DK145380B - Fremgangsmaade til massedyrkning af celler og vaev og beholder til udfoerelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

(19) DANMARK \jsa/

|j| 2) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 145380B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2867/72 (51) lnt.CI.3 C 12 M 3/0A

(22) Indleveringsdag 8. jun. 1972 (24) Løbedag 8. jun. 1972 (41) Aim. tilgængelig 10. dec. 1972 (44) Fremlagt 8. nov. 1982 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag ~ (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 9. jun. 1971* 2128744, DE

(71) Ansøger MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DER WISSENSCHAFTEN

E.V., 3400 Goettingen, DE.

(72) Opfinder Donald Francia Hoelzl Wallach, US: Paul Gerhard Mun= der, DE: Manuel Modolell, DE.

(74) Fuldmægtig Internationalt Patent-Bur eau.

(54) Fremgangsmåde til massedyrkning af celler og væv og beholder til udførelse af fremgangsmåden.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til massedyrkning af celler og væv, ved hvilken man anbringer én eller flere biologisk og kemisk indifferente beholdere, der .indeholder kulturmedier, i en gastæt, eventuelt i flere bevægelige kulturkamre opdelt, inkubator, tilfører i en kontrolstilling gasser til inkuba-toren fra særskilte, kontrollerede oxygen-, nitrogen- og carbondioxidkilder og, om nødvendigt, tilpumper nyt medium og fjerner gammelt medium. Opfindelsen angår

QQ

desuden en biologisk og kemisk indifferent beholder til udførelse af fremgangsmå-30 den ifølge opfindelsen.

“O · ^ Til mange biokemiske,cellefysiologiske og også kliniske opgaver, som f.eks.

j· undersøgelser af lægemidler og afprøvning af væv til transplantation, er det nød- vendigt med dyrkning af celler og væv over længere tidsrum. Til mange opgaver inden for cellefysiologien, som f.eks. undersøgelser over vadesten af benigne og maligne □ 2 145380 celler, er det nødvendigt at udføre parallelforsøg, ved hvilke man ændrer bestemte parametre, som f.eks. pH-værdien, oxygentrykket og carbondioxidtrykket. Det er meget vigtigt at kunne udføre dyrkning af vævskulturer under ændring af pH-værdien og oxygen- og carbondioxidtrykket, da in-vitro-dyrkningsmetoderne må ligge væsentligt nærmere betingelserne i organismen, end det hidtil har været tilfældet. Mange celler og væv har f.eks. helt forskellige oxygentrykbetingelser i organismen.

I det levende menneske eller dyr bevirker en række fysiologiske tilbagekoblingsmekanismer, at pH-værdien, carbondioxidtrykket og oxygentrykket i celleomgivelserne holdes ved en bestemt værdi. Ved de kendte fremgangsmåder til celledyrkning kan man ikke efterligne denne tilstand. Selvom man ved de kendte fremgangsmåder kan måle mediets pH-værdi nøjagtigt og endog kan regulere det ad elektronisk vej, gør man næppe brug af denne mulighed, da dette ved de kendte fremgangsmåder er vanskeligt og kræver en kompliceret arbejdsindsats. Fremgangsmåder, der går ud på at måle oxygen- og carbondioxidtrykkket i et cellelag og at kontrollere det ved væksten af vævskulturer, er hidtil ikke beskrevet i litteraturen.

Hvilken virkning carbondioxidtrykkket har på processerne ved dyrkning af celler er ikke nøjagtigt kendt. Man antager eksempelvis, at der dannes proteincarbamat.

Det er dog kendt, at oxygentryk, som er større end oxygentrykket i luften, dvs. hyperbariske tryk, er dødbringende for hele dyret, og at vævene ligeledes dør hen, og at der kan optræde forøget turmorvækst. Til nærmere undersøgelse af disse forhold er der derfor et behov for enkle fremgangsmåder til massedyrkning af celler cg væv under automatisk kontrol af oxygentrykket og carbondioxidtrykket.

Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe en fremgangsmåde til massedyrkning af celler og væv under automatisk kontrol af oxygentrykket, pH-værdien og carbondioxidtrykket, ved hvilken fremgangsmåde man kan udføre talrige parallelforsøg, hvor de enkelte forsøg adskiller sig ved forskellige forsøgsbetingelser. Opfindelsen tilsigter endvidere at tilvejebringe en beholder til udførelse af denne fremgangsmåde.

Det ovennævnte formål opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved, at man som indifferent beholder anvender én eller flere gas-gennemtrængelige, væskeuigennemtrængelige, steriliserede, transparente plastfilm-beholdere, der til fremme af cellevæksten ad kemisk vej er rugjort på indersiden, og at de tilførte gasser mættes med vanddamp, hvorved vanddamptrykket holdes konstant for en bestemt inkubatortemperatur, og at oxygentrykket, carbondioxidtrykket og pH-værdien måles i cellernes umiddelbare omgivelser og automatisk kontrolleres .

Den omhandlede biologisk og kemiske indifferente beholder til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den består af en gasgennemtrængelig og væskeuigennemtrængelig, transparent plastfilm og foreligger i form af lommer, slanger eller poser af vilkårlig størrelse, som på alle sider 145380 3 er lukkede og eventuelt har tilførsels- og afgangslbninger eller har en åben side, hvorhos beholderens indvendige side er gjort ru ad kemisk vej.

Fra USA-patentskrift nr. 2.996.429 kendes en fremgangsmåde af den omhandlede art og et tilhørende apparat. Ved denne kendte fremgangsmåde er der imidlertid ikke tale om, at oxygentrykket, carbondioxidtrykket og pH-værdien automatisk kontrolleres, og f.eks. kontrollen af pH-værdien foregår rent visuelt med manuel korrektion. Den væsentligste forskel mellem den nævnte kendte fremgangsmåde og fremgangsmåden ifølge opfindelsen består imidlertid i, at den i førstnævnte tilfælde til dyrkning af vævsceller anvendte membran er gennemtrængelig for kulturmediet, men ikke gasgennemtrængelig, medens det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er lige omvendt, idet membranen her skal være uigennemtrængelig for kulturmediet, men gasgennemtrængelig. Først herved bliver det muligt at dyrke cellerne på grænsen mellem gas- og væskefasen på membranen, og først herved bliver massedyrkning af celler i stor målestok økonomisk gennemførlig. Den foreliggende opfindelse muliggør uden teknologiske problemer med forholdsvis små apparater i forhold til dyrkningsapparaturet ifølge det nævnte USA-patentskrift med de deri for dyrkningsfladen angivne mål at lade en ca. 10 gange så stor overflade bevokse med celler og dermed at forøge udbyttet betydeligt.

Endvidere kendes der fra tysk fremlæggelsesskrift nr. 1.467.779 en til dyrkning af mikroorganismer beregnet beholder, som med hensyn til form og materiale ligner beholderen ifølge den foreliggende opfindelse. Der er imidlertid den meget væsentlige forskel, at den sidstnævnte beholder består af en plastfilm, som er gjort ru ad kemisk vej. Herved opnås en fortræffelig gasgennemtrængelighed og en overfladebeskaffenhed, der fremmer tilvæksten og den fortsatte vækst af celler.

Først den med fremgangsmåden og beholderen ifølge opfindelsen opnåelige dyrkning af celler på grænsefladen mellem gas- og væskefasen muliggør en virkelig eksakt automatisk kontrol af oxygentrykket, carbondioxidtrykket og pH-værdien i cellens umiddelbare omgivelser.

Til opnåelse af eksakt automatisk kontrol af oxygentrykket, carbondioxidtrykket og pH-værdien på enkel og dog pålidelig måde er det ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt, at man måler oxygentrykket i inkubatorens gasfase, ved elektronisk tilbagekobling styrer en ventil, hvorved oxygentrykket holdes konstant på en forud fastlagt værdi, måler pH-værdien i kulturmediet med en elektrode og, når pH-værdien afviger fra den indstillede og ønskede pH-værdi med f.eks. mere end 0,05 pH-enheder, åbner eller lukker en tilførselsventil for carbondioxid, hvorved carbondioxidtilførslen forøges eller formindskes, indtil pH-værdien atter har nået den ønskede værdi, idet man, for at holde oxygentrykket.konstant, i det forhold, hvori tilførslen af carbondioxidet forøges eller formindskes, på reciprok måde ved hjælp af en passende koblet ventil formindsker eller forøger nitrogentilførslen, måler carbondioxidtrykket med en elektrode i kulturmediet og, så snart tryk- ( 1Λ5380 4 ket overskrider en bestemt værdi, tilpumper nyt medium og fjerner det gamle med-dium.

En anden hensigtsmæssig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at man til udførelse af multiforsøg i hvert af flere bevægelige kulturkamre, som, undtagen når de befinder sig i kontrolstillingen, er gastætte, anbringer én eller flere beholdere, der indeholder podeceller og kulturmedium, fører hvert kulturkammer i et bestemt tidsrum én gang gennem kontrolstillingen, tilfører kulturkammeret gasser i kontrolstillingen fra særskilte, kontrollerede oxygen-, nitrogen- og carbondioxidkilder, holder vanddamptrykket konstant ved mætning af de tilførte gasser med vanddamp og kontrollerer oxygentrykket, carbondioxidtrykket og ρΗ-værdien automatisk og eventuelt tilfører nyt kulturmedium og tilsvarende fjerner det gamle kulturmedium. Herved kan man på enkel og ensartet måde udføre multiforsøg. En yderligere fordel ved denne udførelsesform kommer til udtryk, når forsøgsbetingelserne i de enkelte kulturkamre er forskellige. Derved kan man nemlig i et enkelt apparat udføre parallelforsøg eller forsøg af forskellig art.

Ved de to sidstnævnte udførelsesformer er det endvidere hensigtsmæssigt, at hvert kulturkammer har en låge til indskydning og fjernelse af dyrkningsbeholderne og eventuelt også er forsynet med et kvartsvindue på to over for hinanden liggende steder. Herved kan en enkelt dyrkningsbeholder udtages og en ny eventuelt indsættes uafhængigt af de øvrige dyrkningsbeholdere, og ved hjælp af kvartsvinduerne kan der foretages optisk måling dels af pH som funktion af en pH-indikators absorption, dels af celle- eller vævsvæksten som funktion af uklarheden.

Yderligere er det ifølge opfindelsen hensigtsmæssigt, at bevægelsen af kulturkammeret og opholdstiden i hver stilling er forprogrammeret. Herved kan systemet indstilles til opnåelse af optimale betingelser.

En hensigtsmæssig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ved hvilken der opnås optimale dyrkningsudbytter under praktisk taget in-vivo-be-tingelser, består i, at man måler oxygentrykket ved hjælp af en oxygen-elektrode, ved elektronisk tilbagekobling styrer en ventil, hvorved oxygentrykket holdes konstant på en forud fastlagt værdi, måler ρΗ-værdien i kulturmediet og forstærker dette signal, hvorved en tilførselsventil for carbondioxid åbnes eller lukkes og tilførslen af carbondioxid forøges eller formindskes, indtil ρΗ-værdien atter har nået den ønskede værdi, idet, for at holde oxygentrykket konstant, i det forhold, hvori tilførslen af carbondioxid forøges eller formindskes, nitrogentilførslen formindskes eller forøges pa reciprok måde ved hjælp af en passende koblet ventil, bestemmer carbondioxidtrykket i kulturmediet med en elektrode og, når carbondioxid-trykket overskrider en forud valgt, bestemt værdi, tilpumper nyt medium og tilsvarende fjerner det gamle medium.

Fremgangsmåden og Beholderen ifølge opfindelsen belyses nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, hvorpå U5380 5 fig. 1 skematisk viser tre ene, sammenhængende beholdere ifølge opfindelsen, fig. 2 flere sammenhængende beholdere ifølge opfindelsen, som indgår i et skematisk vist system til måling og kontrol ifølge den omhandlede fremgangsmåde, fig. 3 et lignende system som i fig. 2, men hvor dyrkningsbeholderne er vist anbragt i et kulturkammer, og fig. A et skematisk delsnitbillede af en anden type kulturkammer indeholdende dyrkningsbeholdere ifølge opfindelsen.

Til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkes cellerne i en beholder, der består af en film. Denne film er biologisk fuldstændigt indifferent, gasgennemtrængelig, transparent og fortrinsvis termoplastisk. Som filmmateriale kan man anvende alle slags plast, der har de angivne egenskaber. Særlig egnet er fluorethylen-propylen-copolymerisater, polytetrafluorethylen og co-polymerisater af hexafluorpropylen og tetrafluorethylen. Tykkelsen af den til fremstilling af dyrkningsbeholderen anvendte film er uvæsentlig, så længe de krævede egenskaber foreligger. Gode resultater blev opnået med filmtykkelser mellem ca.

10 og 100^m. Filmene gøres ad kemisk vej ru på indersiden, således at de er tiiste kkeligt hydrofile til, at cellerne hæfter til dem. Af filmen kan der med et enkelt svejseapparatur forfærdiges enhver slags beholder. Man kan f.eks. forfærdige lommer eller slanger eller poser af vilkårlig størrelse og af enhver form. Almindeligvis anvendes der retvinklede lommer, der f.eks. har en længde og bredde på 1 til 200 cm og en højde på 0,5 til 50 mm.

Da det materiale, som anvendes til fremstilling af beholderne, er gennern-trængeligt for ultraviolet lys, kan dyrkningsbeholderne steriliseres på meget enkel måde ved f.eks. 10 til 15 minutters bestråling med ultraviolet lys.

Cellevæksten kan følges ved direkte visuel kontrol. Beholdernes optiske klarhed gør det imidlertid også muligt at anvende andre metoder, som eksempelvis mikro-spektrofotometri, mikrospektrofluorometri og mikrokinomatografi.

Cellerne kan efter fyldning af hele systemet med dyrkningsvæske enten tilpodes på ét sted eller tilpumpes fra væskereservoiret sammen med dyrkningsvæsken. Mængden af anvendt dyrkningsmedium afhænger af, hvor længe der skal dyrkes uden udskiftning af mediet.

Dersom cellerne tilpumpes fra væskereservoiret, standses ompumpningpmekanis-men derefter i flere timer, for at cellerne kan vokse fast på beholderne.

Efter dyrkningen kan cellerne udtages af beholderne, idet man anvender sædvanlige, kendte kemiske eller enzymatiste fremgangsmåder, f.eks. trypsinbehandling.

Da cellernes vedhæftningsevne til det rugjorte filmmateriale er ganske god, men langtfra så stærk som til glas» kan cellerne ved forsigtig mekanisk manipulation uden beskadigelse trækkes af filmen. Dette gælder navnlig, når der har dannet sig et monolag.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen egner sig også til fremstilling af virus, 6 145380 antibiotika, hormoner og interferon, da massedyrkning af differentierede celler er en forudsætning for udvindingen af disse stoffer in vitro.

Beholderne ifølge opfindelsen kan endvidere indeholde tilsætninger, såsom celler, virus, bakterier, antibiotika osv. Disse tilsætninger kan enten tilføres sammen med kulturmediet, eller man kan tilføre dem, efter at kulturmediet og podecellerne allerede er fyldt på beholderen. Eksempelvis kan man injicere disse tilsætninger direkte gennem filmen, idet ved anvendelse af en ganske lille kanyle indstikningsstedet lukker sig igen af sig selv, da filmen er tilstrækkelig plastisk. Ved anvendelse af større nåle kan man lukke indstikningsstedet ved hjælp af et sterilt klæbebånd.

Beholderne kan også i større enheder fyldes med sterilt medium og derefter ved svejsning opdeles i underenheder af ønsket størrelse og af nøje reproducerbar form. Eventuelt kan beholderne allerede være påfyldt celler til den senere dyrkning.

I sådanne tilfælde må beholderne opbevares således, at cellerne ikke ødelægges.

I så fald kan man f.eks. opbevare beholderne i dybfrossen tilstand.

Man kan også fylde det ønskede kulturmedium på beholderne, sterilisere beholderne og lagre dem sterilt, hvorved det er muligt altid at have brugsfærdige beholdere til rådighed. Disse beholdere kan eventuelt også benyttes direkte til dyrkning af celler i sædvanlige laboratorier,hvor der ikke er sterile arbejdspladser, og hvor et sterilt arbejde ikke er muligt, da de, selvom de er gasgennemtrængelige, ikke er gennemtrængeligefor væsker eller infektiøse partikler. Håndteringen af således forberedte vævskulturbeholdere vil være meget enkel, da man som allerede omtalt kan injicere podekimene eller vilkårlige tilsætninger i beholderen, hvorved det kun vil være nødvendigt kort at sterilisere et eventuelt indstikningssted ved flambering.

Ved med hydrogencarbonat pufrede medier må der under dyrkningen sørges for en passende CO^-atmosfære.

Beholderen kan også foreligge sammenhængende med flere lignende beholdere i form af ruller, plader eller endeløse slanger eller lignende former. Til dyrkningen kan man da afskære den nødvendige mængde beholdere.

I fig. 1 er der afbildet sådanne sammenhængende beholdere.

Til udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen lægger man enkelte eller sammenhængende beholdere i en inkubator. Beholderne kan over en peristaltisk pumpe være forbundet med et væskereservoir. Derved er det muligt at tilpumpe eller frapumpe medium. Ompumpningsmekanismen kan efter behov frakobles og tilkobles, og mængden af tilpumpet eller frapumpet medium kan reguleres på passende måde.

Inkubatoren tilføres derefter gasser fra særskilt kontrollerede oxygen-, nitrogen- og carbondioxidkilder. Vanddamptrykket holdes almindeligvis konstant ved en bestemt inkubatortemperatur, idet man mætter de tilførte gasser med vanddamp.

Oxygentrykket måles i inkubatoreregasfase.Ved elektronisk tilbagekobling styres 145380 7 en ventil, som holder oxygentrykket konstant på en forud fastlagt værdi.

pH-Værdien kan måles på vilkårligt ønsket sted i pumpesystemet. Til denne måling pumpes det almindeligvis hydrogencarbonatholdige medium forbi en pH-elek-trode. Man kan imidlertid også direkte indføre en pH-elektrode i dyrkningsposen og med pumpemekanismen frakoblet direkte bestemme pH-værdien i dyrkningsposen. Dersom pH-værdien afviger fra den ønskede pH-værdi med mere end en bestiemt, forud indstillet pH-enhed, kan man ved passende tilbagekobling åbne eller lukke en tilførselsventil for carbondioxid. Almindeligvis vil man indstille systemet således, at tilførselsventilen for carbondioxid åbner og lukker, når pH-værdien afviger mere end 0,05 pH-enheder fra den ønskede og indstillede pH-værdi .Det er selvsagt også muligt at indstille systemet således,at først større pH-forskelle bevirker en åbning eller lukning af tilførselsventilen for CO^.

Reguleringen af pH-værdien ved tilførsel af carbondioxid er mulig på grundlag af Henderson-Hasselbach-ligningen. Denne ligning giver en sammenhæng mellem pH-værdien, (HCO^ )-koncentrationen og carbondioxidtrykket. Henderson-Hasselbach-ligningen ser således ud: (HCO ") pH„7o = 6,06 + log -- 0,024.pC02

Almindeligvis anvender man ved dyrkningsforsøgene (HCO^ )-koncentrationer på 0,024 mol pr. liter og en pH-værdi på 7,1 + 0,05.

For at opretholde et konstant oxygenpartialtryk ved ændring af carbondioxidtilførslen forøges eller formindskes nitrogentilførslen ved hjælp af en passende forbundet ventil.

Carbondioxidtrykket måles ved hjælp af en carbondioxid-elektrode i pumpesystemet. Hvis der sker en akkumulation af syrer i mediet, vil pH-værdien først blive opretholdt ved hjælp af pH-elektrode-carbondioxid-kontrolsystemet. Hvis imidlertid en bestemt pH-værdi overskrides, som ikke mere kan udlignes ved hjælp af carbondioxidtrykket, dvs. når pufferreserven falder til under en ønsket værdi, kan der automatisk tilpumpes nyt medium og mængden af gammelt medium formindskes tilsvarende.

Fig. 2 på tegningen belyser en eksempelvis udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Kulturbeholderne, som ved denne udførelsesform er anbragt ved siden af hinanden, foreligger i form af slanger og er ved deres ender forbundet med tilløbs- og afløbsledninger for kulturmediet. Kulturmediet indføres over en peristaltisk pumpe, og før det over en strømningsåeler ledes gennem poserne, filtreres det gennem et milliporefilter. I det fraflydende kulturmedium måles pH-værdien ved hjælp af en pH-elektrode. pH-Meteret er over en forstærker forbundet på passende måde med ventiler, som regulerer nitrogen- og carbondioxidtilførslen.

8 145380

Dersom pH-værdien i kulturmediet afviger fra den indstillede og ønskede pH-værdi, åbnes eller lukkes tilførselsventilen for carbondioxidet tilsvarende, indtil pH-værdien atter har nået den ønskede værdi. På reciprok måde åbnes eller lukkes tilførselsventilen for nitrogenet for at holde oxygentrykket i systemet konstant.

I det fraflydende medium bestemmes samtidigt carbondioxidtrykket ved hjælp af en carbondioxid-elektrode. Ved elektronisk tilbagekobling styres over en forstærker tilførselsventilen for kulturmediet. Dersom carbondioxidtrykket i mediet underskrider en bestemt værdi, tilpumpes der automatisk nyt medium, og gammelt medium fjernes.

Oxygenet måles i gasfasen, og ved elektronisk tilbagekobling styres tilførselsventilen for oxygenet tilsvarende.

Det blev beregnet, at kapaciteten af dette automatiske og kontrollerede dyrkningssystem ved benyttelse af en inkubator af middelstor størrelse langt overskrider tidligere dyrkningssystemers.Ved optimal udnyttelse af rummet kan en inkubator give ca. samme ydelse som et såkaldt 37°-rum med "roller machines".Man kan let ved ultraviolet bestråling opnå sterilitet af poserne og elektroderne.Da systemet efter sterilisering og igangsætning er fuldstændigt lukket,opstår der under dyrkningen ingen forureningsproblemer.

Hvis man opdeler vævskulturrummet i flere bevægelige kulturkamre, kan man dyrke celler under kontrolleret ændring af oxygentrykket,pH-værdien og carbondioxid-trykket i talrige parallelle forsøg.De enkelte kulturkamre erstatter til en vis grad en inkubator. På denne måde kan man udføre sammenlignende undersøgelser,idet man varierer en eller anden parameter.

Ved fremgangsmåden til massedyrkning af celler ved multiforsøg dyrkes cellerne,som ovenfor beskrevet,! ad kemisk vej rugjorte beholdere af vilkårlig størrelse. Beholderne inkuberes i de enkelte kulturkamre mellem to stålnet,for at man kan opnå en konstant tykkelse af pakken.Den konstante tykkelse af pakken giver den nødvendige forudsætning for konstant længde af den optiske vej i tilfælde af,at pH-værdien,som nærmere beskrevet nedenfor, kan kontrolleres ad optisk vej.

De anvendte kulturkamre kan være af vilkårlig størrelse og form.De kan f.eks. have rektangulære,trapezformede, kvadratiske,runde eller trekantede grundflader og være af vilkårlig højde. Eventuelt kan de også være bygget således, at de har over hinanden liggende bunde, hvorpå man kan lægge dyrkningsbeholderne. Bundene kan være udformet på vilkårlig måde, f.eks. kan de være forsynet med huller,eller de kan foreligge i form af et net.

Antallet af dyrkningsbeholdere,som anbringes i et kulturkammer,kan varieres efter ønske.Man kan bygge kulturkamrene således,at de kun kan optage få,f.eks.

1 til 10, dyrkningsbeholdere, men man kan imidlertid også bygge dem således, at mange,f.eks. indtil flere hundrede,dyrkningsbeholdere samtidigt finder plads i et kulturkammer.Størrelsen og formen af kulturkamrene afhænger f.eks. også af størrelsen 145380 9 af dyrkningsbeholderne og af det tilsigtede formål med dyrkningen.

De enkelte kulturkamre er fastgjort til en bevægelig indretning. Man kan samtidig fastgøre vilkårligt mange kulturkamre til en sådan indretning. Som bevægelig indretning kan man f.eks. anvende et drejeligt bord. Det drejelige bord kan være bygget således, at det er rundt og befinder sig i den indre cirkel af et ringformet andet bord,der er lige så højt,og hvorpå f.eks. måleinstrumenterne kan befinde sig.

Den bevægelige indretning kan imidlertid også være bygget således, at de enkelte kulturkamre bevæger sig oppe fra og nedad eller fra den ene til den anden side.

Anbringelsen af de enkelte kulturkamre kan vælges således,at de for eksempel er anbragt ved siden af hinanden,bagved hinanden,ovenpå hinanden osv. Det er også muligt at anordne kulturkamrene mæanderformet. En sådan anordning er f.eks. hensigtsmæssig i det tilfælde,hvor man som bevægelig indretning anvender et drejeligt bord.

Kulturkamrenes bevægelse er f.eks. forprogrammeret ved hjælp af et kort eller et magnetbånd ligesom den opholdstid i en bestemt stilling,der er nødvendig for at muliggøre den ønskede indstilling af pH-værdien, oxygentrykket og carbondioxidtrykket .

Hvert kulturkammer er gastæt,undtagen når det befinder sig i kontrolstillingen.I denne stilling tilføres kulturkamneret gasser til begyndelse af forsøget fra særskilte,kontrollerede oxygen-, nitrogen- og carbondioxidkilder.Vanddamptrykket holdes ved disse operationer konstant ved mætning af de tilførte gasser med vanddamp.Under forsøges ændres gasblandingen inde i kulturkammeret i kontrolstillingen ved ændring af oxygen-, nitrogen- og carbondioxidtilførslen i overensstemmelse med et forprogrammeret tilbagekoblingssystéto. Indføringsåbningen ligger centralt, afløbsåbningen perifert.

Hvert kulturkammer indeholder en låge til indskydning og til fjernelse af dyrkningsposer,og hvert kulturkammer er på to overfor hinanden liggende sider forsynet med et kvartsvindue, gennem hvilket der i kontrolstillingen går en lysstråle.

Ved denne udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen sætter man en pH-indikator til kulturmediet for således at bestemme pH-ændringer som ændringer i pH-indikatorens absorption.Dette signal forstærkes og forøger eller formindsker tilførslen af carbondioxid, indtil pH-værdien igen har nået den ønskede værdi.

I det forhold, hvori carbondioxidtilførslen forøges eller formindskes, forøges eller formindskes nitrogentilførslen på reciprok måde ved hjælp af en passende ventil for at holde oxygentrykket konstant.

Oxygentrykket måles ved hjælp af en oxygen-elektrode,og derefter styres ved elektronisk tilbagekobling en ventil for at holde oxygentrykket på en forud valgt værdi. Oxygentrykket kan for hvert kulturkammer være forskelligt,og det 145380 ίο bestemmes altid i kontrolstillingen.

Carbondioxidtrykket miles i gasrummet. Når carbondioxidtrykket overskrider en bestemt, forud valgt værdi,navnlig i det tilfælde,hvor der til opretholdelse af pH-værdien næsten ikke må tilføres mere carbondioxid, da hydrogencarbonatets pufferreserve næsten er udtømt, er en udskiftning af mediet nødvendigt.

Fig. 3 belyser en eksempelvis udførelsesform for en fremgangsmåde til massedyrkning af celler og væv.

Kulturmediet,som er vist i tværsnit,og hvori dyrkningsbeholderne befinder sig på en trådbærer, står i kontrolstillingen.Gennem over for hinanden liggende vinduer i kulturkammeret sendes en lysstråle ved hjælp af et spejl og fokusserings-linser.Ved hjælp af denne lysstråle kontrolleres pH-værdien,idet ændringer i farvestofabsorptionen for en tilsat pH-indikator måles optisk, og efter passende forstærkning af lyssignalet styres ved hjælp heraf på reciprok måde indføringsventiler for nitrogen og carbondioxid.Denne pH-kontrol kan være forskelligt programmeret for hvert kulturkammer.Den grafiske afbildning nederst i fig. 3 viser indikatorens absorption i vævskulturen afbildet som funktion af pH-værdien.

For at fastslå hvor langt celle- eller vævsvasksten er skredet frem, måles endvidere ved hjælp af nævnte lysstråle uklarheden eller absorptionen ved en bestemt bølgelængde,f.eks. ved 256 ιημ, idet man anvender passende forprogrammerede filtre eller passende forprogrammerede monochromatorer.

Ved hjælp af elektroder bestemmes carbondioxid- og oxygentrykket i kulturkammeret, og når carbondioxidtrykket i et bestemt kulturkammer viser en for lav [HCO^ ],opstår der et signal,som betyder, at det er nødvendigt med udskiftning af mediet.Hvad angår pCC^-elektroden,måles respirationen ved konstant respirationskvotient.Hvad angår pC^-elektroden.kan systemet være således programmeret, at der i hvert kulturkammer er forskelligt specifik pC^.

Man kan for hvert enkelt kulturkammer variere de forskellige fremgangsmådebetingelser, såsom oxygentrykket, nitrogentrykket, carbondioxidtrykket osv.

Fig. 4 på tegningen belyser en eksempelvis udførelsesform for en fremgangsmåde til massedyrkning af celler og væv,idet de enkelte kulturkamre er anordnet mæander-formet. Fig. 4 viser et udsnit set fra oven af en eventuelt"karrusel". Dersom pCC^-målingen ved hjælp af en elektrode under gasstrømningen i et bestemt kulturkammer viser,at hydrogencarbonatkoncentrationen er for lav,opstår der et signal, som viser,at mediet må udskiftes i dette kulturkammer.For hvert kulturkammer kan der foreligge forskelligt program. Kulturkamrene kan bevæges på forprogrammeret måde i overensstemmelse med et lysstrålereguleret program,indbefattet en hvileperiode til indstilling af ligevægten.

Claims (5)

11 145380

1. Fremgangsmåde til massedyrkning af celler og væv, ved hvilken man anbringer én eller flere biologisk og kemisk indifferente beholdere, der indeholder kulturmedier, i en gastæt, eventuelt i flere bevægelige kulturkamre opdelt, inku-bator, tilfører i en kontrolstilling gasser til ihkubatoren fra særskilte, kontrollerede oxygen-, nitrogen- og carbondioxidkilder og, om nødvendigt, tilpumper nyt medium og fjerner gammelt medium, kendetegnet ved, at man som indifferent beholder anvender én eller flere gasgennemtrængelige, væskeuigennemtrængelige, steriliserede, transparente plastfilmbeholdere, der til fremme af cellevæksten ad kemisk vej er rugjorte på indersiden, og at de tilførte gasser mættes med vanddamp, hvorved vanddamptrykket holdes konstant for en bestemt in-kubatortemperatur, og at oxygentrykket, carbondioxidtrykket og pH-værdien måles i cellernes umiddelbare omgivelser og automatisk kontrolleres.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at man måler oxygentrykket i inkubatorens gasfase, ved elektronisk tilbagekobling styrer en ventil, hvorved oxygentrykket holdes konstant på en forud1 fastlagt værdi, måler pH-værdien i kulturmediet med en elektrode og, når pH-værdien afviger fra den indstillede og ønskede pH-værdi med f.eks. mere end 0,05 pH-enheder, åbner eller lukker en tilførselsventil for carbondioxid, hvorved carbondioxidtilførslen forøges eller formindskes, indtil pH-værdien atter har nået den ønskede værdi, idet man, for at holde oxygentrykket konstant, i det forhold, hvori tilførslen af carbondioxidet forøges eller formindskes, på reciprok måde ved hjalp af en passede koblet ventil formindsker eller forøger nitrogentilførslen, måler carbondioxidtrykket med en elektrode i kulturmediet og, så snart trykket overskrider en bestemt værdi, tilpumper nyt medium og fjerner det gamle medium.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2,kendetegnet ved, at man til udførelse af multiforsøg i hvert af flere bevægelige kulturkamre, som, undtagen når de befinder sig i kontrolstillingen, er gastætte, anbringer én eller flere beholdere, der indeholder podeceller og kulturmedium, fører hvert kulturkammer i et bestemt tidsrum én gang gennem kontrolstillingen, tilfører kulturkammeret gasser i kontrolstillingen fra særskilte, kontrollerede oxygen-, nitrogen- og carbondioxidkilder, holder vanddamptrykket konstant ved mætning af de tilførte gasser med vanddamp og kontrollerer oxygentrykket, carbondioxidtrykket og pH-værdien automatisk og eventuelt tilsætter nyt kulturmedium og tilsvarende fjerner det gamle kulturmedium.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3,kendetegnet ved, at forsøgsbetingelserne i de enkelte kulturkamre er forskellige.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet ved, at