JP2005518207A - 組織細胞の培養のためのデバイスおよび方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、組織細胞に栄養培地およびガスが供給される組織細胞を培養するための方法およびデバイスに関する。
Description
本発明は組織細胞の培養のための方法およびデバイスに関する。
組織細胞の培養はいわゆる「組織工学」において役割を果たしている。この場合、身体に特異的な特性を有する人工的な細胞組織を作製することが目的である。多くの場合、細胞をある種のバイオマトリックス(構造)上で培養する。「組織工学」の用途は、たとえば、インプラントの作製(人工皮膚、機能性の管または組織系(肝臓、軟骨、その他)の生成)、「インビトロ」組織培養物(培地、代謝、その他)の生理学的研究、生体材料の適合性研究、医薬品の適合性試験、ある種の物質の毒性試験である。
機能性組織の作製では、その手順は複数のステップで行うことができ、重要な点は培養された組織の分化の調整およびインプラントの特異的な幾何学的構造(例えば、皮膚では大面積、耳の外傷での軟骨置換では三次元構造、など)である。最初のステップでは、生検材料中で取り出された細胞を、細胞の数を増やすための特別な栄養培地中でのビン培養で増殖させる。
進歩した培養法で可能な概念では、特別な組織ベース上に細胞を適用することが必要である。この目的では、これらのベースは、任意で生分解性重合体からなるフィルターベース、フリース、スポンジ構造を有するマトリックスでありうる。このように作製した組織を次いで、所望の特性を有する組織が形成されるまで培養する。
原則として、二つの培養方法が区別できる。最も一般的に使用されている方法は、適切な均一温度および高二酸化炭素濃度雰囲気を有する特別なインキュベータ内に置かれた特別な培養ビン(T−ビン、12ウェルプレートなど)でいわゆる静置条件で培養することである。この場合、消費された栄養培地は特定の間隔で新鮮な栄養培地と交換する。ガス発生(酸素供給)は通常、ガス供給キャビネット雰囲気から実施される。培地成分に関する定常的な条件と汚染の危険性が高い非常に大量な手動作業がこれら培養方法の欠点である。
別法として、培地が連続的に流れ、基質および酸素供給ならびに代謝産物の除去が改善、制御されたバイオリアクタ(いわゆる灌流チャンバ)に、組織を導入することができる。この場合、培地はガス化した受取容器から回路にポンプアウトすることができ、あるいは灌流チャンバを通った後に廃棄することができる。
DE−A119808055はこのような灌流チャンバの例を記載している。しかし、そこに記載されている装置では、設計通りに動作するためには、チャンバを液体で完全に充填しなければならないという欠点がある。これに関連して、液体に含まれる気泡がチャンバに集まって、チャンバを通る流れを妨げるという危険がある。さらに、灌流チャンバでは、使用される組織媒質の空間配置によりチャンバの全長にわたり酸素が迅速に除去され、その結果、後方の組織細胞にガス、特に酸素が適切に供給されなくなるという危険が生じる。
したがって、本発明の目的は、上記欠点を排除できる、組織細胞の培養のための方法およびデバイスを提供することである。この場合組織細胞にガスおよび栄養培地を適切に供給することができる。
本発明によれば、一連の目的は特許請求の範囲1および16の特徴部分によって達成される。
本発明は、組織細胞上に形成される流層により、栄養素およびガス状物質の両方が組織細胞に最適に供給されるという利点を提供する。このようにして新鮮な培地が組織細胞に入ることができる。さらにガスに対する拡散路が小さいため組織細胞へのガス供給は改善される。
本発明の好ましい実施形態によれば、栄養素の流れ方向と反対の方向のガス流が生じる。これに関連して、主として、複数の組織培養物の配置において、すべての組織培養物にガス、特に酸素が適切に供給され、かつ望ましくない、培養領域の全長にわたる酸素の除去をもたらさないことが確実になる。
さらに、ガスの拡散路は、栄養素の層厚によって、たとえば実施形態に記載されているオーバフローエッジの形成によって、設けることができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、組織細胞上の栄養培地の薄層は0.1〜3.0mm、好ましくは0.5〜1.0mmである。
組織細胞上の薄い栄養培地の層は、組織細胞が認められる培養領域に栄養培地を送ることによって形成することが好ましい。栄養培地に対し、次いで培養領域からのオーバフローが形成され、栄養培地は組織細胞上を流れた後、収集チャンバに流入する。次いで、栄養培地は再び收集チャンバから除去される。
本発明の他の実施形態は従属請求項に記載されている。
本発明の方法は、ヒト、動物および植物の細胞の培養に特に適している。使用される細胞の種類に応じて、培養にどの栄養培地が必要であるかは当業者に周知である。それに応じて、栄養培地を作製することができる。必要なガスの使用に対しても同じことが適用される。たとえば、酸素がヒトおよび動物の細胞で必要な場合、一般に植物細胞では二酸化炭素が必要となる。使用されるガスの種類に応じて、それに対する栄養培地の組成を適合させることも適切でありうる。したがって、たとえば、高いバッファ能が必要であることも、pH制御が必要になることもある。
さらに、本発明の方法は移植可能な細胞を増殖させるのに適している。ヒトまたは動物の身体に移植される細胞は、特に皮膚または骨組織細胞および軟骨および管細胞である。
さらに、本発明の方法は移植可能な軟骨構築体または骨構築体を得るのに適している。特に、このような構築体を得るために、本発明の方法は、組織細胞が三次元構造を占めるが、依然栄養培地および酸素を適切に供給することができるという利点を提供する。
また、本発明の方法は根本的に効果および毒性の試験を実施するのに適している。このようにして組織細胞に対する薬剤、環境毒素などの作用を検討することができ、それによって動物試験の代替とすることができる。この場合、それぞれの集合状態に応じて、検討すべき物質はガス相に使用するか、固体または液体形状で栄養培地に添加することができる。
本発明の好ましい実施形態を図面に基づいて下記に詳述する。
図1および図2は、ガス供給ユニットおよびこれに接続された排気ラインを有する処理装置の略図を示す。
図3は、個々の挿入物を有する処理装置の略図を示す。
図4は、接着細胞培養物用媒質を有する処理装置の略図を示す。
図5は、特別なガスラインのない処理装置の略図を示す。
図6は、加圧のための処理装置の略図を示す。
図1において、処理装置1を有する組織細胞の培養のためのデバイスが示されており、処理装置1は詳細には示されていない組織細胞が栄養培地と接する培養領域2を有する。これに関連して、処理装置1は栄養培地の入口32および出口33を有しており、したがって栄養培地は培養領域2の一端30から他端31に流れることができる。次に栄養培地は收集チャンバ4に入る。栄養培地は收集チャンバ4からライン6を介して除去される。ポンプ17は回路中の栄養培地をライン5を介して培養領域2に戻す。ポンプ17によって、栄養培地の流速を制御して、特に組織細胞上の栄養培地の流速を設定することができる。さらに、図1は、各種ガスの規定可能な混物を、たとえば、空気、酸素、窒素および二酸化炭素から作ることができ、処理装置1に供給できるガス供給ユニット13を必要とする。ガス供給ユニット13はフローメータ18、19および滅菌フィルタ20も有することができる。処理装置1へ導入される前にガスを水で湿潤させるために湿潤剤21を提供することもできる。ライン10を介して、ガスはガス取入開口部8を通り処理装置1の内部空間12へ移動する。これに関連して、培養領域2に含まれる栄養培地にガスが供給される。ガスはこの場合、栄養培地上の栄養培地の流れに対して反時針回り方向に流れ、ガス排出開口部9を通り処理装置1の内部空間12から出る。ライン11はガス排出開口部9に接続され、これを通ってガスが排気ライン22へ運ばれる。排気ラインは滅菌トラップ23および排気フィルタ24を含んでいる。
細胞の成長が剪断応力の刺激により影響されることが明らかになったため、栄養素の流速も組織細胞の成長に影響する。図1において選択された試験的な構成では、1分当り5mlまでの栄養培地が運ばれた。排出量は好ましくは0.25から1ml/分である。図2に示す試験的な構成では、わずか30ml/日まで、好ましくは2.5から10ml/日が運ばれた。
図2に示す本発明の実施形態によれば、保存ビン26からの新鮮な栄養培地はポンプ25によって一定に吸引され、処理装置1の培養領域2へ向けられる。消費された培地は受取ビン27に收集される。
図3は処理装置1の拡大図を示す。ガスおよび栄養培地の供給および排出パイプは矢印により特徴付けられている。処理装置1は、組織細胞用媒質14、16を受けるために提供される底部34を示す。オーバフローエッジ28は底部34の上に作られ、ここを介して栄養培地は培養領域2から收集チャンバ4に流れることができる。示したこの実施形態では、オーバフローエッジ28は底部34の高い側壁34によって形成される。さらにこの実施形態は、コンパクトまたはマクロポーラスであることができる予め構造化した三次元媒質14に具体的な挿入物15が提供されている特別な機構を示している。これに関連して挿入物15は底部34に脱着可能に接続させることができる。挿入物15は好ましくは底部34に下から螺子止めすることができる。挿入物15の取付状態において、次いで、組織細胞を栄養培地の薄い層がこれらの上を流れることができるように配置する。栄養素は組織細胞上を流れた後收集チャンバ4内へ流れる。
図3に示す媒質14は、詳細には示していないフローカナル内に一本または二本に直列に配置されるのが好ましい。フローカナルの幅は5〜7cmとすることができる。ある種の環境の下で、大きな幅では、フローカナルで均一なフロープロファイルが形成できないという欠点がある。しかし原則としてフローカナルの長さにはまったく役割はない。しかし、可能であれば、約5〜10個の媒質14をフローカナル内に置くことができるように、長さは20〜25cmよりも小さい。
さらなる具体的な機構として、図4に示す実施形態は接着細胞培養物用に設計された具体的な媒質16を示す。媒質16は好ましくはガラスまたは適当なプラスチックからなる。媒質16は、媒質14と同様に、薄層の栄養培地が挿入物16に含まれている組織細胞を通って流れ、收集チャンバ4に流入することができるように、図3に従って配置される。
図1〜図4による実施形態とは対照的に、図5はガスが拡散路の内部空間12に入る処理装置1を示している。このために、ガス取入開口部8として、汚染を避けるために隔膜で閉鎖することができるスリット状開口部を上部7に提供する。ガス排出開口部9についても同様である。さらに栄養培地のための供給および放出パイプが存在する。これらは矢印によって特徴付けられる。図5による実施形態では、このような処理装置1を有するデバイスが何ら特別なガス化剤を必要としないという利点が生じる。この場合、組織細胞の培養は別の機器を必要とすることなくインキュベータで実施することができる。
図6において、根本的に、内部空間12が加圧されている処理装置1を有する一実施形態が示されている。規定の過圧は適切なバルブ29a〜dにより設定し、たとえば、栄養培地へのガス状物質の移動を促進し、したがって組織細胞へのこれらの物質の供給が改善することができる。
1 処理装置
2 培養領域
3 高い側壁
4 收集チャンバ
5 ライン
6 ライン
7 上部
8 ガス取入開口部
9 ガス排出開口部
10 ライン
11 ライン
12 内部空間
13 ガス供給ユニット
14 媒質
15 挿入物
16 媒質
17 ポンプ
18 フローメータ
19 フローメータ
20 滅菌フィルタ
21 湿潤剤
22 排気ライン
23 滅菌トラップ
24 排気フィルタ
25 ポンプ
26 保存ビン
27 受取ビン
28 オーバフローエッジ
29 a〜dバルブ
30 端部
31 端部
32 供給
33 放出
34 底部
2 培養領域
3 高い側壁
4 收集チャンバ
5 ライン
6 ライン
7 上部
8 ガス取入開口部
9 ガス排出開口部
10 ライン
11 ライン
12 内部空間
13 ガス供給ユニット
14 媒質
15 挿入物
16 媒質
17 ポンプ
18 フローメータ
19 フローメータ
20 滅菌フィルタ
21 湿潤剤
22 排気ライン
23 滅菌トラップ
24 排気フィルタ
25 ポンプ
26 保存ビン
27 受取ビン
28 オーバフローエッジ
29 a〜dバルブ
30 端部
31 端部
32 供給
33 放出
34 底部
Claims (23)
- 組織細胞に栄養培地およびガスが供給される組織細胞を培養するための方法であって、組織細胞が培養領域で培養され、培養領域の一端から培養領域の他端まで栄養培地でコーティングされて、ガスが供給される薄い栄養培地の層が組織細胞上に形成されることを特徴とする方法。
- 栄養培地の流れに対して反時計回りの方向に流れるガス流が作られる請求項1に記載の方法。
- 組織細胞上の栄養培地の層厚を調節することができる請求項1または2に記載の方法。
- 組織細胞上の栄養培地の層厚が0.1〜3.0mm、好ましくは0.5〜1.0mmである請求項3に記載の方法。
- 栄養培地が組織細胞上を流れた後、收集チャンバに流入するように、培養領域の一端の上に栄養培地のオーバフローが作られている請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 栄養培地が收集チャンバから除去され、回路内の培養領域に戻される請求項5に記載の方法。
- 組織細胞を供給するために使用される空気またはその他のガスがガスとして使用される請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 処理装置が加圧されている請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト、動物または植物細胞を培養するための請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 移植可能な細胞を培養するための請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 移植可能な軟骨構築体を得るため請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 移植可能な骨構築体を得るための請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 組織細胞に対する作用を調べる活性成分を、栄養培地に添加する請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- ガスが、組織細胞に対する作用を調べる活性成分を含んでいる請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 組織細胞により形成される物質を生産する目的を有する請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 組織細胞にガスおよび栄養培地が供給される処理装置を有し、その結果処理装置が栄養培地の供給および放出を有する、組織細胞を培養するためのデバイスであって、処理装置(1)が組織細胞用の媒質(14、16)の配置を有する培養領域(2)を有し、組織細胞上の薄層に栄養培地が流入できるように組織細胞を位置させることでき、処理装置(1)がガス取入開口部(8)およびガス排出開口部(9)を備えた上部(7)を有する、組織細胞を培養するためのデバイス。
- ガス取入開口部(8)およびガス排出開口部(9)が、処理装置(1)内のガスラインの場合に、栄養培地の流れの方向に対して反時計回り方向に流れるガス流が形成されるように配置される請求項16に記載のデバイス。
- 組織細胞上の栄養培地の層厚が0.1〜3.0mm、好ましくは0.5〜1.0mmである請求項17に記載のデバイス。
- 処理装置(1)が、媒質(14、16)を受けるための底部(34)を有し、その上にオーバフローエッジ(28)が形成され、それを介しての栄養培地が收集チャンバ(4)に流入することができる請求項16〜18のいずれか一項に記載のデバイス。
- 媒質(14、16)が直列に配置されているフローカナルに底部(34)が形成される請求項16〜19のいずれか一項に記載のデバイス。
- ライン(5、6)に栄養培地が提供され、その結果ライン(5)が栄養培地の供給ラインを形成し、ライン(6)が收集チャンバ(4)に接続されている請求項16〜20のいずれか一項に記載のデバイス。
- ガス供給ユニット(13)に接続されるライン(10)がガス取入開口部(8)に接続される請求項16〜21のいずれか一項に記載のデバイス。
- 栄養培地およびガスの供給および放出のためのバルブ(29a〜d)を設けて、処理装置(1)の内部空間(12)内の圧力を制御することを可能にする請求項16〜22のいずれか一項に記載のデバイス。
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