DE9209540U1 - Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen - Google Patents
Vorrichtung zur Kultivierung von MikroorganismenInfo
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Description
BESCHREIBUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, wobei die
Mikrotiterplatten durch Membranen verschlossen sind, die einerseits das Austreten von Flüssigkeit verhindern und
andererseits permeabel für Sauerstoff sind.
Stand der Technik
Die Verwendung von Mikrotiterplatten zur Kultivierung von Mikroorganismen, wobei viele Kulturen getestet werden, ist
bekannt. Eine Reihe von Publikationen beschäftigt sich mit dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Mikroorganismen
bzw. von Substanzen, die von Mikroorganismen erzeugt werden.
FR-A 2 556 741 beschreibt Mikrotiterplatten, die zur
Detektion der Einwirkung bestimmter Substanzen auf Mikroorganismen oder Mischungen von Mikroorganismen
verwendet werden, wobei sich die Mikroorganismen in einem lyophilen Medium befinden und die einwirkende Substanz im
Kulturmedium zugegeben wird sowie danach die Mikrotiterplatte bei geeigneter Temperatur inkubiert
wird.
Mikrotiterplatten für antibiotische Empfindlichkeitstests,
die bei tiefen Temperaturen, beispielsweise bei -70 Grad C
gelagert werden, um die Stabilität der Antibiotika zu erhalten, werden von P.L. Kuglin Bailey und M.B. McGuckin
in Am. J. Med. Technol 45 (6), Seiten 517 bis 522, 1979
beschrieben.
In DE-OS 33 36 738 werden ebenfalls Mikrotiterplatten für antibiotische Empfindlichkeitstests beschrieben. Die
Mikrotiterplatten weisen austauschbare Module mit Kavitäten auf, wobei die Kavitäten bestimmte Volumina,
beispielsweise an Suspensionen von Bakterien, aufnehmen können und wobei die Kavitäten Öffnungen zum Gasaustausch
aufweisen.
Das deutsche Gebrauchsmuster G 91 07 670.6 stellt modifizierte Mikrotiterplatten an sich bekannter
Zusammensetzung vor, die zur Fixierung von biologisch signifikanten, Amino- oder SuIfohydridgruppen enthaltenden
Materialien an der Oberfläche, mindestens im Bereich der Kavität, eine transparente Polymerbeschichtung aufweist,
die eine Vielzahl an Epoxidgruppen enthält. Im US-Patent 4 680 269 werden Mikrotiterplatten
beschrieben, deren Kavitäten mit einer porösen Schicht abgedeckt sind, die mit einer sauren Komponente
imprägniert ist. Diese Schicht ist in der Lage, gasförmige, basische Produkte, wie beispielsweise
Ammoniak, die beim Wachstum von Bakterienkulturen gebildet werden können, zu neutralisieren. Damit werden Fehler bei
pH-sensitiven biochemischen Tests vermieden.
Aufgabe und Lösung
Bei der Kultivierung von Mikroorganismen ist in der Screeningphase oft die Erprobung sehr vieler Kulturen
notwendig. Dabei werden in den einzelnen Kulturen hohe Zelldichten beziehungsweise hohe Biomassekonzentrationen
angestrebt, insbesondere wenn die Bildung eines gewünschten Produktes des Zellstoffwechsels,
beispielsweise eines Fermentationsproduktes, von der Biomassekonzentration in der Kultur abhängig ist.
Die Biomassebildung ist beispielsweise bei aeroben Prozessen primär von der Menge des in die Kultur
eingebrachten Sauerstoffs abhängig. Um dies zu erreichen, werden in der Regel Erlenmeyerkolben mit Schikanen
verwendet, die auf Schüttlern inkubiert werden. Typischerweise weisen die Schüttelkolben ein Gesamtvolumen
von 100 ml auf und werden mit etwa 20 ml Kulturmedium befüllt. Im Vergleich zu einer miniaturisierten Ausführung
ist die Herstellung vieler Schüttelkolbenkulturen zeit- und materialaufwendig.
Verwendet man Mikrotiterplatten des Standes der Technik, so wird bei den o.a. aeroben Prozessen die Biomasse
zunächst an der Oberfläche des Kulturmediums in den Kavitäten gebildet und damit eine weitere
Sauerstoffdiffusion in das Innere des Kulturmediums gehemmt. Diese Diffusionssperre kann teilweise durch
Schütteln überwunden werden, wobei bei der üblichen zweidimensionalen Schütteltechnik die Gaspermeation durch
die hohen Oberflächenspannungen und durch die Konzentration der spezifisch leichteren Biomasse an der
Oberfläche des Kulturmediums nur unwesentlich verbessert wird.
Die daraus resultierende Aufgabe, die in die Kavitäten von Mikrotiterplatten gerichtete Gaspermeation bei der
Kultivierung von Mikroorganismen bei gleichzeitiger miniaturisierter Ausführung der Kulturen zu verbessern,
wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung gelöst. Sie
dient zur Kultivierung von Mikroorganismen in Mikrotiterplatten (Abb. 1, 1), wobei die Kavitäten der
Mikrotiterplatten (2) durch flexible Membranen (4) verschlossen werden, die eine gute Sauerstoffpermeabilität
aufweisen und gleichzeitig das Austreten des in den Kavitäten (2) befindlichen flüssigen Kulturmediums
verhindern. Mit der in Abb. 2 und Abb. 3 dargestellten Vorrichtung werden die Mikrotiterplatten (1) zur
Biomassebildung in den Kulturmedien, die sich in den Kavitäten (2) befinden, bei konstanter Temperatur zur
intensiven Durchmischung und damit zur Sauerstoffanreicherung bewegt. Die flexible Membran (4)
besteht vorzugsweise aus einem Kunststoff mit einer Sauerstoffpermeabilität, ausgedrückt durch den
Gaspermeationskoeffizienten P, von mehr als 10~^ cm3
(■ ^' besonders bevorzugt aus einem
Polymerisat bestehend aus Siloxan-Einheiten (Organopolysiloxan).
Durchführung der Erfindung
In Abb. 1 ist die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte (1)
dargestellt. Sie besteht aus einer variierbaren Anzahl A Kavitäten (2). Gewöhnlich sind Kavitäten (2) und
Grundplatte (2a) aus einem transparenten Material, bevorzugt aus Kunststoff, wobei die Kavitäten (2) nach
einer Seite offene Zylinder darstellen. Die Anzahl A der Kavitäten (2) liegt beispielsweise zwischen 12 und 96.
Nach Befüllen der Kavitäten (2) mit dem flüssigen Kulturmedium, beispielsweise Mikroorganismen in einer
wäßrigen Nährstofflösung, werden die offenen Seiten der ■
bevorzugt zylindrischen Kavitäten mit einer flexiblen Membran (4) abgedeckt, die eine gute Sauerstoffpermeabilität
aufweisen muß. Die Sauerstoffpermeabilität kann beispielsweise durch den Gaspermeationskoeffizienten
P ausgedrückt werden, der in das Fick'sche Transportgesetz eingeht:
&ngr; -
wobei N = durchgehende Menge des Gases P = Gaspermeationskoeffizient
F = Durchgangsfläche
Ap = Dampfdruckdifferenz des Gases
Ap = Dampfdruckdifferenz des Gases
t = Durchgangszeit
und d = Dicke der Membran (4)
bedeuten.
und d = Dicke der Membran (4)
bedeuten.
Vorzugsweise besteht die flexible Membran (4) aus einem Kunststoff mit einem Gaspermeationskoeffizient P von mehr
als 10~9 cm3 &Ggr; / wobei besonders bevorzugt
Kunststoffe eingesetzt werden, die gegen das Kulturmedium korrosionsbeständig sind (vgl. hier z.B. Vieweg/Braun,
Kunststoff-Handbuch, Band 1, Seiten 936 ff, Carl-Hanser, München, 1975) .
Als Kunststoff werden beispielsweise Polystyrol, Poly(meth)acrylate, Polycarbonat, Polyethylen mit einer
Dichte von weniger als 0,94 g/cm3, Styrol-Butadien-Gummi
und insbesondere Organopolysiloxane, wie beispielsweise Dimethylpolysiloxan, verwendet.
Die Membran (4) muß so flexibel sein, daß sie kleine Durchstiche, wie sie beim Nachfüttern von Nährlösung
C^ ^ -T -1
in einzelne Kavitäten (2) mit Injektionsnadeln entstehen können, nach dem Herausziehen der Injektionsnadel sofort
wieder schließen und damit kein Kulturmedium austreten kann.
Zur Fixierung der Membran (4) wird über diese eine Fixierplatte (3), die gewöhnlich aus dem gleichen Material
wie Grundplatte (2a) besteht und um ca. 25 bis 50 % größere Maße besitzt, mit Bohrungen (3a) gelegt, die es
ermöglichen, die einzelnen Kavitäten (2) mit Nährflüssigkeit, Kulturen oder anderen Bestandteilen des
Kulturmediums per Injektionsnadel zu versorgen. Die Fixierplatte (3) wird mit der Grundplatte (2a) über
Verschraubungen (6) verbunden, wobei die Bügel (5) zur zusätzlichen Fixierung von Membran (4) und Fixierplatte
(3) auf den Kavitäten (2) verwendet werden.
Die solcherart zusammengesetzte Mikrotiterplatte (1) wird in einem Medium konstanter Temperatur so bewegt, daß es in
den Kavitäten (2) zu einer intensiven Durchmischung der flüssigen Kulturmedien kommt. Bevorzugt wird als
Temperiermedium Luft verwendet, die mit einem Heizthermostaten auf die erforderliche Temperatur,
bevorzugt zwischen 30 und 60 Grad C, aufgeheizt und im Brutschrank umgewälzt wird. Der Brutschrank
besteht bevorzugt aus einem transparente Gehäuse, das vorzugsweise aus Kunststoff und besonders vorzugsweise
aus Polymethylmethacrylat (Plexiglas®) aufgebaut ist. Die Mikrotiterplatten (1) sind auf einem Haltegestell ,
das auf einer motorgetriebenen Welle sitzt, angebracht. Die intensive Durchmischung des flüssigen
Kulturmediums in den Kavitäten (2) kommt durch eine rotierende Bewegung der Mikrotiterplatten (1) um die Welle
zustande.
Vorteile der Erfindung
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Kultivierung von
Mikroorganismen werden gleichbleibend hohe Sauerstoffkonzentrationen im flüssigen Kulturmedium, das
sich in den Kavitäten (2) befindet, durch intensive Durchmischung des Kulturmediums und durch den ständigen
Ersatz des verbrauchten Sauerstoffs durch die flexible Membran (4) hindurch gewährleistet. Darüber hinaus
verhindert die intensive Durchmischung ein Absetzen der Biomasse an der Oberfläche der Kulturflüssigkeit, was
ebenfalls ein Grund für eine Hemmung des Sauerstoff-Transports und damit der Biomasse-Bildung ist.
Bei Screening-Versuchen ist das kleine Volumen der Kavitäten (2) der Mikrotiterplatten (1) von Vorteil, weil
dadurch die Menge an Kulturmedium deutlich reduziert werden kann. Darüber hinaus ist die Herstellung von vielen
Schüttelkolbenkulturen in Vergleich zu der erfindungsgemäßen miniaturisierten Ausführung sehr zeit-
und materialaufwendig.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern.
Die verwendeten Mikrotiterplatten (1) bestehen aus
Polystyrol (Costar R, Fa. Falcon) und weisen 12 bis 96
Kavitäten (2) auf. Die Membran (4) besteht aus einer Folie aus vernetzten! Polydimethylsiloxan und weist eine
Dicke von 1 mm auf. Die Fixierplatte (3) und die Grundplatte (2a) sind Polymethylmethacrylat-Platten von 5 mm
Dicke mit ca. um 25 % größeren Maßen (Länge, Breite) wie die Mikrotiterplatte (1), wobei die Anzahl und Lage der
Bohrungen (3a) derjenigen der Kavitäten (2) auf der Mikrotiterplatte (1) entspricht.
Die Welle (7) auf der die Mikrotiterplatte (1) befestigt ist, wird von einem Elektromotor angetrieben. Der
Brutschrank (8, vgl. Abb. 2 und 3) besteht aus transparentem Polymethylmethacrylat (Plexiglas ®) , wobei
die erforderliche Temperatur im Brutschrank (8), die zwischen 30 und 60 Grad C, bevorzugt zwischen 35 und 40
Grad C betragen soll, mittels eines Heizthermostaten (9) mit Luftumwälzung eingestellt wird.
Claims (4)
1. Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen in
Mikrotiterplatten,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Kavitäten der Mikrotiterplatten durch flexible Membranen verschlossen werden, die eine gute
Sauerstoffpermeabilität aufweisen und das Austreten der flüssigen Kulturmedien verhindern.
2. Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine
Bewegung der Mikrotiterplatten zur intensiven Durchmischung der flüssigen Kulturmedien bei
konstanter Temperatur erfolgt.
3. Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die flexible Membran aus einem Kunststoff mit einer Sauerstoffpermeabilität, ausgedrückt durch den
Gaspermeationskoeffizienten für Sauerstoff P, von
mehr als 10"9 cm3 C J besteht.
4. Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der die flexible Membran bildende Kunststoff ein Organopolysiloxan ist.
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