DE2128744A1 - Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben und Behalter zur Durch fuhrung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben und Behalter zur Durch fuhrung des Verfahrens

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DE2128744A1 DE19712128744 DE2128744A DE2128744A1 DE 2128744 A1 DE2128744 A1 DE 2128744A1 DE 19712128744 DE19712128744 DE 19712128744 DE 2128744 A DE2128744 A DE 2128744A DE 2128744 A1 DE2128744 A1 DE 2128744A1
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Description

1JAT Ji NlVi NVA LTlJ DlI1L. -ING. K WEl GKMANN,
Dipl.-Ing. H.^7EICICMANn3 Dipl.-Phy3. Dh. K. Pincke WiDMT Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Difl.-Chem. B. Hueek
S MÜNCHEN 27, DEN
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 3921/22
Max-Planck-Gesellschaft zur FcSraerung der* Wissenschaften e. V Göttingen, Bunsenstr. 10
Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben und Behälter zur Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben und Behälter zu seiner Durchführung.
Pur viele biochemische zellphysiologische und auoh klinische Fragestellungen wie beispielsweise Untersuchungen von Arzneimitteln, Austestung von Geweben für die (Transplantation ist die !Cultivation von Zellen und Geweben über längere Zeiträume notwendig. Pur viele Fragen der Zellphysiologie v/ie etwa Untersuchungen übei* das Wachstum von Benignen-und Malignenzellen ist es erforderlich, Parallelansätze durchzuführen, bei denen bestimmte Parameter wie beispielsweise der pH-Wert, der -, Sauerstoff- und Kohlendioxyddruck geändert werden. Die Kultivation von Gewebekulturen unter Veränderung des Wasserstoff-, Sauerstoff- und Kohlendioxyddrucks durchzuführen, wäre sehr wichtig, da sich die in-vitro-Kultivationümethoden wesentlich mehr den Bedingungen im Organismus an-
Eingabe 209853/1128 ehigcgü,:^:! cm .%^
nähern müssen, als es "bisher der Fall ist. Viele Zellen und Gewebe haben beispielsweise völlig unterschiedliche Sauerstoffdruckbedingungen im Organismus.
In dem lebenden Menschen oder Tier bewirkt eine Reihe physiologischer Rückkopplungsmeclianisinen, daß - stoffdarwck, der Kohlendioxydd.ruck und der Sauerstoffdruck in der Zellumgebung bei einem bestimmten Wert gehalten werden. Bei den bekannten Verfahren zur Zellkultivation kann man diesen Zustand nicht nachahmen. Obgleich man bei den bekannten Verfahren den pH-V/ert des Mediums genau messen kann und ihn sogar elektronisch regulieren kann, macht man von dieser Möglichkeit kaum Gebrauch, da dies bei den bekannten Verfahren schwierig ist und einen komplizierten Arbeitsaufwand erfordert. Verfahren, um den Sauerstoff- und Kohlendioxyddruck in einer Zellschicht zu messen und beim Wachstum von Gewebekultüren zu kontrollieren, sind in der Literatur noch nicht beschrieben.'
Welche Wirkung der Kolilendioxyddrack auf die Vorgänge beim Kultivieren von Zellen hat, ist nicht genau bekannt. Beispielsweise nimmt man an, daß Proteincarbamate gebildet . werden. Bb ist jedoch bekannt, daß Sauerstoffdrucke, die größer sind als der Sauerstoffdruck in der Luft, d.h. hyperbarische Drucke, für das ganze Tier tödlich sind und daß ebenfalls die Gewebe absterben und daß erhöhtes ToiüOrwachstum auftreten kann. Um diese Zusammenhänge näher zu untersuchen, besteht daher ein Bedarf nach- einfachen Verfahren sur Massenkultivation von Zellen und Geweben ' ' unter automatischer Kontrolle des Sauerstoffdrucks, und des Kohlendioxyddrucks.
Die vorliegende Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Verfahren zur Kassenkultivation von Zellen und Geweben unter automatischer Kontrolle des Sauerstoffdrucks, des Wasserstoffdrucks und des Kohlendioxyddrucke zu schaffen.
geändert gemäß E'pctatDe 209853/ 112
Die Erfindung hat sich ebenfalls die Aufgabe gestellt, ein KuI ti vationsverfahren zu schaffen, gemäß dem man zahlreiche parallele Ansätze durchführen kann, wobei sich die einzelnen Ansätze durch verschiedene Versuchsbedingungen unterscheiden können. Weiterhin hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, Behälter zu schaffen, um die Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben durchzuführen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen oder mehrere sterilisierte Behälter, enthaltend Kulturmedien und Impfzellen, in einen gasdichten Brutschrank gibt, den Brutschrank aus einzelnen, kontrollierten Sauerstoff-, Stickstoff- und Kohlendioxyd quellen begast, den Wasserdampfdruck für eine bestimmte Brutschranktemperatur konstant hält, indem man die eingeleiteten Gase mit Wasserdampf sättigt und den Sauerstoffdruck, den Kohlendioxyddruck und den pH-Wert automatisch kontrolliert und, falls erforderlich, neues Medium zupumpt und altes Medium entfernt.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Durchführung von Vielfachansätzen in jede von mehreren beweglichen Kulturkammern, die, außer wenn sie sich in der Kontrollposition befinden, gasdicht sind, einen oder mehrere Behälter, enthaltend Impfseilen und Kulturmedien, legt, jede Kulturkammer in einem bestimmten Zeitraum einmal durch die Kontrollposition führt, die Kulturkammer in der Kontrollposition aus einzelnen, kontrollierten Sauerstoff-, Stickstoff- und Kohlendioxydquellen begast, den Wasserdampfdruck durch Wasserdampfsättigung der eingeleiteten Gase konstant hält und den Sauerstoffdruck, den Kohlendioxyddruck und den pH-Wert automatisch kontrolliert und gegebenenfalls neues Kulturmedium zufügt und altes Kulturmedium entsprechend entfernt.
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Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Behälter zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Der Behälter ist dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem biologisch und chemisch inerten, gasdurchlässigen und flüssigkeitsundurchlässigen Material besteht und in Form von Taschen oder Schläuchen oder Beuteln beliebiger Größe vorliegt, die an allen Seiten geschlossen sind und gegebenenfalls Einlaß- und Auslaßöffhungen oder eine offene Seite besitzen.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen in einem Behälter kultiviert, der aus einem Film besteht. Dieser Film ist biologisch völlig inert, gasd\irchlässig, transparent, und vorzugsweise thermoplastisch. Als Filmmaterial kann man alle Sorten Kunststoffe verwenden, die die angegebenen Eigenschaften besitzen. Besonders geeignet sind Fluor-Äthylen-Propylen-Mischpolymerisate, Polytetrafluoräthylen und Mischpolymerisate von Hexafluorpropylen und Tetrafluoräthylen. Die Dicke des zur Herstellung der Kultivationsbehälter verwendeten Films ist unwesentlich, solange die geforderten Eigenschaften vorliegen. Gute Ergebnisse wurden mit Filmdicken zwischen etwa 10 und 100 erzielt. Die Filme werden chemisch an der Innenseite aufgerauht, damit sie ausreichend hydrophil sind, daß die Zellen an ihnen haften. Aus dem Film können mit einem einfachen Schweißgerät jede Sorte von Behältern angefertigt werden. Man kann beispielsweise Taschen oder Schläuche oder Beutel beliebiger Größe und jeder Form anfertigen. Im allgemeinen werden rechteckige Taschen verwendet, die z.B. eine Länge und Breite von 1 bis 200 cm und eine Höhe von 0,5 bis 50 cm besitzen.
Da das Material, das zum Herstellen der Behälter verwendet wird, UV-Licht-durchlässig ist, können die Kultivationsbehälter beispielsweise durch 10- bis 15minütige UV-Bestrahlung sehr einfach sterilisiert werden.
/geändert gemäß
eingegangen am j£&a.
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Das Zellwachstum kann durch direkte visuelle Kontrolle verfolgt werden. Die optische Klarheit der Behälter macht es aber auch möglich, andere Methoden wie beispielsweise Mikrospektrophotometrie, Mikrospektrofluorometrie und Mikrokinomatographie zu verwenden.
Die Zellen können nach Auffüllen des gesamten Systems mit Kultivationsflüssigkeit entweder an einer Stelle eingeimpft v/erden, oder sie werden aus dem Flüssigkeitsreservoir zusammen mit der Kultivationsflüssigkeit zugepumpt. Die Menge an verwendetem Kultivationsmedium hängt davon ab, wie lange ohne Wechsel des Mediums kultiviert v/erden soll.
Werden die Zellen aus dem Flüssigkeitsreservoir mit zugepumpt, wird der Umpumpmechanismus anschließend für mehrere Stunden abgestellt, damit die Zellen an den Behältern fest~ wachsen können»
Nach der Kultivation können die Zellen aus den Behältern entnommen werden, indem man normale, bekannte chemische oder enzymatische Verfahren, beispielsweise Trypsinbehandlung, verwendet. Da die Haftfähigkeit der Zellen auf dem aufgerauhten Pilmmaterial zwar gut, aber bei weitem nicht so stark ist wie auf Glas, können die Zellen durch vorsichtige mechanische Manipulation ohne Schädigung von dem PiIm abgezogen werden. Dies gilt insbesondere, dann, wenn sich eine Monolage ausgebildet hat.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Herstellung von Viren, Antibiotika, Hormonen und Interferon, da die Massenkultivation von differenzierten Zellen Voraussetzung für die Gewinnung dieser Substanzen in vitro ist.
Die erfindungsgemäßen Behälter können weiterhin Zusätze wie Zellen, Viren, Bakterien, Antibiotika usw. enthalten. Diese Zusätze können entweder zusammen mit dem Kulturmedium einge-
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füllt v/erden, man kann sie aber aucli einfüllen, nachdem das Kulturmedium und die Impfzellen bereits in den Behälter eingefüllt wurden. Beispielsweise kann man diese Zusätze direkt durch den Film injizieren, v/obei sich bei einer ganz kleinen Kanüle die Einstichstelle von selbst wieder schließt, da der IiIm hinreichend plastisch ist. Bei Verwendung von größeren Nadeln kann man die Einstichstelle durch ein steriles Klebeband verschließen.
Die Behälter können auch in größeren Einheiten mit sterilem Medium gefüllt werden und dann durch Verschweißen in Untereinheiten gewünschter Größe und genau reproduzierbarer Form geteilt werden.
Gegebenenfalls können die Behälter bereits mit Zellen für die spätere Kultivation beschickt sein. In einem solchen Fall müßten die Behälter so aufbewahrt werden, daß die Zellen nicht zerstört werden. Beispielsweise kann man die Behälter dann tiefgefroren aufbewahren.
Man kann auch in die Behälter das gewünschte Kulturmedium abfüllen, die Behälter sterilisieren und sie steril lagern, wodurch es möglich ist, immer gebrauchsfertige Behälter zur Verfügung zu haben. Diese Behälter können auch gegebenenfalls in üblichen Labors, wo sterile Arbeitsplätze nicht vorhanden sind und wo ein steriles Arbeiten nicht möglich ist, direkt sum Kultivieren von Zellen benutzt werden, da sie zwar gasdurchlässig sind, nicht aber für Flüssigkeiten oder infektiöse Partikel durchlässig sind. Die Handhabung solcher vorbereiteter Gewebekulturbehälter wäre sehr einfach, da man die Impfkeime oder irgendwelche Zusätze in den Behälter, wie bereits erwähnt, injizieren könnte«, '^obei es nur erforderlich wäre, eine eventuelle Einstichstelle kurz durch Abflammen au sterilisieren.
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"- 7 — -
Bei mit Bicarbonat gepufferten Medien iöt während der Kultivation für eine entsprechende CO^-Atmosphäre zu sorgen.
Der Behälter kann auch.mit mehreren gleichen Behältern zusammenhängend in Form von Rollen, Platten oder ähnlichen Formen vorliegen. Pur die !Cultivation würde man dann die benötigte Menge an Behältern abschneiden.
In Fig, 1 sind solche zusammenhängenden Behälter dargestellt.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens legt man einzelne oder zusammenhängende Behälter in einen Brutschrank. Die Behälter können über eine peristaltische Pumpe mit einem Plüssigkeitsreservoir verbunden sein. Dadurch ist es möglich, Medium zu- oder abzupumpen. Der Umpumpmechanismus kann je nach Bedarf ab- und angestellt werden, und die Menge an zugepumptem und abgepumptem Medium kann entsprechend reguliert werden..
Der Brutschrank wird dann aus einzelnen kontrollierten Sauerstoff-, Stickstoff- und Kohlendioxydquellen begast. Der Wasserdampfdruck wird bei einer bestimmten Brutschranktemperatur im allgemeinen konstant gehalten, indem man die eingeleiteten Gasen mit Wasserdampf sättigt.
Der Sauerstoffdruck'wird in der Gasphase des Brutschranks gemessen« Durch elektronische Rückkopplung wird ein Ventil gesteuert, das den Sauerstoffdruck auf einem vorher festgelegten Wert konstant hält.
Der pH-Wert kann an irgendeiner beliebigen Stelle im Pumpsystem gemessen werden. Dabei wird das im allgemeinen bicarbonathaltige Medium an einer pH-Elektrode vorbeigepumpt. Man kann aber auch direkt eine pH-Elektrode in den Kultivationsbeutel einführen und bei abgestelltem Pumpmechanismus den pH-Wert direkt in dem Kultivationsbeutel bestimmen. Weicht der pH-Wert um mehr als eine bestimmte,
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_ 8 —
vorher eingestellte pEKEinheit vom gewünschten pH-Wert ab» so kann man durch entsprechende Rückkopplung ein Einlaßventil für Kohlendioxyd öffnen oder schließen. Im allgemeinen wird man das System so einstellen, daß sich das Einlaßventil für Kohlendioxyd öffnet und schließt, wenn der pH-Wert um mehr als 0,05 pH-Einheiten vom gewünschten und eingestellten pH-Wert abweicht. Selbstverständlich ist' es aber auch möglich, das System so einzustellen, daß erst größere pH- Differenzen ein Öffnen oder Schließen des Einlaßventils für GO0 bewirken.
Me Regulierung des pH-Wertes durch Einleiten von Kohlendioxyd ist aufgrund der Henderson-Hasselfcaeh-Crleichung möglich. Diese Gleichung gibt eine Beziehung zwischen dem pH-Wert, der (HCO~"~)-Konzentration und dem Kohlendioxyddruck wieder. Die Henderson-Hasselbach-Gleichung lautet:
(HCO") . ρΗ,,-,ο = 6,06 + log
0,024·ρ002
Im allgemeinen verwendet man bei den Kultivationsversuchen (HCO^")-Konzentrationen von 0,024 Mol und einen pH-Wert von 7,1-0,05.
Um einen konstanten Sauerstoffpartialdruck bei Veränderung der Kohlendioxydzufuhr aufrechtzuerhalten, wird die Stickstoffzufuhr durch ein entsprechend verbundenes Ventil entweder erhöht oder erniedrigt.
Der Kohlendioxyddruck wird durch eine Kohlendioxyd-Elektrode im Pumpsystem gemessen-. Kommt es zu Akkumulation von Säuren im Medium, wird zuerst der pH-Wert durch das pH-Elektroden-Kohlendioxyd-Kontrollsystem aufrechterhalten. Wird aber ein bestimmter pH-Wert überschritten, der durch den Kohlendioxyddruck nicht mehr ausgeglichen
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werden kann, d.h. wenn die Pufferreserve unter einen gewünschten Wert abfällt, kann automatisch neues Medium zugepumpt und das alte Medium entsprechend verringert werden.
InPig. 2 der Zeichnung ist eine beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Die Kulturbehälter, die bei dieser Ausführungsform nebeneinander angebracht sind, liegen in Form von Schläuchen vor und sind an ihren Enden mit Zu- und Abflußleitungen für das Kulturmedium verbunden. Das Kulturmedium wird über eine peristaltische Pumpe eingeführt und bevor es über einen Strömungsteiler durch die Beutel geleitet wird, wird es über ein Milliporenfilter filtriert. In dem abfließenden Kulturmedium wird über eine pH-Elektrode der pH-Wert gemessen. Das pH-Meter ist über einen Verstärker auf geeignete V/eise mit Ventilen verbunden, die die Stickstoff- und Kohlendioxydzufuhr regeln. Weicht der pH-Wert im Kulturmedium vom eingestellten und gewünschten pH-Wert ab, dann wird das Einlaßventil für das Kohlendioxyd entsprechend geöffnet und geschlossen, bis der pH-Wert wieder den gewünschten Wert erreicht hat. Reziprokerweise wird das Einlaßventil für den Stickstoff geöffnet oder geschlossen, um den Sauerstoffdruck in dem System konstant zu halten.
In dem abfließenden Medium wird gleichzeitig über eine Kohlendioxyd-Elektrode der Kohlendioxyddruck bestimmt. Durch elektronische Rückkopplung wird über einen Verstärker das Einlaßventil für das Kulturmedium gesteuert. Unterschreitet der Kohlendioxyddruck in dem Medium einen bestimmten Wert, wird automatisch neues Medium zugepumpt und altes Medium entfernt.
Der Sauerstoff wird in der Gasphase gemessen und durch , elektronische Rückkopplung v/ird das Einlaßventil für den · Sauerstoff entsprechend gesteuert.
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Es wurde errechnet, daß die Kapazität dieses automatischen und kontrollierten Kultivationssystems bei Benutzung eines Brutschranks mittlerer Größe bisherige Kultivationssysteme bei weitem überschreitet. Bei optimaler Ausnutzung des Raums kann ein Brutschrank etwa dieselbe Leistung bringen wie ein sogenannter 37°-Raum mit "roller machines". Sterilität der Beutel und Elektroden kann leicht durch UY-Bestrahlung erreicht werden. Da das System nach Sterilisation und Inbetriebnahme vollständig geschlossen ist, kommt es im Verlauf der Kultivation zu keinerlei Kontaminationsproblemen.
Unterteilt man den Gewebekulturraum in mehrere bewegliche Kulturkammern, so kann man Zellen unter kontrollierter Veränderung des Sauerstoff drucks.»o J und des Kohlendioxyddrucks in zahlreichen parallelen Ansätzen kultivieren. Die einzelne Kulturkammer ersetzt gewissermaßen einen Brutschrank. Auf diese V/eise kann man vergleichende Untersuchungen durchführen, wobei man jeweils irgendwelche Parameter variiert.
in Vielfachansätzen
Bei dem Verfahren zur Massenkultivation von Zellen/werden die Zellen, wie zuvor beschrieben, in den chemisch aufgerauhten Behältern beliebiger Größe kultiviert. Die Behälter werden in den einzelnen Kulturkammern zwischen zwei Stahlnetzen inkubiert, damit man eine konstante Dicke des Päckchens erhält. Die konstante Dicke des Päckchens schafft die Voraussetzung für konstante Länge des optischen Weges im Pail, wie v/eiter unten ausgeführt wird, der pH-Wert auf optischem Wege kontrolliert werden kann.
x)
/geändert gemäß Einaabe eingegangen am .yV
'f. H
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Die verwendeten Kulturkammern können jede "beliebige Größe und Form "besitzen. Sie können beispielsweise rechteckige, trapezförmige, quadratische, runde oder dreieckige Grundflächen und jede beliebige Höhe besitzen. Gegebenenfalls können sie auch so gebaut sein, daß sie übereinanderliegende Böden besitzen, auf die man die Kultivationsbehälter legen kann. Die Böden können beliebig ausgebildet sein, z.B. können sie mit Löchern versehen sein oder sie können in Form eines Netzes vorliegen.
Die Anzahl an Kultivationsbehältern, die in eine Kulturkammer gegeben wird, kann beliebig variiert werden. Man kann die Kulturkammern so bauen, daß sie nur wenige, beispielsweise 1 bis 10, Kultivationsbehälter aufnehmen können, man. kann sie aber auch so bauen, daß viele, beispielsweise bis zu mehreren 100, Kultivationsbehälter in einer Kulturkammer gleichzeitig Platz haben. Die Größe und die Form der Kulturkammern hängt beispielsweise auch von der Größe der Kultivationsbehälter und von dem beabsichtigten Zweck der Kultivation ab.
Die einzelnen Kulturkammern sind an einer bewegbaren Vorrichtung befestigt. Man kann beliebig viele Kulturkammern gleichzeitig an einer solchen Vorrichtung befestigen. Als bewegbare Vorrichtung kann man beispielsweise einen drehbaren lisch verwenden. Der drehbare Tisch kann so gebaut sein, daß er rund ist und sich im Innenkreis eines ringförmigen zweiten Tischs befindet, der gleichhoch ist und auf dem sich beispielsweise die Meßinstrumente befinden können.
Die bewegbare Vorrichtung kann aber auch so gebaut sein, daß die einzelnen Kulturkammern von oben nach unten oder von der einen zur anderen Seite bewegt werden.
Die Anordnung der einzelnen Kulturkammern kann so gewählt werden, daß sie beispielsweise nebeneinander, hintereinander, aufeinander usw. angeordnet sind. Es ist auch möglich, die KuI-
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turkamniern inäanderförmig anzuordnen. Eine solche Anordnung ist beispielsweise dann zweckmäßig, wenn man als bewegbare Vorrichtung einen drehbaren Tisch verwendet.
Die Bewegung der'Kulturkammern ist z.B. durch eine Karte oder ein Magnetband vorprogrammiert wie auch die Verweildauer in einer jeweiligen Position, die erforderlich ist, um die gewünschte Wasserstoffdruck-, Sauerstoffdruck- und Kohlendioxyddruck-Einstellung zu ermöglichen.
Jede Kulturkammer ist gasdicht, außer wenn sie sich in der Kontrollposition befindet. In dieser Stellung wird die kulturkammer zu Beginn des Versuchs aus einzelnen, kontrollierten Sauerstoff-, Stickstoff- und Kohlendioxydquellen begast. Dabei wird der Wasserdampfdruck durch Wasserdampfsättigung der eingeleiteten Gase konstant gehalten. Während des Versuchs wird in der Kontrollppsition die Gasmischung innerhalb der Kulturkammer durch Veränderung des Sauerstoff-, Stickstoff- und Kohlendioxydzuflusses entsprechend einem vorprogrammierten Rückkopplungssystem, verändert. Der Zufluß liegt zentral,der Abfluß peripher.
Jede Kulturkammer enthält eine Tür zum Einschieben und zum Entfernen von Kultivationsbeuteln, und jede Kulturkammer ist an zv/ei sich gegenüberliegenden Seiten mit einem Quarzfenster ausgerüstet, durch das in der Kontrollposition ein Lichtstrahl geht.
Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens versetzt man das Kulturmedium mit einem pH-Indikator, um so pH-Veränderungen als Veränderungen der Absorption des pH-Indikators zu bestimmen. Dieses Signal wird verstärkt und verstärkt oder vermindert den Zufluß von Kohlendioxyd, bis der pH-Wert wieder den gewünschten Wert erreicht hat.
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In dem Maße, wie die Kohlendioxydzufuhr erhöht oder erniedrigt wird, wird in reziproker Weise durch ein entsprechendes Ventil der Stickstoffzufluß erhöht oder erniedrigt, um den Sauerstoffdruck konstant zu halten.
Der Sauerstoffdruck wird durch eine Säuerstoff-Elektrode gemessen, und dann wird durch elektronische Rückopplung ein Ventil gesteuert, um den Sauerstoffdruck auf einem vorgewählten Wert zu halten. Der Säuerstoffdruck kann für jede Kulturkaminer verschieden sein, und er wird immer in der Kontrollposition "bestimmt.
Der Kohlendioxyddruck wird im Gasraum gemessen. Wenn der Kohlendioxyddruck einen bestimmten, vorgewählten Wert überschreitet, insbesondere dann, wenn zur Aufrechterhaltung des pH-Werts kaum noch Kohlendioxyd zugeführt werden muß, da die Pufferreserve des Bicarbonats fast erschöpft ist, ist ein Mediumwechsel angezeigt.
In Pig. 3 ist eine beispielhafte Ausführung für ein Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben dargestellt.
Die Kulturkammer, die im Querschnitt gezeigt ist.und in der sich die Kultivationsbehälter auf einem Drahtträger befinden, steht in Kontrollposition. Durch sich gegenüberliegende Fenster der Kulturkammer wird ein Lichtstrahl über Spiegel und Pokussierlinsen geleitet. Durch diesen Lichtstrahl werden nach entsprechender Verstärkung Einlaßventile für Stickstoff und Kohlendioxyd gesteuert.
Um festzustellen, wie weit das Zeil- oder Gewebewachstum fortgeschritten ist, wird weiterhin die Trübung oder die Absorption bei einer bestimmten Wellenlänge, beispielsweise bei 256 m/U, gemessen, wobei man entsprechend vorprogram-
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-H-
mierte Filter oder entsprechend vorprogrammierte Monoehromatoren verwendet.
Über Elektroden v/ird der Kohlendioxyd- und der Sauerstoffdruck in der Kulturkammer bestimmt, und wenn der Kohlendioxyddruck in einer bestimmten Kulturkammer eine zu niedrige /~HCOZ_7 anzeigt, dann entsteht ein Signal, was bedeutet, daß ein Mediumwechsel angezeigt ist.
Man kann für jede einzelne Kulturkammer so die verschiedensten Verfahrensbedingungen wie den Säuerstoffdruck, den Stickstoffdruck, den Kohlendioxyddruck usw. variieren.
In Fig.. 4 der Abbildung ist eine beispielhafte Ausführung für ein Verfahren zur Masseiikultivation von Zellen und Geweben dargestellt, wobei die einzelnen Kulturkammern mäanderförmig angeordnet sind. Die Zeichnung ist eine Draufsicht auf ein mögliches' "Karussell".
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Claims (17)

- 15 Patentansprüche
1. Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Gewesen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen oder mehrere sterilisierte Behälter, enthaltend Kulturmedien und Impf-zellen, in einen gasdichten Brutschrank gibt, den Brutschrank aus einzelnen, kontrollierten Sauerstoff-, Stickstoff- und Kohlendioxydquellen begast, den Wasserdampfdruck für eine "bestimmte Brutschranktemperatur konstant hält, indem man die eingeleiteten Gase mit Viasserdampf sättigt und den Sauerstoffdruck, den Kohlendioxyddruck und den pH-Wert automatisch kontrolliert und, falls erforderlich, neues Medium zupumpt und altes Medium entfernt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Sauerstoffdruck in der Gasphase des Brutschranks mißt,durch elektronische'Rückkopplung ein Ventil steuert, wodurch der Sauerstoffdruck auf einem vorher festgelegten Wert konstant gehalten wird, den pH-Wert in dem Kulturmedium mit einer Elektrode mißt und, wenn der pH-Wert um mehr als 0,05 pH-Einheiten Vom eingestellten und gewünschten pH-Wert abweicht, ein Einlaßventil für Kohlendioxyd öffnet oder schließt, wodurch die Kohlendioxydzufuhr verstärkt oder vermindert wird, bis der pH-Wert wieder den gewünschten Wert erreicht hat, wobei man, um den Sauerstoff-druck konstant zu halten, in dem Maße, wie der Zufluß von Kohlendioxyd erhöht oder erniedrigt wird, in reziproker Weise durch ein entsprechend gekoppeltes Ventil den Stickstof fzufluß erniedrigt oder erhöht, den Kohlendioxyddruck mit. einer Elektrode im Kulturmedium mißt und, sobald der Druck einen bestimmten ^ert überschreitet, neues Medium zupumpt und das alte Medium entfernt.
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3. Verfahren zur Massenkultivation von Zellen und Geweben, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchführung von Vielfachansätzen in jede von mehreren beweglichen Kulturkammern, die, außer wenn sie sich in der Kontrollposition befinden, gasdicht sind, einen oder mehrere Behälter, enthaltend Impfzellen und Kulturmedium, legt, jede Kulturkammer in einem bestimmten Zeitraum einmal durch die Kontrollposition
führt, die Kulturkammer in der Kontrollposition aus einzelnen, kontrollierten Sauerstoff-, Stickstoff- und Kohlendioxydquellen begast, den Wasserdampfdruck durch Wasserdampfsättigung der eingeleiteten Gase konstant hält und den ™ Sauerstoff druck, den Kohlendioxyddruck und den pH-Wert automatisch kontrolliert und gegebenenfalls neues Kulturmedium zufügt und das alte Kulturmedium entsprechend entfernt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Versuchsbedingungen in den einzelnen Kulturkammern unterscheiden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß jede Kulturkammer eine Tür zum Einschieben Und Entfernen der Kultivationsb'ehälter besitzt und an zwei sich gegenüberliegenden Stellen gegebenenfalls auch mit einem Quarzfenster ausgerüstet ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Bewegung der Kulturkammer und die Verweildauer in jeder Position vorprogrammiert sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man den Sauerstoffdruck durch eine Sauerstoffelektrode mißt, durch elektronische Rückkopplung ein Ventil steuert, wodurch der Sauerstoffdruck bei einem vorher festgelegten Wert konstant gehalten wird, den pH-Wert
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in dem Kulturmedium mißt und dieses Signal verstärkt, wodurch ein Einlaßventil für Kohlendioxyd geöffnet oder geschlossen wird und der Zufluß von Kohlendioxyd verstärkt und vermindert wird, bis der pH-Wert wieder den gewünschten Wert erreicht hat, wobei, um den Sauerstoffdruck konstant zu halten, in einem Maß, wie der Zufluß von Kohlendioxyd erhöht oder erniedrigt wird, in reziproker Weise durch ein entsprechend gekoppeltes Ventil der Stickstoffzufluß erniedrigt oder erhöht wird, den Kohlendioxyddruck im Kulturmedium mit einer Elektrode bestimmt und, wenn der Kohlendioxyddruck einen vorgewählten, bestimmten Wert überschreitet, neues Medium zupumpt und das alte Medium entsprechend entfernt.
8. Behälter zur Durchführung der Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem biologisch und chemisch inerten, gasdurchlässigen und flüssigkeitsundurchlässigen Material besteht und in Form von Taschen oder Schläuchen oder Beuteln beliebiger Größe vorliegt, die an allen Seiten geschlossen sind und gegebenenfalls Einlaß- und Auslaßöffnungen oder eine offene Seite besitzen.
9. Behälter nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die inneren Seiten des Behälters chemisch aufgerauht sind.
10. Behälter nach einem der Ansprüche 8 und 91 dadurch gekennzeichnet, daß er UV-Licht-durchlässig ist.
11· Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Material ein Fluoräthylen-Propylen-Mischpolyraerisat ist.
12. Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Material ein Teflonfilm ist.
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- is -
13. Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Material 10 bis lOO-^oytt-Mck ist.
14. Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß er in Form rechteckiger Taschen vorliegt, die eine Lange und Breite von 1 bis 200 cm und eine Höhe von 0,5 bis 50 cm besitzen.
15. Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Kulturmedium enthält.
16. Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch ψ gekennzeichnet, daß er tiefgefrorene Zellen und gegebenenfalls ein Kulturmedium enthält.
17. Behälter nach einem der Ansprüche 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß er mit mehreren gleichen Behältern zusammen vorliegt, die miteinander in Form von Rollen, Platten oder endlosen Schläuchen verbunden sind.
^geändert gemäß Eingabe eingegangen am .^a£7^
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JA
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