６　：８９の標準 的インビトロコロニー刺激アッセイにかけられた場合、このものは主としてマク ロファージコロニーの形成をもたらす。生来のＣ５Ｆ−１はグリコジル化された 二量体であり、二量体化は活性のために必要であろう。二量体形及び単量体形の 両者が本発明の範囲及びＣ５Ｆ−１の定義内に入ると理解される。単量体形は細 胞内条件を試験管内で与えることにより二量体に転換することができ、そして単 量体はそれ自体抗−Ｃ５Ｆ−１抗体を生産するための抗原として有用である。

幾分の種特異性が存在するようである。ヒトＣ５Ｆ−１はヒト及びネズミの両者 の骨髄細胞に対して機能し、ネズミＣ５Ｆ−１はヒト細胞に活性を示さない。従 って、「ヒトＪ　Ｃ５Ｆ−１は、完全な相関が存在するという必然性はないが、 Ｄａｓ、Ｓ、に、ら、Ｂｌｏｏｄ（１９８１）５８　＝　６３０の特異的ネズミ ・ラジオレセプターアッセイにおいて陽性であるはずである。この蛋白質の生物 学的活性はまた一般にヒト尿Ｃ５Ｆ−１に対する中和抗血清により阻害される（ Ｄａｓ、Ｓ、に、ら、前掲）。しかしながら、ある特定の状況下で（例えば、特 定の抗体調製物が生物学的機能のために必須でないＣ３Ｆ−１エピトープを認識 し、このエピトープが試験される特定のＣ５Ｆ−１ミユーテイン中に存在しない 場合）、この基準は適合しないであろう。

Ｃ３Ｆ−１の幾つかの他の性質が、一連のプラスタグランジン、インターロイキ ン−１及び成熟マクロファージからのインターフェロンの分泌を刺激する該蛋白 質の能力を含めて、さらに最近になって認識されている（Ｍｏｏｒｅ、Ｒ，ら、 ５ｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３　：　１７Ｂ）。これらの活性の機構は現存 理解されておらず、そして本明細書において定義の目的で、定義を満たす基準は 出発材料としての適切な種からの骨髄細胞を用いる単球／マクロファージコロニ ーの形成を刺激する能力に存在し、はとんどの場合において（前記参照のこと） 精製されたヒト尿Ｃ５Ｆ−１に対する中和抗体によるこの活性の阻害、及び種タ イプについて適切な場合、ラジオレセプターアッセイに対する陽性応答。［Ｃ３ Ｆ−１の増殖効果が単核貧食系の細胞に限定されること（Ｓｔａｎｌｅｙ、Ｅ、 Ｒ，Ｔｈｅ　Ｌ　ｍ　ｈａｋｉｎｅｓ、　１９８１　；　Ｓｔｅｗａｒｔ。

Ｗ、Ｅ、、ＩＩら、編集、Ｈｕｍｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃ１１ｆｔｏｎ、ＮＪ 、１０２−１３２頁）並びにＣ３Ｆ−１のレセプターがこれらの細胞系（Ｂｙｒ ｎｅ＋　Ｐ、　Ｖ、　＋らＣｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、（１９８４）９１　：　８４Ｂ ）及び胎盤に限定されることが知られている。〕 すべての蛋白質についてそうであるように、精密な化学構造は多くの因子に依存 する。分子中にイオン化可能なアミノ基及びカルボキシル基が存在するので、特 定の蛋白質は酸性塩もしくは中性塩又は中性の形で得られるであろう。適当な環 境条件下におかれた場合にそれらの活性を維持するこのようなすべての調製物が 定義内に含まれる。さらに、−次アミノ酸配列に対して糖成分を有いる誘導体化 により、又は他の補完分子、例えば脂質、リン酸基、アセチル基等により、さら に一般的にはサツカライドとの接合により増加が行われるであろう。−次アミノ 酸構造はまた凝集して複合体、最もしばしば二量体を形成するであろう。確かに 、生来のヒト尿Ｃ５Ｆ−１は高度にグリコジル化されたダイマーとして単離され る。この様な増加の幾つかの観点は生産宿主の翻訳後プロセシング系を通して達 成され、他のこの様な修飾は試験管内で導入され得る。ともかく、上に定義した 蛋白質の活性が破壊されない限り、この様な修飾は前記定義に含まれる。言うま でもなく、この様な修飾は種々のアッセイにおいて蛋白質の活性を増強又は低下 により量的又は質的に活性に影響を与えることが予想される。

さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基は酸化、還元又は他の誘導体化により修飾す ることができ、そして蛋白質を開裂させることにより活性を保持している断片を 得ることができる。

活性を破壊しないこの様な変更はその蛋白質配列から前記定義から排除しない。

翻訳中の配列へのアミノ酸の除去、付加又は変更の導入による一次構造自体の修 飾は蛋白質の活性を破壊することなく行われ得る。この様な置換又は他の変更は 、ｒ　Ｃ５Ｆ−１のアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を有する」蛋白 質の定義に属する。確かに、ヒト由来Ｃ３Ｆ−１蛋白質及びネズミ由来Ｃ３Ｆ− １蛋白質は同一ではないがしかし高度な相同性を示す類似のアミノ酸配列を示す 。

便宜上、本明細書において例示されるｃＤＮＡクローンから推定される第１図に 示される二量体蛋白質の一量体部分の成熟アミノ酸配列をｍｃｓＦ−１（成熟Ｃ ５Ｆ−１）と称する。第１図は、哺乳類細胞からの分泌の際におそらく開裂され るであろう３２残基の推定上のシグナル配列の存在を示し、ｍｃｓＦ−１はこの 図中でアミノ酸１−２２４により示される。その単量体及び二量体がｍｃｓＦ− １であるミューティン及びｍｃｓＦ−１からの相違により命名される＋ｎＣ５Ｆ −１の関連形が特にヒトＣ５Ｆ−１の定義に含まれる。

他の種に由来するＣ５Ｆ−１が、ヒト基質について前に記載した活性の必要なパ ターンを示すことにより「ヒトＪ　Ｃ５Ｆ−１の定義に合致するであろう。

さらに、便宜上、ｍｃｓＦ−１のアミノ酸配列が参照として使用され、そしてＣ ’；Ｆ−１活性に関してこれと実質的に同等な他の配列が第１図に示される配列 に言及することによって命名されるであろう。特定のアミノ酸の置換はそれを置 換するアミノ酸残基への言及によって示されるであろう。従って、例えば、５ｅ ｒｑ。Ｃ５Ｆ−１は、９０位のアミノ酸がシスティンではなくセリンである点を 除き第１図に示される配列を有する蛋白質を含む。除去は、Δとこれに続くＮ− 末端配列から除去されるアミノ酸の数により、又は残基がＣ−末端配列から除去 される場合に残るアミノ酸の数により示され、この場合はこの数の後にマイナス 記号が付される。すなわち、４ＣＳＦ−１は最初の４個のアミノ酸がＮ−末端か ら除去されている第１図のＣ３Ｆ−１を含み、１３０−はアミノ酸１３０続く最 後の９４個のアミノ酸が除去されているＣ３Ｆ−１に関する。後に、多数のＣ５ Ｆ−１蛋白質、例えばｃＤＮＡによりコードされるチロシン残基の代りに５９位 において遺伝子（第１図）によりコードされるアスパラギン酸残基を含むａｓｐ ｓｑｃｓＦ−１、及びｍＣ５Ｆ−１のアミノ酸１−１５８ノミから成ルＶ−１５ ８−ＣＳＦ−１（以後１５８）、が例示される。

「作用可能に連結された」とは、複数の成分の正常な機能が達成され得るような 並置を意味する。従って、制御配列に「作用可能に連結された」コード配列は、 これらの配列の制御の下でコード配列が発現され得るような配置を意味する。

「制御配列」は、特定の宿主生物において作用可能に連結されたコード配列の発 現のために必要なりＮＡ配列を意味する。

原核生物のために適当な制御配列は、例えばポロモーター、場合によってはホペ レーター配列、ルボゾーム結合部位、そしておそらくまだ十分に理解されていな い他の配列を包含する。真核細胞はプロモーター、ポリアゾニレ−ジョンシグナ ル、及びエンハンサ−を用いることが知られている。

「有効量」とは、特定された機能を遅生するため、例えば腫瘍を移しもしくは腫 瘍負荷を減少せしめ又は感染性疾患を予防もしくは治癒せしめるために効果的な 量を意味する。

「治療的処置」は病気に罹った後の処置意味し、他方「予防的」処置は病気に罹 る前の処置を意味する。

「哺乳類」は任意の哺乳類種を示し、そしてラビット、マウス、イヌ、ネコ、霊 長類及びヒトを含み、好ましくはヒトである。

「発現系」は、作用可能に連結された所望のコード配列及び制御配列を含み、こ れらの配列によって形質転換された宿主がコードされた蛋白質を生産することが できるようなりＮＡ配列を意味する。形質転換を行うため、発現系がベクター上 に含まれることができるが、しかしながら当該Ｄ　Ｎ　Ａ′はまた宿主の染色体 に組込まれる場合がある。

この明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養物 」は相互交換可能に使用され、そしてこの様な名称のすべてが子孫を包含する。

従って「形質転換体」又は「形質転換された細胞」は−次対象細胞、及び経代数 には無関係にそれらに由来する培養物を包含する。さらに、意図的な又は意図的 でない変異のためにすべての子孫がＤＮＡ含有において正確に同一ではない場合 がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能 を有する変異子孫が含まれる。別個の命名が意図される場合、それは文脈から明 らかであろう。

Ｂ、二股血に敗 本発明のＣ５Ｆ−１蛋白質は原骨髄細胞からの単球前駆体／マクロファージ細胞 生産を刺激して免疫系の有効性を増強することができ、そして同時に成熟マクロ ファージにおけるリンホカインの分泌のごときこれらの分化細胞の機能を刺激す ることができる。

１つの用途において、これらの蛋白質は化学療法のための補助薬として有用であ る。化学療法処置が免疫系の抑制をもたらすことがよく理解される。しばしば、 化学療法処置は、それらが向けられている腫瘍細胞を破壊するのには有効である が、免疫系の細胞に対する化学毒性剤の副作用のため、化学療法処置は対象者の 死をもたらす。骨髄由来前駆体のマクロファージ及び単球への増殖及び分化中介 し且つ増強しそしてこれらの成熟細胞の機能を刺激するＣ３Ｆ−１の能力のため 、前記のような患者へのＣ５Ｆ−１の投与は免疫系を再刺激して前記副作用を予 防しそしてそれ故に二次感染に負ける患者の傾向を防止する。このような処置に より助けられるであろう他の患者には、骨髄移植により白血病の治療を受けた者 が含まれる。これらはしばしば拒絶を回避するために免疫抑制状態にある。これ らの患者についてはまた、免疫抑制がＣ５Ｆ−１の投与により逆転され得るであ ろう。

一般に、化学療法によるものであれ、骨髄移植によるものであれ、又はその他の 、疾患（例えば後天性免疫不全症候群）及び創傷のごとき免疫抑制の不慮の形態 によるものであれ、免疫抑制に罹っているすべての対象者は薬学的用途のための Ｃ５Ｆ−１の入手可能性により利益を得るであろう。さらに、骨髄又は他の適当 な調製物の試験管内培養及びこれに続（ＣＳＦ−１による処理により生産された すでに分化したマクロファージの増強された量を対象者に提供することができ、 これにより生来の系のそれを補完することができよう。前記の調製物には患者自 身の血液単球のそれが含まれ、これは前記のように培養しそして局所療法又は全 身療法のためにもどすことができる。

マクロファージによるリンホカインの生産を刺激しそして標的細胞を殺すそれら の能力を増強するＣ５Ｆ−１能力はまた、Ｃ５Ｆ−１を新生物及び感染の治療に おいて直接的に有用なものとする。

Ｃ５Ｆ−１はネズミ由来のマクロファージによるインターフェロンの生産を刺激 しくＦｌｅｉｔ、　Ｈ，Ｂ、ら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏ１．（１９８１） １０８　：　３４７）　、そしてＭＩＡＰａＣａ細胞由来のヒトの特に精製され たＣ３Ｆ−１は、１９８６年８月１４日に公開された本発明者に係るＰＣＴ公開 Ｗ０８６１０４６０７に記載されているように、ヒト単球からのインターフェロ ン及びＴＮＦのｐｏｌｙ（１）　：　ｐｏｌｙ（Ｃ）に誘導される生産を刺激す る。さらに、Ｃ３Ｆ−１はヒト血液単球による骨髄性ＣＳＦの生産を刺激する。

さらに、Ｃ３Ｆ−１は腫瘍の処置のために、例えばα−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ −ＩＦＮ、　ＩＬ−２又はＴＮＦのごときリンホカイン類又はサイトカイン類を 含めての他の効果的な薬剤と組合わせて使用することができる。

さらに、正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス末梢マクロフアージを刺激してネズミ肉腫Ｔ Ｕ５標的を殺すＣ３Ｆ−１（ネズミＬ−細胞条件化培地から、及び大腸菌により 生産されるヒト組換Ｃ５Ｆ−１）の能力の証明を後に示す。この活性は、Ｃ５Ｆ −１が前処置として及びエフェクター期の間に使用される場合に全く効果的であ る。

これを行うＣ５Ｆ−１の能力は、第３図に後で示すように、他のコロニー刺激因 子により示されるそれよりも非常に大である。

Ｃ５Ｆ−１はまた、腫瘍細胞に対するマクロファージのリンホカインにより誘導 される抗体依存性の細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増強するためにも使用され得 る。この活性は特に、Ｃ３Ｆ−１がＩＬ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ −７と組合わせて使用される場合に特に効果的である。

さらに、サイトメガロウィルス（（ＪＶ）のごときウィルス、真菌、及びグラム 陰性敗血症を惹起する細菌を含めての感染性生物を攻撃するネズミ細胞の能力は Ｃ５Ｆ−１により増強される。〔ネズミＣ５Ｆ−１は、ネズミマクロファージを 刺激してＰ８１５腫瘍細胞に対して静細胞的であるようにしくＷｉｎｇ、　Ｅ、 　Ｊ、ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　（１９８２）６９　：　２７０）、 あるいは他の白血病標的を殺さない（Ｒａｌｐｈ、Ｐ、ら、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕ ｒｏｌ、　（１９８３）７６　：　１０）と、一貫性なく報告されている。Ｎｏ ｇａｗａ、　Ｒ，Ｔ、ら、釦旦１ｍｍｕｎｏｌ。

（１９８０）５３　：　１１６は、酵母を摂取しそして殺すようにマクロファー ジを刺激することができると報告している。〕従って、免疫抑制それ自体を克服 するのに加えて、Ｃ３Ｆ−１はマクロファージの分泌及び活性の刺激により間接 的に侵入生物及び悪性細胞を破壊するために使用することができる。

Ｃ３Ｆ−１はまた白血球細胞の総数の不足を含む疾患である白血球減少症の救済 のために用いることができる。好中球減少症は主として多形核白血球（好中球、 顆粒球）に影響を与える欠陥を反映しており、そして種々の感染、ある種の薬剤 （例えば、細胞毒性剤）又はイオン化照射によるであろう。

従って、好中球を含めての白血球細胞の数を増加させるように幹細胞を誘導する ためにＣ３Ｆ−１の生体内投与を用いることができる。

最後に、Ｃ５Ｆ−１は、局所的又は全身的に投与した場合に創傷の治癒を促進す るために使用することができ、そしてマクロファージを回復させそして腫瘍壊死 因子（ＴＮＦ）　、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）及び他の結合組織成長因子 を生産するようにそれらを誘導することができる。

本発明のＣ５Ｆ−１は、蛋白質基質の投与のために当業界において標準的な常法 により製剤することができる。注射による投与が好ましく、製剤には溶液又は懸 濁液、乳剤、あるいは注射できるように再溶解するための固体組成物が包含され る。

適当な賦形剤には例えばリンゲル溶液、バンク溶液、水、塩水、グリセロール、 デキストロース溶液等が包含される。さらに、本発明のＣ３Ｆ−１は、適切な応 答を刺激するために細胞の調製物と共に前インキュベートすることができ、そし て全体調製物又はそれからの上滑を対象者に導入することができる。後に記載す るように、Ｃ５Ｆ−１刺激に応答して種々のタイプの血液細胞により生産される 物質は所望の標的に対して効果的であり、そして侵入ウィルス又は新生物を攻撃 するこれらの血液細胞自体の性質が増強され得る。対象者自身の細胞が取り出さ れそしてこの方法において使用され、あるいは例えば、他の適合性個体からの単 球又はリンパ球が前記インキュベーションにおいて用いられる。

ヒトＣ５Ｆ−１の完全なコード配列が今や入手可能であり、そして種々の宿主系 に適用可能な発現ベクターが作製され、そしてコード配列が発現されている。例 えば、ＰＣＴ公開（前掲）；Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｅ、Ｓ、ら５ｃｉｅｎｃｅ（１ ９８５）２３０　：　２９１−２９６　；　Ｌａｄｎｅｒら（１９８７）ＥＭＢ ＯＪ、旦（９）　：　２６９３−２６９８　；　１９８８年５月５日に公開され たｌ１１ｏ　８８１０３１７３　：及び１９８８年６月２９日に公開されたＥＰ Ｏ，２７２，７７９を参照のこと。これらの参照文献のすべてを引用により本明 細書に組入れる。利用可能な宿主の多様はこの様な宿主のために適当なベクター と相俟って、翻訳後プロセシング系及びこうして生産された蛋白質のコンホーメ ーション抑制を提供する環境因子の選択を可能にする。従って、この情報の入手 可能性が本明細書において検討する種々の療法において利用するための十分な量 のＣ５Ｆ−１蛋白質を提供する。

ヒ）ＣＳＦ−１の特定の例において、現在蓄積しつつある証拠が示すところによ れば、組換条件下及び生来的条件下の両方において蛋白質のＣ−末端におけるか なりの欠失が生ずることができそしてその蛋白質の活性はなお保持されている。

単離された生来の蛋白質はある種の末端切除形又はその混合物として存在するこ とができ、そして多様なＣ−末端プロセシングを示すようである。これらの「末 端切除された」形の活性はそれらの意図的な製造により明瞭に確立されている。

例えば、５ＣＳＦ／Ｃ１５０（以後、１５０と称する）をコードするＤＮＡから 生産されたミューティンはＣ５Ｆ−１のためのアッセイにおいて、ＬＣ５Ｆ／Ｃ １９０（以後、１９０と称する）　、　５Ｃ５Ｆ／Ｃ２２１（以後、２２１と称 する）、又はａｓｐ５ｇＬＣＳＦ／　Ｎ２２１（以後、Ｎ３Ｃ２２１と称する） をコードするｃＤＮＡから生産されたそれと同様に十分な活性を有する。これら のミューティンは１９８８年６月２９日に公開された係属中のヨーロッパ公開Ｎ α２７２．７７９、及び１９８８年５月５日に公開されたＰＣＴ公開−ｏ　８８ １０３１７３に記載されており、この両者を引用によりこの明細書に組入れる。

Ｃ９好遣ｍ檄 本発明の組換Ｃ３Ｆ−１は、類似するがしかし必ずしも同一ではない一次アミノ 酸配列を有する一連のミューティンであって、そのすべてがＣ５Ｆ−１に特徴的 な活性パターンを示すか又はそれを示すミューティンに特異的に開裂され得るも のであると理解することができる。すなわちそれらは単球に圧倒的に分化するよ うに骨髄細胞を刺激することができ、そして上記の定義の範囲内で生来のＣ５Ｆ −１に対して生じた抗体及びＣ３Ｆ−１活性と関連するレセプターと免疫反応性 である。しかしながら、これらのミューティンのある種の具体例が好ましい。

成熟Ｃ３Ｆ−１についてＬａｄｎｅｒら、前掲、の第１図及び第４図に示される 一次配列は必要される活性を有し、そして言うまでもなく好ましい具体例に属す る。配列の幾つかの部分が成熟Ｃ５Ｆ−１中の１・個又は複数個のアミノ酸の欠 失又は保存的置換により変化しているミューティンも好ましい。「保存的」アミ ノ酸置換とは、蛋白質の活性特性を変えず、そして一般に２個の相互交換された 残基の側鎖の化学的類似性により特徴付けられる置換を意味する０例えば、酸性 残基は他の酸性残基により、塩基性残基は塩基性残基により、疎水性残基は疎水 性残基により、バルキーな残基はバルキーな残基により、等々・・・、保存的に 置換される。言うまでもなく、要求される類似の程度は置換が行われるアミノ酸 の必須性、及びその性質に依存する。従って、一般に、システィン残基の好まし い置換はセリン及びアラニンであり、アスパラギン酸残基のためにはグルタミン 酸であり、リジン又はアルギニン残基のためにはヒスチジンであり、ロイシン残 基のためにはイソロイシン又はバリンであり、トリプトファン残基のためにはフ ェニルアラニン又はチロシンである等々、である。

変更に対して最も耐性なＣ５Ｆ−１蛋白質の領域は、ヒト及びマウス種の間での 既知の低相同性領域（残基１５−２０及び７５−８４）、蛋白質分解的開裂に対 する感受性を提供する領域（残基５１及び５２並びに残基１９１−１９３）、ジ スルフィド結合に関与しないシスティン残基、又は活性のためムこ絶対的に必須 でない他の領域（残基１５９−２２４）を包含する。残基１５１−２２４も必須 でない様である。

従って、ｍＣ５Ｆ−１の１５９位と２２４位（これらを含む）の間、又は１５１ −２２４位（これらを含む）の間の１個もしくは複数個のアミノ酸及び／又は１ 個もしくは複数個のアミノ酸配列の欠失又は保存的置換により特徴付けられるＣ ３Ｆ−１ミユーテインが特に好ましい。特に、１５８ＣＳＦ−１は切除されたＣ −末端に限定された数のＣ３Ｆ−１に関係のない追加のアミノ酸残基が含まれて いても生来の蛋白質のＣＳＦ活性に匹敵するＣＳＦ活性を有し、１５０ＣＳＦ− １は類似の活性を有する。確かに、生来の蛋白質は１４〜１５ｋｄ　（ｃＤＮＡ 配列から推定される２６ｋｄとは異る）の分子量を有し、そして組換（推定）ア ミノ酸配列から予想される疎水性は開裂に対して通常感受性の膜貫通領域に対応 する。従って、末端切除された変形体はおよそ、単離されたＣ３Ｆ−１に対応す るようである。

さらに、５Ｃ５Ｆ又はＬＣＳＦの最初の３〜１５０又は４〜１５０アミノ酸配列 を含むアミノ酸配列を含んで成り、そしてＣ−末端欠失を含むＣ５Ｆ−１蛋白質 、例えばＬＣ３Ｆ／Ｃ２２１及び”５ｐｓＪＣ５Ｆ／Ｎ３Ｃ２２１も好ましい。

さらに、ｍｃｓＦ−１の位１５１及び５２及び／又は位置１９１．１９２及び１ ９３の１個又は複数個のアミノ酸の欠失又は保存的置換により特徴付けられるミ ューティンも好ましい。特にｇｌｎｓｚｃｓＦ−１が好ましく、対応するプロリ ン置換は保存的ではなく、そして活性なＣＳＦをもたらさない。これらが見かけ 上低い相同性を示すため、他の一連の好ましい具体例はｍＣ３Ｆ−１の位置１５ −２０及び／又は位置７５−８４の１個又は複数個の欠失又は保存的置換により 特徴付けられるものである。さらに、ジスルフィド結合の形成のために必須でな い任意の位置におけるシスティンの欠失又は保存的置換により特徴付けられるミ ューティンが好ましい。さらに、ｍＣ３Ｆ−１の位Ｗ５９のチロシン残基の欠失 又は置換、特にアスパラギン酸残基による置換により特徴付けられるミューティ ンが好ましい。

Ｄ、ヒトＣ３Ｆ−１のクローニング　びＰＣＴ公開誓０８６１０４６０７（前掲 ）は、ヒトＣ５Ｆ−１のコード配列を得、この配列を発現ベクターに配置し、そ して所望の蛋白質の発現を得るための方法を例示している。この公開の教示を特 に引用により本明細書に組み入れる。

十分な長さのｃＤＮＡは１．６４ｋｂであり、そして２２４アミノ酸の成熟Ｃ５ Ｆ−１蛋白質をコードしている。このクローンをＣ５Ｆ−１７と称し、これはシ タス寄託番号ＣＭＣＣ２３４７を有し、そして１９８５年６月１４日にＡＴＣＣ に寄託された（ＡＴＣＣ５３１４９）。Ｃ３Ｆ−１コードＤＮＡを担持するこの プラスミドはｐｃＣＳＦ−１７と称される。

Ｄ、１　ミュー−インをコードする配置ｐｃｃｓＦ−１７の挿入部に修飾を行っ てｍｃｓＦ−１蛋白質のミューティンをコードする対応するプラスミドを得た。

部位特定変異誘発のため、ｐｃＣＳＦ−１７及びＭ１３ｍｐ１８を、Ｃ３Ｆ−１ コ一ド配列の適当な領域を切り出す同一の制限酵素により消化し、そして切り出 された配列をＭ１３ベクターに連結した。第二鎖の合成及び所望の変異したＤＮ Ａの回収のため次のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。

ｐｒｏｓｚｃｓＦ−１のため、５’　−ＴＡＣＣＴＴＡＡＡＣＣＧＧＣＡＴＴＴ ＣＴＣ−３’　、これはコドン５２−５３に新たなＨｐａ　１１部位を形成する ；ｇｌｎｓｚｃｓＦ−１のため、５’　−ＴＡＣＣＴＴＡＡＡＣＡＧＧＣＣＴＴ ＴＣＴＣ−３’　、これはコドン５２−５３に新たな５ｔｕＩ部位を形成する； ａｓｐｓ＊ｃｓＦ−１のため、５　’　−ＧＧＴＡＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧ ＡＧ−３’　、これはコドン５９−６０に新たなＥｃｏＲＶ部位を形成する。

Ｋｌｅｎｏｗを用いる第二鎖の延長の後、ファージを大腸菌ＤＧ９８に形形質転 し、そして生ずるプラークをキナーゼ処理されラベルされたプローブによりスク リーニングする。プラーク精製の後、所望の変異した挿入部をｐｃＣＳＦ−１に もどしてそれぞれｐＣＳＦ−ｐｒｏｓｚ、ｐＣＳＦ−ｇｌｎｓｚ及びｐＣＳＦ− ａｓｐ５ｇを得る。

１５８Ｃ５Ｆ−１をコードする３個の欠失変異体を含むプラスミド：　ｐｃｓＦ −Ｂａｍ、　ｐＣＳＦ−ＢａｍＢｃｌ及びｐＣＳＦ−ＢａｍＴＧＡも調製された 。

ｐＣＳＦ−Ｂａｍのためには、ｐｃＣＳＦ−１７をＢａｍＨＩにより消化し、そ してコード領域の上流ＢａｍＨＩ　／　ＢａｍＨＩ断片を単離し、そしてベクタ ー断片に再連結した。この連結混合物を大腸菌間２９４に形質転換し、そして正 しい方向付けを有するプラスミドを単離した。得られるｐｃＳＦ−Ｂａｍは、Ｃ 〜末端でベクター由来の６残基：　Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−１１ｅ− Ｈｉｓに融合したＣ５Ｆ−１蛋白質の１５８アミノ酸をコードしている。

１５９位のセリンが終止コドンに変異している点を除き完全なＣ５Ｆ−１７一ド 配列を含有するｐＣＳＦ−ＢａｍＢｃｌのため、ｐｃＣＳＦ−１７からコード配 列を切り出し、そしてプライマー：５’−ＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣ ＧＣＡＧＣＴＣＣ−３’を用いる部位特定変異誘導のためＭ２Ｓに連結した。こ れはコドン１５９−１６０に新たなりｃｌ　１部位をもたらす。変位したＤＮＡ をＢｓｔＸ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩにより切り出し、そしてＢｓｔＸ　Ｉ　／　Ｅ ｃｏＲＩで消化したｐｃＣＳＦ−１７に連結し、そしてこの連結混合物を大腸菌 ＤＧ１０５　ｄａｍ−宿主に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを単離した。

１５９−終止の下流のコドンが除去されているｐＣＳＦ−ＢａｍＴＧＡのため、 ｐＣＳＦ−ＢａｍＢｃｌをＸｈｏ　Ｉ及びＢｃｌ　Ｉにより消化し、そして挿入 部をＸｈｏ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ消化ｐｃｃｓＦ−１７に連結した。

さらに、１５１位のヒスチジンの代りにＴＧＡ終止コドンを含有するｐｃｓｐ− ｃｔｙｔｓｏをｐｃＣＳＦ−１７挿入部から、上記のようニテ適切なプライマー を用いる部位特定変異誘発により調製した。

Ｄ、２　Ｃ３Ｆ−１の　び″　アッセイＣＯ５−７細胞でのＣ５Ｆ−１７からの プラスミドＤＮＡ　（ｐｃＣＳＦ−１７）の発現が骨髄増殖アッセイ、コロニー 刺激アッセイ及びラジオレセプターアッセイにより、ｈｏ　８６１０４６０７　 （前掲）に教示されているように確認されそして定量された。Ｃ３Ｆ−１につい ての骨髄増殖の特異性は活性を妨害するＣ５Ｆ−１抗血清の能力にのみ存在し、 コロニー刺激アッセイについては得られるコロニーの性質に存在することが思い 出されよう。両アッセイは−当り数千ユニットのオーダーのＣ３Ｆ−１生産を示 した。

Ｄ、３　ミューティンの ｐｃＣＳＦ−１７について教示したのと類領する方法で、ミューティンをコード するプラスミドをＣ０５−Ａ２細胞にトランスフェクトし、そしてＣ５Ｆ−１活 性の一時的発現を骨髄増殖アッセイ及び抗−ＣＳＦ抗体を用いるラジオイムノア ッセイにより測定した。

ｐＣＳＦ−ｐｒｏ５２の発現生成物は不活性であり、予想されたようにプロリン による置換が非保存的であることが示された。他のすべてのミューティンは両ア ンセイにおいて下記の結果により示されるように活性を示した。

ＣＯＳ細胞でのＣ５Ｆ−１構成物の発現Ｃ５Ｆ−１ラジオイムノ　骨髄ア　ッ　 セ　イブラスミド　アッセイ　増　殖　コロニー（ユニット／ｄ）　（ユニット ／戚） ｐＣＳＦ−Ｇ１ｙ１５０　２６．８５０　５５．７１０ネズミＣ５Ｆ−１をコー ドするイントロン不含有ＤＮＡ配列がｗｏ　５６１０４６０７に教示されており 、そして引用によりこの明細書に組入れる。このネズミＣ３Ｆ−１を、多量のＣ ３Ｆ−１を生産するネズミ繊維芽細胞系を用いて調製する。ＡＴＣＣから入手で きるＬ−９２９細胞系を、ｃＤＮＡライブラリーを作るためのｍＲＮＡ源として 用いる。既知のネズミのＮ−末端及びＣＮＢｒ−開裂中間ペプチド配列に基いて 構成されたオリゴマープローブを用いて、このｃＤＮＡライブラリーをプローブ してネズミ形蛍白質の完全なコード配列を回収する。ネズミＣ３Ｆ−１はヒトの 材料と約８０％の相同性を有すると信じられ、その由来は、Ｎ−末端配列の相同 性、骨髄細胞からマクロファージコロニーを刺激するヒト及びネズミの両Ｃ５Ｆ −１調製物の能力、及びラジオレセプターアッセイ及びラジオイムノアッセイに 関しての限定された交叉反応性による（Ｄａｓ、Ｓ、に、らＢｌｏｏｄ（１９８ １）５８　：　６１０）。

ネズミＣ５Ｆ−１のｃＤＮＡの調製、クローニング及び発現はＷＯ８６１０４６ ０７（前掲）に記載されている。

Ｅ、長り上９五性 部分精製されたＭＩＡＰａＣａ　Ｃ５Ｆ−１、ネズミＬ細胞Ｃ５Ｆ−１、ＣＶ− １により生産された組換物質又は大腸菌により生産されたヒ）ＣＳＦ−１を用い て、Ｃ３Ｆ−１の活性を次の実施例において決定した。　Ｃ３Ｆ−１は、誘導さ れたヒト単球によるインターフェロン及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生産を１０ 〜３０倍増強することが示された。Ｃ３Ｆ−１はまた、マクロファージの抗腫瘍 毒性をインビトロで刺激し、腫瘍の増殖をインビボで阻害し、マウスを致命的な 細菌感染から保護し、そしてマウスにけおるサイ゛　トメガロウィルスの増殖を 阻害することが証明された。

次の実施例は、請求の範囲に記載された治療的及び予防的使用を限定的にではな く例示するものである。

夫隻桝 ヒト　゛によるＴＮＦ　の１゛ ＭＩＡＰａＣａ　Ｃ５Ｆ−１を上清からリン酸カルシウムゲル濾過及びレンチル レシチンクロマトグラフィーにより精製した。リンホカイン生産のアッセイのた め、末梢血付着細胞をそれぞれ１０７細胞を含有する２本のフラスコ中でインキ ュベートした。

一方のフラスコは上記のようにして精製された１０００　Ｕ／ｄのＣ３Ｆ−１で 処理した。３日後、細胞を収得し、そして洗浄し、そして５　ＸＩＯ’／ｌ１１ １の細胞濃度で再懸濁しそして２４−ウェルプレート中で０．５ｄ／ウエルでプ レートした。ウェルを１０ａｇ／ｄのりポポリサッカライド（ＬＰＳ）及び２０ ｎｇ／ｍのＰＭＡで４８時間処理し、そして上滑をＴＮＦアッセイのために収得 した。

Ｃ３Ｆにより処理された細胞は未処理細胞より約９倍高いＴＮＦの分泌を示した （１６２　Ｕ／ｄに対して１５００　Ｕ／ｖｄｌ’）。

ヒト　に　るイン　−フェロン　の「゛インターフェロン生産に対するＣ５Ｆ− １の効果を決定するための類憤の実験において、末梢血付着細胞を１０００　Ｕ ／−の５ｐｐ−１の存在下又は非存在下で３日間、上記のようにしてインキュベ ートし、収得し、５×１０ＳＺＩＩ＆で再゛懸濁し、そして前記のようにし、て ２４−ウェルプレートにプレートした。細胞をインターフェロン生産のために種 々の量のｐｏｌｙ（１）　：　ｐｏｌｙ（Ｃ）の添加により誘導した。上滑を、 ｖＳｖが感染したＧＭ　２５０４細胞に対するその細胞変性効果によりインター フェロン生産についてアッセイした。　Ｃ３Ｆ−１により刺激された細胞は５０ ｐｇ／ｄのｐｏｌｙ（１）　：　ｐｏｌｙ（Ｃ）により誘導された場合に１００ ０／ｄの生産を示し、他方同様に誘導された未処理細胞は３Ｕ／ｍ１未満の生産 を示した。

ヒト　・による夙ｇＣ５Ｆ　の１゜ 単球をＣ３Ｆ−１の存在下及び非存在下で３日間インキュベートし、そして第２ 表に示すように骨髄性Ｃ５Ｆの生産について誘導した。示されている３つの代表 的な実験は異る提供者からの血液を使用した。

Ｌｉ盗 骨髄性Ｃ５Ｆ　（Ｕ／ｄ） 培地　ｏｏ　ｏ　ｏ　ｏ　。

１　ｎ／１ａｉｌ　ＬＰＳ　０　７００±７２４０±２０　２００±２０　１０ ３±１２　３７７±５７２ｎｇ／ｍ　ＰＭＡ　−３７０±１７　２９７±６１８ ３±１５　３８０±５２　７１６±７６従って、Ｃ５Ｆ−１は骨髄性Ｃ５Ｆ又は コロニー刺激活性の生産を刺激する。

ネズミマクロファージによるｘｌ　の１°　：　のコロニー１°　との　六 マクロファージの刺激を測定するため、Ｌ−細胞条件化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅ ｄ）培地から得られたネズミＣ５Ｆ−１をｐｃＣＳＦ−１７からの組換生産Ｃ３ Ｆ−１のためのモデルとして、肉腫標的を殺すネズミマクロファージの能力を示 す測定において用いた。この測定においては、２時間の付着Ｃ３Ｈ／）ｌｅＮマ ウス末梢マクロファージをＣ５Ｆ−１と共に、又はそれを伴わないで試験管内で １日インキュベートし、そして次にＴ−インターフェロンを含有する１０％Ｖ／ νＣｏｎＡ誘導（１０ｎ　／　Ｉｄ）肺臓リンホカイン（ＬＸ）と共に、３Ｈ− チミジン標識マウス肉腫ＴＵ５細胞と２０：１の比率で混合した。この測定にお いてＬＫ調製物を精製γ−インターフェロンで代替することができる。その後４ ８時間にわたる標識されたチミジンの放出を殺腫瘍細胞の測定値として用いた。

１２００　Ｕ／ｄのＣ３Ｌ−１を含有するネズミＬ−細胞条件化培地としてＣ３ Ｆ−１を添加する効果を次の表に示す。

精製されたネズミＣ５Ｆ−１並びにＣＶ−１及び大腸菌（２２１）からのｒｈＣ ＳＦ−１もこの測定において有効であった。

標的細胞を殺す能力の増加は、Ｃ５Ｆ−が増殖の予備的１日の間に添加され又は 誘導の期間の間に添加された場合に認められたが、しかしながらＣ５Ｆ−１が雨 期間にわたって添加された場合に最も劇的な効果が観察された。

マクロファージ及び単球の刺激の原因としての細菌性ＬＰＳ汚染の可能性は排除 された。適用されたＣ３Ｆ−１のＬＰＳ含量は低く　〔リムラス試験（Ｌｉｍｕ ｌｕｓ　ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ　１ｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）ａｓｓａｙ）により＜ 　０．３　ｎ／１ａｉｌ　Ｕ　Ｃ５Ｆ−１）　、抗−ＣＳＦ−１カラムへの適用 により活性は除去され；　ＬＰＳを中和するためにポリノキシンＢが使用され； 　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪからのマクロファージはＣ５Ｆ−１に応答するがしかしＬＰＳ に応答しない。

の１Ｃ３Ｆの六 ５屑のＬＰＳの■ν投与の後５時間目に得た６個のマウスの肺からＣＳＦ−ＧＭ を調製した。この肺を切りきざみ、無血清培地中で３日間インキュベートし、Ｙ ＹＧ１０６アフイニテイーカラムを用いて上清からＣ５Ｆ−１を除去した（ＣＳ Ｆ−１含量は２７０　Ｕ／ｄから７８０／ｄに低下した。同様に処理したＬＤＩ 無血清培地からＣ５Ｆ−Ｇを調製した。Ｃ３Ｆ−叶含量及びＣ３Ｆ−Ｇ含量の両 者を２０００Ｕ／ｍｌ！においてコロニー刺激アッセイにより測定した。

末梢マクロファージを４０％の上記の培地のいずれかと共に又は２０００　Ｕ／ ｄ　Ｃ５Ｆ−１で測定されたし一細胞培地と共に１日インキュベートし、そして 次に追加の培地と共に又はＩＪと共に４８時間インキュベートし、そして上記の ようにして殺ＴＵ５について測定した。

結果を第３図に示す。Ｃ５Ｆ−１はＴＵ５に対する毒性の顕著な増強を示したが 、Ｃ３Ｆ−Ｇ及びＣＳＦ−ＧＭはいずれもなんらの効果も示さなかった。

ＡＤＣＣのｊ゛　としてのＣ５Ｆ−１の−　−ＭＩＡＰａＣａ細胞系から精製さ れたＣ５Ｆ−１（〜４０％４０％純活性〜２　ＸＩＯ’　Ｕ／■）、ネズミＬ− 細胞条件化培地（比活性〜２．３Ｘ１０ＳＵ／ｄ）　、及びＣシー１からの組換 ヒト（ｒｈ）Ｃ５Ｆ−１（＞９５％純度、比活性〜５　Ｘ　１０’　Ｕ／　ｍｇ 　）は、ＩＬ−２又はＩＦＮ−ｃｒ、−βもしくは−Ｔとの組合わせにおいて腫 瘍標的に対するネズミマクロファージＡＤＣＣを刺激することが見出された。

ＡＤＣＣ測定、において、雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ又はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに１． ５７のプロテアーゼペプトン（ディフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、Ｍｌ） をｉ、ｐ、注射した。３日後、末梢滲出細胞を３Ｘ１０’大細胞１０．５ｄαＭ ＥＭ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清で２個の１ｄウエルに並行して付着さ せた。２時間後、ウェルをＰＢＳにより３回十分に洗浄し、そしてＣＳＦ−１又 はリンホカインを添加し、そして３７℃にて２日間インキュベートした。細胞集 団は形態的に〉９５％マクロファージであり、そして並行ウェルで２日目に回収 された細胞数は異る処理について類似していた。２日目に、熱不活性化された抗 血清（抗Ｔｈｙ−１、ラビット抗〜マウス脳、アキャレートケミカルス、ウェス トバレイ、ＮＹ）を並行セットの一方に種々の稀釈で加えた。Ｔ−リンパ腫細胞 系である標的Ｒ１，１をマクロファージウェルに、及びマクロファージを伴わな い並行ウェルに加えた（±Ｃ５Ｆ−１、リンホカイン、又は抗血清）。

高濃度（１鱈／戚）の細胞ＬＰＳがマクロファージＡＤＣＣを刺激するので、ネ ズミ及びヒ）ＣＳＦ−１１製物をＬＡＬ測定を用いて試験し、０．２ｎｇ／ｍｌ ！未満のＬＰＳを有していた。

マクロファージを３＝１のエフェクター二標的比率においてＡＤＣＣについて、 抗血清の存在下又は非存在下で１０ＳＲ１，１標的を導入し、そして生きている 標的細胞を９．２４．４８及び９６時間目に計数することにより試験した。対照 マクロファージ十抗体を伴うＲ１，１の増殖は、抗体の非存在下での対照マクロ ファージ又はサイトカイン処理マクロファージを伴うそれ、あるいはＲ１，１の み士抗体士すイト力インのそれと同一であった。

培地　０　０　０ Ｍ−ＣＳＦ　Ｏ００ ＩＦＮ−γ　４４±５６３±３　７２±３殺ＡＤＣＣ”　（％）　＝１００（ｙ −ｘ）／ｙここで、ｙ＝抗血清の非存在下での標的細胞数ｘ　＝　１　：　２０ ．００ＯＮｉ釈抗血清の存在下での標的細胞数 ＩＦＮ−ｒは５　Ｕ／ｄで使用。

５０　Ｕ／ｄのＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βは５　Ｕ／−のＩＦＮ−ｒとおよそ同 じＡＤＣＣ刺激活性を有していた。５　Ｕ／ｄのＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βはＡ ＤＣＣに対する効果を本質上有しなかったが、しかしＣ３Ｆ−１の存在下で５０ ０／−のいずれかのＩＦＮのみを用いて見られるレベルに刺激された殺腫瘍を有 していた。同様の効果がｒｈＩＬ−２について見られ、５　Ｕ／ｄのＩＬ−２の みによる２日間のマクロファージの処理がマクロファージＡＤＣＣを実質的に補 助した。

Ｃ３Ｆ−１はこの強いＩＬ−２により誘導された活性を中程度に増強した。しか しながら、ＩＬ−２がＩ　Ｕ／ｒｄ又は０．２　Ｕ／Ｊｌｌｌ！の低い非有効濃 度で使用された場合、Ｃ３Ｆ−１の添加は殺腫瘍活性に対する強い増強効果を示 した。

他のリンホカインをＡＤＣＣの一次刺激剤として試験した。

１．１０もくしは１００　Ｕ／−のｒｈＴＮＦのみ又は１０００　Ｕ／ｍｌのＣ ３Ｆ−１を伴う２日間のマクロファージのインキュベーションはＡＤＣＣ活性を 有意に誘導しなかった。０．２〜５０Ｕ／ＩｎＲのｒｈｌＬ−１α又はβ及び１ 〜１００Ｕ／ＩｄのネズミｒＩＬ４も単独で又はＣ３Ｆ−１を伴ってＡＤＣＣを 刺激しなかった。Ｃ５Ｆ−１の代りに使用できるかもしれない他の補助因子を見 出すための試みが行われた。１０゜１００又は１０００　Ｕ／ｄで試験されたネ ズミｒＧＭ−ＣＳＦ及びｒＴＬ−３は、Ｃ５Ｆ−１とは対照的に、マクロファー ジの標準的２日前処理において、単独で又はＩＦＮ　７と共にＡＤＣＣを補助し なかった。

これらのサイトカインは培地中で２日間のインキュベーションの後、マクロファ ージの非存在下でＲ１，１の標的の増殖に対する効果を有しなかった。

ｔ　についてのＣ５Ｆ−１の　： Ａ、　Ｍｅｔｈ　Ａ肉腫モデル ＣＶ−１細胞系からの組換生産されたＣ３Ｆ−１（１５８）　２　ＸＩＯ’　： ｘニット／ｍｇ（ＬＡＬアッセイ：　２ｎｇ　ＬＰＳ／ｄ、８ｎｇ　ＬＰＳ／Ｉ ｎＩＣ５Ｆ）を５０ｎ／−投与で１日２回５日間にわたり、７日前にＭｅｔｈ　 Ａ肉腫を皮下移植された２０ｇのマウス（群当り３マウス）に服腔内注射した。

Ｃ３Ｆ−１処置の開始の後６日間にわたり、３匹の未処置マウス及び３区の処置 マウスを体重及び腫瘍体積について評価した。体重の変化により測定される毒性 の証拠はなかった。７日目に、各群からの一匹のマウスを病理形態学的比較分析 のために殺した（顕著な兆候はなかった）。残り４匹のマウスをＭｅｔｈ　Ａモ デルにおいて通常の１４日間にわたり評価した。結果を次の表に示す。

Ｃ５Ｆ−１緩　衝　液　処理／対照 日　（腫瘍体積の変化の平均ΔＴＶ）　（％）３　２．０　２．２　９１ ６　２．６　６．８　３８ ７　４．１　８．０　５１ ８　５．７　１１．０　５２ １４　１３．９　２９．４　４７ ΔＴＶ＝示された日における平均腫瘍体積：０日における平均腫瘍体積の比（１ つのマウス郡における）結果が示すところによれば、特に６日目の腫瘍体積測定 においてＣ５Ｆ−１介在活性の証拠が存在した。Ｃ３Ｆ−１群と対照群との間の 差は処理の開始後数日から始まりその後数日の間で最大であり、その後腫瘍はそ の通常の増殖速度にもどった。

これらのデーターが示唆するところによれば、１日多数回の投与（この投与量に おいて長時間にわたり有効性を改善するための連続注入）又はより高い投与レベ ル及び薬剤を投与しない日を含めるための変化したスケジュールが有効性を高め ることができる。

大腸菌からのＣ５Ｆ−１（１５０）、Ｃ５Ｆ−１（１９０）、及びＣ５Ｆ−１（ ２２１）を用いて類僚の結果が見られた。５匹のマウスから成る群を用いてこの 方法を行った。５０ｇ／投与の各生成物を用い、そして計画が１０日に延長され そして投与が７〜８日隔てて行われた大腸菌１５０物質及び１９０物譬の場合を 除き、投与（１日２回で５日間）は類似していた。次の表は、各Ｃ５Ｆ−１由来 物質について、処理動物のΔＴＶを対照のΔＴＶで除した％として結果を示して いる。

Ｂ１６ネズミ黒色腫細胞系における転移を回避するためにＣ３Ｆ−１を用いる第 二の生体内腫瘍モデルも検討した。

０、２　ｒｒｄｌｃＤ　Ｃｕ”及びＭ　ｇ　’　２不含有ＨＢＳＳ中に懸濁した 腫瘍細胞Ｉ　ＸＩＯ’を麻酔してないマウスの側層静脈に接種した。腫瘍細胞の 接種の２１日後、マウスを殺しそして死体解剖した。解剖の間、肺及び脳を摘出 し、水ですすぎ、そして秤量した。

次に、肺をボーイン（Ｂｏｕｉｎ）の溶液中に固定し、そして一対の肺当たりの 表面腫瘍小結節の数を拡大鏡により決定した。

組換ヒトＣ５Ｆ−１（９ＸＩＯ’　Ｕ／ｄ）力価及び０．８２ｎｇ／　ｍｇＣＳ Ｆ−１のエキソトキシンレベルを有する）をすべての実験のために使用した。各 実験の前にＣ３Ｆ−’１を一凍結スドックから新たに得、そして注射の直前にｔ ｌｓＰ　０．９％塩水中に稀釈した。Ｃ３Ｆ−１を１日１回（ＱＤ）　Ｘ　１０ 日間のスケジュールで静脈内投与した。

使用した投与レベルを下記の表に示す。非特異的且つ非療法的蛋白質から成る負 対照としてＵＳＰヒト血清アルブミン（Ｈ５Ａ）又は無溝したＣ５Ｆ−１を使用 した。Ｃ３Ｆ−１を３０分間煮沸してＣ３Ｆ−１活性を不活性化した。

力価データーが示すところによれば、Ｉ　ＸＩＯ’個の腫瘍細胞の静脈内接種の ３日から始めてＱＤ　Ｘ　１０で静脈内投与されたＣ５Ｆ−１は肺転移の中央値 の有意な低下を示した。この投与レベル（２，５〜５．０■／ｋｇ）において致 死によって測定される明確な毒性は観察されなかった。

１、　塩水　＋１　５５（５，２９，４８，５２，５２５８，５８，７４，８０ ，９１） ２、Ｍ−Ｃ５Ｆ　２．５■／ｋｇ　＋　１　３８（１１，ＩＬ　１３．２Ｂ、　 ３２゜４４．５０，６４，６７．９０） ３、Ｍ−Ｃ５Ｆ　５　■／ｋｇ　＋　１　５０（２２，３２，４８，４８，４８ ゜５２．５７，６２，６５．７６） （ａ）この群と対照との間の差はｐ−０，００２において有意である（門ａｎｎ −Ｗｈｉｔｎｅｙ） 六　についてのＣ５Ｆ−１虫　はＩＦＮ−と　ムわせでの試讃Ｊロジ友狡 下記の方法はＡ３７５ヒト異性黒色腫細胞系標的細胞に対するＣ３Ｆ−１のみ及 びＩＦＮ−７との組合わせにおける試験管内細胞毒性効果を示す。この例は、腫 瘍細胞に対する細胞毒性の増強について、Ｃ３Ｆ−１及びＩＦＮ〜γのほかに多 くのサイトカインを試験した。

単核細胞（ＭＮＣ）をヘパリン処理した静脈細胞又は健康な正常志願者のバフィ ーコートから、リンパ球分離媒体（ＬＳＭ−オオルガノンテクニカ社、ダルハム 、Ｎ、Ｃ）上での密度勾配遠心により分離した。次に、ＭＮＣをＰＢＳで２回洗 浄し、そして４９．２％等張Ｐｅｒｃｏｌｌ　（ファルマシャ）上に重層しそし て１５００χＧにて２５分間遠心した。界面の単球バンド（細胞遠心調製物の形 態学的分析により〉８０％純度の単球）を収得し、そして３７°Ｃでのプラスチ ック付着によりさらに精製した。付着は９６ウエルプレート中で１．２　Ｘ　１ ０Ｓ細胞／ウエルの密度にて行った。

１時間後、非付着細胞を激しい洗浄により除去し、〜１×１ＯＳ細胞／ウェルが 残した。

精製された単球を、３日間にわたり、Ｃ３Ｆ−１（大腸菌Ｎ３Ｃ２２１）、ＩＬ −２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−Ｃ５Ｆ　（すべてＧｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ 。

より）　、ＩＬ−２（シタス社）、又は培地のみを含有する０、１％ＦＣＳ中で 培養した（１°誘導）。３日後、単球を洗浄し、そして次に２°の誘導剤と共に さらに２日間インキュベートした。Ｃ５Ｆ−１を伴う又は伴わない１°の誘導も 幾つかの実験においてフラスコ中で行った。単球は組織培養フラスコ中で直接付 着し、非付着細胞を除去し、そして１°の誘導剤を加えた。１°の誘導の後、単 球をトリプシン処理及びおだやかなかきとりにより収得し、ハリバンブルー排除 により生存細胞の計数を行い、そしてウェル当り１×１０５１ｉｌ胞を９６ウエ ルプレート中にプレートしさらに２日装置いた。

ＷＥ）ＩＩ　１６４殺腫瘍アツセイ　［Ｃｏ１ｏｔｔａら（１９８４）Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　１３２：９３６〕を用いてサイカイニンの細胞毒性を試験した。

要約すれば、活性な対数期のＷＥＨＩ　１６４標的細胞を１　ｎ　／　ｍｆｌの アクチノマイシンＤ　（ａｃｔ　Ｄ）により３時間前処理しそして２００μＣｉ の５ｔ（ｒにより１時間標識するか、又はａｃｔ　Ｄと５ＩＣｒとで同時に１時 間３７°Ｃにて５％Ｃｏ２中で処理した。特にことわらない限り、単球から１０ ０Ｊ１１の培養上清を除去した後、標識された標的細胞を１００Ｊｌ！の容量で エフェクター細胞に加えてエフェクタ一対標的の比率を１０：１とした。２００ Ｉの容量の細胞を３７°Ｃにて５％ＣＯ□中で６時間インキュベートした。次に 、プレートを机上回転パケット遠心機中で１２０Ｏｒｐｍにて５分間遠心した６ １００１ｉの上清を各ウェルから取り出し、そしてＴカウンターで計数した。

アクチノマイシンＤによる前処理を略したほか、Ｐ８１５標的細胞を同様に処理 し、そして標的細胞とエフェクター細胞とを１８時時間待インキュベートした。

誘導された細胞毒性を次の式を用いて計算した。

ここで、実験ｃｐａ＋　＝エフェクター細胞十標的細胞＋誘導剤自然ｃｐＩｌｌ ＝エフェクター細胞＋標的細胞上培地最大ｃｐ＋ｍ＝１％ＳＤＳで細胞溶解され た標的細胞のみ結果を次の表に示す。

Ｃ５Ｆ〜１によ　°　れた　０ ＋１ １″培地Ｃ３Ｆ−Ｉ　Ｃ３Ｆ−１ ２°　Ｃ５Ｆ−Ｉ　Ｃ５Ｆ−１里−熔 実験　１　１９％　３４％　３５％ 実験　２　１２％　４９％　３７％ 実験　３　４％　８％　５％ 実験　４　７％　１９％　９％ Ｃ３Ｆ−１により誘導される活性化レベルは可変であるが、４゜のこの様な提供 者の内１６がＣ３Ｆ−１のみによる刺激に対して１０％と４９％の間の増強され た殺腫瘍活性を示した。

次の表において、種々の２″′の誘導剤の添加に先立って１゜の誘導剤としてＣ ５Ｆ−１を用いた。

細胞毒性（％） 培地対照　０２ Ｍ−Ｃ５Ｆ　１０００　Ｕ／ｄ　１　１１ＬＰＳ　１　ｎ／１ｔｄｌ　４　２６ ＩＦＮ−γ１１１／ｄ　Ｏ７ ＩＦＮ−ｒ　１００　Ｕ／ｄ　２　１３ＬＰＳ　１　ｎ／ａｆｔ　＋ ＩＦＮ−γ（ＩＵ／滅”）　１．１　２９ＬＰＳ　１　ｎ／ａｔｌ　＋ ＩＦＮ−ｒ　（１００Ｕ／戚）７４９ ＬＰＳ　Ｉ　Ｒ／ｒｔｒｌ　＋ ＰＭＡ　２ｎｇ／ｒｎｆｌ　２２　５３ＬＰＳ　１０ｇ／ｄ　＋ ＰＭＡ　２ｎｇ／ｒｔｔｆｌ　２４　４５ＩＬ−２５０Ｕ／ｄ　２　５ ２°の誘導剤として試験されそしてＣ５Ｆ−１の存在下又は非存在下で効果を有 しないことが見出された他の因子には５００Ｕ／ｄまでのＩＬ−１、ＩＬ−３、 ！Ｌ−４及びＧＭ−ＣＳＦが含まれた。

ネズミ　ウィルス２　の゛　「゛ チオグリコレートで誘導れたネズミ付着マクロファージをＣ５Ｆ−１と共に３日 間インキュベートし、そしてｖＳｖを一夜感染させた［Ｌｅｅ、Ｍ、Ｔ、ら（１ ９８７）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３８　：　３０１９−３０２２）　−次の表 は付着したままの細胞の５５０ｎｓｍでの吸光度により測定したクリスタルバイ オレット染色を示す。

培地／ウィルスなし　０．３４６±０．０２培地士ウィルス　０．１７０±０． ０２Ｃ３Ｆ−１，１０００１Ｊ／Ｉｄ＋ウイルス　０．２６４±０．０２従って 、Ｃ３Ｆ−１で処理された細胞はｖＳｖに対するマクロファージの保護を示した 。

Ｃ３Ｆ−１ニよるＣＭＶ仇の　几 異系交配ＣＤ−１を、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の致死量より少い量での 感染の２日前から始めて１日１回５日間にわたり、ＣＶ−１細胞系から生産され たＣ３Ｆ−１（１５８）により腹腔肉処理した。マウスを感染の３日後に殺しそ して肺臓のごとき標的器官でのウィルスの増殖の程度をプラークアッセイにより 評価した。その結果が示すところによれば、Ｃ３Ｆ−１により処理されたマウス は食塩水で処理された対照マウスと比べて有意に低い（５７，８％低い）肺臓で のウィルス力価を示し、ＣＭＶ感染がＣ３Ｆ−１で処理されたマウスにとってあ まり深刻でないことが示された。

別途、大腸菌（Ｎ３Ｃ２２１）で生産されたＣ３Ｆ−１を異系交配ＣＤ−１マウ スでの致死的ネズミＣＭＶ惑染モデルにおいて試験した（これは、器官のウィル ス力価がモニターされた、致死量より少い投与量を用いる上記の実験と対象的で ある）。Ｃ３Ｆ−１がウィルスチャレンジの２４時間前に３〜４■／ｋｇ（マウ ス当りの単位投与量）でマウスに腹腔内投与された場合、食塩水で処理された対 照に比べて生存の有意な増加が存在した。

従って、Ｃ３Ｆ−１は単独で又は他のリンホカインと組合わせて一般にウィルス 感染の治療のために使用することができ、そして特に免疫抑制ウィルス感染、例 えば後天性免疫不全症候群（ＡＴＤＳ）において有効である。

好ましい投与量はマウス１日当り約０．４〜４■／ｋｇのＣ３Ｆ−１異系交配Ｃ Ｄ−１マウスに、宿主への導入の後にグラム陰性敗＝　６　Ｘ１０’ＣＦＭ）に よるチャレンジの１日前に、ＣＶ−１細胞系から生産されたＣ５Ｆ−１の一投与 量（１０ｘ／ｋｇ）を個々に投与した。次に、注射後７日間マウスを生存につい てモニターした。

Ｃ３Ｆ−１による前処置が、致死量の大腸菌によりチャレンジされたマウスの生 存を有意に増加させた。

この実験はまたＮ３Ｃ２２１Ａ　Ｃ３Ｆ−１を用いても行われた。

Ｃ３Ｆ−１の各ロフトを、４倍の稀釈で、３Ｘ１０’〜２．７Ｘ１０”ユニッ） ／ｋｇ体重の投与量で試験した。最少保護投与量は、食塩水又は煮沸、Ｃ５Ｆ− １対照と比べて統計的に有意な（ＦｉｓｈｅｒのＥｘａｃｔ検定において０．０ ５未満のＰ値）生存の増加を示す単位投与量（１日１回、５日間ｉ、ｐ、投与） として定義された。

群　投与量　生存％（７日目） ＣＳＦ−１２，９７ｍｇ／ｋｇ　１００Ｃ３Ｆ−１０，７４■／ｋｇ　９０ Ｃ３Ｆ−１０，１８■／ｋｇ　１０ 煮沸Ｃ５Ｆ−１２，９７ｍｇ／ｋｇ　Ｏ煮沸Ｃ３Ｆ−１０，７４ｍｇ／ｋｇ　２ ０煮沸Ｃ３Ｆ−１０，１８ｍｇ／ｋｇ　Ｏ白　°ゞ小小感モモデ ル０■／ｋｇのサイクロホスファミド（ＣＹ）により前処置されたマウスにおけ る大腸菌感染のＣ５Ｆ−１により誘導される保護の結果。マウスについてのｃＹ のＬＤ、。は約４００■／ｋｇであり、本発明者らが用いたより低いｃＹ投与量 はＬＤ、。の１／８であった。

この投与量は、３日速＜ｉｐ注射された場合、全白血球細胞及び好中球の減少を 誘導し、そしてマウスを大腸菌感染に対してより一層感染性にした（例えば、３ 　Ｘ１０’ｃｆｕ／マウスでの感染はＣＹ処理されたマウスの１００％を殺した が、この投与量のＣＹを与えられなかったマウスのねずが２０％を殺した。Ｃ３ Ｆ−１がＣＹ処理マウスニ与えられた場合（０，８９ｍｇ／ｋｇ（７）Ｃ５Ｆ− １，１日１回４日間ｉｐ）　、食塩水を与えられマウスにおいて３０％であるの に対して１００％の生存が存在した。

内皿゛　胞　の生　］゛ 異系交配ＣＤ−１マウスに精製組換ヒトＣ３Ｆ−１ヲ２■／ｋｇ／投与で１日３ 回５日間続けて投与した。合計白血球細胞数は食塩水処理された対照マウスにお ける６、８２１／ｍからＣ３Ｆ−１で処理すれたマウスにおいて１２．０００〜 １３．０００／　ｍに増加した。

さらに、好中球数は食塩水で処理された対照マウスにおける１　、　０７８／　 ｄに比べてＣ３Ｆ−１で処理されたマウスにおける６、８２１／Ｉに増加した。

この効果はＣ５Ｆ−１の投与量及び投与スケジュールに依存する。末梢血好中球 の増加はＣ５Ｆ−１の腹腔円単位投与の後２〜４時間で検出できた。これらの結 果が示すところによれば、顆粒球生産の刺激剤及び白血球数の増強剤としてＣ３ Ｆ−１の投与は臨床医学及び獣医学において有用であろう。

Ｉ　の治癒におけるＣ５Ｆ−１。

Ｃ５Ｆ−１を創傷の治癒について、動物モデル及び方法、例えばＧｏｏｄｓｏｎ 及びＨｕｎｔのＧｏｒｅｔｅｘ　ミニチュア−創傷治癒モデル［（１９８２）Ｌ 嘔」シカカニ３３　：　３９４）を用いて測定する。この方法においては、移植 されたＧｏｒｅｔｅｘチューブが侵入マクロファージ、繊維芽細胞及び他の結合 組繊細胞、並びにコラーゲン及びフィブリンの沈着により満たされる。治癒はチ ューブの中味を顕微鏡検査することにより測定される。第二のモデルはＥｉｓｅ ｎｇｅｒら［（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Δｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ□ξ ＋５　：　１９３７）の切開創傷治癒モデルであり、この場合は創傷が視覚観察 され、そして治癒、細胞３度、及びのう毛から生ずる上皮細胞層の数をモニター するためにパンチ生検体が採取される。第三のモデルは漿液モデル、例えばＦｏ ｔｅｖら［（１９８７）Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ。

ては治癒が傷ついた部位の中皮表面形成の程度により測定される。これらのモデ ルのそれぞれの教示を引用によりこの明細書に組み入れる。

一般に、Ｃ５Ｆ−１は、局所投与のための上皮由来因子（ＥＤＦ）を用いる切開 創傷治癒モデル参照に記載されているように塩水中１０．０００〜１，０００， ０００　Ｕ／滅のＣ３Ｆ−１に非付着性外科包帯を浸漬することにより創傷の部 位に通用される９あるいは、Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＨｕｎｔ　（前掲）に記載され ているように、類憤の量のＣ５Ｆ−１がＧｏｒｅｔｅｘチューブに移植の際に導 入され、あるいはＣ５Ｆ−１はまた、１０〜１．０００　ｎ／ｋｇ／日の量での １日１〜３回の全身処置（ｉ、ｖ、　、　ｉ、ｐ、、又はｓ、（１）により、創 傷の部位に適用される（Ｇｏｒｅｔｅｘチューブ中で、包帯中又は包帯下で、又 は漿膜キャビティーへの注射により）。

Ｃ５Ｆ−１の存在下又は非存在下で各モデルの治癒速度が測定され、そして組織 の再生が評価される。

Ｃ５Ｆ−１はまた創傷の治癒を促進するための他の増殖因子、例えばＥＤＦ、上 皮増殖因子（ＥＧＦ）　、繊維芽細胞増殖因子（塩基性又は酸性ＦＧＦ）、血小 板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）又は形質転換増殖因子（ＴＧＦα及びβ）、ＩＬ− １及び他の物質、例えばソマトメジンＣおよびビタミンＣと組合わせて使用する こともできる。

Ｆ、Ｃ３Ｆ−１の制　び１ 組換生産されたヒ）Ｃ５Ｆ−１は標準的製剤法を用いて投与のために製剤化する ことができる。通常ＣＳＦは注射可能な形で調製することができ、これは唯一の 活性成分として、又は補完的もしくは類似の活性を有する他の蛋白質又は他の化 合物との組合わせにおいて使用され得る。この様な他の化合物には他の抗腫瘍剤 、例えば化学療法剤、例えばアトレアマイシン、又はリンホカイン、例えばＩＬ −１、−２、−３及び−４、α−１β−及びγ−インターフェロン、Ｃ３Ｆ−Ｇ Ｍ及びＣ５Ｆ−Ｇ　、並びに腫瘍壊死因子が含まれるであろうＣ５Ｆ−１活性成 分の効果はこの様な追加の成分の存在により増加又は改善され得る。上記のよう に、Ｃ５Ｆ−１は有利な態様で適切な血液細胞と相互作用することができ、そし てそれ故に本発明の組成物は、場合によっては追加のリンホカイン又はサイトカ インの存在下でのＣ３Ｆ−１とこれらの細胞のインキュベーション混合物を包含 する。この様なインキュベーション混合物の上清両分、又は細胞を含有する全体 混合物のいずれも使用することができる。

ある組合わせには時間差、例えばＣ５Ｆ−１に続き１〜２日後にＴ−インターフ ェロンを投与するのが好ましい場合がある。

本明細書に記載されるＣ５Ｆ−１は一般に、癌を除くすべての症状のため、例え ば感染性疾患の処置、創傷の治癒、骨髄造血の回復及び免疫のために、単一ポル ス投与で又は２４時間にわたって分けて１日当り０．００１〜１■／ｋｇＯ量で 療法的に投与される。血液好中球及び単球数を回復するため及び感染を予防する ために用いられるＣ３Ｆ−１投与とは対照的に、直接マクロファージ介在抗腫瘍 効果のために１日当り約０．１〜５■／ｋｇが癌患者に投与される。

下記の寄託が行われている。

ｐＨＣ５Ｆ−１４０１７７１９８５年４月２日ｐＨｃｓＦ−１ａ　２３１２　４ ０１８５　１９８５年５月２１日Ｃ３Ｆ−１７２３４７５３１４９１９８５年６ 月１４日ｐＬｃｓＦ２２１Ａ　３０９５　６７３９０　１９８７年４月１４日ｐ Ｃ５Ｆ−ａｓｐ５９　２７０５　６７１３９　１９Ｂ６年６月１９日ｐＣ５Ｆ− ｇｌｎ５２　２７０８　６７１４０　１９８６年６月１９日ｐＣ５Ｆ−ｐｒｏ５ ２　２７０９　６７１４１　１９８６年６月１９日ｐＣ５Ｆ−Ｂａｒａ　２７１ ０　６７１４２　１９８６年６月１９日ｐＣＳＦ−ＢａｍＢｃｌ　２７１２　６ ７１４４　１９８６年６月１９日ｐＣＳＦ−Ｇ１ｙ１５０　２７６２　６７１４ ５　１９８６年６月１９日これらの寄託は特許手続のための微生物の屈託の国際 的承認に関するベダペスト条約の規定及びその規則（ブダペスト条約）のもとに 行われた。これは寄託の日から３０年間の生存培養物の維持を保証する。これら の寄託物はブダペスト条約の規定のもとに、及び関連する米国特許の発行の後の 永久的且つ無制限の入手可能性を保証する寄託者とＡＴＣＣとの契約に従ってＡ ＴＣＣにより入手可能にされる。この契約は、適当な条件下で培養された場合に おいて寄託培養物が死滅し又は失われもしくは破壊された場合に、通知の俊速や かに同じ培養物の生存検体によりそれが置き代えられることに同意する。寄託物 の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとにその特許法に従って認められた 権利に反しての発明の実施の承諾であると解してはならない。

これらの寄託は関連する公衆の便宜のために行われたものであり、記載が発明の 実施を可能にするために十分でないこと又は本発明がこれらの特定の構成物に限 定されることの自白を構成するものではない、当業者が寄託された構成物を複製 し、ＤＮＡの代替形又はそれを含有する生物体を構造することを可能にし、請求 の範囲に記載されている発明の実施を可能にする完全な記載が上に記載されてい る。

本発明の範囲は例示された具体例により制限されると解すべきではなく添付され る請求の範囲に従って決定されるべきである。

＝９　ｖ　ｕ　＝３　”４　：”　章３　ｉ？　＝　茶１：浄書（内容に変更な し） 部分的ヒトＣ３Ｆ−１配列 Ｉ　ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＣ ＡＡＧＧＴＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴＡａ入Ａ＾Ｔ６１　ＣＣＴＧＧＧＡ ＡＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡＧＧＧＡＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣＴＧＡＧＧＴＡＡＧ ＧＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＴ１２１　ＴＧＴＡＧＡＴＡＴＧＡＧＧＣＣ ＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＴｆｌ、ＡＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＧＧＡＴＡ ＡＣＴＧＧＧＩＡfＡＧ ↓ １８１　ＴＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＴＧＴ ＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴs ＴｈｒＴｒｐＬｅｕＧＩｙＳｅｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕ２４１　ＧＴＴＧＧＴＣＴ ＧＴＣτＣＣＴＧ　ＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧ ＴＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＡＧＣb＾ ３５１ＴＡＴＴＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＣＴＧＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧ ＣＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＧＡ４２１　ＧＣＡＧＴ ＴＧＣＡＧ［、ＣＡＧＧＡＡＡＡＴＡＧＧＧＣＡＧＴＧＣＧＧＣＡＣＡＴＴＧＣ ＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＡＧＣＴbＣ ４８１ＡＣＣＡＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＣＡＣＴＬＡＣＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＴ ＴＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＧＡＡ５４１　ＧＣＣＣＴ ＣＴＣＴμＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴ ＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴＧＣＣＴＧＧＧＴ６０１　ＴＡＧＴＧＡＴＴＧＣＣＣＡＧ ＧＡＡＣＡＴＣ触ＣＣＡＣＴＧＡＴＴＣＴＧＡＭＡＧＧＣＴＴＣＴすＧＧＴＣＴ ＧＣＴＧＴＣＣ６６１ＣＴＣＡＧＴＧＧＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＧ［、＾Ａ Ｉｌ＋ＣＴＡＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＣＡＣＡＴＧＴsＧ Ｃ ＦＩＧ、　２ａ 特表平３−５０１３８２　（１４） ７２１　Ａ丁ＣＴＡＧＣＣＴＣＣＴＧＳＡ（ＴＣＴＣＡＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＡ ＳＴＣＴＧＣＧＡ？ＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡττＴf ７８１　ｃＡＧＧＧＬＬＧＣＧＣＴＴＧ：ＣゴＡＡＣＴＣロＡＧＣＣＴＴＣＣＡ ＣＡＣＴＣＡニアＴ　、、、　２００　ｇａｓ＝ｓ　−−００，ＴＣＣＡＧＳＣ ＣＣＣ丁ＧＡＧＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧ丁Ｃ５ＣＣＴＧＴＣＣＣτＴＣＣＧＣＣ 丁ＣＴＣτＴｕＣＣＣＣＡＧｂＡ　Ｃs ６１　ＡＣＴＴＣＴごＣＴＧＴＡＴＧＴＡＳ７ＴＧＣＴＧＴＡｌ：＋ＣＡＡＴＣ ＣＡＡＧＧＴＡＧＡＣＣＡＡ（ａＡｃこＣニ：ＡＣ，：久τ■b＋　Ｐ １２１　ＴＣＡＧＧＣＴＴＡＡＡＡτＣＣ＆ＧＬＡＣ７ＧＺ７ＧＣ７Ｃ７ＧＧＧ ＧＣ７ＡＡＡＧＡ＊ＧＣＴＴτＡＡＳＳＳ：Ｐτ（：ＱＳ：１ε：　τＣＦＡＡ こニ口；τｌ’ｌＣＡｕ　ＳＴＵ”７　こＪ’＋Ｆｌ？ｌ＋：：ｂｌ’ｉｌ　Ａ ’ｌ：”？ＩＪＴＩＣ関：ＣＴＣＴ＊こ■VＧＡＡττＣ？二二； ２４：　Ａ７ＧＡＣＡ；＊Ｓτ；Ｃ７Ｃ４：τＧ：：ＴＣ：ＡＣＣＣＡＡＱＡ７ ７Ａ　τＡ−、：：？Ａ？Ａ７？（７ｍ：＋、Ａ？ＡＱＡ：`Ｔ：Ｔ ３Ｄ’ｚ　ＣＴτ：ＣＴ７ＡＡＡＡこＦＬＡＡ？１ＪＩＪコ＋Ａ＋＋＋ＧτこＡ ＧＡτττ−５７ＳＳＣｕ？Ｇ５７ＡＳＡＡＣ１ＡＡＡ：Ａ`ＳＡ：＋Ａ ）５１　Ｃ？７ＣＴτ；ＴＴＣ７ＴＣτＦＩ　ＣＡＳ：：ττＣＣＣＣＴ’＋Ｇ ＳＣＡτこ７ＧＯ＝ｓｓ：ＡｃＴ−Ａτ：°７：τＣＣτ二R二： ４２！　ＴτＧＡＣＴＣＴＧτ０丁ＴτＣＣＡＣＧ７Ｇ７ＧＧτ７’ａＧ；ＡＳ ＳＳＡτＣＡＡＳττ：＆ＡＡ（（（：ＡＡ７（ＣＡ：？：`ｓ シ己Ｉ　Ａ大にτ”２ＳＧτＣＣＣＣＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＡＳＳニアＧＡ昌ｓ ”τＩＩ、ＡＣ７７３ＡＧＣ７Ｇ７Ａ；７７７Ａ　：：＋＋|、： ↓ ５４１　ＡＪＴＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＴＣＴＣＴＣ丁ＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＣ ＡＧＴＣＡＧＡτＧＧＡ（ａＡｃｃＴｃ’：＋Ｔｆｌ＋（：`ＡＡＴＴＡ 浄書（内容に変更なし） ６６１　ＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＴ ＧＴＧＧＧＧＧＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＴＧb ７２１ＣＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＧＧＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧ７８１　ＡＴＣＣＡ ＧＧＧＣＴＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＣＣＴ ＧＡＴＡＣＡＴＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＣ` ８４１　ＣＴＡＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＴＧＣＴＡＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴ ＧＡＣＡＧＴＡＣＣＡＣＴＡＴＧＴＧＧＴＡＣＡＣＡＡＡＴ` ９０１　ＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＣ ＡＴＡＧＣＴＡＧＴＡＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡ丁s ９６１　ＴＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＴＡＧＧＧＣＴＴいＧＧ ＣＡＡＡＴＣＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＡＡ１０２１　ＧＣＴＴ ＊１）ネズミアミノ酸配列との一致を示す一１′＞ヒトアミノ酸配列との一致を 示す↓　１２イントロン、／第２゛尤ノ境界を示すＦＩＧ、　２ｃ 浄書（内容に変更なし） 測定の間培地又は１０％リンホカイン ＦＩＧ、　３ ＡＮＹ　ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ　Ｔ。

ＦＩＧＵＲＥ　４ ＳＨＡＬＬ　ＢＥ　Ｃ０Ｎ５ＩＤＥＲＥＤ　Ｎ０Ｎ−ＥＸＸＳＴＥＮＴ（Ｓｅｅ 　Ａｒｔｉｃｌｅ　１４（２））補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年３月２２日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３２３４ ２　発明の名称 組換えコロニー刺激因子−１の使用 ３　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４６０Ｂ。

エミリービル、フィフティーサード　ストリー）　１４００名　称　シタス　コ ーボレイシッン ４代理人 補正書の翻訳文　１通 浄書（内容に変更なし） 請求の範囲 １、哺乳類における細菌感染疾患の療法的処置のために有用な組成物の製造のた めの組換コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）の使用。

λ　前記細菌感染疾患がグラム陰性敗血症である請求項１の組成物。

３、　サイトメガロウィルス感染疾患の療法的処置のために有用な組成物の製造 のための組換コロニー刺激因子−１（Ｃ５Ｆ−１）の使用。

４、哺乳類における肉腫又は黒色腫である腫瘍の処置のために有用な組成物の製 造のための組換コロニー刺激因子−１（Ｃ５Ｆ−１）の使用。

５、　前記組換Ｃ５Ｆ−１がインターフェロン−α、インターフェロン−β、イ ンターフェロン−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、　ＩＬ−１、ＧＭ−Ｃ５Ｆ又はＧ−Ｃ ５Ｆから成る群から選択された１又は複数のリンホカインと組合わせて投与され る請求項、１．２．３又は４に記載の組成物。

６、単球が生体外でＣ５Ｆ−１により処理されそして次に哺乳類に導入される、 請求項４に記載の組成物。

７、　前記リンホカインがインターフェロン−α、インターフェロン−β、イン ターフェロン−γ、ＩＬ−２又はＴＮＦである請求項５に記載の組成物。

８、腫瘍細胞に対するマクロファージの抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ） の刺激のために有用な組成物の製造のための組換コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ −１）の使用。

９、前記組換Ｃ３Ｆ−１がＩＬ−２、インターフェロン−α、インターフェロン −β又はインターフェロン−Ｔから成る群から選択された１又は複数のリンホカ インと共に投与される請求項８に記載の組成物。

１０、対象における創傷の治癒のために有用な組成物の製造のためのコロニー刺 激因子−１（ＣＳＦ−１）の使用。

１１、前記組換Ｃ３Ｆ−１が好酸球分化因子、酸性又は塩基性繊維芽細胞増殖因 子、上皮増殖因子、形質転換増殖因子α又はβ、ＩＬ−１及びソマトメジンＣか ら成る群から選択された１又は複数の増殖因子と共に投与される、請求項１０に 記載の組成物。

平成３年７月７０日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．幹細胞からの好中球を含めての白血球細胞の生産を増強するために有用な組 成物の製造のための組換コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）の使用。
2. ２．ウイルス又は細菌により惹起される感染性疾患の哺乳類における予防的又は 治療的処置のために有用な組成物の製造のための組換コロニー刺激因子−１（Ｃ ＳＦ−１）の使用。
3. ３．ウイルスがサイトメガロウイルスである請求項２の組成物。
4. ４．感染性疾患がグラム陰性敗血症である請求項２の組成物。
5. ５．組換ＣＳＦ−１がインターフェロン−α、−βもしくは−γ、ＩＬ−２、Ｔ ＮＦ、ＩＬ−１、ＧＨ−ＣＳＦ、又はＧ−ＣＳＦから成る群がら選択された１又 は複数のリンホカインとの組み合わせで投与される、請求項２の組成物。
6. ６．肉腫又は黒色腫である腫瘍の哺乳類における処置のために有用な組成物の製 造のための組換コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）の使用。
7. ７．単球がＣＳＦ−１により生体外で処理され、そして次に哺乳類に導入される 請求項６の組成物。
8. ８．リンホカインがインターフェロン−α、−βもしくは−γ、ＩＬ−２又はＴ ＮＦである請求項６の組成物。
9. ９．腫瘍細胞に対するマクロファージの抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ） を刺激するために有用な組成物の製造のための組換コロニー刺激因子−１（ＣＳ Ｆ−１）の使用。
10. １０．組換ＣＳＦ−１がＩＬ−２、インターフェロン−α、−β又はγから成る 群から選択された１又は複数のリンホカインと共に投与される、請求項９の組成 物。
11. １１．哺乳類における創傷の治癒のために有用な組成物の製造のためのコロニー 刺激因子−１（ＣＳＦ−１）の使用。
12. １２．少なくとも１種の追加のリンホカインと組合わせて組換コロニー刺激因子 −１（ＣＳＬ−１）を含んで成る哺乳類の予防的又は治療的処置のための組成物 。