EP1478729A2 - Vorrichtung und verfahren zur kultivierung von gewebezellen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur kultivierung von gewebezellen

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Publication number
EP1478729A2
EP1478729A2 EP03722203A EP03722203A EP1478729A2 EP 1478729 A2 EP1478729 A2 EP 1478729A2 EP 03722203 A EP03722203 A EP 03722203A EP 03722203 A EP03722203 A EP 03722203A EP 1478729 A2 EP1478729 A2 EP 1478729A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nutrient medium
tissue cells
gas
treatment apparatus
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP03722203A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stephanie Nagel-Heuer
Ralf PÖRTNER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Hamburg TUHH
Tutech Innovation GmbH
Original Assignee
TUHH Technologie GmbH
Technische Universitaet Hamburg TUHH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TUHH Technologie GmbH, Technische Universitaet Hamburg TUHH filed Critical TUHH Technologie GmbH
Publication of EP1478729A2 publication Critical patent/EP1478729A2/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion

Definitions

  • the invention relates to a method and an apparatus for the cultivation of tissue cells.
  • tissue engineering The cultivation of tissue cells plays a role in so-called "tissue engineering".
  • the aim here is to artificially create cell tissue with body-specific properties.
  • cells are cultivated on certain biomatrices (structures). Areas of application for "tissue engineering” are z.
  • Biomaterials, drug compatibility tests or toxicity tests for certain substances are biomaterials, drug compatibility tests or toxicity tests for certain substances.
  • the production of functional tissues can be carried out in several steps, with important points being the control of the differentiation in the cultivated tissue and a specific geometric structure of the implant (e.g.
  • Bottle cultures propagated in a special nutrient medium to increase the number of cells.
  • tissue support For further cultivation, one possible concept is to apply the cells to a special tissue support. This can be filter pads, fleeces or matrices with a sponge structure, optionally act from biodegradable polymers. The tissues created in this way are then cultivated until a tissue with the desired properties has formed.
  • the most common method is cultivation under so-called static conditions in special culture bottles (T-bottle, 12-well plate, etc.), which are placed in a special incubator with appropriate temperature control and an atmosphere enriched with carbon dioxide.
  • the used nutrient medium is exchanged for fresh one at certain intervals. Fumigation (supply of oxygen) usually takes place from the atmosphere of the
  • the tissues can be introduced into a bioreactor (a so-called perfusion chamber) which is continuously flowed through with culture medium and in which an improved and controlled supply of substrates and oxygen as well as a disposal of
  • Metabolic products can take place.
  • the culture medium can be pumped out of a fumigated receptacle in a circuit or, alternatively, can be discarded after passing through the perfusion chamber once.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method and an apparatus for cultivating tissue cells with which the disadvantages described can be eliminated.
  • the tissue cells should be adequately supplied with gas and nutrient medium.
  • a gas stream is generated which is opposite to the direction of flow of the nutrient medium. This ensures, above all with an arrangement of several tissue cultures, that all tissue cultures are adequately supplied with gas, in particular with oxygen, and that there is no undesired depletion of oxygen over the length of the culture area.
  • the thin layer of the nutrient medium above the tissue cells is 0.1 ... 3.0 mm, preferably 0.5 ... 1.0 mm.
  • the formation of a thin nutrient medium layer above the tissue cells can preferably be achieved by passing nutrient medium into a culture area in which the tissue cells are located. An overflow from the culture area is then generated with the nutrient medium, and the nutrient medium arrives in a collecting chamber after the tissue cells have overflowed. The nutrient medium is then removed again from the collecting chamber.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the cultivation of human, animal and vegetable Cells.
  • the person skilled in the art knows which nutrient medium is required for cultivation.
  • the nutrient medium can be composed accordingly.
  • Oxygen required there is usually a need for carbon dioxide in plant cells.
  • Buffer capacity or pH adjustment may be required.
  • the method according to the invention is suitable for the multiplication of implantable cells.
  • Cells that are implanted in the human or animal body are, in particular, skin or bone tissue cells as well as cartilage and vascular cells.
  • the method is also suitable for obtaining implantable cartilage constructs or bone constructs. Especially for obtaining such constructs, the method according to the invention offers the advantage that the tissue cells assume three-dimensional structures and can nevertheless be adequately supplied with nutrient medium and oxygen.
  • the method according to the invention is also suitable for carrying out activity and toxicity tests.
  • the effect of medication, environmental toxins and the like on the tissue cells can be investigated in order to enable an alternative to animal testing.
  • the substance to be examined can be classified according to its either use the respective aggregate state in the gas phase or add it to the nutrient medium in solid or liquid form.
  • FIGS. 1 and 2 show a schematic representation of a treatment apparatus with a gas supply unit and exhaust air duct connected to it,
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of a treatment apparatus with individual inserts
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a treatment apparatus with carriers for adherent cell cultures
  • FIG. 5 is a schematic representation of a treatment apparatus without a special gas line
  • Figure 6 is a schematic representation of a treatment apparatus for pressurization.
  • Figure 1 is a device for the cultivation of
  • Tissue cells are shown with a treatment apparatus 1, in which the treatment apparatus 1 has a culture area 2, in which tissue cells, not shown, are brought into contact with nutrient medium.
  • the treatment apparatus 1 has an inlet 32 and an outlet 33 for the nutrient medium, so that the nutrient medium from one end 30 of the culture area 2 to the other end 31 can flow.
  • the nutrient medium then arrives in a collecting chamber 4.
  • the nutrient medium is drawn off from the collecting chamber 4 via the line 6.
  • a pump 17 transports the nutrient medium in the circuit via line 5 back into the culture area 2. With the help of the pump 17, the
  • 1 also provides a gas supply unit 13, by means of which a definable mixture of different gases, for example from air, oxygen, nitrogen and carbon dioxide, can be produced and supplied to the treatment apparatus 1.
  • the gas supply unit 13 can also have flow meters 18, 19 and a sterile filter 20.
  • Humidifiers 21 can also be provided in order to moisten the gas with water before it is introduced into the treatment apparatus 1.
  • Via line 10 the gas passes through the gas inlet opening 8 into the interior 12 of the treatment apparatus 1.
  • Gas is applied to the nutrient medium located in the culture area 2. The gas flows in the opposite direction to the flow of the nutrient medium via the nutrient medium and leaves the interior 12 of the
  • a line 11 is connected to the gas outlet opening 9, via which the gas is led to an exhaust air duct 22.
  • the exhaust air line contains a sterile trap 23 and an exhaust air filter 24.
  • the flow rate of the nutrient medium also has an influence on the growth of the tissue cells.
  • the one chosen in Figure 1 Experimental arrangements were fed up to 5 ml of nutrient medium per minute. The delivery rate was preferably 0.25 to 1 ml / min. In the experimental arrangement shown in FIG. 2, only up to 30 ml / day, preferably 2.5 to 10 ml / day, were delivered.
  • fresh nutrient medium is constantly sucked out of a storage bottle 26 by means of a pump 25 and fed into the culture area 2 of the treatment apparatus 1. Used medium is collected in a collecting bottle 27.
  • FIG. 3 shows the treatment apparatus 1 in an enlarged view. Inlets and outlets for gas and nutrient medium are indicated by arrows.
  • the treatment apparatus 1 has a bottom profile 34, which is provided for receiving supports 14, 16 for the tissue cells.
  • An overflow edge 28 is formed on the bottom profile 34, via which the nutrient medium can flow from the culture area 2 into a collecting chamber 4.
  • the overflow edge 28 is formed in the exemplary embodiment shown by an elevated side wall 3 of the floor profile 34.
  • These embodiments also have the special feature that special inserts 15 are provided for pre-structured, three-dimensional supports 14, which can be compact or macroporous.
  • the inserts 15 are detachably connected to the bottom profile 34. They can preferably be screwed into the bottom profile 34 from below. In the installed state of the inserts 15, the tissue cells are then positioned so that a thin layer of nutrient medium can flow over them. After this The nutrient medium then flows over the tissue cells into the collecting chamber 4.
  • the carrier 14 shown in Figure 3 are preferably arranged in one or two rows in a flow channel, not shown.
  • the width of the flow channel can be 5 to 7 cm. Larger widths may have the disadvantage that a uniform flow profile cannot form in the flow channel. In contrast, the length of the flow channel does not play a role
  • Role If possible, however, it should not be larger than 20 to 25 cm, so that about 5 to 10 supports 14 can be accommodated in the flow channel.
  • FIG. 4 shows, as a further special feature, special carriers 16 which are designed for adherent cell cultures.
  • the carrier 16 are preferably made of glass or suitable plastics. Like the carriers 14 according to FIG. 3, they are positioned such that the nutrient medium can flow in a thin layer over the tissue cells located in the inserts 16 and reach the collecting chamber 4.
  • FIG. 5 shows a treatment apparatus 1 in which gas enters the interior 12 by diffusion.
  • a gap-shaped opening is provided in the upper part 7 as the gas inlet opening 8, which can also be closed with a diaphragm to avoid contamination.
  • Derivatives for the nutrient medium continue to exist. They are identified by arrows.
  • a device with such a treatment apparatus 1 does not require any special fumigants.
  • the cultivation of tissue cells can be carried out in a heating cabinet without additional equipment.
  • FIG. 6 shows an embodiment with a treatment apparatus 1 in which the interior 12 is pressurized.
  • a defined overpressure can be set via suitable valves 29 a-d, by means of which, for example, the passage of gaseous substances into the nutrient medium is facilitated and the supply of the tissue cells with these substances is improved.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Kultivierung von Gewebezellen. Gemäss der Erfindung werden die Gewebezellen in einem Kulturbereich kultiviert, wobei die Gewebezellen von einem Nährmedium in dünner Schicht überströmt werden. Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich vor allem zur Vermehrung von implantierbaren Zellen wie Haut- oder Knochengewebszellen sowie von Knorpel- und Gefässzellen. Darüber hinaus eignet sich das Verfahren zur Gewinnung implantierbarer Knorpel- oder Knochenkonstrukte.

Description

VORRICHTUNG UND VERFAHREN ZUR KULTIVIERUNG VON GEWEBEZELLEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Kultivierung von Gewebezellen.
Die Kultivierung von Gewebezellen spielt eine Rolle beim sogenannten "Tissue Engineering". Hierbei ist es das Ziel, künstlich Zellgewebe mit körperspezifischen Eigenschaften zu erstellen. Vielfach werden dabei Zellen auf bestimmten Biomatrices (Strukturate) kultiviert. Anwendungsbereiche für das "Tissue Engineering" sind z. B. die Implantatherstellung (Generierung von künstlicher Haut, funktionellen Gefäßen oder GewebeSystemen (Leber, Knorpel etc.)), physiologische Untersuchungen an "in vitro "-Gewebekulturen (Medium, Metabolismus etc.), Kompatibilitätsuntersuchungen an
Biomaterialien, Verträglichkeitsprüfungen von Medikamenten oder Toxizitätstests für bestimmte Substanzen.
Bei der Herstellung von funktionsfähigen Geweben kann in mehreren Schritten vorgegangen werden, wobei wichtige Punkte die Steuerung der Differenzierung im kultivierten Gewebe und eine spezifische geometrische Struktur des Implantates (z. B.
Haut — flächig, Knorpelersatz für Ohrverletzungen — dreidimensionale Struktur etc.) sind. In einem ersten Schritt werden die in einer Biopsie entnommenen Zellen in
Flaschenkulturen in einem speziellen Nährmedium vermehrt, um die Anzahl der Zellen zu vergrößern.
Für die weitergehende Kultivierung sieht ein mögliches Konzept vor, die Zellen auf eine spezielle Gewebeunterlage aufzubringen. Hierbei kann es sich um Filterunterlagen, Vliese oder Matrices mit einer Schwammstruktur, gegebenenfalls aus biologisch abbaubaren Polymeren handeln. Die so erstellten Gewebe werden anschließend solange kultiviert, bis sich ein Gewebe mit den gewünschten Eigenschaften gebildet hat.
Es können grundsätzlich zwei Kultivierungsmethoden unterschieden werden. Die gebräuchlichste Methode ist die Kultivierung unter sogenannten statischen Bedingungen in speziellen Kulturflaschen (T-Flasche, 12-well-plate, etc.), die in einen speziellen Brutschrank mit entsprechender Temperierung und einer mit Kohlendioxid angereicherten Atmosphäre gestellt werden. Dabei wird das verbrauchte Nährmedium in bestimmten Intervallen gegen frisches ausgetauscht. Die Begasung (Versorgung mit Sauerstoff) erfolgt üblicherweise aus der Atmosphäre des
Begasungsschrankes . Nachteile dieser Kultivierungsmethode sind die stationären Bedingungen in bezug auf die Medienkomponenten sowie der sehr hohe manuelle Aufwand, der ein hohes Kontaminationsrisiko birgt.
Alternativ können die Gewebe in einen Bioreaktor (eine sogenannte Perfusionskammer) eingebracht werden, die kontinuierlich mit Kulturmedium durchströmt wird und in der eine verbesserte und kontrollierte Versorgung mit Substraten und Sauerstoff sowie eine Entsorgung -von
Stoffwechselprodukten stattfinden kann. Das Kulturmedium kann dabei aus einem begasten Vorlagegefäß heraus in einem Kreislauf gepumpt oder alternativ nach einmaligem Passieren der Perfusionskammer verworfen werden.
Ein Bespiel für eine derartige Perfusionskammer beschreibt DE-Al 198 08 055. Bei der dort beschriebenen Apparatur besteht allerdings der Nachteil, daß die Kammer vollständig mit Flüssigkeit gefüllt werden muß, um funktionsgemäß zu arbeiten. Hierbei besteht die Gefahr, daß sich in der Flüssigkeit befindliche Gasblasen in der Kammer sammeln und die Durchströmung der Kammer behindern. Des weiteren kommt es bei Perfusionskammern aufgrund der räumlichen Anordnung der eingesetzten Gewebeträger rasch zu einer Abreicherung des Sauerstoffs über die Länge der Kammer, wodurch die Gefahr auftritt, daß die hinteren Gewebezellen nicht mehr ausreichend mit Gas, insbesondere mit Sauerstoff versorgt werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Kultivierung von Gewebezellen bereitzustellen, mit dem die geschilderten Nachteile beseitigt werden können. Dabei sollen die Gewebezellen ausreichend mit Gas und Nährmedium versorgt werden können .
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgabe entsprechend den kennzeichnenden Teilen der Patentansprüche 1 und 16.
Die Erfindung bietet den Vorteil, daß durch die ausgebildete Strömungsschicht oberhalb der Gewebezellen eine optimale
Versorgung der Gewebezellen sowohl mit Nährstoffen als auch mit gasförmigen Stoffen ermöglicht wird. Auf diese Weise kann frisches Medium zu den Gewebezellen gelangen. Darüber hinaus wird die Gasversorgung der Gewebezellen verbessert, da die Diffusionswege für die Gase gering sind. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird ein Gasstrom erzeugt, der der Strömungsrichtung des Nährmediums entgegengerichtet ist. Hierdurch wird vor allem bei einer Anordnung von mehreren Gewebekulturen gewährleistet, daß alle Gewebekulturen ausreichend mit Gas, insbesondere mit Sauerstoff versorgt werden, und daß es zu keiner ungewünschten Abreicherung von Sauerstoff über die Länge des Kulturbereiches kommt.
Darüber hinaus läßt sich durch die Schichtdicke des
Nährmediums der Diffusionsweg für die Gase einstellen, beispielsweise durch die Ausbildung einer in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Überlaufkante .
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die dünne Schicht des Nährmediums oberhalb der Gewebezellen 0,1...3,0 mm, vorzugsweise 0,5...1,0 mm.
Die Ausbildung einer dünnen Nährmediumschicht oberhalb der Gewebezellen läßt sich in bevorzugter Weise dadurch erreichen, daß man in einen Kulturbereich, in dem sich die Gewebezellen befinden, Nährmedium leitet. Mit dem Nährmedium wird sodann ein Überlauf aus dem Kulturbereich erzeugt, und das Nährmedium gelangt nach dem Überströmen der Gewebezellen in eine Auffangkammer . Aus der Auffangkammer wird das Nährmedium anschließend wieder abgeführt.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Kultivierung von menschlichen, tierischen und pflanzlichen Zellen. Je nach Art der verwendeten Zellen weiß der Fachmann, welches Nährmedium zur Kultivierung erforderlich ist. Entsprechend läßt sich das Nährmedium zusammensetzen. Das gleiche gilt für den Einsatz der erforderlichen Gase. Wird bei menschlichen und tierischen Zellen unter anderem
Sauerstoff benötigt, ergibt sich bei pflanzlichen Zellen in der Regel ein Bedarf an Kohlendioxid. Je nach Art der verwendeten Gase kann es auch zweckmäßig sein, die Zusammensetzung des Nährmediums hierauf abzustimmen. So kann sich beispielsweise der Bedarf nach einer erhöhten
Pufferkapazität ergeben oder eine pH-Wert-Regulierung erforderlich sein.
Darüber hinaus eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Vermehrung von implantierbaren Zellen. Bei Zellen, die in den menschlichen oder tierischen Körper implantiert werden, handelt es sich insbesondere um Haut- oder Knochengewebszellen sowie um Knorpel- und Gefäßzellen. Darüber hinaus eignet sich das Verfahren zur Gewinnung implantierbarer Knorpelkonstrukte oder Knochenkonstrukte . Gerade zur Gewinnung derartiger Konstrukte bietet das er indungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß die Gewebezellen dreidimensionale Strukturen einnehmen und trotzdem ausreichend mit Nährmedium und Sauerstoff versorgt werden können .
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich schließlich auch zur Durchführung von Wirkungs- und Toxizitätstests. Auf diese Weise läßt sich die Wirkung von Medikamenten, Umweltgiften und dergleichen auf die Gewebezellen untersuchen, um hierdurch eine Alternative zu Tierversuchen zu ermöglichen. Dabei läßt sich der zu untersuchende Stoff nach seinem jeweiligen Aggregatzustand entweder in der Gasphase einsetzen oder dem Nährmedium in fester oder flüssiger Form zugeben.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend anhand der Zeichnungen näher beschrieben.
Es zeigen
Figuren 1 und 2 eine schematische Darstellung einer Behandlungsapparatur mit daran angeschlossener Gasversorgungseinheit und Abluftstrecke,
Figur 3 eine schematische Darstellung einer Behandlungsapparatur mit einzelnen Einsätzen,
Figur 4 eine schematische Darstellung einer Behandlungsapparatur mit Trägern für adhärente Zellkulturen,
Figur 5 eine schematische Darstellung einer Behandlungsapparatur ohne spezielle Gasleitung sowie
Figur 6 eine schematische Darstellung einer Behandlungsapparatur zur Druckbeaufschlagung.
In Figur 1 ist eine Vorrichtung zur Kultivierung von
Gewebezellen mit einer Behandlungsapparatur 1 dargestellt, bei der die Behandlungsapparatur 1 über einen Kulturbereich 2 verfügt, in dem nicht näher dargestellte Gewebezellen mit Nährmedium in Berührung gebracht werden. Die Behandlungsapparatur 1 verfügt hierbei über einen Zulauf 32 und einen Ablauf 33 für das Nährmedium, so daß das Nährmedium von dem einen Ende 30 des Kulturbereichs 2 zum anderen Ende 31 strömen kann. Anschließend gelangt das Nährmedium in eine Auffangkammer 4. Von der Auffangkammer 4 wird das Nährmedium über die Leitung 6 abgezogen. Eine Pumpe 17 transportiert das Nährmedium im Kreislauf über die Leitung 5 zurück in den Kulturbereich 2. Mit Hilfe der Pumpe 17 läßt sich die
Strömungsgeschwindigkeit des Nährmediums regulieren, so daß insbesondere die Strömungsgeschwindigkeit des Nährmediums oberhalb der Gewebezellen einstellbar ist. Des weiteren sieht Figur 1 eine Gasversorgungseinheit 13 vor, mit Hilfe der ein definierbares Gemisch verschiedener Gase, beispielsweise aus Luft, Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid herstellbar und der Behandlungsapparatur 1 zuführbar ist. Die Gasversorgungseinheit 13 kann ferner Durchflußmesser 18, 19 sowie ein Sterilfilter 20 aufweisen. Ebenso können Befeuchtungsmittel 21 vorgesehen sein, um das Gas vor Einleitung in die Behandlungsapparatur 1 mit Wasser anzufeuchten. Über die Leitung 10 gelangt das Gas durch die Gaseinlaßöffnung 8 in den Innenraum 12 der Behandlungsapparatur 1. Hierbei wird das in dem Kulturbereich 2 befindliche Nährmedium mit Gas beaufschlagt. Das Gas strömt hierbei entgegengesetzt zur Strömung des Nährmediums über das Nährmedium und verläßt den Innenraum 12 der
Behandlungsapparatur 1 durch die Gasauslaßöffnung 9. An die Gasauslaßöffnung 9 ist eine Leitung 11 angeschlossen, über die das Gas zu einer Abluftstrecke 22 geführt wird. Die Abluftstrecke enthält eine Sterilfalle 23 sowie ein Abluftfilter 24.
Da sich herausgestellt hat, daß das Wachstum der Zellen durch Stimulation der Scherbeanspruchung beeinflußbar ist, hat die Strömungsgeschwindigkeit des Nährmediums auch Einfluß auf das Wachstum der Gewebezellen. Bei der in Figur 1 gewählten Versuchsanordnung wurden bis zu 5 ml Nährmedium pro Minute gefördert. Vorzugsweise betrug die Förderleistung 0,25 bis 1 ml/min. Bei der in Figur 2 dargestellten Versuchsanordnung wurden nur bis zu 30 ml/Tag, vorzugsweise 2,5 bis 10 ml/Tag gefördert.
Nach der in Figur 2 dargestellten Ausführungsform der Erfindung wird mittels einer Pumpe 25 ständig frisches Nährmedium aus einer Vorratsflasche 26 angesaugt und in den Kulturbereich 2 der Behandlungsapparatur 1 geleitet. Verbrauchtes Medium wird in einer Auffangflasche 27 gesammelt .
Figur 3 zeigt die Behandlungsapparatur 1 in vergrößerter Darstellung. Zu- und Ableitungen für Gas und Nährmedium sind durch Pfeile gekennzeichnet. Die Behandlungsapparatur 1 weist ein Bodenprofil 34 auf, das zur Aufnahme von Trägern 14, 16 für die Gewebezellen vorgesehen ist. An dem Bodenprofil 34 ist eine Überlaufkante 28 ausgebildet, über die das Nährmedium aus dem Kulturbereich 2 in eine Auffangkammer 4 fließen kann. Die Überlaufkante 28 wird im gezeigten Ausführungsbeispiel von einer erhöhten Seitenwand 3 des Bodenprofils 34 gebildet. Diese Ausführungsformen weist weiterhin die Besonderheit auf, daß spezielle Einsätze 15 für vorstrukturierte, dreidimensionale Träger 14, die kompakt oder makroporös sein können, vorgesehen sind. Die Einsätze 15 sind hierbei lösbar mit dem Bodenprofil 34 verbunden. Sie lassen sich bevorzugt von unten in das Bodenprofil 34 einschrauben. Im eingebauten Zustand der Einsätze 15 sind die Gewebezellen dann so positioniert, daß sie von einer dünnen Schicht aus Nährmedium überströmt werden können. Nach dem Überströmen der Gewebezellen fließt das Nährmedium dann in die Auffangkammer 4.
Die in Figur 3 dargestellten Träger 14 sind bevorzugt in einer oder zwei Reihen in einem nicht näher dargestellten Strömungskanal angeordnet. Die Breite des Strömungskanals kann 5 bis 7 cm betragen. Größere Breiten haben unter Umständen den Nachteil, daß sich in dem Strömungskanal kein gleichmäßiges Strömungsprofil ausbilden können. Dagegen spielt die Länge des Strömungskanals grundsätzlich keine
Rolle. Sie sollte nach Möglichkeit aber nicht größer als 20 bis 25 cm sein, so daß sich im Strömungskanal etwa 5 bis 10 Träger 14 unterbringen lassen.
Die in Figur 4 dargestellte Ausführungsform zeigt als weitere Besonderheit spezielle Träger 16, die für adhärente Zellkulturen ausgebildet sind. Die Träger 16 bestehen vorzugsweise aus Glas oder geeigneten Kunststoffen. Sie sind wie die Träger 14 gemäß Figur 3 so positioniert, daß das Nährmedium in einer dünnen Schicht über die in den Einsätzen 16 befindlichen Gewebezellen hinwegströmen und in die Auffangkammer 4 gelangen kann.
Im Unterschied zu den Ausführungsformen gemäß den Figuren 1 bis 4 zeigt Figur 5 eine Behandlungsapparatur 1, bei der Gas in den Innenraum 12 im Wege der Diffusion gelangt. Als Gaseinlaßöffnung 8 ist hierzu im Oberteil 7 eine spaltförmige Öffnung vorgesehen, die zur Vermeidung von Kontaminationen auch mit einem Diaphragma verschließbar sein kann. Entsprechendes gilt für die Gasauslaßöffnung 9. Zu- und
Ableitungen für das Nährmedium bestehen weiterhin. Sie sind durch Pfeile gekennzeichnet. Für die Ausführungsform gemäß Figur 5 ergibt sich der Vorteil, daß eine Vorrichtung mit einer solchen Behandlungsapparatur 1 keine besonderen Begasungsmittel erfordert. Die Kultivierung von Gewebezellen läßt sich in diesem Falle ohne zusätzlichen apparativen Aufwand in einem Wärmeschrank durchführen.
In Figur 6 ist schließlich eine Ausführungsform mit einer Behandlungsapparatur 1 dargestellt, bei der der Innenraum 12 druckbeaufschlagt ist. Über geeignete Ventile 29 a-d läßt sich ein definierter Überdruck einstellen, durch den beispielsweise der Übertritt von gasförmigen Stoffen in das Nährmedium erleichtert und somit die Versorgung der Gewebezellen mit diesen Stoffen verbessert wird.
Bezugszeichenliste
1 Behandlungsapparatur
2 Kulturbereich
3 Seitenwand
4 Auffangkammer
5 Leitung
6 Leitung
7 Oberteil
8 Gaseinlaßöffnung
9 Gasauslaßöffnung
10 Leitung
11 Leitung
12 Innenraum
13 Gasversorgungseinheit
14 Träger
15 Einsatz Träger
Pumpe
Durchflußmesser
Durchflußmesser
Sterilfilter
Befeuchtungsmittel
Abluftst ecke
Sterilfalle
Abluftfilter
Pumpe
Vorratsflasche
Auffangflasche
Überlaufkante a-d Ventile
Ende
Ende
Zulauf
Ablauf
Bodenprofil

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Kultivierung von Gewebezellen, bei dem die Gewebezellen mit Nährmedium und Gas versorgt werden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gewebezellen in einem Kulturbereich kultiviert und von einem Ende des Kulturbereichs zum gegenüberliegenden Ende des Kulturbereichs mit Nährmedium überströmt, so daß sich oberhalb der Gewebezellen eine dünne Nährmediumschicht ausbildet, die man mit Gas beaufschlagt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Gasstrom erzeugt, der entgegengesetzt zur Strömungsrichtung des Nährmediums verläuft.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Schichtdicke des Nährmediums oberhalb der Gewebezellen einstellbar ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schichtdicke des Nährmediums oberhalb der Gewebezellen 0,1...3,0 mm, vorzugsweise 0 , 5...1 , 0 mm beträgt .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man an dem einen Ende des Kulturbereichs einen Überlauf des Nährmediums erzeugt, so daß das Nährmedium nach dem Überströmen der Gewebezellen in eine Auffangkammer fließt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Nährmedium aus der Auffangkammer abführt und im Kreislauf zurück in den Kulturbereich leitet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gas Luft oder ein anderes zur Versorgung der Gewebezellen dienendes Gas verwendet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlungsapparatur druckbeaufschlagt .
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur
Kultivierung von menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Zellen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Vermehrung von implantierbaren Zellen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Gewinnung implantierbarer Knorpelkonstrukte .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Gewinnung implantierbarer Knochenkonstrukte .
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem man dem Nährmedium einen Wirkstoff zusetzt, dessen Wirkung auf die Gewebezellen untersucht werden soll.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem das Gas einen Wirkstoff enthält, dessen Wirkung auf die Gewebezellen untersucht werden soll.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 mit dem Ziel der Herstellung von Stoffen, die von den Gewebezellen gebildet werden.
16. Vorrichtung zur Kultivierung von Gewebezellen mit einer Behandlungsapparatur, in der die Gewebezellen mit Gas und Nährmedium versorgt werden, wobei die Behandlungsapparatur über einen Zulauf und einen Ablauf für das Nährmedium verfügt, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlungsapparatur (1) einen Kulturbereich (2) mit einer Anordnung von Trägern (14, 16) für die Gewebezellen enthält, so daß die Gewebezellen derart positionierbar sind, daß das Nährmedium in einer dünnen Schicht oberhalb der Gewebezellen strömen kann, und daß die Behandlungsapparatur (1) ein Oberteil (7) aufweist, das mit einer Gaseinlaßöffnung (8) und einer Gasauslaßöffnung (9) versehen ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Gaseinlaßöffnung (8) und die Gasauslaßöffnung (9) so angeordnet sind, daß sich bei einer Gaseinleitung in die Behandlungsapparatur (1) ein Gasstrom bildet, der entgegengesetzt zur Strömungsrichtung des Nährmediums verläuft .
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Schichtdicke des Nährmediums oberhalb der Gewebezellen 0,1...3,0 mm, vorzugsweise von 0,5...1,0 mm beträgt.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlungsapparatur (1) ein
Bodenprofil (34) zur Aufnahme der Träger (14, 16) aufweist, an dem eine Überlaufkante (28) ausgebildet ist, über die das Nährmedium in eine Auffangkammer (4) fließen kann.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Bodenprofil (34) ein
Strömungskanal ausgebildet ist, in dem die Träger (14, 16) reihig angeordnet sind.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß Leitungen (5, 6) für das Nährmedium vorgesehen sind, wobei die Leitung (5) eine Zuleitung für das Nährmedium bildet und die Leitung (6) an die Auffangkammer (4) angeschlossen ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß an die Gaseinlaßöffnung (8) eine Leitung (10) angeschlossen ist, die mit einer Gasversorgungseinheit (13) verbunden ist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß Ventile (29 a-d) für Zu- und Abläufe von Nährmedium und Gas vorgesehen sind, die eine Drucksteuerung im Innenraum (12) der Behandlungsapparatur (1) ermöglichen.
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