JPS63130600A

JPS63130600A - 生理活性物質

Info

Publication number: JPS63130600A
Application number: JP61276497A
Authority: JP
Inventors: Tadaaki Furuta; 古田　忠昭; Tsuneo Sato; 恒雄佐藤; Kahori Yoshinari; 吉成　河法吏; Mitsuharu Ono; 大野　満春
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1986-11-21
Filing date: 1986-11-21
Publication date: 1988-06-02
Also published as: JPH0474360B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規な生理活性物質およびその製造方法に関す
るものである。更に詳しくは、ヒト由来のマクロファー
ジ様細胞を培養することによって産生される、細胞分化
誘導作用を有する蛋白性のヒト由来の生理活性物質（以
下、細胞分化誘導物質と略記）およびその製造方法に関
するものである。

［従来の技術］免疫反応をつかさどっている細胞群の中で、最近マクロ
ファージ（以下Ｍφと略す）が注目されちようになって
きた。Ｍφが、どん食作用による抗原の処理を始めとし
て、生体の防御機構の中で、中心的な役割を演じている
ことが、明らかになってきたからである。また、細胞外
からの刺激に応じて、Ｍφが、インターロイキン−１、
癌壊死因子、コロニー形成刺激因子など、多種の重要な
生理活性物質を産生ずることが知られてきた。

血液細胞は、造血幹細胞より、増殖分化を繰り返し、成
熟して機能細胞へ到達するのである。この分化成熟の過
程で増殖能をもち、腫よう化してしまったものが白血病
細胞である。このような腫よう細胞を正常な機能をもっ
た細胞へと分化を誘導するのが、分化誘導能をもった物
質であり、これら分化誘導能をもった物質を用いること
により、所しい癌の治療方法を開発できるものとして、
近年、注目されている。

分化誘導能をもった物質としては、安全性の高い蛋白性
の物質、特にヒト由来の蛋白性の物質が開時を集め、近
年活発に研究がなされている。現在までに、ヒト末梢血
リンパ球をレクチンで刺激することにより、分化誘導活
性が生成されることが報告されている（ジャーナル　ナ
ショナル　カンサー　インステチ：ｘ　−）　（，１，
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒを用いたゲルろ過分画
法によって分子量２５，０００と４０．０００の蛋白性
物質であることが報告されているのみてあったが、その
後の研究において、公開特許公報、Ｉｌ、！？　６０−
２８９３４号に示される分子量４５．０００〜６０．０
００または１００，０００　、等電点５〜７の物質であ
り、トリプシンに感受性を示し、熱に不安定な物質であ
るとされた。一方、ヒト−ニーリンパ球性白血病細胞の
培養上清中に見いだされた分化誘導活性は、アクリルア
ミドゲル電気泳動法によって、分子量５０，０００〜６
０，０００の蛋白性の物質に由来するものとされたが、
単離工程中で、その活性の約６０〜９０％が失われた（
日本組織培養学会要旨、４３頁、（１９８３年））。

［発明が解決しようとする問題点コこのように、ヒト末梢血リンパ球およびヒト−ニーリン
パ球性白血病細胞から生成される分化誘導活性は、その
活性をもたらす物質の性質はほとんどわカ）っていない
か、熱や蛋白質分解酵素に強い感受性を示す不安定な物
質であった。

また、これらの活性は弱く、ビタミンＡ誘導体少とが共
存しないと、白血病細胞に充分な分化を誘導することが
できなかった。

［問題点を解決するための手段］本発明者らは、上記先行知見を認識し、マクロファージ
（Ｍφ）系の細胞が、より安定性に優れた、強い細胞分
化誘導作用を有する蛋白性の生理活性物質を産生ずると
の作業仮説に基いて、鋭意検討を続けてきた。その結果
、ヒトのＭφ前駆細胞に作用して、単独で、Ｍφへと分
化を誘導しろる活性を有するヒト由来の蛋白性の細胞分
化誘導物質を見いだし、本発明を完成するに至った。

［発明の内容］すなわち、本発明は下記の特性を有する蛋白性の生理活
性物質であって、ａ）分子量　５０．０００±５　、０００（ゲルろ過法
）５０．０００±５，００区５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法）ｂ）等電点　６．５±１．０（等電点電気泳動法）Ｃ）
熱安定性　７０℃にて失活しない白血病細胞に対して細胞分化誘導作用を有する生理活性
物質を、ヒト由来のマクロファージ様細胞をマクロファ
ージ活性化物質の存在下での培養によって生産すること
を特徴とする、細胞分化誘導活性を有するヒト由来の生
理活性物質であり、その生産方法である。

本発明において、細胞分化誘導物質とはヒト由来のＭφ
又はＭφ様細胞が産生ずる物質であって、ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏで少なくともマウスＭ−１細胞を分化させ、どん食
能を誘起する能力を有するものを意味する。

本発明の方法によれば、培養規模を調節することにより
任意の量の細胞分化誘導物質を、随時、製造することが
できる。

本発明て用いられろＭφ様細胞とは、末梢血単球、組織
Ｍφ、Ｍφ前駆細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで分化誘導剤の
作用によりＭφ様細胞に変化したものなとを用いること
ができる。Ｍφ前駆細胞とは、分化誘導剤の作用により
始めてＭφ様細胞に変化する細胞又は本来Ｍφの性質の
一部を有しているが、分化誘導剤の作用により更にＭφ
の性質を有するように変化する細胞を意味する。Ｍφ前
駆細胞は、白血病患者から分離した初代細胞及び株化細
胞などから得られるが、株化細胞が大量に得やすく好ま
しい。本発明で用いられる株化細胞の例として！、、ｔ
　、　ＨＬ−６０細胞（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
２７０巻。

３４７頁（１９７７年））ＴＨＰ−１ｍ胞（インターナ
ショナル　ジャーナル　カンサー（Ｉｎｔ、　ｊ、　Ｃ
ａｎｃｅｒ）２６巻、１７１頁（１９８０年）　）　、
Ｍｏｎｏ−１−２０７細胞（ウィルヒョーズ　アルヒー
フ　ァー　パソロジカル　アナトミー　ヒスドパソロジ
ー（ＶｉｒｃｈｏｗｓＡｒｃｈ、　Ａ　　Ｐａｔｈ、　
Ａｎａｔ、　ａｎｄ　Ｈｉｓｔｏｌ、）　３７１巻、１
５頁（１９７６年））などが挙げられる。ここで用いら
れる分化誘導剤としては、Ｍφ様細胞へ変化し得るＭφ
前駆細胞をＭφ様＜Ｆｓ胞への変化を誘導する物質を書
味し、例えば、ホルボールエステル類、メゼレインのよ
うなジテルペン系化合物、テレオシジンなどが挙げられ
る。ホルボールエステル類では、４β−ヒドロキシ体が
好ましく、中でも、１２−０−テトラデカノイルホルボ
ール−１３−アセテート（以下、ＴＰＡと略記する）が
特に好ましい。

本発明において用いられるＭφ活性化物質としては、ビ
タミンＡ誘導体（例えば、ビタミンＡ酸、ビタミンＡア
ルコール、ビタミンＡアセテート、ビタミンＡパルミテ
ート）、ジメチルスルホキシド、酪酸ナトリウム塩、ハ
イドロコーチシン、ダラム陰性菌由来のりボボリサッカ
ライド（以下ＬＰＳと略す）、リピッドＡ、ＢＣＧ菌な
どの菌体３０００ｎｇ／ｍｌ　、より好ましくは約５０
０〜２００Ｏｒ＋ｇ／ｍ　ｌのビタミンＡ誘導体、中で
もビタミンＡ酸の使用が特に好ましい。

細胞分化誘導物質産生に充分な時間、ヒト由来のＭφ様
細胞を培養した後、培養上清を収集し、遠心分離により
細胞層を除去すれは、細胞分化誘導物質を含む溶液が得
られる。この細胞分化誘導物質を含む溶ン夜を生化学的
分離操作における常法、限外ろ過による濃縮、透析脱塩
、陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィー
、ゲルろ過、電気泳動等を適宜■み合わせて精製するこ
と；こより、高純度の細胞分化誘導物質を得ることがで
きる。

細胞分化誘導物質の活性の測定は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで
マウス骨髄性白血病細胞Ｍ−１細胞に、どん食油を誘起
する効果を測定することにより行なう。本発明者らが用
いている方法は、林の方法（トキシコロジ−７オ−ラム
、７巻、５０頁、（１９８４年））を改良したものであ
る。即ち、増殖間にあるＭ−１細胞５Ｘ１０５ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌ　（培地：イーグルＭＥＭ＋２処理（＋０００
　ｒｐｍ、　１０分間）を施し、上澄み液を捨て、血清
を含まない培養液１ｍｌを加えて再び細胞を懸濁し、２
ｕ　Ｉ＃ｎｌの濃度のポリスチレン・ラテックス粒子（
１，００４１１ｍ　：積木化学社製）を加え攪はんした
後、さらに４時間培養する。この細胞をＰＢ３１ｍｌで
よ＜ｉ浄、遠心し、細胞外のラテックス粒子を除去する
。この操作を２回繰り返したのち、遠心管の底に沈殿し
た細胞をピペットで吸い上げ、スライドガラス上にｌｉ
落とす。

これに０．５％エオシン０１滴を加え、カバーガラスを
のせ、顕微鏡で観察する。赤く染色される死細胞を除き
、生細胞のみについて、ラテックス粒子をどん食した細
胞と非どん食細胞とを計数し、どん食細胞の比率を求め
る。試験液を適宜希釈して、上記の測定を行ない、どん
食細胞の比率が１０％になるのに必要な、細胞分化誘導
物質の試料の希釈率の逆数をもって、本発明における細
胞分化誘導物質の活性量を１単位（Ｕ）／ｍｌと定義す
る。

以下本発明における細胞分化誘導物質の活性量は、この
どん食油測定法によって測定した単位で示さ、塩化ナト
リウム８ｇ／１．リン酸第１カリウム０．２ｇ／１．リ
ン酸第２ナトリウム１．１５ｇ／Ｉ、　ｐ　Ｈ７，４）
に０．０１χポリエチレングリコールを添加した溶液に
て平衡化した５Ｂｅｒｏｓｅ　６　＋　５ｕａｅｒｏｓ
ｅ　１２　（）７ルマシア社（スエーデン）製）を用い
るゲルろ過法により分画し、Ｍ　−１細胞でのとん食油
の誘起による細胞分化誘導活性を測定する。

Ｂ）分子ｆｆｉ　：　５０．０００±５．０００（Ｓ　
Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動法）Ｓｅｇｒｅｓｔらの方法［メソッド　イン　エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔ、ｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）　２８−８巻、５４頁（１９７２年）］に従い、トリ
ス／グリシン／５ＤＳ（ｐ）ｌ　８．３）て、電気泳動
を行なった。標準分子量キット（ファルマシア社製）を
用いて分子量検孟線を作成し、分画したゲルからの抽出
物のＭ−１細胞のどん食油誘起活性評価により分子量を
決定する。

以上の結果より、本発明の細胞分化誘導物質はサブ・ユ
ニット構造をとっていない物質であることが分かる。

Ｃ）等電点：６．５±１．０（等電点電気泳動法）アト
−株式会社製の等電点電気泳動装置（Ｓ、Ｊ＋０７１Ｅ
Ｃ型）を用い、ファルマライト（ファルマシア社製、ｐ
Ｈ４〜８）とグリセロールを含む５％ポリアクリルアミ
ド平板ゲルを作成する。陽極側に０．０４Ｍ　　ＤＬ−
グルタミン酸、陰株側に０．２Ｍ　Ｌ−ヒスチジンを使
用して、７００ｖて５０分間の前泳動を行なう。続いて
試料を付与し、マＯＯｖて１時間、５００　Ｖ　Ｔ：１
６時間泳動を行なう。泳動終了後ゲルを２．５　ｍｍ巾
で切り出し、次いて各ゲル片を０．１５　Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０２　Ｍ　）リス−塩酸緩衝？ｌ　（ｐ
）Ｉ　８．２　）　０．２　ｍｌで抽出し、各抽出ン夜
について、Ｍ−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の評（
Ｉ！ｌｉを行なう。

Ｄ）熱安定性本発明の細胞分化誘導物質を０．０＋：ポリエチレング
リコールを添加したｐ）（７，４リン酸緩衝液にて３倍
に希釈し、所定の時間、所定の温度にて加熱した後、Ｍ
−１細胞を用いた′ｇＡ胞分化分化誘導活性価を行なう
。本発明の細胞分化誘導物質は、７０℃、１時間の処理
において、その活性を失なず、熱的に安定な生理活性物
質である。

Ｅ）レクチンカラムへの吸着性市販の各挿レクチン固定化樹脂を市販セパコールミニカ
ラム（バイオラッド社製）に充填し１５０ｍＭの塩化ナ
トリウムを含む５０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
で充分に洗浄後、本発明の細胞分化誘導物質試料を添加
し、同緩衝液にて洗浄する。

次いて、各種糖類を含む溶Ｂ液で溶出を行なう。

コンカナバリン−Ａ、および、レンチルレクチンのカラ
ムを用いた場合に、レクチンカラムへの吸着が認められ
、いずれのカラムにおいても０．２Ｍα−メチル−ｄ−
マンノシド溶液により、細胞分化誘導活性が溶出する。

Ｆ）ジスルフィド結合の還元剤による影響ジスルフィド
結合の還元剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又
は、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を、本発明
になる細胞分化誘導物質のｍ　ｔ１１２中に加え、３７
℃で、４時間反応させる。

反応後、Ｍ−１胞に対するどん金部誘起活性を測定する
。５０　ｍＭのジチオスレイトールを添加した場合に、
活性が低下する。

Ｇ）ｐＨ安定性本発明になる細胞分化誘導物質を含む溶、夜に、４倍量
の各種ｐＨの緩衝液を添加し、２４時間、３７°Ｃに加
温した後、ｐＨを中性にもとし、Ｍ　−１細胞豐対する
細胞分化誘導活性を測定する。ｐＨ２〜１０の範囲にお
いて、活性の低下は認められない。

■）蛋白分解酵素安定性本発明になる細胞分化誘導物質を含む溶液ＣｎＨ７、＝
１）に蛋白分解酵素トリプシン、または、プロナーゼ−
Ｅ　　（２００巣位）を添加し、３７°Ｃにて、３時間
反応させる。反応後において、Ｍ−１細胞に対する細胞
分化誘導活性の低下は認められない。上記実験に０．１
％ＳＤＳを添加したこと以外は、同一の条件にて、蛋白
分解酵素の効果を検討すると、０．１％ＳＤＳの添加時
のプロナーゼ−Ｅミこより、細胞分化誘導活性が消失す
ることが認められる。

Ｉ）ヒト白血病細胞に対する生理作用牛胎児血清を１０％含むＲＰ　Ｔｈ、４１−１６４０培
地にヒト単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）、ヒト前骨髄
性白血病細胞（Ｔ（Ｌ−６０）を３７°Ｃ１炭酸ガス培
養型中てそれぞれ培養し、増殖間にある細胞をリン酸緩
衝液でよく洗浄する。該細胞を１０％牛脂児血清および
　１０　ｎＭビタミンＡ酸を添加したＲＰＭＩ−１６４
０培地（ビタミン、アミノ酸強化）に、それぞれ２ＸＩ
０５個／　ｍｌ培地になるように懸濁する。細胞〒１濁
）α１００７１１　と細胞分化誘導物質溶液（試験液）
　＋００　ｕ　Ｉとの混合液を９６穴プレートに入れ、
３７°Ｃ，５％炭酸カスｆＨ合空気の下で、３日問培養
する。０．２％ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＥＴ、
シグマ社）の溶ｉｆｆ　（０，２ｕ　ｇ／ｍｌ　Ｔ　Ｐ
　Ａ含有培地）ｌｏｏａｌを加えて、更に４５分間培養
後、顕微鏡下てｔｌ！察する。青く沈着した色素を有す
る細胞がＮＥＴ還元能陽性細胞として観察されろ。

本発明の細胞分化誘導物質と３日問培養することにより
、Ｔ　ＨＰ−１細胞、ＨＬ−６０細胞にＮＢＴ還元能が
誘導されるのみならず、ラテックス粒子どん食油、培養
容器壁への付着能、酵母菌殺菌能、酸性ホスファターゼ
活性、β−グルクロニダーゼ活性なと、Ｍφの特徴とし
て、細胞鑑定に常用される（「マニュアル　オブ　マク
ロファージ　メソトロジー（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍａ
ｃｒｏｐｈａａｅ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）、マーで
ル　デツカ−社、米国、１９８１年」　「図解白血球、
金芳堂、１９８２年」）各種指標の活性の１９強が認め
られる。

なお、これまでの説明で明らかなように、不発明になる
新規生理活性物質は、Ｍφ前駆細胞であるヒトおよびマ
ウスの骨髄性白血病細胞に作用して、Ｎ１φ様細胞へと
分化を誘導し、％４φに特有な各種（熾能の昂進をもた
らし、溶液中ての分子量、分化誘導物質は、サブ・ユニ
ット構造を有しない糖蛋白質であると考えられる。

次に本発明の細胞分化誘導物質の製造方法について詳し
く述へる。

本発明で使用される細胞の培養には、高等動物細胞の培
養に適した各種合成培地が用いられろ。

代表的な培地としては、例えばＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０
培ｔ１セ、イーグルのＭＥＭ培地、ダルベツコ変法のＭ
ＥＭ培地、ａ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地、Ｈａｍの培地、１９
９培地、　ＭｃＣｏｙ　５Ａ培地、Ｉ　５ｃｏｖｅの培
地などを単独もしくは適宜混合した培地が用いられろ。

これらの培地の組成は「細胞組織培養マニュアル、講談
社、１９８２年」に記載されている。これらの培地乙こ
は、アルブミン、インシュリン、トランスフェリンなど
の血清由来の蛋白質、ヒト血清、牛胎児血清、牛血清、
馬血清などの動物血清を単独で、あるいは適宜刊み合わ
せて添加してもよい。また必要に応じて、微生物による
汚染を防止するために、例えばペニシリン１０〜１００
単位／　ｍｌ培地、硫ジンエタンスルホン酸コなとのｐ
Ｈ緩衝剤を使用してもよい。培養容器の材質は特に限定
しないが、プラスチック、ガラスあるいは金属製のもの
であって、細胞の増殖が可能であり、細胞の接着性に優
れたものが好ましい。

細胞分化誘導物質を産生させるためには、適当な培地を
用いて、ヒト由来のＭφ様細胞を、培養容器面１ｃｍ２
当たりに約５Ｘ１０’　〜５ＸｌＯ’１．好ましぐは、
約８ＸＩＯ’〜３ＸｌＯ’個となるように１１スえ込む
。次いで、Ｍφ活性化物質を添加する。細胞及びＭφ活
性化物質を含む培養容器を約３５〜：慴°Ｃ１好ましく
は約３７°Ｃ１約５〜１０％炭酸カス含有空気中、温度
約９０〜１００％の条件の下で、４０〜１００時間培養
することにより、細胞分化誘導物質が産生され、培養上
清中に放出される。培地のｐＨは、培養期間巾約６．０
〜７．５に維持することが好ましい。また、Ｍφ前駆細
胞を用いる場合には、動物血清を含む適当な培地中にて
、１〜２４時間、Ｍφ前駆細胞をＮ１φ様細胞へと変化
させうるＴ　Ｐ　Ａ去し、得られろＭφＢ　、ｆｔｆｌ
胞を使用し、上記のことく培養することにより、細胞分
化誘導物質を取得する。

次：こ実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものでないことは言う
までもない。なお以下の記載において、１％」：、を特
に記載しない限り容量パーセントぐＶ／＼・％）を表わ
す。また特二二紀社がない限り、培養は３７’Ｃ，湿度
９０〜１００％、５％炭酸ガス含有空気中で行なった。

実施例１ヒトで、性里球性白血病細胞ＴＨＰ−１細胞を、１０％
の牛胎児血清、５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０Ｉ
Ｚｇ／ｍ＋のストレプトマイシンを含有するＲＰＭｌｌ
［’ｉ４０培地にて、細胞密度６ｙｌＯ−’ｆｌｎ／ｍ
ｌとなるように、細胞浮遊１７２を調製し、その　１０
ｍ１を　１００枚のｉｆｆ　ＬＪ培養用プラスチック製
ペトリデイツシュ（直径８　ｃｍ　）に植え込み、分化
誘導剤として、１２−θ−テトラデカノイルホルボール
ー１３−アセテ−）　（ＴＰＡ）を　Ｉｕｇ／ｍｌとな
るように添加し、３７℃、５％炭酸ガス含有空気中で２
４時間培養した。

その後、培篇液を除去し、ＴＰＡを含まずＮＴ値活性化
物質としてビタミンＡ酸（ＲＡ）を１７１ｇ／ｉｆ含む
血清不含の新鮮ＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地（ペニシリ
ン、ストレプトマイシンを含む）１０ｍｌと置き換え、
さらに培養を続けた。７２時間後に各ディツシュの培養
上清を収集し、３００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し８１１
１胞屑を除去した後、上清中の細胞分化誘導物質の活性
を１ｌｌｌｌ定した。即ち、増輩朋にあるＭ−１ｍｌＦ
ｄ　５ＸＩＯ５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　（培地：イーグルＭ
　Ｅ　Ｍ　＋　２培量ビタミン・アミノ酸＋１０％牛脂
１凡血消）η透液に得られた培養液を混じ、その１ｍｌ
を　ｌ０ｍ１ガラス管にとり横に倒して、炭酸ガス培養
器中で３７℃で２日間培養後、遠心処理（１０００ｒｐ
ｍ、　１０分間）を施し、上澄み液を捨て血清を含まな
い培養液１ｍｌを加えて再び細胞を懸濁し、２μｍ／ｍ
１の濃度のポリスチレン・ラテックス粒子（１，００４
ｔｔｍ：積水化学社Ｉりを加え攪はんした後、ざらに４
時間培養する。この細胞をＰＢＳｌｍｌでよく洗浄、遠
心し、細胞外のラテックス粒子を除去する。

６：の操作を２回繰り返したのち、遠心管の底に沈殿し
た細胞をピペットで吸い上げ、スライドガラス上に１滴
落とす。これに０．５％エオシン液１滴を加え、カバー
ガラスをのせ、顕ｙｇ＆鏡で観察する。

赤く染色される死ｍ胞を除き、生細胞のみについて、ラ
テックス粒子をどん食した細胞と非どん食細胞とを計数
し、どん食細胞の比率を求める。培養液を適宜希釈して
、上記の測定を行ない、どん食細胞の比率ｈ１０％にな
るのに必要な、培養液の希釈率の逆数をもって、１単位
（Ｕ）／ｍｌ　と定義されろ本発明の細胞分化誘導物質
の活性量は、得られた培養液において、７７単位／ｍ１
であった。

得られた培ＩＩ　ｔａのレクチンにたいする吸着性を検
討した。市販の各種レクチン固定化樹脂を市販セパコー
ルミニカラム（バイオラッド社製）に充填し　１５０　
ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０　ｍＭリン酸緩衝）α
（ｐＨ７，５）で充分に洗浄後、培養液試料を添加し、
同緩衝液にて洗浄し、次いで、各種糖類を含む溶離液で
溶出を行なった。コンカナバリン−Ａ　（Ｃｏｎ−Ａ）
　、および、レンチルレクチンのカラムを用いた場合に
、レクチンカラムへの吸着が認められ、いずれのカラム
においても０．２−α−メチル−ｄ−マンノシド溶液に
より、細胞外０．２ｇ／１．塩化ナトリウム８ｇ／　Ｉ
　、リン酸第１カリウム０．２ｇ／１．リン酸第２ナト
リウム１．１５ｇ／１．　　ｐ　Ｈ７，４）にｏ、ｏｔ
ｚポリエチレングリコールを添加した溶液にて平衡化し
た５ｕｐｅｒｏｓｅ　６　＋　５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２
（ファルマシア社製）を用いろゲルろ過法により分画し
、Ｍ−１ｍ胞でのどん食油の誘起による細胞分化誘導活
性を測定したところ、分子量５０．０００±５．０００
の両分に細胞分化誘導物質の活性が認められた。

５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測
定のため、トリス／グリシン／５ＤＳ（ｐＨ８，３）で
、電気泳動を行なった。標准分子量キット（ファルマシ
ア社製）を用いて分子量検量線を作成し、分画したゲル
からの抽出物のＭ−１細胞のどん食油誘起活性評価によ
り分子量を決定したところ、分子＠　５０．０００±５
．０００の両分に細胞分化誘導物質の活性が認められた
。

等電点測定のために、等電点電気泳動法を以下の方法に
よって行なった。即ち、アト−株式会社製の等電点電気
泳動装置（Ｓ　Ｊ　１０７ＩＥＣ型）を用い、ファルマ
ライト（ファルマシア社製、ｐＨ４〜８）とグリセロー
ルを含む５％ポリアクリルアミド平板ゲルを作成した。

陽極側に０．０４Ｍ　ＤＬ−グルタミン酸、陽極側に０
．２Ｍ　Ｌ−ヒスチジンを使用して、７００ｖて５０分
間の前泳動を行なった。続いて試料を付与し、７００ｖ
で１時間、５００　Ｖ　７１６時間泳動を行なった。泳
動終了後ゲルを２．５　ｍｍ巾で切り出し、次いて各ゲ
ル片を０．１５　Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２　Ｍ
　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）０．２　ｍｌで抽
出し、各抽出液について、Ｍ−１細胞を用いた細胞分化
誘導活性の評価を行なったところ、等電点はｐＨ：６．
５±１．０であった。　次に示す方法により、細胞分化
誘導物質の熱安定性を検討した。培Ｎｉαに、０．０１
χポリエチレングリコールを添加したｐＨ７，４リン酸
緩衝液にて３倍に希釈し、所定の時間、所定の温度にて
加熱した後、Ｍ−１細胞を用いた細胞分化誘導活性の評
価を？テなった。

（以下　余白）表　　　１実験番号　条件　　　Ｍ−１Ｆｃｍ胞とん含率　％（相
対値　％）１　　　　（無処置）５４％（１００％）２　　　５６
℃、１５分　　　　５８％　（１０７％）３　　　　　
　６０分　　　　５９％　（１０９％）４７０°Ｃ１５
分　　　　６３％（１１６％）５　　　　　　６０分　
　　　６１　％　（１１２％）６１００℃　１５分　　
　　２８％　（５２％）ジスルフィド結合の還元剤によ
る影響を検討するために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ
）　、又は、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を
、培養７α中に加え、３７℃で、４時間反応させた。反
応後、Ｍ−１細胞に対するとん食油誘起活性を測定した
。

表　　　　２実験番号　条件　　　Ｍ−１細胞とん食出　％（相対値
　（Ｘ、）１　　　　（貴処理）４４％（１００％）２　　２　Ｍ
　Ｅ　Ｏ，１％３８　％　（８６％）３１％　　　３６
％（８２％）４　　　ＤＴＴ５ｍＭ　　　　３２％（７３％）５　　
　　　５０　ｍＭ　　　　１０％（２３％）ｐＨ安定性
を次に示す。細胞分化誘導物質を含む培養Ｑ夜に、４倍
辱のｐ　Ｈ２，４、７，３、９、１０の各種援衝液を添
加し、２４時間、３７℃に加温した後、ｐ　Ｈを中性に
もどし、Ｍ−１細胞に対する細胞分化誘導活性を測定し
た。ｐＨ２〜１００範囲のいずれにおいても活性の低下
は認められなかった。

ついで、蛋白分解酵素に対する安定性を検討した。

細胞分化誘導物Ｎを含む培養ｉαに蛋白分解酵素トリプ
シン、または、プロナーセーＥ　　（２００ｖＩ８．位
）を添加し、３７°Ｃにて、３時間反応させた。反応後
、Ｓト＋傭胞に対する細胞分化誘導活性を測定したが、
いずれの条件においても、活性の低下は認められなかっ
た。−ヒ記実験に０．１％ＳＤＳを添加したことジノ外
は、同一の条件にて、蛋白分解酵素の効果を検討したと
ころ、０．１％ＳＤＳの添加時のプロナーセーＥにより
、細胞分化誘導活性が完全に消失した。

ざら：こ、ヒト白血病細胞に対する生理作用を確認すへ
く、牛胎児血清を１０％含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０
培地にヒト単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）、ヒト前骨
髄性白血病、ＩＨｊａ　（ＨＬ−６０）　ａ　３７℃、
Ｋ　酸ガス培養器中でそれぞれ培覆し、増殖ｖ■にある
畑を９６穴プレートに入れ、３７°Ｃ，５％炭酸ガス混
合空気の下で、３日間培両した。０．２％ニトロブル−
テトラソＩＪウム（ＮＢＴ、ジグマン土）の溶１ｆｆ（
０，２Ｂ　ｇ／＋ｎｌ　Ｔ　Ｐ　Ａ含有培地）　　１０
０μｌを加えて、更に４５分間培養下後２顕微鏡下で観
察した。青く沈着した色素を有するＮＢＴ還元能陽性細
胞か、Ｔ　ＨＰ−１細胞において２９％、ＨＬ−６０細
胞において２１％に観察された。

実施例２ヒト急性単球性白血病細胞ＴＨＰ−１細胞を、１０％の
牛胎児血清、５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０μｍ
＜１ｍ　ｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−
１６４０培地にて、細胞密度６Ｘ１０５個／ｍｌ　とな
るように、細胞浮遊ｉｌｌを調製し、その１０…１を　
１攻の［１培養用プラスチツク製ペトリデイツシユに植
え込み、ＴＰＡを　１００　ｎｇ／ｍｌとなるように添
加し、３７°Ｃ１５％炭酸ガス含有空気中で２４時間培
養した。その１輸で、培養ｉαを除去し、Ｔ　Ｐ　、Ａ
、を含まず、下表に示すＭφ活性化物質（ビタミンＡ酸
（ＲＡ）、ＬＰＳ、サクシニル化ＣｏｎＡ　（Ｓ−Ｃｏ
ｎＡ）　）をした後、Ｌ、清中の細胞分化誘導物質の活
性を測定した。細胞分化誘導物質の活性が２０単位／ｍ
１以上であった培養上清について、Ｃａｎ−Ａカラムへ
の吸着処理およびα−メチル−ｄ−マンノシド溶液によ
る脱着処理により得られる活性画分は、分子量約５０．
０００　（Ｓ　Ｄ　Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動法
）で、ｐＨ２〜ｌＯでの処理により失活せずに、７０℃
の加熱処理においても、その活性を保持していた。

表　　　３実験番号　Ｍφ活性化物質　細胞分化誘導物質（比較例
）　　（なし）　　　　　　　７単位／ｍｌｌ　　　　
ＲＡ　　　Ｏ，Ｉｌｚｇ／ｍｌ　　　３４２　　　　Ｒ
Ａ　　　　　１μｇ／ｍｌ　　　（３２３ＲＡ　　　Ｏ
，１μｇ／ｍｌ　　　４９Ｌ　Ｐ　Ｓ　　　１０ｔｔ　
ｇ／ｍ１４　　　　ＬＰＳ　　　ＩＯμｇ／ｍｌ　　　２７（比
較例）Ｓ−ＣｏｎＡ　　２０μｇ／ｍｌ　　　４実施例
３ヒト急性前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０細胞を用い、Ｎ
１φ用細胞への分化誘導剤として、表−４；こ示す、１
２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテー
ト（ＴＰＡ）、ホルボール−１２，１３−ジデカノエー
ト（ＰＤＤ）、メゼレイン（ＭＥＺ）、Ｍφ活性化物質
として、１μｇ／ｍｌのビタミンＡ酸を用いること以外
は、実施η１１２と同様に培養を行ない、培養−ヒ清を
得た。

培養上清中の細胞分化誘導物質の活性を測定し、その活
性が認められろ培養上清について以下の検討を行なった
。Ｃｏｎ−Ａカラムへの吸着およびα−メチルーｄ−マ
ンノシド溶液による脱着処理により得られろ活性両分は
、その分子債は約５０．０００（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動法）であり、７０°Ｃての加熱処理にお
いても、その活性を失わなかった。

（以下　余白）表　　　４実験番号　分化誘導剤　　細胞分化誘導物質（比較例）
　　（なし）　　　　　　　５　単位／ｍｌＩ　　　　
ＴＰＡ　　ｌｏｎｇ／ｍｌ　　　　４１２　　　　Ｔ　
Ｐ　Ａ　　１１００ｎ／ｍｌ　　　　４８３　　　　Ｔ
　Ｐ　Ａ　Ｉ０００ｎｇ／ｍｌ　　　　５７４　　　　
Ｐ　Ｄ　Ｄ　　１１０００ｎ／ｍｌ　　　　４３５　　
　　Ｍ　Ｅ　Ｚ　　ｌｏ００ｎｇ／ｍｌ　　　　２９実
施例４ヘパリン１．０００　巣位を添加した健常人末梢血２０
ｍ１を２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｐａｑｕｅｉ
ｉ　（フフルマεア社）に上、贋し、８００　ｒｐｍに
て、３０分間、比重遠心を行ない、中間層より、単核球
を採取した。

該単核球を４°Ｃに冷却したｌＯ％牛脂児血清含有ＲＰ
τＶＴ　［−１６４０培地で一晩前処理したＭｉ繊培養
用ペトリディッシュ（直径８ｃｍ　）　１０枚に植えつ
けた。

該ディツシュを、３７°Ｃ１５％炭酸カス含有空気中で
３時間培養した。無血清ＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地に
て、洗浄し、非付着性細胞を除去した。ディツク１１枚
当たり平均５ＸＩＯ個（ｌＸｌ０’個／ｃｍ２）の＠Ｈ
胞が得られた。得られた細胞の、９０％以上が単球であ
った。

該ディツシュを、最終濃度として、ビタミンＡ酸１１１
ｇ／ｍｌ、ＬＰＳ　　ｌ１１ｇ／ｍｌを添加した無血清
ＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地（ビタミン・アミノ酸強化
）１５ｍ１にて置換し、３７℃、５％炭酸ガス含有空気
中で、３日問培養した。

３日後、培養液を回収し、３．０００　ｒｐｍにて遠心
処理して、細胞層を除く。得られた培養液を、マウスＭ
−１細胞のとん食油誘起活性を測定したところ、４４単
位／ｍｌであった。

以上詳細に説明した、本発明の紹胞分化講導物一

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の特性を有する蛋白性の生理活性物質であつ
て、ａ）分子量５０，０００±５，０００（ゲルろ過法）５
０，０００±５，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動法）ｂ）等電点６．５±１．０（等電点電気泳動法）ｃ）熱
安定性７０℃にて失活しない白血病細胞に対して細胞分化誘導作用を有するヒト由来
の生理活性物質
（２）ヒト由来のマクロファージ様細胞をマクロファー
ジ活性化物質の存在下に培養することを特徴とする、細
胞分化誘導活性を有するヒト由来生理活性物質の生産方
法