PL211789B1 - Kompozycje zawierające hemoglobinę płodową i endotoksynę bakteryjną oraz opcjonalnie, dodatkowe składniki wątroby płodowej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej endotoksynę lub jej fragment o aktywności endotoksycznej, hemoglobinę płodową lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów i, opcjonalnie, dodatkowy związek(-i) oraz, dowolnie, zaróbkę; albo zawierającej endotoksynę lub jej fragment o aktywności endotoksycznej, hemoglobinę płodową lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinację(-e) jej łańcuchów, opcjonalnie dodatkowy związek(-i) oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz/lub rozcieńczalnik oraz/lub zaróbkę, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, stwierdzono zaskakująco, że endotoksyna bakteryjna i hemoglobina płodowa wykazują wyraźną synergistycznie, biomedyczną aktywność. Kompozycja według wynalazku znajduje różnorodne zastosowania, włączając pobudzanie układu immunologicznego, zapobieganie i/lub leczenie raka, infekcji, takich jak infekcje wirusowe i/lub alergie oraz odwrócenie związanej z wiekiem nierównowagi odpornościowej.

W walce ludzkoś ci z chorobami, takimi jak rak lub poważ ne infekcje - i również z procesem starzenia - przez dziesiątki lat jako środek zapobiegawczy lub leczniczy propagowano przeniesienie płodowych narządów, tkanek lub komórek. Historia płodowej „terapii komórkowej” jest bogata w anegdoty opisujące powrót do zdrowia i donoszące o efektach odmładzających [Lambert, G., 1959; Schmid, F., 1963]. Efekty medyczne, mimo że często atakowane, przez wiele lat oceniane były jedynie pod kątem kryteriów subiektywnych a czynniki odpowiadające za aktywność biologiczną tkanki płodowej pozostawały niezidentyfikowane. Postulowano, że aktywność medyczna składników pochodzących z tkanki płodowej wynika z immunogennych właściwości antygenów onkopłodowych, reagujących krzyżowo z pewnymi składnikami błon [H.Rohrer, 1987], w ten sposób podkreślających ksenogenność wstrzykniętego materiału (owca vs. człowiek) [Coggin, J.H. i wsp. 1971; Renner, H., 1977]. Ekstrakty tkanek płodowych wykazywały przez to korzystny efekt medyczny i chwilami były szczególnie polecane w leczeniu lub zapobieganiu raka i pewnych infekcji. Aktywne medycznie składniki takich ekstraktów tkanek płodowych, mimo znacznego zainteresowania w tej dziedzinie, pozostawały do tej pory nieokreślone. Problemy z rejestracją takich kompozycji są oczywiste. Od ponad stulecia propagowano leczenie raka poprzez wstrzyknięcie żywych i/lub zabitych ciepłem bakterii [Coley, W. 1893]. Około 50 lat temu wykazano, że efekt powodujący nekrozę komórek rakowych wynika z działania endotoksyny bakteryjnej. Wagowo, endotoksyna bakteryjna (lipopolisacharyd, LPS) jest najbardziej aktywnym środkiem przeciwrakowym, fakt, ten podkreślany jest raz po raz na podstawie wyników badań naukowych prowadzonych na tych liniach. Jednakże, niepożądane skutki uboczne endotoksyny nie pozwalają na szersze, bardziej ogólne zastosowanie tej terapii. Jak dobrze wiadomo, podejmowano liczne, dalsze próby pokonania tych chorób lub skutecznego zantagonizowania zjawiska starzenia się. Mimo tego, rak - jak infekcje, jak również choroby alergiczne i/lub starzenie się - pozostają poważnymi problemami dzisiejszej ludzkości, ponieważ wiele z tych prób nie powiodło się lub nie przyniosły one oczekiwanych rezultatów. Zatem, problem techniczny zawarty w niniejszym wynalazku polegał na znalezieniu środków, które mogłyby zostać skutecznie wykorzystane w walce przeciwko wspomnianym chorobom lub przeciwko procesowi starzenia się. Rozwiązanie wspomnianego problemu technicznego osiągnięto poprzez dostarczenie rozwiązań opisanych w zastrzeżeniach.

Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, zawierającej endotoksynę lub jej fragment o aktywności endotoksycznej, hemoglobinę płodową lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów i, opcjonalnie, dodatkowy związek(-i) oraz, dowolnie, zaróbkę; albo zawierającej endotoksynę lub jej fragment o aktywności endotoksycznej, hemoglobinę płodową lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinację(-e) jej łańcuchów, opcjonalnie dodatkowy związek(-i) oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz/lub rozcieńczalnik oraz/lub zaróbkę, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

Szczegółowo, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej (lub „produktu medycznego”) składającej się z endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i opcjonalnie, dodatkowego związku(-ów) i dowolnie, zaróbki; lub też obejmującej endotoksynę lub jej fragment o aktywności endotoksycznej, hemoglobinę płodową lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinację(-e) jej łańcuchów, opcjonalnie, dodatkowy związek(-i) i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub rozcieńczalnik i/lub zaróbkę,

PL 211 789 B1 przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

Stosowany w niniejszym wynalazku termin „kompozycja farmaceutyczna” (używany zamiennie z terminem „produkt medyczny”) posiada ogólnie szersze znaczenie niż przyję te w dziedzinie. Korzystnie, oznacza jakąkolwiek substancję lub kombinację substancji (jak powyżej), dowolnie, w kombinacji z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami, rozcieńczalnikami i/lub zaróbkami, przeznaczoną do leczenia lub zapobiegania chorobom ludzi lub zwierząt. Innymi słowy, termin ten określa jakakolwiek substancję lub kombinację substancji (jak powyżej), która może być podawana ludziom lub zwierzętom w celu dokonania diagnozy medycznej lub przywrócenia, poprawienia lub zmodyfikowania funkcji fizjologicznych u ludzi i zwierząt. Korzystnie, lecz nie niezbędnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest sprzedawana/wymaga autoryzacji na rynku. Innymi słowy, wynalazek obejmuje również kompozycje sprzedawane OTC z przeznaczeniem do przywrócenia, poprawienia lub zmodyfikowania funkcji fizjologicznych u ludzi i zwierząt lub do zapobiegania, leczenia czy też modulacji jakiejkolwiek choroby, takiej jak wymieniona w niniejszym tekście, lub do poprawiania dobrego samopoczucia czy też jako przeciwwaga zjawiska/przyczyn starzenia się (patrz również poniżej).

Termin „endotoksyna” (lipopolisacharyd, LPS) odnosi się do związków o aktywności biologicznej, produkowanych, ogólnie, przez bakterie Gram-ujemne i stanowiących główny składnik zewnętrznej błony bakteryjnej, z której mogą być uwalniane biologicznie lub chemicznie. Strukturę endotoksyn odzwierciedla ogólny schemat przedstawiony na Fig. 1 przykładowo dla Salmonella enterica. Endotoksyny są cząsteczkami amfofilowymi, składającymi się ze składnika lipidowego, zwanego lipidem A i związanego kowalencyjnie polisacharydu. Ze względu na genetyczne, biosyntetyczne, biologiczne i strukturalne wł a ściwoś ci, fragment wę glowodanowy moż na dalej podzielić na poksymalny obszar rdzenia lipidu A i O-specyficzny łańcuch boczny. Pozostaje oczywistym według wynalazku, że wykorzystana w kompozycji według wynalazku endotoksyna, może pochodzić z jakichkolwiek Gram-ujemnych bakterii posiadających endotoksyny. W jednej z korzystnych realizacji, wspomniana endotoksyna pochodzi z Escherichia coli, Ogólnie, O-specyficzne łańcuchy są heteropolimerami, utworzonymi z powtarzających się jednostek oligosacharydowych (u Enterobakterii do 50), które składają się z od dwóch do oś miu monomerów. Obszar rdzenia LPS składa się z kompleksu oligosacharydowego, i jeś li chodzi o jego strukturę , wykazuje mniejszą zmienność w porównaniu z O-specyficznym ł a ń cuchem [Zahringer, U. i wsp. 1994]. U Enterobakterii i kilku innych rodzin, można dokonać zróżnicowania między obszarem zewnętrznego rdzenia z dominującymi heksozami piranozydowymi, takimi jak D-glukoza, D-galaktoza, 2-amino-2-deoksy-D-glukoza lub 2-amino-2-deoksy-D-galaktoza a obszarem rdzenia wewnętrznego. U wszystkich bakterii Gram-ujemnych, ten drugi zawiera kwas 3-deoksy-D-manno-okta-2-ulosonowy, Kdo) i często L-glicero-D-manno-heptozę (Hep).

Strukturalnie, składnik lipidu A tworzy najbardziej jednorodną część LPS. Może być ona rozdzielona od fragmentu węglowodanowego poprzez lekko kwaśną hydrolizę prowadzącą do cięcia wiązania glikozydowego między Kdo a lipidem A, przez co, staje się on bardziej dostępny w badaniach szczegółowo wyjaśniających jego strukturę. Próby lipidu A uzyskane z E.coli okazały się posiadać aktywność endotoksyczną in vitro i w modelach zwierzęcych jako LPS, na podstawie czego wykazano, że lipid A przejawia główną aktywność endotoksyczną LPS. Wykazano to jednoznacznie na drodze syntezy chemicznej lipidu A z E.coli i przedstawienia pełnej aktywności biologicznej syntetycznego produktu. Na Figurze 2 przedstawiono strukturę chemiczną lipidu A z LPS Escherichia coli w postaci częściowo monofosforylowej struktury (MPLA). Dojrzały lipid A zawiera ponadto grupę fosforylową w pozycji glikozydacji redukującej reszty glukozaminy. Termin LPS obejmuje formę S i formę R LPS oraz podstruktury, takie jak lipid A i jego częściowe struktury.

Termin „fragment o aktywności endotoksycznej” endotoksyny odnosi się do fragmentów, które wykazują przynajmniej 50%, korzystnie przynajmniej 75%, bardziej korzystnie przynajmniej 90%, tak jak przynajmniej 95% i najbardziej korzystnie przynajmniej 100% aktywności endotoksycznej naturalnie występującej endotoksyny. Korzystnie, gdy wspomniany fragment o aktywności endotoksycznej jest składnikiem lipidu A. Najkorzystniej, fragment o aktywności endotoksycznej jest monofosforylowanym lipidem A (MPLA), opisanym poniżej oraz w załączonych przykładach.

Hemoglobina (Hb) odnosi się w stanie techniki do hemoproteiny o masie cząsteczkowej około 64,500 Da, którego główną funkcją biologiczną jest transport tlenu (O2). Hb dorosłych (HbA) składa się z 4 polipeptydów (dwa łańcuchy α i dwa β) i jednej grupy hemowej. Hb płodowa (HbF) zawiera dwa łańcuchy α i dwa łańcuchy γ. HbA jest syntetyzowana w szpiku kostnym, natomiast HbF głównie produkowana jest w wątrobie i śledzionie płodu. W niniejszym wynalazku termin hemoglobina płodowa

PL 211 789 B1 określa postaci tetrameryczne HbF, jak również HbF bez hemu. Kombinacje łańcuchów obejmują dimery α-, γ. Monomery obejmują α- i γ-monomery.

Po rozpoczęciu doświadczeń, które doprowadziły do niniejszego wynalazku, stwierdzono zaskakująco, że aktywność biologiczna fragmentów pochodzących z ekstraktu płodowej wątroby (owcy) (FSLE) - jeśli chodzi o nazewnictwo, patrz Przykład 1 - związana jest z obecnością małych ilości bakteryjnej endotoksyny, rzędu 10 ng/g (100 EU/g) z FSLE. Jeżeli płodowy ekstrakt z wątroby owcy poddawano frakcjonowaniu na Sephadex G100, jak opisano w Przykładzie 2, małe ilości endotoksyny gromadziły się w dwóch frakcjach, zwanych CLP1b i CLP2p, które okazały się najaktywniejszymi preparatami w zastosowanej analizie biologicznej.

Porównawcza analiza biologiczna, której poddano oczyszczoną endotoksynę wykazuje obecność w CLP1b i CLP2p czynnika zdolnego do modyfikowania aktywności endotoksyny. Czynnik taki został zidentyfikowany jako hemoglobina płodowa, a w szczególności jej składnik, jakim jest łańcuch γ. Stwierdzono następnie, że endotoksyna i hemoglobina płodowa oddziałują między sobą, wykazując synergistyczną, tj. maksymalną aktywność biologiczną. W badaniach porównawczych wykazano, że hemoglobina płodowa i podjednostki zawierające łańcuch y są znacznie bardziej aktywne biologicznie, niż hemoglobina dorosłych i podstruktury zawierające łańcuch β (patrz, przykład 8 i 9). Stwierdzono także, ze ekstrakt wątroby płodowej, działa ponadto korzystnie na endotoksynę i hemoglobinę, możliwie w odniesieniu do ich farmakologicznej tolerancji przez organizm lub czasu trwania ich aktywności in vivo, tj. ich dynamiki biologicznej. W związku z tym, ekstrakt z tkanki płodowej (wątroby) poddany był intensywnym badaniom pod kątem takich dodatkowych czynników aktywności biologicznej, prawdopodobnie o charakterze polipeptydowym (patrz, analiza białka ekstraktu wątroby płodowej w Przykładach 3.3.2 i Tabela 4).

Analizowano pod względem aktywności biologicznej różne kombinacje endotoksyny i FSLE, badano aktywności takie jak aktywacja makrofagów, cytostaza nowotworu i cytotoksyczność wobec nowotworu, dynamika produkcji cytokin, zjawisko przeciwdziałające starzeniu się, itp. również w różnych układach ludzkich (patrz, Przykład 8,12, 13, 15).

Następnie, stwierdzono, że takie pochodzące z FSLE składniki wykazywały aktywność biologiczną (u myszy) również po podaniu doustnym. Zatem, zastosowanie doustne odpowiedniej kombinacji tych, tak różnych związków, o aktywności biologicznej, takich jak endotoksyny, hemoglobiny i FSLE (polipeptydy) może umożliwić szersze, bardziej skuteczne zastosowanie medyczne, na przykład, w dziedzinie raka, infekcji, alergii i związanym z procesem starzenia się brakiem równowagi odpornościowej.

Składniki kompozycji (farmaceutycznej) według wynalazku mogą być otrzymane w wyniku różnych metod produkcji, przy czym poniższe opcje nie wyłączają innych procesów, lecz odnoszą się do korzystnych realizacji: czy na drodze ekstrakcji z wątroby płodowej, składniki aktywne są tam obecne ze względu na biologicznie nagromadzone w płodowej tkance wątrobowej; czy na drodze preparacji chemicznej z dostępnych źródeł, takich jak endotoksyny z hodowli Gram-ujemnych bakterii lub hemoglobina z krwi z pępowiny; pojedyncze łańcuchy, takie jak jej łańcuch γ, jak również kombinacje łańcuchów mogą być również otrzymane za pomocą procedur technologii genetycznych. Zatem, składniki preparatu zawarte w kompozycji według wynalazku mogą być uzyskane ze źródeł naturalnych, poprzez techniki rekombinowanego DNA/syntezę biochemiczną lub na drodze syntezy chemicznej, jak również jakichkolwiek kombinacji powyższych. Po syntezie może dojść do interakcji składników preparatu.

Jeśli chodzi o techniki rekombinacyjne produkcji, kwas nukleinowy kodujący wspomniany (poli)peptyd może być wykorzystany w konwencjonalnym procesie ekspresji, przy użyciu różnych komórek gospodarza i wektorów ekspresji (patrz, np., Sambrook i wsp., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual:, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989, „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2001).

Ogólnie, w odniesieniu do wszystkich realizacji wynalazku, wspomniana komórka gospodarza zastosowana do produkcji rekombinowanej może być komórką prokariotyczną lub eukariotyczną. Polinukleotyd lub wektor, obecny w komórce gospodarza może być włączony do genomu komórki gospodarza lub może pozostać utrzymany pozachromosomalnie.

Przyjęto, że termin „prokariotyczna” obejmuje wszystkie bakterie, które mogą być transformowane lub transfekowane cząsteczką kwasu nukleinowego lub odnoszącym się do powyższego wektorem. Gospodarze prokariotyczni mogą obejmować bakterie Gram-ujemne, jak i Gram-dodatnie, na przykład, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens i Bacillus subtilis. Uważa się,

PL 211 789 B1 że termin „eukariotyczna” obejmuje komórki drożdży z rodzaju Saccharomyces, w szczególności należących do gatunków S.cerevisiae, roślin wyższych, grzybów, owadów i korzystnie ssaków, takie jak komórki ludzkie. Ponadto, zwierzęta transgeniczne, korzystnie ssaki, zawierające wspomniane komórki gospodarza mogą być wykorzystane do produkcji na wysoką skalę składników białkopodobnych, zawartych w kompozycji według wynalazku.

Wektorami mogą być szczególnie plazmidy, kosmidy, wirusy i bakteriofagi konwencjonalnie stosowane w inżynierii genetycznej, które zawierają polinukleotyd według wynalazku. Korzystnie, wspomniany wektor jest wektorem ekspresji i/lub wektorem przenoszącym gen lub ukierunkowanym na gen. Wektory ekspresji pochodzące z wirusów, takich jak retro wirusy, wirus krowianki, adenopokrewne wirusy, wirusy opryszczki lub wirus brodawczaka bydła mogą zostać zastosowane do dostarczenia polinukleotydów lub wektora do określonej populacji komórek. Do otrzymania rekombinowanych wektorów wirusowych mogą być użyte dobrze znane specjalistom w dziedzinie sposoby, patrz, na przykład, techniki opisane w Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. oraz Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternatywnie, w celu dostarczenia do komórki docelowej, polinukleotydy i wektory mogą być związane w liposomach. Wektory zawierające polinukleotydy, kodujące wspomniane polipeptydy mogą być przeniesione do komórki gospodarza za pomocą dobrze znanych metod, które w znacznym stopniu zależą od rodzaju komórki gospodarza. Na przykład, transfekcja chlorkiem wapnia lub transfekcja z wykorzystaniem DEAE-Dekstranu lub elektroporacja mogą być zastosowane do odmiennych komórek gospodarzy, patrz, Sambrook, jak wyżej.

Takie wektory mogą zawierać inne geny, takie jak geny markerowe, umożliwiające selekcję wspomnianego wektora w odpowiednich komórkach gospodarza i w odpowiednich warunkach. Korzystnie, sekwencja kodująca wspomniany polipeptyd jest operatywnie połączona z sekwencją kontroli ekspresji, powalającą na ekspresję w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych. Ekspresja wspomnianego polinukleotydu obejmuje transkrypcję polinukleotydu do odpowiedniego do translacji mRNA. Elementy regulatorowe zapewniające ekspresję w komórkach eukariotycznych, korzystnie w komórkach ssaczych, są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Obejmują one zazwyczaj sekwencje regulatorowe, zapewniające rozpoczęcie transkrypcji i, dowolnie, sekwencję sygnałową poli-A, zapewniającą zakończenie transkrypcji i stabilizację transkryptu, i/lub intron dodatkowo wzmacniający ekspresję wspomnianego polinukleotydu. Dodatkowe elementy regulacyjne mogą obejmować enhancery (wzmacniacze) transkrypcyjne, jak i translacyjne, oraz/lub naturalnie-związane lub heterologiczne regiony promotorowe. Możliwe elementy regulatorowe pozwalające na ekspresję w komórkach prokariotycznego gospodarza obejmują, np., promotor PL, lac, trp lub tac w E.coli, przykładami elementów regulatorowych pozwalających na ekspresję w komórkach eukariotycznego gospodarza jest promotor AOX1 lub GAL1 w drożdżach lub promotor CMV, SV40, RSV (wirusa mięsaka Rous), enhancer CMV, enhancer SV40 lub intron globiny w ssaczych i innych komórkach zwierzęcych. Oprócz elementów odpowiedzialnych za rozpoczęcie transkrypcji, takie elementy regulatorowe mogą również obejmować sygnały zakończenia transkrypcji, takie jak miejsce SV40-polyA lub tk-poly-A, położone poniżej polinukleotydu. Ponadto, zależnie od zastosowanego systemu ekspresji, do sekwencji kodującej polinukleotydu kodującej polipeptyd zawarty w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, mogą być dodane dobrze znane w dziedzinie sekwencje liderowe, zdolne do ukierunkowania polipeptydu do przedziałów komórkowych lub do wydzielenia go do podłoża. Sekwencja(-e) liderowa jest (są) składana w odpowiedniej fazie z translacją, sekwencjami inicjującymi i kończącymi, i korzystnie, sekwencja liderowa jest zdolna do ukierunkowania wydzielania poddanego translacji białka lub jego części, do przestrzeni periplazmatycznej lub podłoża pozakomórkowego. Dowolnie, sekwencja heterologiczna może kodować białko fuzyjne, obejmujące identyfikujący C- lub N-zakończony peptyd nadający pożądane właściwości, np. stabilizujący lub ułatwiający oczyszczanie ekspresjonowanego produktu rekombinacji. W tym kontekście, w stanie techniki znane są odpowiednie wektory ekspresji, takie jak Okaya-ma-Berg cDNA wektor ekspresji pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3, system klonowania Echo^TM (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL) lub pRevTet-On/pRevTet-Off lub pCI (Promega).

Korzystnie, sekwencje kontroli ekspresji będą układami promotora eukariotycznego w wektorach zdolnych do transformacji lub transfekcji komórek gospodarza eukariotycznego, lecz mogą być także użyte sekwencje kontrolne dla gospodarzy prokariotycznych.

Składnik hemoglobinowy (włączając pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinację(-e) łańcuchów) według wynalazku może być otrzymany z użyciem metody obejmującej hodowlę wspomnianej komórki

PL 211 789 B1 gospodarza w odpowiednich warunkach, które umożliwiają syntezę wspomnianego (poli)peptydu (tj. peptydu do 30 aminokwasów lub polipeptydu o więcej niż 30 aminokwasach) i odzyskanie i/lub izolację wspomnianego (poli)peptydu, z supernatantu lub z masy komórki.

W szczególności, transformowany/transfekowany gospodarz moż e wzrastać w fermentorach i być hodowanym zgodnie z technikami znanymi w dziedzinie w celu osią gnię cia optymalnego wzrostu komórki. Składnik hemoglobinowy i dowolnie, inne białka mogą być następnie wyizolowane z podłoża wzrostowego, lizatu komórkowego lub frakcji membran komórkowych. Po ekspresji, wspomniane białko może być oczyszczane zgodnie ze standardowymi procedurami w stanie techniki, włączając wytrącanie siarczanem amonu, kolumny powinowactwa, kolumny chromatograficzne, elektroforezę żelową i tym podobne; patrz, Scopes, „Protein purification”, Springer-Verlag, N.Y. (1982). Do zastosowania farmaceutycznego preferowane są zasadniczo czyste polipeptydy, o przynajmniej około 90 do 95% homogenności i bardziej korzystnymi są od 98% do 99% lub o większej homogenności.

(Częściowo) oczyszczone składniki mogą być wymieszane w jakichkolwiek pożądanych proporcjach (wagowych). W celu utworzenia kompozycji według wynalazku, czysta endotoksyna i czysta hemoglobina płodowa mogą być również dodane w określonych ilościach do danej ilości ekstraktu wątroby płodowej (FSLE).

Dawką wyjściową do i.m. wstrzyknięcia kompozycji farmaceutycznej, jak zilustrowano dla FSLE, może być 680 mg (zdefiniowane jako jedna jednostka), z której w przybliżeniu 300 mg stanowią białka, w przybliżeniu 320 mg jest materiałem niebiałkopodobnym a 60 mg stanowi chlorek sodu. Jedna jednostka tego materiału zawiera w przybliżeniu 6 ng równoważników LPS. Z 680 mg FSLE, po frakcjonowaniu na Sephadex G-100, uzyskuje się w przybliżeniu 20 mg CLP1b/2p (~3%). W analizie Limulus-Test (LAL) materiał ten daje zawartość w przybliżeniu 2 μg (2x10⁴ EU) równoważników LPS dla 20 mg, które są częścią standardowego zastrzyku i.m.

Maksymalna tolerowana dawka (MTD) wyizolowanego LPS (i.v.) u ludzi mieści się całościowo w zakresie od 0.05 do 0.1 μg (w przybliżeniu 1 ng/kg masy ciała). Odpowiednia jednostka FSLE z 620 mg składników organicznych, odpowiednio, zawiera średnio 20-40 MTD (i.v.) LPS, które są wstrzykiwane (i.m.) bez subiektywnych skutków ubocznych.

Zatem, zależnie od sposobu podawania, jednostka iniekcyjna może zawierać

10-100 ng (i.v.) lub 0.2-2 μg (i.m., s.c. lub i.d.) lub do 1 mg (doustnie) równoważników LPS,

0.001-10 mg (lub więcej) hemoglobiny płodowej lub częściowych struktur, takich jak korzystnie zawierających łańcuch γ i ~ 0.1-500 mg (lub więcej) (gliko)-protein wątroby płodowej.

Kompozycja według niniejszego wynalazku może ponadto zawierać dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i/lub rozcieńczalnik i/lub zaróbkę. Przykłady odpowiednich nośników farmaceutycznych są dobrze znane w dziedzinie i obejmują roztwory izotoniczne buforowanych fosforanem roztworów soli fizjologicznej, wodę, emulsje, takie jak emulsje olej/woda, różne rodzaje czynników nawilżających, roztwory sterylne itp. Kompozycje zawierające takie nośniki mogą być otrzymane za pomocą dobrze znanych metod konwencjonalnych. Formulacje mogą być płynami, żelami, syropami, zawiesinami, tabletkami, pigułkami, kapsułkami lub drażetkami, zależnie od drogi podawania. Tego typu kompozycje mogą być podawane pacjentowi w odpowiednich dawkach. Podawanie odpowiedniej kompozycji może przebiegać różnymi sposobami, np., dożylnie, podskórnie, domięśniowo, domiejscowo, przezskórnie, donosowo lub doustnie. Reżim podawania będzie określony przez opiekującego się lekarza i czynniki kliniczne. Jak dobrze wiadomo w dziedzinie medycyny, dawki dla każdego pacjenta zależą od wielu czynników, włączając szczególny związek, który ma być podawany: ogólny stan zdrowia pacjenta, wielkość, powierzchnię ciała, wiek, płeć, czas i sposób podawania i inne, jednocześnie podawane leki. Jak wyżej podkreślono, zależnie od drogi podawania, typowa dawka dla człowieka może, na przykład, odpowiadać od 0.01 do 1000 μg równoważników LPS. Jednakże, przewiduje się też dawki niższe lub wyższe od tego przykładowego przedziału, szczególnie biorąc pod uwagę wymienione wyżej czynniki, również w stosunku do podawania doustnego. Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku formułowana jest zgodnie z prawem narodowym i wymaganymi regulacjami według standardów GMP. Przykłady zaróbek są również dobrze znane w dziedzinie i odpowiadają jakiejkolwiek mniej więcej obojętnej substancji, która dodana jest do recepty w celu nadania odpowiedniej konsystencji lub postaci lekowi. Przykłady zarobek obejmują, lecz nie ograniczają się do laktozy, cukrozy, sorbitolu, manitu, skrobii, amylopektyny, składników celulozowych i cukrowych.

Jak podkreślono wyżej, w zgodzie z niniejszym wynalazkiem, w zaskakujący sposób stwierdzono, że preparat zawierający endotoksynę, hemoglobinę płodową lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub

PL 211 789 B1 kombinację(-e) jej łańcuchów, tak jak hemoglobina bez hemu i opcjonalnie, dodatkowe składniki ekstraktu wątroby płodowej, może wywierać korzystny biologiczny efekt, w szczególności w walce przeciwko rakowi, infekcjom patogenami, w szczególności wirusowym, alergiom i procesowi starzenia się. Niniejszy wynalazek dostarcza zatem, nową koncepcję, opartą na stwierdzeniu, że fizjologiczne i in vivo oddział ywanie pomi ę dzy endotoksyna, hemoglobiną , obecnymi w owczej wą trobie pł odowej prowadzi do uzyskania widocznych korzyści, włączając inhibicję wzrostu raka i aktywację układu immunologicznego. W konsekwencji, stwierdzono według wynalazku, że takie preparaty, po ich wyizolowaniu, korzystnie z płodowej tkanki wątrobowej lub po wyprodukowaniu, korzystnie za pomocą metod chemicznych lub technik biologii molekularnej, gdy zastosowane u dorosłych ssaków, włączając ludzi, również wywierają terapeutycznie użyteczne efekty, (patrz, Przykład 8, 12, 13, 15). Jak opisano w poniższym rozdziale Przykłady, okazało się możliwe wzbogacenie takich preparatów z ekstraktów homogenatów wątroby płodowej i wykazano, że aktywują one silnie makrofagi, włączając cytotoksyczność przeciwrakową, również w układach ludzkich komórek, inhibitują wzrost raka i odwracają związany z wiekiem stan odpornościowy, do odpowiadającego młodym osobnikom. Preparaty te okazały się odpowiadać za wiele korzystnych efektów medycznych, wykazywanych przez tkankę wątroby płodowej, co wykorzystano w tak zwanej „terapii komórkowej”. Ponadto, kompozycja według wynalazku może być zastosowana jako narzędzie do blokowania niepożądanych reakcji naświetlania, na przykład, jako adiuwanty w celu uniknięcia lub zredukowania niekorzystnych skutków ubocznych leczenia raka wywołanych naświetlaniem. We wszystkich powyższych zastosowaniach, należy zauważyć, że wykazano lub oczekiwano, że kompozycja według wynalazku jest dobrze tolerowana przez odpowiednich pacjentów. Jak można wywnioskować z powyższego opisu, kompozycja według niniejszego wynalazku może być z korzyścią zastosowana w leczeniu lub zapobieganiu szerokiej gamy różnych chorób, również jako lek przeciwko starzeniu. Mimo że różne medyczne zastosowania okazały się z pewnością zaskakujące, nawet bardziej zdumiewające, jest to, że kompozycja według wynalazku wykazuje tak heterogenny układ korzystnych aktywności. Stwierdzenia te są zaskakujące, mimo faktu, że aktywność biologiczna hemoglobiny dorosłych lub jej pochodnych była już wcześniej badana.

Wykazano, że hemoglobina dorosłych stanowi adiuwant bakteryjnego wzrostu [Dunn i wsp. 1983] do aktywowania układu dopełniacza [Kaca, W. 1995] i indukuje TNFa w monocytach [Carillo, E., 2002]. Stwierdzono również, że hemoglobina dorosłych oddziałuje z endotoksyną [Roth RJ i Levin J, 1999]. W szczególności, odnotowano zwiększoną toksyczność przy jednoczesnym zastosowaniu endotoksyny i hemoglobiny. Wyjaśniono, że w efekcie tym bierze udział endotoksyna, która wzmacnia aktywność biologiczną hemoglobiny [White C.T., 1986] lub, alternatywnie, że hemoglobina wzmacnia aktywność endotoksyny [Su, D. i wsp. 1999]. W badaniach tych, analizowano LPS i hemoglobinę w różnych badaniach in vitro, ogólnie, komórki jednojądrowe były podawane myszom lub królikom drogą dożylną lub wewnątrzotrzewnowo. Zastosowane w poprzednich badaniach preparaty hemoglobiny zawierały ludzką i wołową, zanieczyszczoną i bezzrębową hemoglobinę (SFH), ludzką, krzyżowo połączoną α,α-Hb, polimeryzowaną hemoglobinę wołową (Biopure 2) i jej chemiczne modyfikacje. Dotychczas nie przeprowadzono żadnych badań z hemoglobiną płodową lub dimerem α, γ-łańcucha czy oczyszczonymi łańcuchami α- i γ, zgodnie z wiedzą Zgłaszającego, badania takie nie były nawet sugerowane. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, stwierdzono zaskakująco, że hemoglobina płodowa lub dimer łańcucha α, γ lub monomeryczny łańcuch γ wykazywały znacznie wyraźniejszy efekt synergistyczny z endotoksyna, niż HbA lub jej podstruktury. Dalszym zaskakującym stwierdzeniem było, że synergizm był również przejawiany przez hemoglobinę pozbawioną hemu (globinę). Jest to sprzeczne z tym, co można było by przypuszczać, mianowicie, że ujemnie naładowany LPS oddziałuje z jonami Fe²⁺ obecnymi w hemie. Kolejnym zaskakującym stwierdzeniem było to, że do oddziaływania z endotoksyną nie jest konieczna kompletna struktura globiny, a raczej wystarczający jest łańcuch α, γ lub sam łańcuch γ. Ze względu na to, że dimery łańcuchów α, β przejawiały bardzo umiarkowaną aktywność synergistyczną z LPS, jest jasne, że w tym efekcie biologicznym uczestniczy w sposób optymalny łańcuch γ. Nie odnotowano efektu zwiększenia aktywności biologicznej hemoglobiny płodowej lub częściowych struktur z zawierającą hemoglobiną (dane nieprzedstawione). Zastosowanie dożylne HbA i LPS prowadzi do przejawienia ostrych efektów biologicznych. Przeciwnie, preparaty według niniejszego wynalazku stosowane domięśniowo lub doustnie wywierają jedynie korzystne, nietoksyczne efekty.

Endotoksyna obecna w ekstrakcie płodowym może pochodzić z flory bakteryjnej organizmu matki, jednak, w postaci utajonej biologicznie, jednakże Zgłaszający nie chce skłaniać się do jakiejkolwiek teorii w tej kwestii. Powyższe twierdzenie potwierdzają obserwacje, frakcje o aktywności

PL 211 789 B1 biologicznej przechowane w 37°C przez 0.5 do 2 godz. (w Przykładach zidentyfikowane jako CLP1b i 2p) są 30-40 razy bardziej aktywne pod względem aktywności przeciwrakowej. W parze z tymi zmianami idzie równoległy wzrost (aż do 75-krotny) stężenia wolnej endotoksyny, tj., odnotowanej endotoksyny, wykrywalnej w teście Limulus-Amoebocyte-Lysate-Test (LAL-Test). Zatem, wynika z tego, że dodatkowa aktywność biologiczna LPS może być uruchamiana w wyniku krótkotrwałej inkubacji homogenatu wątroby w temperaturze fizjologicznej. Ponownie, mimo że Zgłaszający nie skłania się do żadnej teorii, zakłada się, że: płodowa wątroba owcy widocznie zawiera małe (pikogram per miligram) ilości endotoksyny w stanie fizycznym agregacji, w którym jest mało reaktywna w analizie LAL, tj., w którym jest w znacznym stopniu nieaktywna biologicznie. W wyniku oddziaływania zagregowanej endotoksyny z hemoglobiną płodową - co może nastąpić po zastosowaniu domięśniowym lub doustnym - endotoksyna będzie przekształcana do formy aktywnej biologicznie, wywierając również korzystny efekt medyczny, jak opisano dla kompozycji według niniejszego wynalazku. Kompozycja może działać jako depot, z którego dynamicznie uwalniana jest aktywna biologicznie endotoksyna. W ten sposób endotoksyna będzie działać mniej ostro i, w konsekwencji, w lepiej tolerowany przez organizm sposób.

Kompozycja według wynalazku zawiera do zastosowania medycznego, korzystnie minimalną ilość 0.001-10 mg hemoglobiny płodowej lub pojedynczych łańcuchów lub kombinacji jej łańcuchów i 0.01-1000 μg endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej.

Kompozycja według wynalazku może zawierać jeden lub więcej rodzajów endotoksyny (tak jak bakteryjna forma S- i R LPS lub podstruktury) oraz jedną lub więcej hemoglobinę płodową (podstruktury) lub dodatkowe (poli)peptydy. Zatem, kompozycja może być homogenna lub heterogenna.

W korzystnej realizacji kompozycji według niniejszego wynalazku, wspomniana hemoglobina płodowa lub pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów pochodzi(-ą) z różnej od ludzkiej tkanki płodowej.

W odniesieniu do niniejszego wynalazku, termin „wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów pochodzi(-ą) z różnej od ludzkiej tkanki płodowej” oznacza korzystnie, że wspomniany preparat jest otrzymywany bezpośrednio ze wspomnianej tkanki za pomocą metod oczyszczania. Alternatywnie, wspomniany termin oznacza, że wspomniany preparat jest identyczny lub istotnie identyczny z preparatem bezpośrednio uzyskanym ze wspomnianej tkanki, lecz wyprodukowany za pomocą technik rekombinacyjnych lub metod (pół)syntetycznych.

W szczególnie korzystnej realizacji kompozycji według niniejszego wynalazku, wspomniana różna od ludzkiej tkanka płodowa pochodzi z owcy, kozy, konia lub wołu.

Mimo że w załączonych przykładach (przedstawiających korzystny sposób uzyskania składników kompozycji), w dalszych analizach aktywnego składnika(-ów) zawartych w kompozycji według wynalazku, zastosowano ekstrakty z płodowej tkanki owiec, oczekuje się, że do tego samego celu może służyć tkanka płodowa pochodząca z innych ssaków, w szczególności, innych przeżuwaczy, ze względu na oczekiwaną podobną florę bakteryjną jelita. Oprócz wątroby lub jako alternatywa wątroby, może zostać użyte łożysko wyizolowane z tych zwierząt, będące źródłem wyżej wymienionych składników kompozycji (farmaceutycznej) według wynalazku. Źródła te są, zatem, również włączone jako korzystne źródła według wynalazku.

Opisywane preparaty są bardzo słabo immunogenne lub nieimmunogenne, gdy podawane ksenogennemu organizmowi, takiemu jak człowiek ze względu na konserwatywną pierwszorzędową strukturę białek płodowych (patrz Przykład 3) i małą ilość LPS obecną w preparatach. To, wraz z brakiem tworzenia przeciwciał, wyjaśnia obserwowaną klinicznie dobrą i długotrwałą tolerancję ekstraktów uzyskanych jak wyżej opisano i przedstawionych w załączonych przykładach oraz podfrakcji odpowiednich nawet do powtórnego zastosowania.

W szczególnie korzystnej realizacji kompozycji według niniejszego wynalazku, wspomniana różna od ludzkiej tkanka płodowa pochodzi z ciężarnej owcy w fazie od około czterech tygodni przed urodzeniem do porodu.

W przypadku, gdy tkanka płodowa, taka jak wątroby owcy, na różnym etapie rozwoju, jest ekstrahowana i odpowiednie frakcje (oznaczone w załączonych przykładach CLP1b i CLP2p) porównywane są pod kątem przeciwrakowej aktywacji makrofagów, jest oczywiste, że podczas życia płodowego aktywność biologiczna, szczególnie ta związana z CLP2p, wzrasta do maksymalnej w momencie narodzin. Następnie, aktywność silnie spada do znacznie niższego poziomu, rzędu 0.1 do 1% stężenia krótko przed i w chwili urodzin. Oznacza to, że składniki płodowe ulegają zmianie po urodzeniu lub, że w życiu płodowym produkowanych jest znacznie wyższe stężenie składników aktywnych,

PL 211 789 B1 w porównaniu z życiem dorosłym i etapem starzenia się. Obserwacja ta jest zgodna z kinetyką biosyntezy hemoglobiny. Zatem, wiadomo dobrze, że produkcja hemoglobiny płodowej (HbF), składającej się z dimerów α-,γ maleje blisko narodzin na korzyść syntezy dimerów α,β obecnych w hemoglobinie dorosłych (HbA). W istocie, synteza łańcuchów β u ludzi rozpoczyna się kilka tygodni przed urodzeniem. U owiec, jednak, synteza łańcuchów β zaczyna się krótko przed narodzinami, tak, że u płodu od około 100 dni przed urodzinami do, w przybliżeniu, tygodnia przed porodem, obecna jest wyłącznie postać α2γ2 Hb [Hammerberg, B. i wsp. 1974].

W innej, szczególnie korzystnej realizacji kompozycji według niniejszego wynalazku, wspomniana różna od ludzkiej tkanka płodowa jest wątrobą. Najkorzystniejsze i równie dobre jak produkcja rekombinowana czy chemiczna, jest uzyskanie z wątroby składnika(-ów) aktywnych, zawartych w kompozycji według wynalazku. W szczególności, protokół otrzymywania wspomnianego składnika aktywnego opisano dla owcy w załączonych Przykładach, może jednak on być przystosowany przez specjalistę w dziedzinie do płodowej tkanki wątrobowej z innych, różnych od ludzi ssaków.

Jak wykazano w załączonych Przykładach i w celu dalszego scharakteryzowania składników o aktywności biologicznej, liofilizowany ekstrakt wątroby płodowej (FSLE) może być poddany ekstrakcji wodą lub solanką, wirowany i rozdzielany na frakcje w chromatografii na Sephadex G100 lub rozdzielany na dwie frakcje, wykazujące znaczną aktywność biologiczną, zwane CLP-Ibis lub CLP1b i CLP-IIprime lub CLP2p. Analiza biochemiczna CLP1b i CLP2p ujawniła obecność endotoksyny i w sumie 576 białek, w tym 25 dotychczas niezidentyfikowanych (patrz Przykład 3.3.2). Zakłada się, że oprócz hemoglobiny płodowej, pewne z tych dodatkowych białek, szczególnie te wymienione poniżej, mogą wpływać modyfikująco na korzystny efekt(-y) kompozycji według wynalazku. Powyższy protokół może być dalej dopracowywany z wykorzystaniem wskazówek zawartych w załączonych Przykładach (patrz, w szczególności, Przykłady 2 i 3).

W kolejnej korzystnej realizacji kompozycji (farmaceutycznej) według wynalazku, wspomniany dodatkowy związek(-i) jest/są (gliko)peptydem(-ami) wątroby płodowej. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem stwierdzono, że dodatkowe składniki pochodzące z wątroby płodowej i o charakterze białkopodobnym, korzystnie glikoproteiny (stosowane tu do określenia tego samego rodzaju co glikopeptydy), mogą wzmacniać terapeutycznie aktywne działanie hemoglobiny lub pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i endotoksyny lub/i fragmentu o aktywności endotoksycznej lub jej pochodnej (patrz Przykłady 8 i 9).

Ponadto, korzystnie według wynalazku, kombinacja łańcuchów jest dimerem α-, γ hemoglobiny płodowej. Jak już wcześniej wspomniano, stwierdzono zaskakująco, że dimer α-, γ, a nawet sam monomeryczny łańcuch γ hemoglobiny płodowej oddziałuje w nieoczekiwanie synergistyczny sposób z endotoksyna. Korzystny efekt w połączeniu z dobrą tolerancją tych składników kompozycji według wynalazku nie wynika sama, bez zachowania poziomu wynalazczego ze stanu techniki.

Korzystnym, również zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jest pojedynczy łańcuch będący łańcuchem y hemoglobiny płodowej.

Kolejnym zaskakującym stwierdzeniem według wynalazku jest to, że do osiągnięcia korzystnych efektów nie jest potrzebna część hemowa hemoglobiny. Zatem, w dalszej, korzystnej realizacji kompozycji według wynalazku, kombinacja(-e) łańcuchów jest/są pozbawione grupy hemowej, zawierającej żelazo frakcji hemoglobiny.

W innej, korzystnej realizacji kompozycji według niniejszego wynalazku, wspomniana endotoksyna jest bakteryjnym lipolpolisacharydem (LPS) i korzystnie bakteryjnym lipopolisacharydem w postaci S- lub R lub aktywnym biologicznie fragmentem lub ich pochodną.

W kolejnej, korzystnej realizacji kompozycji według niniejszego wynalazku, wspomniana endotoksyna jest bakteryjnym (LPS) pochodzącym z Enterobacterium. W innej, bardziej korzystnej realizacji kompozycji według niniejszego wynalazku, wspomniane bakterie Enterobacterium wybrane są spośród gatunków lub rodzajów Escherichia coli, Salmonella, Yersinia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacterium i/lub Shigella.

Termin „aktywny biologicznie fragment lub pochodna” LPS odnosi się do związków pochodzących z chemicznego lub enzymatycznego cięcia LPS lub z (bio)chemicznych modyfikacji LPS, na skutek których utrzymane (zasadniczo) lub udoskonalone są korzystne farmaceutycznie aktywności. Składniki te obejmują fragmenty otrzymane w wyniku częściowej enzymatycznej/hydrolitycznej deglikozylacji, defosforylacji i deacetylacji, lub też pochodne uzyskiwane są poprzez działanie glikozylo, fosforylo lub acylotransferaz lub poprzez inne enzymatyczne etapy modyfikacji, znane z przebiegu w tkankach ssaczych, w szczególności w wątrobie.

PL 211 789 B1

Endotoksyna bakteryjna lub LPS, wielkocząsteczkowe amfofile, wykazują u wyższych zwierząt i ludzi, zależ nie od sposobu podawania, znaczną róż norodność biologicznych aktywnoś ci, interesują cych pod kątem farmakologicznym, już przy dawkach tak małych, jak 0.01-0.1 ng/kg masy ciała [Alexander, Ch., 2001]. W efektach LPS uczestniczą komórki odpornościowe i uwalniane przez nie czynniki, włączając cytokiny, rodzaje reaktywnego tlenu i mediatory lipidowe [Brabetz, W., 1999]. Aktywność biologiczna LPS opiera się na jego składniku, lipidzie A, którego pierwszorzędowa struktura znana jest dla wielu rodzajów bakterii [Zahringer, U., 1994]. Ekspresja aktywności biologicznej lipidu A (lub LPS) uzależniona jest od jego cząsteczkowej konformacji, stopnia agregacji i organizacji trójwymiarowej [Brandenburg, K., 1996], czynniki te są określane poprzez stopień acylacji i fosforylacji. Zatem, pełna endotoksyczność wyrażana jest przez heksaacylo bisfosforylowany lipid A, natomiast pentaacylo bisfosforylo- lub heksaacylo- monofosforylowane struktury częściowe są w przybliżeniu 10-100 razy mniej aktywne [Rietschel, E.Th. 1994]. W szczególności, analizowano w różnych układach monofosforylowany(heksaacylo) lipid A (MPLA) i wykazano, że przejawia on znacznie (około 10-100 krotnie) niższą toksyczność w porównaniu z lipidem A lub LPS [Ulrich, J.T. i wsp. 1995].

Zastosowanie medyczne LPS, włączając leczenie raka i zapobieganie infekcjom, propagowane jest od ponad stu lat, lecz często zarzucane z powodu niepożądanych skutków ubocznych, towarzyszącym skutecznym terapeutycznie dawkom [Zhang, M., 1999]. W związku z powyższym, opisano imponujące wyniki regresji raka, w której uczestniczył LPS [Zhang, M., 1999], lecz również reakcje uboczne, takie jak gorączka i podciśnienie, które wpłynęły na zakazanie powszechnie akceptowanej endotoksyny w praktyce lekarskiej. W celu kontroli ostrej toksyczności, zamiast ogólnie stosowanych iniekcji dożylnych, propagowano zastosowanie LPS podanego przezskórnie. W związku z tym, Nishizawa i wsp. [1992] wyizolował LPS z Pantoea agglomerans, mikroorganizmu wzrastającego na pszenicy, który polecany był do stosowania na drodze iniekcji przezskómych, i który uważa się, że zachowuje homeostazę (tj. zdrowie) u pacjentów cierpiących na różne choroby [Goto, S., 1996]. Z toksykologicznego punktu widzenia, autorzy wskazują na znacznie wyższą tolerancję w tych warunkach [Inagawa, H., 1997]. Mało wiadomo o tych mechanizmach i cząsteczkach, które kontrolują aktywność biologiczną LPS w organizmach wyższych, włączając ludzi, w szczególności farmakokinetykę LPS in vivo. Badania losu LPS, wstrzykniętego, czy uwolnionego z bakterii Gram-ujemnych w warunkach fizjologicznych lub patofizjologicznych, wykazały, że wśród wszystkich organów, wątroba pełni pierwszorzędową i centralną rolę [Freudenberg, M.A., 1990]. Stwierdzono, że wątroba eliminuje LPS z obiegu w sposób niezapalny i nagromadza go w postaci nietoksycznej lub mniej toksycznej [Freudenberg, M.A., 1990]. Zatem, główna droga endotoksyn, które wchodzą do krwi z jelita prowadzi przez żyłę wrotną do wątroby, gdzie mogą one być pobrane przez komórki Kupffer'a, ponownie uwolnione do strumienia krwi, a następnie rozdzielone do hepatocytów, które ostatecznie wydzielają je razem z żółcią [Bertok, L. 1980; Van Bossuyt, H., 1988]. Wykazano występowanie degradacji enzymatycznej endotoksyn, prowadzącej do mniejszych lub nietoksycznych częściowych struktur lipidu A przeprowadzanej przez enzymy pochodzące z makrofagów i neutrofili. Opisano defosforylację szkieletu lipidu A w komórkach eukariotycznych i surowicy [Poelstra, K., 1997]. Ta aktywność fosfatazowa została zidentyfikowana w lizatach komórkowych i nienaruszonych komórkach makrofagów otrzewnowych, zlokalizowana w lizozymach. Ponadto, acyloksyacylo hydrolaza neutrofilo-pochodna [Munford, S., 1986] tnie drugorzędowe wiązanie estrowe kwasów tłuszczowych lipidu A. Los endotoksyn jest również zdeterminowany przez czynniki surowicze, takie jak HDL, LDL oraz czynniki dopełniacza, które tworzą w obiegu kompleksy z LPS. Ponadto, powstawanie kompleksów z BPI prowadzi do transportu do wątroby i pobrania przez hepatocyty. U ciężarnych ssaków, również łożysko może wzbogacać LPS. W związku z tym, Y. Katayama i wsp. (1975) opisał „LPS(endotoksyno)-podobną substancję w łożysku ludzkim”. Autorzy odnoszą się do wrażliwości Shwartzman'a ciężarnych kobiet i płodu i przedstawiają, że materiał o aktywności Shwartzman'a nagromadza się w łożysku, z którego może być ekstrahowany w małych ilościach w wyniku zastosowania znanych procedur ekstrakcyjnych dla LPS. Aktywność ekstraktu wynosiła około tysiąca z czystego LPS pochodzącego z E.coli. Autorzy zapowiedzieli dalszą charakterystykę aktywnego składnika w kolejnych raportach, które, jednakże dotychczas się nie ukazały. Liczne badania wykazują, że wątroba stanowi główny organ, do którego kierowany jest krążący w organizmie LPS.

W kolejnej, korzystnej realizacji, endotoksycznie aktywny fragment endotoksyny jest związkiem lipidu A bez LPS-pochodnego polisacharydu.

W dziedzinie, podejmowano próby syntetycznego otrzymania analogów strukturalnych obszaru lipidu A z LPS [Jeanin, J.F., 1991; Kusawa, T., 1991], które miały na celu korzystne rozdzielenie

PL 211 789 B1 endotoksyczności od aktywności przeciwrakowej. Podjęto liczne próby w celu chemicznej zmiany wyizolowanego LPS w taki sposób, aby jego niepożądane skutki uboczne zostały wyeliminowane, natomiast jego terapeutycznie użyteczne właściwości, takie jak aktywność nekrotyczna wobec raka pozostały [Zhang, M.,1999 i patenty Np. US4185090, GB2147806 i WO0026384]. Te nieodwracalne chemiczne lub enzymatyczne modyfikacje obejmowały defosforylację i saponifikację reszt acylowych związanych z lipidem A, jak również derywatyzację tj., z użyciem kwasu ftalowego [Elin, R.J., 1981].

Chemiczna struktura lipidu A, środek LPS o aktywności biologicznej obejmuje hydrofilowy i lipofilowy obszar, oba wymagane są do ekspresji aktywności biologicznej LPS. Zgodnie z powyższym, lipid A jest korzystnym przykładem fragmentu LPS o aktywności biologicznej. Znane są naturalne związki, związane z obszarem lipidu A, w ten sposób fizycznie i odwracalnie kompleksujące LPS i redukujące jego aktywność biologiczną [David, S.A., 1999; Porro, M., 1999]. Cząsteczki wiążące się zarówno z hydrofilowym, jak i hydrofobowym obszarem lipidu A i hamujące jego biologiczne efekty obejmują białko bakteriobójcze/zwiększające przepuszczalność (BPI), białko neutralizujące endotoksynę (ENP), antybiotykową polimyksynę B [Rifkind, D., 1967] i kationowy peptyd 18 (CAP 18) [Opal, S.M., 1998], natomiast białko wiążące lipopolisacharyd (LBP), hemoglobina dorosłych (Hb) i rozpuszczalne białko CD14 zwiększają aktywność endotoksyczną [Roth, R.J., 1999, Kitchens i wsp., 2000]. Związki związane głównie z obszarem lipofilowym lipidu A, a zatem inhibitujące jego bioaktywność, obejmują surfaktanty, takie jak dodecylosiarczan sodu i pewne kwasy żółciowe [Bertok, L.1980; Van Bossuyt, H., 1988]. Zdolność LPS do wiązania z kationowymi lub hydrofobowymi cząsteczkami daleko przekraczająca stechiometryczne proporcje jest znana od pewnego czasu [Liideritz, O., 1958]. W takich kompleksach białko nie może być już dłużej wytrącane za pomocą denaturujących odczynników chemicznych, takich jak kwas trichlorooctowy czy też lipidy za pomocą odczynników wytrącających, na przykład, cholesterol przez digitoninę [Liideritz, O., 1958; Neter, E., 1958]. Według obecnej wiedzy, cząsteczki kompleksujące mogą zakrywać szczególne miejsca tych obszarów lipidu A, które wymagane są do jego oddziaływania z humoralnymi (np., LBP) lub komórkowymi np., CD14/TLR4) receptorami gospodarza [Połtorak, 1998]. Zahamowanie oddziaływań kompleksów LPS z jego receptorami gospodarza inhibituje inicjację i przejaw efektów LPS [Opal, S.M., 1998]. Wszystkie z poprzednich badań nad powstawaniem kompleksów LPS z innymi związkami skierowane były wyłącznie na detoksyfikację LPS [Opal, S.M., 1998]. Mimo że jedno z podejść ukierunkowane było na zastosowanie LPS jako stymulanta fagocytozy (EP-A 0 405 315), potencjalnie, korzystne właściwości preparatu wynikające z oddziaływania między LPS a innymi związkami, takimi jak hemoglobina, nie zostały dotychczas dobrze zbadane [patrz, Brade, H., 1999].

Ponadto, korzystnie, według wynalazku, gdy wspomniana endotoksyna jest naturalnym lub syntetycznym penta- i/lub heksaacylolipidem A.

W kolejnej realizacji wynalazku, wspomniana endotoksyna zawarta we wspomnianej kompozycji jest monofosforanem syntetycznego penta- i/lub heksaacylolipidu A (MPLA).

Zalety stosowania tych endotoksyn wiążą się z faktem, że ich ostra toksyczność jest znacznie niższa (około 100 razy) w porównaniu z toksycznością heksaacylo bifosforylo lipidu A lub LPS (patrz również strona 15 tekstu oryginalnego).

Ponadto, jest również korzystnym w jednej z realizacji według wynalazku, że w kompozycji stosunek wagowy składników wynosi około 1000:1 lub mieści się w zakresie od 1:1 do 1000:1 hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczych łańcuchów lub kombinacji jej łańcuchów do endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej. Inne realizacje obejmują odmienne stosunki.

W następnej korzystnej realizacji, kompozycja według niniejszego wynalazku zawiera ponadto (gliko)peptyd wątrobowy, który jest tioredoksyną, białkiem wiążącym fosfatydyloetanoloaminę (PBP), peptydylo-propylo-cis-trans-izomerazą A (PPIaza A), czynnikiem inhibicji migracji makrofagów (MIF) lub ubikwityną (Ub) lub też jakimkolwiek z innych białek zamieszczonych na liście w Tabeli 4.

Ubikwityną i tioredoksyną mogą działać jako chemokiny a MIF może korzystnie regulować receptory TLR-4, stwarzając przez to korzystne komórkowe środowisko do aktywacji LPS [Roger i wsp. 2001].

Korzystnie również, gdy wspomniana kompozycja jest lub obejmuje dodatek żywnościowy (suplement żywnościowy). Odnosi się to też do innych (korzystnych) realizacji omawianych według wynalazku.

Termin „dodatek żywnościowy” w kontekście niniejszego wynalazku ma szersze znaczenie niż przyjęte w dziedzinie. Zazwyczaj, dodatek żywnościowy jest lub obejmuje substancje dodawane do żywności w celu jej zakonserwowania lub udoskonalenia smaku i wyglądu. Wspomniane dodatki

PL 211 789 B1 żywnościowe obejmują, lecz nie ograniczają się do kwasów, regulatorów kwasowości, środków zapobiegających zbrylaniu, antypieniaczy, przeciwutleniaczy, środków spulchniających, barwników, środków utrzymujących barwę, substancji emulgujących, smakowych, podkreślających smak, czynników polepszających mąkę, środków konserwujących, materiałów napędowych, środków stabilizujących i/lub słodzących. Wszystkie te związki mogą również być dodane do kompozycji według wynalazku. Istotne według wynalazku, jednak, jest to, by dodatek żywnościowy składał się z lub obejmował wyżej wymienianą endotoksynę lub jej fragment o aktywności endotoksycznej oraz hemoglobinę płodową, taką jak hemoglobinę bez hemu lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinację(-e) jej łańcuchów i, dowolnie, dodatkowy związek(-i), taki jak (gliko)peptydy wątroby płodowej. Składniki te występujące lub zawarte w dodatku żywnościowym według wynalazku mogą być podawane klientom o całkiem dobrym stanie zdrowia zaopatrującym się w produkty żywnościowe. Na przykład, przypuszcza się, że związki te będą równoważyć zjawisko/przyczyny obserwowane w związku z procesem starzenia, jak wyjaśniono w innym miejscu niniejszego opisu.

W kolejnej, korzystnej realizacji, kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku jest konfekcjonowana do podawania doustnego. Przykłady takich opakowań obejmują, lecz nie ograniczają się do tabletek (z otoczką lub nieopłaszczonych), miękkich kapsułek żelatynowych, twardych kapsułek żelatynowych, pastylek do ssania, kołaczyków, roztworów, emulsji, zawiesin, syropów, eliksirów, pudrów/granulek do szybkiego odtworzenia, zdyspergowanych proszków/granulek, gum medycznych, tabletek do żucia i tabletek rozpuszczalnych.

Podanie doustne wiąże się z licznymi zaletami, w szczególności znaczną wygodą stosowania dla pacjenta.

Zaskakująco, stwierdzono, że kompozycja farmaceutyczna według wynalazku jest również aktywna biologicznie u myszy, gdy podana doustnie w dawkach od 0.5 μg do 50 μg. Wcześniejsze badania regularnie wykazywały, że LPS wykazuje aktywność biologiczną u wyższych zwierząt, włączając ludzi, tylko jeżeli podawany jest inną niż doustną drogą, taką jak dożylnie, wewnątrzotrzewnowe, podskórnie lub domięśniowo. Zatem, Ch.Galanos (Max-Planck-Institute for Immunobiology Freiburg, Niemcy; korespondencja prywatna) wykazał, że dawki doustne, wysokości 5 mg na zwierzę nie zabijają D-galaktozamino uwrażliwionych myszy, wrażliwych na 1 do 5 ng/mysz, jeżeli LPS podawany jest dożylnie. W związku z tym, zaobserwowana aktywność biologiczna kompozycji endotoksyno/hemoglobinowej nie była wcześniej opisana. Można wykazać według niniejszego wynalazku, że LPS po interakcji z hemoglobiną płodową jest znacznie bardziej aktywny niż równe ilości wolnego LPS. Związki o aktywności biologicznej pochodzące z tkanki płodowej, dotychczas opisane w literaturze zostały zastrzeżone jako niestabilne temperaturowo i wrażliwe na proteolizę, natomiast w niniejszym zgłoszeniu opisane preparaty LPS, przeciwnie, są raczej stabilne temperaturowo i oporne na działanie enzymów proteolitycznych. Specjalista w dziedzinie może łatwo rozszerzyć dane uzyskane dla myszy na inne ssaki, włączając ludzi (patrz, Przykłady 8, 12, 13 i 15).

W kolejnej, korzystnej realizacji, wspomniana kompozycja zawiera od 0.001 do 10 mg hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczych łańcuchów lub kombinacji jej łańcuchów oraz między 0.01 a 1000 ug endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej.

Niniejszy wynalazek związany jest także z zastosowaniem endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i, dowolnie, dodatkowego związku do otrzymywania kompozycji do stymulowania wrodzonego i nabytego układu immunologicznego, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

Niniejszy wynalazek dotyczy także zastosowania endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i, dowolnie, dodatkowego związku do otrzymywania kompozycji do leczenia raka, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

Nowotwory i raki, które mogą zostać leczone lub zapobiegane poprzez podawanie kompozycji według wynalazku obejmują, lecz nie ograniczają się do raka prostaty, takiego jak gruczolakorak prostaty, raka piersi, raka płaskokomórkowego szyjki macicy i gruczolakoraka trzustki. Infekcje patogenami obejmują infekcje wywołane wirusami, bakteriami i organizmami eukariotycznymi, strukturami jednokomórkowymi, jak i wielokomórkowymi, takimi jak komórki drożdży, grzyby, robaki pasożytujące w jelicie, itp.

PL 211 789 B1

Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i, dowolnie, dodatkowego związku(-ów) do otrzymywania kompozycji do leczenia lub zapobiegania infekcjom, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

Ponadto, niniejszy wynalazek związany jest z zastosowaniem endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i, dowolnie, dodatkowego związku do otrzymywania kompozycji do zapobiegania lub leczenia stanów alergicznych, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej. Wspomniane stany alergiczne obejmują w korzystnych realizacjach wszystkie alergie typu 1, gorączkę sienną i astmę alergiczną.

W innej, korzystnej realizacji, niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i, dowolnie, dodatkowego związku do otrzymywania kompozycji do odwracania zmian w produkcji cytokin/chemokin, zachodzących w sposób skorelowany z wiekiem, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej. W dalszej korzystnej realizacji, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu przywracania równowagi immunologicznej, zaburzonej wiekiem, obejmującego podawanie ludziom endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i, dowolnie, dodatkowego związku(-ów). Zgodnie z wynalazkiem, starzenie, w najszerszym znaczeniu związane jest z zazwyczaj nieodwracalnym powstawaniem stanu nierównowagi immunologicznej w czasie.

W innej korzystnej realizacji niniejszego wynalazku, wspomniana nierównowaga immunologiczna związana z wiekiem obejmuje nienormalną produkcję cytokin. W kolejnej korzystnej realizacji kompozycji według niniejszego wynalazku, wspomniana związana z wiekiem nienormalna produkcja cytokin jest zwiększoną produkcją TNFa, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8 i/lub IL-10 oraz/lub obniżoną produkcją IL-2.

Kolejnym zaskakującym stwierdzeniem według wynalazku, że podawanie kompozycji według wynalazku powoduje odwrócenie związanej z wiekiem nierównowagi immunologicznej. Ze względu na to, że takie zaburzenia równowagi immunologicznej mogą być traktowane jako kluczowy czynnik zjawiska starzenia, niniejszy wynalazek stanowi istotny krok w próbach ludzkości uzyskania wpływu na starzenie się i związany z tym wzrost podatności na choroby, takie jak rak, alergia i infekcje. Opcjonalnie, kompozycja według wynalazku może być podawana razem z aktywnymi farmaceutycznie związkami, otrzymanymi w celu zatrzymania lub opóźnienia fizjologicznych lub patofizjologicznych konsekwencji starzenia się, włączając zwiększoną podatność na raka, infekcje i alergie. Inne związane ze starzeniem się choroby obejmują, lecz nie ograniczają się do choroby Alzheimer'a, choroby Parkinsona, osteoporozy i osłabienia.

Niniejszy wynalazek związany jest również z zastosowaniem endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i, dowolnie, dodatkowego związku do otrzymywania kompozycji do łagodzenia skutków ubocznych naświetlania, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej. Choroby związane ze skutkami ubocznymi naświetlania obejmują, lecz nie są ograniczone do jakiegokolwiek patofizjologicznego stanu skorelowanego z supresją odporności. Obejmuje zatem, na przykład, choroby związane z obniżoną liczbą leukocytów.

W najkorzystniejszej realizacji zastosowania niniejszego wynalazku, wspomniany rak jest rakiem prostaty, takim jak gruczolakorak prostaty, rak piersi, rak płaskokomórkowy szyjki macicy i gruczolakorak trzustki. Według wynalazku, szczególnie korzystnie, gdy infekcja jest infekcją wirusową, korzystnie chroniczną infekcją wirusową, korzystniej opryszczki (herpes), zapalenia wątroby B lub infekcją zapalenia wątroby C.

Ponadto, według korzystnego zastosowania wynalazku, odwrócenie wspomnianej, zależnej od wieku produkcji cytokin/chemokin związane jest z aktywacją makrofagów.

W korzystnej realizacji zastosowań niniejszego wynalazku, wspomniana kompozycja przeznaczona jest do stosowania doustnego.

PL 211 789 B1

W innej, korzystnej realizacji kompozycji lub zastosowania niniejszego wynalazku, wspomniany preparat występuje w ilości równoważnej od 0.01 do 2 μg LPS (i struktur częściowych lipidu A). Zależnie od drogi podawania, do podawania doustnego może być zastosowane do 1 mg LPS, obecnego w preparacie.

W kolejnej, korzystnej realizacji kompozycji lub zastosowania niniejszego wynalazku, wspomniana endotoksyna otrzymywana jest biochemicznie lub chemicznie. W dodatkowej, korzystnej realizacji kompozycji lub zastosowania niniejszego wynalazku, wspomniana hemoglobina i/lub wspomniany dalej (poli)peptyd otrzymywane są biochemicznie lub chemicznie lub też za pomocą technik rekombinacyjnych. Powyżej, znajdują się odwołania do biochemicznych, chemicznych i rekombinacyjnych narzędzi i metod produkcji.

Wszyscy pacjenci poddawani leczeniu według wynalazku, zgodnie z poniższym opisem wyrazili zgodę.

Na figurach przedstawiono:

Fig. 1: Schematyczne przedstawienie struktury liposacharydów (LPS) dzikiego typu i mutantów „szorstkich” Salmonella enterica

Zgodnie z chemicznymi, biosyntetycznymi, biologicznymi i genetycznymi kryteriami, LPS można podzielić na trzy obszary: łańcuch O-specyficzny, rdzeń oligosacharydowy i lipid A. Łańcuch O-specyficzny stanowi polimer powtarzających się jednostek oligosacharydowych, charakterystycznych dla każdego szczepu bakterii. Określenie Ra-Re dotyczy struktur LPS z mutantów szorstkich (R), które w wyniku wady genetycznej syntetyzują krótszy rdzeń oligosacharydowy, przez co nie posiadają O-specyficznego łańcucha. Mniejsza struktura LPS, występująca u wciąż zdolnych do życia szczepów Salmonella enterica składa się z lipidu A i dwóch reszt Kdo (mutant Re). Grupy cukrowe zaznaczono sześciokątami a kropkowane linie oznaczają niestechiometryczne podstawienia. GlcN, D-glukozamina; Kdo, kwas 3-deoksy-D-manno-okta-2-ulosonowy (kwas 2-keto-3-deoksy-D-manno-oktanowy); Hep, L-glicero-D-manno-heptoza; Glc, D-glukoza; Gal, D-galaktoza; GlcNAc, N-acetylo-D-glukozamina; P, fosforan.

Fig. 2: Struktura heksa-acylo monofosforylo lipidu A (MPLAheksa) wyizolowanego z LPS z mutanta Re E.coli (szczep F515)

Litery a-d wskazują pierwszorzędowe [14:0(3-OH)] i c'-d' drugorzędowe kwasy tłuszczowe (12:0 i 14:0). Przestawiono w pełni uprotonowaną formę struktury monofosforylo heksa-acylo lipidu A.

Fig. 3: Aktywacja in vivo komórek śledziony myszy różnymi porcjami FSLE w celu indukcji z udziałem makrofagów inhibicji wzrostu komórek rakowych

Fig. 4: Podział na frakcje FSLE na chromatografii Sephadex G-100® po dializie

Fig. 5: Aktywność biologiczna (inhibicja wzrostu komórek rakowych) CLP2p przed i po dializie z granicą przepuszczania 35 kDa.

Mysie BMDM stymulowano stosując CLP2p otrzymany po dializie i z niedializowanego materiału i testowano pod kątem aktywności TCGI na komórkach rakowych Abelson 8-1.

Fig. 6: Stabilność temperaturowa przeciwrakowego aktywatora makrofagowego, obecnego w CLP1b i CLP2p w różnych wartościach pH.

Liofilizowane preparaty (0.25 mg) CLP1b i CLP2p solubilizowano odpowiednio, w wolnej od pirogenu wodzie, w pH 5.8 (górny wykres) lub w 20 mM buforze octanu sodu, pH 4.7 (dolny wykres). Próby inkubowano w 4°C (kontrola, szare słupki) lub w 100°C (czarne słupki) przez 60 min. Aktywność przeciwrakową mysich BMDM, w warunkach różnych temperatur i w próbach kontrolnych określano we wskazanych stężeniach końcowych w analizie TCGI.

Fig. 7: Oporność proteazowa w analizie TCGI indukującej aktywność obecną w CLP1b i CLP2p

CLP1b (A) i CLP2p (B) poddano działaniu wskazanych proteaz, w stosunku enzymu do całości białka 1:10 (w/w) w 37°C, przez 30 min, w celu inaktywacji cieplnej proteaz. Następnie badano aktywność przeciwrakową, w której uczestniczą makrofagi, w próbach potraktowanych proteazami i odpowiadających im kontrolach CLP1b (A) i CLP2p (B), stosowano test TCGI dla wskazanych stężeń końcowych.

Fig. 8: Wrażliwość związku aktywującego makrofagi, występującego w CLP2p, na łagodne działanie jodanem sodu

Fig. 9: Adsorpcja przeciwrakowego aktywatora makrofagowego na Affi-Prep®Polymyxin.

CLP2p inkubowano wstępnie bez (szare słupki) lub w obecności (czarne słupki) stosując Affi-Prep®Polymyxin w 4°C przez 14 dni. Po usunięciu żywicy z kolumny powinowactwa, próby analizowano stosując test TCGI, we wskazanych stężeniach.

PL 211 789 B1

Fig. 10: Indukcja uwalniania tlenku azotu w BMDM u myszy LPS dających odpowiedź na LPS (C57BI/10 ScSn) i niedających odpowiedzi na LPS (C57BI/10 ScCr) z użyciem frakcji LPS lub CLP.

BMDM z myszy z odpowiedzią LPS (C57BI/10 ScSn, szare słupki) i bez odpowiedzi na LPS (C57BI/10 ScCr, czarne słupki) pobudzano stosując LPS lub jedną z puli CLP we wskazanych stężeniach. Uwalniany przez komórki tlenek azotu określano po 48 godz., jako azot w supernatantach hodowlanych.

Fig. 11: Analiza SDS-PAGE dla CLP1b i CLP2p.

0.02 mg CLP1b (linia 1) i CLP2p (linia 2) analizowano stosując SDS-PAGE, a następnie barwienie srebrem. Położenie poszczególnych prążków białek oznaczono na podstawie wskazań odpowiadających im markerów wagowych.

Fig. 12: Analiza 2-DE dla FSLE

Analizowano skład całkowitego białka w ekstrakcie z płodowej wątroby owcy stosując dwuwymiarową, wysokorozdzielczą elektroforezę (2-DE) i barwienie srebrem, jak opisano w rozdziale materiały i metody.

Fig. 13: Analiza 2-DE dla CLP1b z ekstraktu płodowej wątroby owcy

Analizowano skład białka z CLP1b, pochodzącego z ekstraktu z płodowej wątroby owcy stosując dwuwymiarową, wysokorozdzielczą elektroforezę (2-DE) i barwienie srebrem, jak opisano w rozdziale materiały i metody. Wybrane białka w żelu 2-DE identyfikowano stosując trawienie tryptykowe w żelu odpowiednich kropek, w żelu barwionym srebrem, a następnie technikę spektrofotometrii masowej mieszaniny peptydów. Ponadto, do identyfikacji białek w CLP1b, zastosowano przeniesienie w polu elektrycznym na membranę Immobilon PVDF i sekwencjonowanie N-końcowe Edman'a barwionych prążków z użyciem Coomassie Brilliant Blue. Zaprezentowano całościowy obraz 2DE białek z CLP1b i zliczono pojedyncze, zidentyfikowane prążki. Na wykresie B, przedstawiono dodatkowo odpowiadające zestawienie zidentyfikowanych białek, jak opisano bardziej szczegółowo w Tabeli 2.

Fig. 14: Analiza 2-DE dla CLP2p z ekstraktu wątroby płodu owcy

W analogiczny sposób jak CLP1b, analizowano skład białek w CLP2p (Fig. 13), stosując wysoko rozdzielczą dwuwymiarową elektroforezę (2-DE) i barwienie srebrem. Poszczególne prążki w żelach 2-DE barwionych srebrem dla CLP2p zestawiano według zidentyfikowanych białek z CLP1b przy pomocy programu komputerowego z pakietem Delta2D (DECODON GmbH; Greifswald).

Fig. 15: Analiza 2-DE dla CLP1b z ekstraktu wątroby dorosłych owiec

Analogicznie, jak w przypadku preparatów płodowych CLP1b i CLP2p, analizowano skład białka w preparacie CLP1b z wątroby dorosłych owiec (Fig. 13 i 14), stosując wysoko rozdzielczą dwuwymiarową elektroforezę (2-DE) i barwienie srebrem. Poszczególne prążki w barwionych srebrem żelach 2-DE z prób CLP1b pobranych od dorosłych osobników mogą być zestawione według zidentyfikowanych białek w próbie płodowych białek CLP1b, przy pomocy programu komputerowego z pakietem Delta2D (DECODON GmbH; Greifswald). Odpowiadający zestawieniu, otrzymany w wyniku obliczeń komputerowych obraz wzorca 2-DE dla białek płodowego i „dorosłego” preparatu CLP1b przedstawiono na Fig. 13.

Fig. 16: Analiza nałożonego obrazu wzorców 2-DE dla CLP1b z wątroby płodu i z dorosłej owcy

Główne różnice w 2-DE wzorcu białek CLP1b dla preparatu płodowego versus dorosłej owcy wykryto stosując technikę optymalizacji komputerowej i nałożenie dwóch obrazów barwionych srebrem żeli 2-DE, z użyciem pakietu komputerowego Delta2D (DECODON GmbH; Greifswald). Prążki białek specyficznych dla płodowego i owczego preparatu CLP1b zaznaczono odpowiednio zielonym i czerwonym kolorem, natomiast sygnały prążków wspólnych dla prób płodowych i dorosłych przedstawiono na żółto.

Fig. 17: Selektywna adsorpcja 12 kDa białka z CLP1b do formy S LPS

W celu skriningu CLP1b pochodzącego z płodowej wątroby owcy dla LPS i białek wiążących lipid A, wykonano (patrz metody) analizę adsorpcyjną opartą na początkowym pokryciu polichlorkiemwinylu, 96-studzienkowej płytki do miareczkowania formą S LPS z Salmonella enterica sv. Minnesota 188233 (patrz metody). Ostateczna analiza supematantów po przemyciu i resztkowych, zaadsorbowanych białek w żelu SDS PAGE ujawniła zależne od LPS zwiększenie stężenia prążku pojedynczego białka o masie cząsteczkowej około 12 (±1) kDa.

Fig. 18: Selektywna adsorpcja 12 kDa białka z CLP1b do Re-LPS

W analizie adsorpcji wykonanej z Re-LPS z E.coli, szczepu F515 jako opłaszczający materiał (patrz metody) uzyskano zależne od LPS wzmocnienie pojedynczego 12 (±1) kDa prążka białka z CLP1b.

PL 211 789 B1

Fig. 19: Selektywna adsorpcja 12 kDa białka z CLP1b do lipidu A

Wykorzystanie wolnego lipidu A pochodzącego z Re LPS z E.coli, jako materiału opłaszczającego w analizie adsorpcyjnej (patrz metody) wykazało zależne od lipidu A wzmocnienie pojedynczego 12 (±1) kDa prążka białka z CLP1b.

Fig. 20: Identyfikacja głównego, wiążącego LPS/lipid A, 12 kDa białka w CLP1b

Dzięki przeprowadzeniu analizy adsorpcyjnej dla CLP1b w skali preparatywnej, z wykorzystaniem Re-LPS jako materiału pokrywającego, po której prowadzono trawienie tryptykowe w żelu 12 kDa białka i spektrometrię masową posobną, zidentyfikowano główny składnik prążka białka specyficznego dla LPS/lipidu A jako łańcuch alfa hemoglobiny owcy (Hb-alfa). Przedstawiono sekwencje aminokwasowe dwóch tryptykowych peptydów i łańcucha alfa Hb różnych gatunków zwierząt.

Fig. 21: Zmniejszenie LPS-specyficznej adsorpcji płodowej hemoglobiny owczej w wyniku wstępnego potraktowania CLP1b ludzką haptoglobiną

Zestawienie głównego wiążącego LPS/lipid A białka w CLP1b jako postaci płodowej hemoglobiny owczej weryfikowano dalej prowadząc wstępną inkubację preparatu CLP z ludzką haptoglobiną (fenotyp 1-1) - przejawiającą wysoką konserwatywność ewolucyjną i stanowiącą odczynnik wiążący hemoglobinę z dużym powinowactwem - przed przeprowadzeniem testu adsorpcji. Wykazano, że haptoglobiną inhibituje wiązanie hemoglobiny z otoczką LPS.

Fig. 22: Pierwszorzędowa struktura łańcucha alfa i gama owczej hemoglobiny

Sekwencje aminokwasowe łańcucha alfa (A) i gama (B) hemoglobiny owczej uzyskano z bazy danych SWISS-PROT, pod hasłem, odpowiednio HBBFSHEEP i HBA_CAPHI. Na górnym rysunku (A) podano sekwencję wariantu alfa 1 owczej Hb. Tłustym drukiem wskazano różnice pojedynczych reszt występujące w dodatkowych izoformach łańcucha alfa hemoglobiny owczej. W wariancie Hb-alfal, Asp-75 podstawiony jest resztą Tyr, natomiast w wariancie Hb-alfa2, Gly-19, Leu-113 i Asn-115 zastąpione są odpowiednio przez Ser, His i Ser. Ponadto, allele alfa-D owcy różnią się od alleli alfa A zastąpieniem Gly-15 przez resztę Asp.

Fig. 23: Chromatografia jonowymienna DE52 dla płodowej hemoglobiny owczej

Zastosowano materiał 70 kDa, uzyskany po chromatografii na Sephadex G100.

Fig. 24: SDS-PAGE materiału uzyskanego z chromatografii DE52 (patrz, Fig. 23)

Lewa linia, oczyszczona płodowa hemoglobina owcza (10 mikrogramów/ml), w warunkach nieredukujących; prawa linia, ta sama próbka hemoglobiny po redukcji (20 mM DL-ditiotreitol). Środkowa linia - markery wagi cząsteczkowej.

Fig. 25: SDS-PAGE dla Hb bez hemu

Linia 2, oczyszczona globina bez hemu (10 mikrogramów/ml), w warunkach nieredukujących; linia 4 i 5, ta sama próbka globiny po redukcji (20 mM DL-ditiotreitol) (odpowiednio, 10 i 5 mikrogramów/ml); linia 7 i 8, dwie frakcje globiny bez hemu po rozdzieleniu na kolumnie chromatografii kationo-wymiennej (słabo widoczne prążki ze względu na niską rozpuszczalność białka); prawa linia, markery wagi cząsteczkowej.

Fig. 26: Chromatografia kationo-wymienna UNO-S® dla Hb poddanej działaniu HMB

Pik 1 zawiera nienaruszoną (tetrameryczną) Hb, pik 2 zawiera monomeryczne łańcuchy Hb (Mw = 17 kDa).

Fig. 27: Chromatografia Superdex S75® dla monomerycznych łańcuchów Hb (pik 2 z Fig. 26)

Fig. 28: Oczyszczanie monomerycznych łańcuchów Hb (patrz, Fig. 27) na kolumnie chromatografii aniono-wymiennej (UNO-Q)

Fig. 29: Analiza TLC surowego monofosforylowego lipidu A (MPLA, linia 2), wyizolowanego z Re-LPS ze szczepu F515 E.coli.

Odnośnikowy, oczyszczony penta-acylo MPLA (Rf = 0.71, linia 1) zawiera również mniejszą ilość heksa-acylo MPLA (Rf = 0.77). Odnośnikowy heksa-acylo MPLA (linia 4) zawiera śladowe ilości zanieczyszczeń 14:0 (3-OH) (Rf = 0.82).

Fig. 30: Ujemno-jonowa metoda MALDI-TOF spektrometrii masowej dla monofosforylo lipidu A (MPLAheksa) (obliczona masa cząsteczkowa m/z 17617.21)

Niewielkie piki należące do fragmentów MPLAheksa z M-(14:0) i M-[14:0(3-OH)] oraz M-[14:0

-14:0(3-OH)].

Fig. 31: Zarysy wykresu ¹H,¹H-COSY widma dla MPLAheksa (600 MHz, chloroform-d: metanol-d4, 300 K)

Protony przydzielone do GlcN 1 (H-1 do H-6a,b) i GlcN II (H-L do H-6a,b') i kwasów tłuszczowych 2^a, 2^b, 2^c, 2^d, 2^c', 2^d' itp. zostały wskazane na górze obrazu F₂ 1D widma ¹H-NMR.

PL 211 789 B1

Fig. 32: Indukcja rozpadu agregatów LPS przez płodową hemoglobinę owczą

Analizowano modulowanie ultrastruktur natywnych agregatów Re-LPS o wysokiej masie cząsteczkowej z F515 E.coli (lewy wykres) i formy S LPS z Salmonella enterica sv. Minnesota 188233 (prawy wykres) przez oczyszczoną płodową hemoglobinę owczą (s-HbF) stosując automatyczną analizę natywną PAGE, z użyciem aparatu PhastSystem^TM (Amersham Pharmacia Biotech). Przed niedenaturującą elektroforezą próby inkubowano w 37°C przez 30 min. Dla porównania, testowano preparaty ludzkiej i owczej hemoglobiny dorosłych (h-HbA i s-HbA) a integralność preparatów hemoglobiny weryfikowano dodatkową SDS PAGE (rysunki na dole). Na natywne (górne rysunki) i SDS Phast^TM żele (dolne rysunki) nakładano następujące próbki: linia 1 i 8: LPS (Re-LPS lub forma S LPS); linia 2: ludzka HbA; linia 3: LPS plus ludzka HbA; linia 4: owcza HbA; linia 5: LPS plus owcza HbA; linia 6: owcza HbF; linia 7: LPS plus owcza HbF.

Fig. 33: Indukcja rozpadu agregatów LPS przez płodową, owczą hemoglobinę bez grupy hemowej

Analizowano preparat płodowej, owczej hemoglobiny bez hemu (s-HbF/bez hemu) w porównaniu z s-HbA dorosłych i oryginalnym preparatem s-HbF, zawierającym jon żelaza grupy hemowej pod kątem aktywności przeciwagregacyjnej LPS, stosując automatyczną analizę natywną Phast^TM PAGE. Integralność preparatów hemoglobiny weryfikowano dodatkową SDS PAGE (rysunki na dole). Na natywne (górne rysunki) i SDS Phast^TM żele (dolne rysunki) nakładano następujące próbki: linia 1 i 8: LPS (Re-LPS lub forma S LPS); linia 2: owcza HbA; linia 3: LPS plus owcza HbA; linia 4: owcza HbF; linia 5: LPS plus owcza HbF; linia 6: owcza HbF bez hemu; linia 7: LPS plus owcza HbF bez hemu.

Fig. 34: Synergistyczny efekt (produkcja NO) Re-LPS i owczej HbF (a: 30 μg/ml; b: 10 μg/ml)

Fig. 35: Synergistyczny efekt (produkcja NO) Re-LPS i owczej HbF pozbawionej hemu (a: 30 μg/ml;b: 10 μg/ml)

Fig. 36: Synergistyczny efekt monofosforylolipidu A i owczej, pozbawionej hemu HbF (a: 30 μg/ml; b: 10 μg/ml)

Fig. 37: Synergizm produkcji TNFa w komórkach śledziony myszy z udziałem LPS i HB dorosłych lub płodowej

Komórki śledziony uzyskano od dawców: 3 C57BL/6 (8-tygodniowych samców). Komórki inkubowano w trzech powtórzeniach w 2 ml podłoża (z 10% płodową surowicą cielęcą i 200 ng/ml LPS) w stężeniu 1x10⁶ ml. Podłoże zawierało dodatkowo hemoglobinę dorosłych lub płodową (owcy) w różnych, określonych stężeniach. Supernatanty zbierano 24 godz. później i wykonywano analizę ELISA, w trzech powtórzeniach, pod kątem TNFa. Dane stanowią średnią arytmetyczną (±SD). Hodowle kontrolne (bez LPS, jedynie LPS lub jedynie Hb płodowa/dorosłych) dawały odpowiednio poziom < 50 ng/ml, < 70 ng/ml lub < 50 ng/ml.

Fig. 38: Synergizm produkcji IL-6 w komórkach śledziony myszy z udziałem LPS i HB dorosłych lub płodowej

Komórki śledziony uzyskano od dawców: 3 C57BL/6 (8-tygodniowych samców). Komórki inkubowano w trzech powtórzeniach w 2 ml podłoża (z 10% płodową surowicą cielęcą i 200 ng/ml LPS) w stężeniu 1x10⁶ ml. Podłoże zawierało dodatkowo hemoglobinę dorosłych lub płodową (owcy) w różnych, określonych stężeniach. Supernatanty zbierano 24 godz. później i wykonywano analizę ELISA, w trzech powtórzeniach, pod kątem II-6. Dane stanowią średnią arytmetyczną (±SD). Hodowle kontrolne (bez LPS, jedynie LPS lub jedynie Hb płodowa/dorosłych) dawały odpowiednio poziom < 100 ng/ml, < 120 ng/ml lub < 100 ng/ml.

Fig. 39: Synergizm produkcji TNFa w ludzkich PBL z udziałem LPS i HB dorosłych lub płodowej

PBL uzyskano w wyniku oczyszczania metodą „fikol-hipaque” z materiału od wolontariuszy. Komórki inkubowano w trzech powtórzeniach w 2 ml podłoża (z 10% handlowo dostępną, ludzką surowicą AB i 200 ng/ml LPS) w stężeniu 1x10⁶ ml. Podłoże zawierało dodatkowo hemoglobinę dorosłych lub płodową (owcy) w różnych, określonych stężeniach. Supernatanty zbierano 24 godz. później i wykonywano analizę ELISA, w trzech powtórzeniach, pod kątem TNFa. Dane stanowią średnią arytmetyczną (±SD). Hodowle kontrolne (bez LPS, jedynie LPS lub jedynie Hb płodowa/dorosłych) dawały odpowiednio poziom < 50 ng/ml, < 100 ng/ml lub < 65 ng/ml.

Fig. 40: Synergizm produkcji TNFa w ludzkich PBL in vitro z udziałem LPS i HB dorosłych lub płodowej

PBL uzyskano w wyniku oczyszczania metodą „fikol-hipaque” z materiału od wolontariuszy. Komórki inkubowano w trzech powtórzeniach w 2 ml podłoża (z 10% handlowo dostępną, ludzką surowicą AB) w stężeniu 1x10⁶ ml. Komórki inkubowano w obecności/bez 500 ng/ml łańcucha a- lub γ

PL 211 789 B1 płodowej hemoglobiny owczej. Komórki kontrolne inkubowano bez białka hemoglobiny (z lewego brzegu Figury). Ponadto, każdą grupę podzielono następnie na trzy grupy, które nie otrzymały dodatkowego materiału (puste słupki) lub 200 ng/ml LPS (pełne słupki). Supernatanty zbierano 24 godz. później i wykonywano analizę ELISA, w trzech powtórzeniach, pod kątem TNFa. Dane w części A i B stanowią wyniki niezależnych badań z użyciem różnych dawców wolontariuszy (±SD). W panelach a i b przedstawiono dane uzyskane z PBL od dwóch różnych dawców ludzkich.

Fig. 40a: W synergizmie między Hb a LPS pośredniczy łańcuch HbY

W eksperymencie tym analizowano klonowany łańcuch γ- i β owczej Hb w ekstraktach CHO (20 μg /ml) wraz z LPS (100 ng/ml) i wywołane pobudzenie komórek śledziony myszy in vitro do produkcji TNFa (wykrywanego po 24 godz. w teście ELISA)

Fig. 40b: Synergizm między MPLA a biochemicznie oczyszczonym łańcuchem γ płodowej Hb owczej określony produkcją TNFa ludzkich monocytów obwodowych

Fig. 40c: Wzmacniający wpływ CLP1b i CLP2p na synergizm między płodową Hb owczą (sHbF) i jej podstrukturami (wyizolowanymi łańcuchami) z LPS określony uwalnianiem TGFe z komórek śledziony myszy. Bardziej szczegółowo, patrz rozdział 8.4.2

Na dolnym panelu (przerywane linie) przedstawiono produkcję cytokin z LPS z CLP. Produkcja powyżej tej linii świadczy o synergizmie z frakcjami Hb i wskazuje jasno na istnienie „trójczynnikowego” synergizmu między LPS, frakcją Hb a pulą CLP.

Fig. 40d: Wzmacniający wpływ CLP2p na sHbF/LPS indukowane uwalnianie TNFa przez ludzkie monocyty obwodowe

Fig. 41: Synergizm surowiczej produkcji TNFa/IFNY po podaniu przez zgłębnik, pojedynczo lub razem, FSLE i LPS

Grupy 5 myszy otrzymywały 100 μl samej solanki lub 100 μl solanki zawierającej 300 μl FSLE przez zgłębnik lub LPS (10 μg/mysz), podane wewnątrzotrzewnowo lub przez zgłębnik. Dwie oddzielne grupy otrzymywały FSLE przez zgłębnik, jak również LPS, przez zgłębnik lub ip. Wszystkie myszy zostały uśmiercone po 24 godz. Krew zebrano poprzez nakłucie serca. Krew przechowywano w 4°C przez 4 godz. i po odwirowaniu na wysokich obrotach (10,000 obr/min przez 20 min), zbierano surowicę. Płyn surowiczy otrzewnej zbierano od poszczególnych myszy przez przemycie 2 ml gorącego medium z 10% płodowej surowicy cielęcej - komórki usuwano wirując (1500 obr./min. przez 10 minut w 4°C) a podłoże użyto do analizy cytokin. TNFa i IFNy analizowano w trzech powtórzeniach dla każdej próby w teście ELISA i analizie biochemicznej (patrz, Gorczynski i wsp., 2001, test ELISA); w badaniach biochemicznych mierzono inhibicję proliferacji komórek Wehi 279 (IFNy) lub komórek Wehi 1640 (TNFa) - w każdej z analiz odnotowano równoważne dane. Dane wyrażają średnie (±SD) dla 5 myszy/grupę, z użyciem 200 μl podłoża (10% płynu surowiczego otrzewnej) lub 20 μl surowicy.

Fig. 42: Inhibicja pobudzania produkcji cytokin typu 2 dorosłych myszy, po podaniu przez zgłębnik FSLE lub LPS

Grupy 5 dorosłych myszy C57BL/6 > 20 miesięcy lub 10-tygodniowe otrzymywały 100 μl samej solanki lub 100 μl solanki zawierającej 150 μg FSLE lub LPS (10 μg/mysz), samego lub w kombinacji, w 0 i 10 dniu. Wszystkie myszy uśmiercano po 20 dniach, zbierano komórki śledziony a komórki pobudzano in vitro w 2 ml podłoża dodając 10% płodową surowicę cielęcą w stężeniu 1x10⁶ komórek/ml i konkanawalinę A (ConA) w stężeniu 5 μg/ml. Supernatanty zbierano po 40 godzinach a cytokiny (IL-2 (puste słupki)/IL-4 (pełne słupki)) mierzono w ELISA [Gorczynski i wsp. 2001]. Dane wyrażają średnie arytmetyczne (±SD). W hodowlach kontrolnych (bez pobudzania ConA) uzyskano poziom IL-2 i IL-4 < 50 pg/ml dla wszystkich grup (dane nie przedstawione). Dane wyrażają średnie (±SD) dla 5 myszy/grupę.

Fig. 43: Synergizm w produkcji TNFa w surowicy po podaniu przez zgłębnik FSLE i LPS lub podaniu i.p. preparatów monofosforylolipidu A

Grupom 5 myszy podawano przez zgłębnik 100 μl roztworu fizjologicznego (słupki z prawej strony Fig.) lub 150 μg CLP lot 072 (słupki z lewej strony figury). W ciągu 15 minut myszy w różnych wskazanych grupach otrzymały ponadto 100 μl solanki bez dodatków lub 100 μg/ml LPS lub 30 μg/ml różnych, przedstawionych struktur częściowych lipidu A (heksa, penta i tetraacylowa). Wszystkie myszy uśmiercano po 24 godz. A krew zbierano przez nakłucie serca. Krew przechowywano w 4°C przez 4 godz. i po odwirowaniu przy wysokich obrotach (10,000 obr./min. przez 20 minut) zbierano surowicę. TNFa analizowano w trzech powtórzeniach dla każdej próbki w ELISA [Gorczynski i wsp., 2001). Dane wyrażają średnie (±SD) dla 5 myszy/grupę.

PL 211 789 B1

Fig. 45: Proliferacja splenocytów myszy po pobudzeniu za pomocą CLP1b, CLP2p i LPS u myszy dających odpowiedź na LPS (C57 BR/10 ScSn) i myszy niedających odpowiedzi na LPS (C57 Bl/10ScSr)

Fig. 46: Aktywność nieindukująca CLP1b i CLP2p u myszy dających odpowiedź na LPS (a) i myszy niedających odpowiedzi na LPS (b)

Fig. 47: Indukcja aktywności TCGI w BMDM myszy przez CLP1b i CLP2p

Mysie BMDM pobudzano bez (A) lub w z dodatkiem (B) jednorodnych komórek śledziony, stosując CLP1b lub CLP2p w stężeniach wskazanych i przetestowanych w teście aktywności TCGI na komórkach rakowych Abelson 8-1, zgodnie z opisem w Przykładzie 12.

Fig. 48: Wpływ FSLE na metastazę raka płuc 3-Lewis u myszy

Fig. 49: Aktywność, w której pośredniczą makrofagi, przeciwrakowa CLP2p ze zwierząt na różnym etapie rozwoju

Otrzymywano pule CLP2p z ekstraktów wątroby pochodzących ze zwierząt na różnym etapie rozwoju i testowano ich aktywność indukującą TCGI w BMDM myszy, zgodnie z opisem w Przykładzie 12.

Fig. 50: Aktywność względna CLP1b i CLP2p jako funkcja etapu rozwoju

Ekstrakty wątroby pochodzące od zwierząt na różnym etapie rozwoju rozdzielano na Sephadex G-100® otrzymując 5 frakcji (puli) przedstawionych na Fig. 3. Testowano ich indukującą aktywność TCGI na BMDM myszy, jak opisano w Przykładzie 3.1.1.3. Aktywność najbardziej aktywnej puli z każdego supernatantu umownie przyrównywano do 100 i pozostałe aktywności CLP1b i CLP2p wyrażano w odniesieniu do nich.

Fig. 51: Cytostaza nowotworu indukowana przez monocyty ludzkie stymulowane CLP1b lub CLP2p

Monocyty z ludzkiej krwi obwodowej pobudzano CLP1b lub CLP2p i badano ich aktywność cytostatyczną w stosunku 10:1 na U 937 komórkach rakowych. Stężenie roztworów wyjściowych wynosiło 20 mg/ml i 10 mg/ml, odpowiednio dla CLP1b i CLP2p.

Fig. 52: Mediatory cytostatyczne dla nowotworu uwalniane z monocytów ludzkich stymulowanych CLP1b lub CLP2p

Monocyty z ludzkiej krwi obwodowej pobudzano CLP1b [200 μg/ml] lub CLP2p [100 μg/ml] lub inkubowano w podłożu przez określone okresy czasu i badano aktywność cytostatyczną supematantów na U 937 komórkach rakowych. Jako odnośnik, przedstawiono proliferację nie traktowanych niczym komórek rakowych (kontrola).

Fig. 53: Indukcja aktywności LAK-komórkowej w ludzkich limfocytach przez pule CLP pochodzące od zwierząt na różnym etapie rozwoju

Monocyty wyizolowane z ludzkiej krwi obwodowej pobudzano mieszaniną 1:1 CLP1b i CLP2p, pochodzących z płodów, nowonarodzonych lub dorosłych zwierząt [50-80 μg/ml] lub IL-2 [100 U/ml] przez 3 dni i badano ich aktywność LAK-komórkową na komórkach rakowych Raji.

Fig. 54: Aktywność cytostatyczna monocytów ludzkich aktywowanych przez CLP1b/CLP2p skierowana przeciwko linii komórek rakowych LNCaP (E:T = Efektor : licz. komórki docelowe = 1:2)

Fig. 55: Aktywność cytostatyczna monocytów ludzkich aktywowanych przez LPS skierowana przeciwko linii komórek rakowych LNCaP (E:T = Efektor : licz. komórki docelowe =1:1)

Fig. 56: Kinetyka indukcji uwalniania tlenku azotu w BMDM myszy przez CLP1b i CLP2p

BMDM myszy pobudzano różnymi rozcieńczeniami wyjściowych roztworów CLP1b lub CLP2p (odpowiednio dla CLP1b i CLP2p, 40 mg/ml i 17 mg/ml). Uwalnianie tlenku azotu określano jako stężenie azotu w supernatantach hodowlanych w określonym czasie. Zastosowano rozcieńczenia: 1:100 (romby), 1:1000 (trójkąty na dół) i 1:10000 (trójkąty do góry). Jako kontrole użyto wyhodowane w podłożu makrofagi (koła).

Fig. 57: Inhibicja uwalniania tlenku azotu indukowanego przez CLP1b lub CLP2p, w wyniku dodania iNOS inhibitora L-NMMA

BMDM z myszy pobudzano różnymi stężeniami CLP1b lub CLP2p bez lub w obecności wskazanych stężeń i NOS inhibitora L-NMMA. Uwalnianie tlenku azotu określano po 48 godz.

Fig. 58: Wzmożenie uwalniania tlenku azotu indukowane przez CLP1b lub CLP2p w mysich BMDM przez IFNy

PL 211 789 B1

BMDM z myszy pobudzano różnymi stężeniami CLP1b (550, 55, 5.5 μg/ml) lub CLP2p (290, 29, 2.9 μg/ml) bez lub w obecności 0.5 U/ml rekombinowanego mlFNY. Uwalnianie tlenku azotu określano po 48 godz.

Fig. 59: Uwalnianie cytokin przez ludzkie leukocyty, stymulowane przez CLP1b lub CLP2p

Prowadzono hodowle pełnej krwi ludzkiej i pobudzano je przez 48 godz. CLP1b [200 μg/ml lub CLP2p [100 μg/ml]. Jako kontrolę pozytywną zastosowano PHA [10 μg/ml]. Uwalniane do supernatantu cytokiny wykrywano za pomocą testu ELISA.

Fig. 60: Uwalnianie cytokin przez ludzkie monocyty krwi obwodowej, stymulowane przez CLP1b lub CLP2p

Wyizolowane z krwi obwodowej ludzkie monocyty, pobudzano CLP1b [140 μg/ml] lub CLP2p [120 μg/ml]. Cytokiny uwolnione do supematantów hodowlanych wykrywano stosując ELISA w odpowiednio wskazanym czasie.

Przykłady obrazują wynalazek.

1. P r z y k ł a d 1

Otrzymywanie ekstraktu z płodowej wątroby owczej (FSLE)

Uśmiercano ciężarne owce z 2-4 tygodniowym płodem w zdezynfekowanym parą pomieszczeniu. Płody w owodni uzyskiwano w całości, w wyniku cesarskiego cięcia i natychmiast, w warunkach chłodniczych przenoszono do laboratorium. Kolejne etapy przeprowadzono w temperaturze +4°C. Owodnie dezynfekowano, rozdzielano od płynu owodniowego, a organy płodu, szczególnie wątrobę, preparowano w sterylnych warunkach. Wątrobę przemywano sterylną wodą, tętnice czyszczono wodą stosując sterylne strzykawki. Następnie, cięto na małe kawałki, o średnicy około 1 cm, kawałki te przenoszono natychmiast do ciekłego azotu i gromadzono w zamrażalce w -80°C.

Próby liofilizowano i sproszkowywano w aparacie RETSCH (Shieritz & Hauenstein AG, Arlesheim, Szwajcaria), stosując filtr o średnicy 0.25 mm. Proszek przechowywano w sterylnych kolbach w -80°C aż do wykorzystania do ekstrakcji.

Wydajność proszku z wątroby płodowej (FLP, liofilizowany homogenat wątrobowy) wynosiła 18% początkowej wagi świeżej wątroby. Masa wątroby pojedynczego płodu, pobranej między 2 a 4 tygodniem przed urodzeniem była rzędu 100-120 g.

W ramach kontroli jakościowej, próby FLP ad hoc mogą być analizowane chemicznie (profil białkowy, patrz. Fig. 12) i/lub biologicznie (aktywność przeciwrakową, patrz Fig. 3).

Prowadzono ciągłą kontrolę zdrowia zwierząt, w szczególności by mieć pewność, że hodowane owce nie posiadają znanych wirusów. Ultrawirowanie ekstraktu wątrobowego mogłoby prowadzić do sedymentacji potencjalnie obecnych wirusów. Ponadto, etap pasteryzacji [Heimburger, H., 1989] powoduje inaktywację wszystkich znanych wirusów bez obniżenia odpowiednich właściwości biologicznych. Można też podkreślić, że priony nie występują w FLP, ponieważ wątroba owcy nie zawiera ani białek prionów (PrP^c) ani mRNA kodującego priony [Horiuchi, M., 1995].

1.1 Ekstrakcja

Proszek z wątroby płodowej (1 kg) wymieszano z 6.5 l sterylnego NaCl (0.9%) i mieszano przez 10-15 min na mieszadle magnetycznym (Colora) w 4°C. Mieszaninę wirowano przy 12.5000 obr./min przez 50 min stosując wirówkę Beckman-Coulter. Następnie, supernatant ultrawirowano przy 50.000 obr./min. (Beckman-Coulter, Optima L70 Kin) przez 1 godz. Supernatant filtrowano sterylnie stosując filtry Gelman (Super DCF, klasa farmaceutyczna, sterylny 0.8/0.2 nm EFA: 1000 ml (CFS 92-DS)). Wydajność z FSLE wynosiła około 2.5-2.7% na 1 kg proszku z wątroby. Zawartość białek w ekstrakcie szacowano w Autoanalyser/Integra 400 (Roche Diagnostics) i określono na rzędu 50 g/l. Porcje zawierające 300 mg białek (=1 jednostka U), tj. 6 ml ekstraktu, umieszczono w kolbach o zawartości 25 ml i liofilizowano. Zatem, jedna liofilizowana jednostka, składała się z około 300 mg białka, 60 mg soli nieorganicznej (głównie NaCl) i w przybliżeniu 320 mg nie zawierającego białka materiału organicznego, tak, że jedna jednostka stanowiła w sumie około 680 mg.

Podsumowując, z 1 kg FLP (proszku z wątroby płodowej) otrzymywano około 400 jednostek (każda z 300 mg białka). Zawierały one w przybliżeniu 250 g ekstrahowanego materiału organicznego lub 25% całkowitej masy proszku. Tak uzyskane FSLE zawierały zgodnie z analizą Limulus-lizatu równoważniki LPS rzędu 10 ng/g ekstraktu.

Kolby z liofilizowanym FSLE przechowywano w zamrażalce w -80°C aż do momentu ponownego rozpuszczenia do dalszego zastosowania.

Do klinicznego zastosowania, liofilizowana jednostka pobierano w wodzie sterylnej, roztwór izotoniczny (do iniekcji) uzyskiwano stosując osmometr (Knauer, Berlin). W powyższych warunkach

PL 211 789 B1 eksperymentu dodawano 7 ml wody do 1 liofilizowanej jednostki. Liofilizowany materiał jest łatwo rozpuszczalny w wodzie, dając klarowny roztwór o lekko żółto-brązowawym zabarwieniu.

1.2 Protokół rutynowego testu dla FSLE przez; in vitro aktywację komórek śledziony myszy i makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) do cytotoksyczności wobec raka z uczestnictwem makrofagów dni przed eksperymentem, myszy (Balb/c x C57BI/6) zaszczepiano S.c. roztworem 0.5 ml zawierającym 1 mg FSLE. Dnia 0 zwierzęta uśmiercano, pobierano śledziony i hodowano komórki.

Inkubowano komórki, tj. 10⁶ komórek śledziony, 10⁵ BMDM (nie aktywowane) i 10³ rakowych (chłoniaka Abelson 8.1). Równoległe hodowle, służące jako kontrole zawierały i) jedynie komórki rakowe, ii) komórki rakowe + makrofagi, iii) komórki rakowe + makrofagi + komórki śledziony z nie traktowanych według FSLE zwierząt.

Komórki rakowe w kontrolach ii) i iii) muszą wykazywać taki sam lub lepszy wzrost, jak w kontroli i). W ten sposób kontrolowano nieaktywowany poziom makrofagów i komórek śledziony z nietraktowanych myszy.

W różnych odstępach czasowych (48, 72 i 96 h) od rozpoczęcia hodowli, szacowano wzrost komórek rakowych w różnych zestawach, przy użyciu testu fosfatazy alkalicznej [Modolell, M., 1994]. Potencjał biologiczny FSLE szacowano ilościowo zgodnie ze wzorem:

(Wzrost komórek rakowych w obecności aktywowanych komórek śledziony + makrofagów) / / (Wzrost komórek rakowych) x 100

Na Fig. 3 przedstawiono wyniki uzyskane dla 12 próbek. Odnotowane wariacje odzwierciedlają różnice poszczególnych myszy, z których pobrano komórki odpornościowe.

2. P r z y k ł a d 2

Frakcjonowanie FSLE; otrzymywanie puli CLP1b i CLP2p

1.5 g liofilizowanego ekstraktu wątroby płodowej rozpuszczono w 8 ml wody i dializowano przez noc (torby do dializy o przepuszczalności 3.500 Da) wobec 10 objętości 0.03 M buforu fosforanowego (pH 7.4), dokonując dwóch zmian buforu do dializy. Dializowany ekstrakt doprowadzony do 10 ml buforem nakładano na kolumnę G-100 Sephadex® (Pharmacia; objętość 600 ml, średnica 24 mm, długość 130 cm), zrównoważoną tym samym 0.03 M buforem fosforanowym. Wymywane frakcje (8 ml) zbierano i mierzono ich gęstość optyczną przy 280 nm. (Patrz profil elucji na Fig. 4). Frakcje zebrano w pulach i 5 pul nazwano CLP1, CLP1b, CLP2p, CLP2 i CLP2b. Jak pokazano na Fig. 4, CLP1b zawarta jest między końcem ostrego obniżenia gęstości optycznej puli I a następnym ostrym obniżeniem gęstości optycznej, odpowiadając frakcjom 53 do 71 (objętość elucji 424 do 568 ml). CLP2p mieści się między końcem puli I-bis a wzrostem gęstości optycznej puli II odpowiadając frakcjom 72-82 (objętość elucji 576 do 656 ml).

Zebrane w pule frakcje liofilizowano, rozpuszczano w jednej dziesiątej początkowej objętości w wodzie, dializowano wobec roztworu fizjologicznego buforowanego fosforanem (PBS) rozcieńczonego 1/3 (oryginalny PBS = 0.14 M NaCl w 0.01 M fosforanie, pH 7.4), po czym próby liofilizowano.

W testach biologicznych stwierdzono, że grupa aktywności biologicznych skupia się w puli CLP1b i CLP2p. Z 1.5 g FSLE wydajność dla CLP1b wynosiła 40 ± 4 mg a dla CLP2p « 10 ± 3 mg. Obie pule otrzymano zatem w ilości w sumie ok. 50 mg, tj., w przybliżeniu 3% FSLE. Zawartość LPS w pulach CLP1b i CLP2p była rzędu 100 ng/mg (tj.,100 μg/g).

Należy zauważyć, że etap dializy nie prowadził do jakiejkolwiek utraty aktywności biologicznych FSLE lub otrzymywanych puli CLP (patrz poniżej), jak pokazano na Fig.5 dla CLP2p.

3. P r z y k ł a d 3

Analiza biochemiczna i fizykochemiczna FSLE i puli CLP1b i CLP2p

3.1 Metody

3.1.1. Układ analizy biologicznej

3.1.1.1. Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy różnicowano in vitro z komórek prekursorowych szpiku kostnego, zgodnie z opisem [Hoffmann, P., 1989]. W skrócie, komórki szpiku kostnego wypłukiwano z kości udowej i piszczelowej 6- do 8-tygodniowych myszy BALB/c (Charles River; Sulzfeld lub MPI for Immunobiology, Freiburg, FRG), przemywano dwukrotnie w RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein, FRG) i hodowano przez 11 dni w teflonowych torbach z filmem (SLG, Gauting, FRG) w 37°C i 5% CO2. Podłoże hodowlane składało się z RPMI 1640, uzupełnionego 15% podłoża komórkowego L-uwarunkowanego i stanowiło źródło M-CSF (patrz poniżej), 10% inaktywowanej cieplnie FCS, 5% inaktywowanej cieplnie surowicy końskiej, 1 mM pirogronianu sodu,

PL 211 789 B1

U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny (wszystkie z Seromed Biochrom KG, Berlin, FRG) i 5x 10^-5M 2-merkaptoetanolu. Hodowle nastawiono z 6x10⁶ komórek/50 ml. Po zebraniu, makrofagi przemywano, zliczano i zawieszano ponownie w 2x10⁶ komórek/ml w DMEM z 4.5 g/l glukozy (Seromed Biochrom KG), uzupełnionym 10% FCS, 2 mM L-glutaminy, 1% endogennych aminokwasów (NEAA), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (cDMEM). W celu uzyskania podłoża dostosowanego L-komórkowo, hodowano 1x10⁵ L 929 komórek/ml w 100 ml partiach w kolbach do hodowli komórkowej (Falcon, Becton Dickinson, Heidelberg) w podłożu RPMI 1640 z 10% FCS, 4 mM L-glutaminą, 1% NEAA, 100 U/ml penicyliny i 100 g/ml streptomycyny w 37°C i 5% CO2. Po 7 dniach, gromadzono płyny hodowlane, oczyszczano ze szczątek komórkowych poprzez wirowanie (1500 x g, 15 min) i przechowywano w -20°C.

3.1.1.2 Linia komórek rakowych

Linię komórek rakowych chłoniaka Abelson 8-1 komórek B myszy utrzymywano w cDMEM, na 6-studzienkowych płytkach (Falcon, Becton Dickinson), w 37°C, 10% CO2. Komórki wzrastały do uzyskania znacznej konfluencji w studzience hodowlanej, po czym poddawano je dwóm pasażom w tygodniu.

3.1.1.3 Określenie aktywności przeciwrakowej z uczestnictwem komórek (analiza TCGI)

Stosowano test fosfatazy alkalicznej [Modolell, M., 1994] do określania inhibicji wzrostu komórki rakowej z udziałem makrofagów [Hoffmann, P., 1989]. Hodowle nastawiano w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania o całkowitej objętości 200 pl. 5x10³ komórek rakowych wraz z 1x10⁵ BMDM i pulami CLP w różnych stężeniach hodowano w cDMEM, przy 10% CO2. Po 3 dniach płytki odwirowywano przy 660 x g przez 2 min a Supernatanty dekantowano. Do każdej studzienki dodano 100 pl buforu, pH 10.2 zawierającego dietanoloaminę (200 mM), MgCl₂ (2 mM), Triton Χ-100 (10%) i p-nitrofenylofosforan (10 mM) i płytki inkubowano przez 60 min w RT, w ciemności, na wytrząsarce horyzontalnej. Reakcję enzymatyczną zatrzymywano przez dodanie 100 pl/studzienkę 0.5 M NaOH. Mierzono O.D. przy 405/490 nm w automatycznym czytniku ELISA (MRX Dynatech, Denkendorf, FRG). Studzienki o O.D.>3.000 rozcieńczano odpowiednio 0.5 M NaOH na nowych płytkach i mierzono ponownie. Wartości O.D. hodowli zawierającej komórki rakowe i niepobudzane komórki efektorowe przyjęto jako 100%.

3.1.1.4 Indukcja produkcji tlenku azotu (NO) w BMDM myszy

Dojrzałe BMDM zbierano po 10 min inkubacji na lodzie, po której delikatnie zwijano teflonowe torby. Komórki raz przemyto i zawieszono ponownie w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS, 1% NEAA, 100 U/ml penicyliny i 100 pl/ml streptomycyny. 1x10⁵ komórek/studzienkę zaszczepiano w studzienkach 96-studzienkowej płaskodennej płytek do mikromiareczkowania (Falcon, Becton Dickinson) i pobudzano różnymi stężeniami pul CLP +/- IFN-γ (4-20 U/ml) w całkowitej objętości 150 pl. Supernatanty z hodowli zbierano po 24 lub 48 h i sprawdzano pod kątem stężenia azotynu, jak niżej opisano. Wszystkie analizy wykonano w trzech powtórzeniach.

3.1.1.5 Określenie uwalniania tlenku azotu (NO) przez makrofagi myszy

Produkcję NO przez makrofagi [Suehr, D.J., 1989] określano mierząc azotyn, stabilny metabolit NO, w supernatantach hodowlanych stosowano odczynnik Griess [Green, L.C., 1982]: 100 pl supernatantu pohodowlanego mieszano ze 100 pl odczynnika Griess'a (1% sulfanilamidu i 0.1% N-(1-naftylo)etylenodiaminy w 2.5% kwasie fosforowym) i dokonywano pomiaru absorbancji przy 570 nm, stosując czytnik płytkowy Dynatec MRX ELISA (Denkendorf, FRG). Stężenia azotynu obliczano z krzywej standardowej otrzymanej dla azotynu sodu. Od wszystkich wartości odjęto absorbancję samego podłoża RPMI 1640.

3.1.1.6 Rozdzielenie FSLE i puli CLP w SDS-PAGE

Analizę SDS-PAGE dla FSLE i puli CLP wykonano zgodnie ze standardowymi procedurami, stosując 12-20% żele [Laemmli, U.K., 1970].

3.2 Wyniki

3.2.1 Stabilność temperaturowa głównego przeciwrakowego aktywatora makrofagowego w CLP1b i CLP2p

W celu zbadania wpływu wstępnego ogrzewania na silne pobudzenie aktywności przeciwrakowej, w której uczestniczą makrofagi, przez CLP1b i CLP2p, 0.25 mg liofilizowanego materiału rozpuszczano w wodzie, w pH 5.8 lub 20 mM buforze octanu sodu, pH 4.7 i inkubowano przez 60 min, odpowiednio w 4°C i 100°C. Aktywność przeciwrakową makrofagów w traktowanych ciepłem i kontrolnych próbach określano w analizie inhibicji wzrostu komórki rakowej (TCGI) (patrz, Przykład 3.1.1.3)

PL 211 789 B1 według [Modolell, M., 1994], stosując wspólne hodowle komórek rakowych Abelson 8-1 z zróżnicowanymi in vitro makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego z myszy BALB/c [Hoffmann, P., 1989].

Ogrzewanie CLP1b i CLP2p w 100°C do 1h w pH 5.8, jak i w pH 4.7 - te drugie warunki znane są jako sprzyjające wybiórczemu odcinaniu labilnych w kwaśnym pH łańcuchów bocznych oligosacharydowych lub polisacharydowych z glikokoniugatów - w porównaniu z próbami kontrolnymi, nie prowadziło do znaczących zmian aktywności przeciwrakowej makrofagów przez preparaty CLP. Udowodniono, że kierowana przez makrofagi aktywność immunostymulująca w CLP1b i CLP2p jest stabilna temperaturowo (Fig. 6).

3.2.2 Oporność proteazowa głównego przeciwrakowego aktywatora makrofagowego w CLP1b i CLP2p

W celu dalszej biochemicznej charakterystyki przeciwrakowego aktywatora makrofagowego, pule CLP1b i CLP2p poddawano trawieniu proteolitycznemu. Nie zawierające pirogenu preparaty proteinazy K, pronazy, papainy, subtylizyny, trypsyny i endoproteazy Glu-C (proteaza V8) nabyto z Boehringer Mannheim (Niemcy). Następnie, 0.24 mg CLP1b i CLP2p poddawano działaniu każdej z wybranych proteaz w stosunku enzymu do całkowitego białka 1:10 (wag./wag.) w 0.24 ml wody nie zawierającej pirogenu w 37°C przez 21 h. Po dodaniu sond do analizy SDS-PAGE w 15% (wag./obj.) żelach akrylamidowych i kolejne barwienie srebrem pozostałe próby inkubowano w 100°C przez 30 min w celu inaktywowania poszczególnych proteaz. Próby traktowane proteazami i nietraktowane kontrole i CLP1b i CLP2p ostatecznie badano w analizie TCGI pod kątem aktywacji przeciwrakowych makrofagów (porównaj Przykład 3.1.1.3).

Całościowa lub częściowa degradacja białek CLP1b i CLP2p, i następnie etap inaktywacji nie spowodowały znaczących zmian w aktywnościach przeciwrakowych makrofagów w żadnym z preparatów CLP, jak stwierdzono w analizie TCGI (Fig. 7A i 7B). Aktywator przeciwrakowych makrofagów w CLP1b i CLP2p okazał się być silnie oporny na proteazy.

3.2.3 Wrażliwość aktywatora przeciwrakowych makrofagów w CLP1b na działanie jodanem w łagodnych warunkach

Analizowano skutki łagodnego utleniania aktywatora przeciwrakowego makrofagów w CLP1b w wyniku traktowania jodanem sodu (NalO4) w 4°C. W skrócie, 2.5 mg porcje liofilizowanego materiału rozpuszczono w 0.9 ml 100 mM buforu octanu sodu, pH 4.7, w fiolkach z ciemnego szkła. Utlenianie jodanem wykonano po dodaniu 0.1 ml 2.5 mM jodanu sodu w 4°C i 2h ciągłym mieszaniu. Reakcję zatrzymano przez dodanie 0.01 ml glikolu etylenowego. Próby dializowano wobec wody nie zawierającej pirogenu w torbach do dializy Spektra/Por® (i.d. 11.5 mm; próg przepuszczalności: 3500 Da; Serva, Niemcy) i liofilizowano. Próby 0.25 mg suszonego sublimacyjnie materiału poddawano metanolizie w 0.5 M HCl/metanol w 45°C przez 45 min i peracetylacji w acetanowodorku/pirydyna (85°C, 30 min) i analizowano skład monosacharydów przy użyciu gazowo-cieczowej chromatografii/spektrometrii masowej. Pozostała część prób i odpowiadające im kontrole ostatecznie testowano w analizie TCGI pod kątem aktywacji makrofagów przeciwrakowych.

Poddanie CLP2p działaniu jodanu sodu w łagodnych warunkach reakcji spowodowało wybiórczą redukcję kwasu sialowego zawartego w preparacie (co sugeruje obecność glikoprotein), co stwierdzono na podstawie analizy GC/MS i znaczne obniżenie inhibicji wzrostu, regulowanej przez makrofagi i zniszczenia komórek rakowych, co stwierdzono na podstawie analizy TCGI (Fig. 8). Zatem, aktywator przeciwrakowych makrofagów w CLP2p okazał się być wrażliwym na jodan sodu w łagodnych warunkach reakcji, co wskazuje, że węglowodanowa część cząsteczki(-ek) uczestniczy w aktywności TCGI. Inaktywacja utlenianiem LPS przez działanie jodanem sodu została opisana przez Neter i Godin [Neter, E., 1956; Godin, D.V., 1983]. Dane te są zgodne z wnioskiem, że LPS włączony jest w aktywację makrofagową przez CLP2p.

3.3 Identyfikacja składników CLP1b i CLP2p

3.3.1 Lipopolisacharyd (LPS, endotoksyna)

3.3.1.1 Analiza Limulus Amoebocyte Lysate, Test LAL

W celu zbadania potencjalnego występowania lipopolisacharydu bakteryjnego (LPS) w CLP1b i CLP2p, przeprowadzono dwa handlowo dostępne testy: chromogenną analizę Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) - test QCL-100® (BioWhittaker; Walkersville, Maryland, U.S.A.) i test endotoksynowy COATEST® (Charles River Endosafe, Charleston, U.S.A.). W skrócie, liofilizowane preparaty CLP rozpuszczano i odpowiednio rozcieńczano w wodzie do reakcji LAL (<0.005 EU/ml) uzyskanym z BioWhittaker (Walkersville, Maryland, U.S.A.). W celu inaktywacji potencjalnie zakłócających białek, próby inkubowano wstępnie w 75°C przez 5 min, po czym energicznie wytrząsano i sonifikowano

PL 211 789 B1 przez 30 min w 37°C. Następnie, próby poddawano testowi LAL zgodnie z protokołem producenta, stosując jako standard do kalibracji LPS otrzymany z E.coli O111:B4. Oprócz w sumie 16 partii z CLP1b i CLP2p, 3 różne partie ekstraktu płodowej wątroby owczej analizowano w opisanym wyżej teście procedury LAL.

Za pomocą obu chromogennych analiz LAL [Levin, J., 1982], wykryto niskie, lecz znaczące ilości endotoksyny w preparatach CLP1b/2p. Stwierdzono, że widoczna zawartość LPS w poszczególnych partiach CLP1b i CLp2p ulegała wahaniom ze średnią 100 ng (1000 EU) na mg (100 μg/g), jak wykazano w 12 partiach preparatów CLP. Wyniki LAL dla 3 partii ekstraktu płodowej wątroby owczej (FSLE) ujawniły widoczną zawartość LPS w przybliżeniu 10 ng równoważników LPS na g liofilizowanego materiału. Zatem, stwierdzono, że ilość widocznego LPS w FSLE jest istotnie niższa w porównaniu z CLP1b i CLP2p wskazując na średnie zwiększenie około 10,000-krotne materiału reaktywnego w LAL.

Na podstawie tych wyników i obserwacji oporności temperaturowej i na proteazy wywnioskowano, że aktywator makrofagowy, wzmocniony w CLP1b i CLP2p zawiera głównie endogenny LPS oddziałujący ze składnikami płodowej wątroby owcy (porównaj Przykład 4).

3.3.1.2 Adsorpcja LPS oparta na polimiksyno Affi-Prep®

W celu wyłapania wykrytego w testach LPS-u z CLP1b i CLP2p, próby nałożono na LPS specyficzną żywicę powinowactwa polimiksyno Affi-Prep®, nabytą z BIO-RAD (Hercules, Kalifornia, U.S.A.). Preparaty CLP inkubowano w końcowym stężeniu 1 mg/ml w 0.7 ml nie zawierającej pirogenu wodzie, w 4°C przez 14 h, delikatnie wstrząsając w obecności lub braku 0.05 mg sorbentu powinowactwa. Następnie, sedymentowano żywicę powinowactwa poprzez wirowanie przy 5000xg przez 5 min a supernatanty testowano w analizie TCGI.

Jak przedstawiono na Fig. 9, działanie polimyksyny B (PxB) na CLp2p znacznie zmniejszyło jego aktywność biologiczną (TCGI) [Rifkind, D., 1967]. Jak wiadomo, LPS jest neutralizowany przez PxB, wynik ten zatem potwierdza pogląd, że LPS jest biologicznie aktywnym składnikiem CLP2p.

3.3.1.3 Indukcja uwalniania tlenku azotu w BMDM u niedających odpowiedzi LPS myszy

Aktywność indukującą NO CLP1b i CLP2p określano dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego z dających odpowiedź LPS (C57B1/10 ScSn) i niedających odpowiedzi LPS (C57B1/10 ScCr) myszy [Freudenberg, M.A., 1991]. Jak pokazano na Fig. 10, uwalnianie NO w odpowiedzi na pule LPS jest znacznie zmniejszone w BMDM z niedających odpowiedzi LPS myszy, w porównaniu z obserwowanym dla dających odpowiedzi LPS myszy. Jednakże, ciągle pozostaje niska, lecz znacząca, zależna od dawki indukcja uwalniania NO również w BMDM z niedających odpowiedzi LPS myszy, które jednakże, inaczej, nie przejawiają lub jedynie marginalne wydzielają NO po pobudzaniu wyizolowanym LPS z Salmonella abortus equi lub Escherichia coli.

Wyniki wskazują, ze głównym induktorem NO w puli CLP jest LPS, lecz również, że dodatkowy składnik(-i) wątroby płodowej, możliwe o charakterze białkopodobnym, uczestniczy(-ą) w aktywności biologicznej puli CLP.

3.3.1.4 Jednoczesne pobudzanie makrofagów LPS/CLP2p i rekombinowanymi cytokinami

LPS, jak również wiele określonych cytokin, włączając IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13 oraz IFNy pobudzają makrofagi do produkcji innych cytokin in vitro i in vivo. W celu porównania materiału w pulach CLP z tymi pobudzającymi czynnikami, porównywano skutki hodowanych makrofagów lub komórek dendrytycznych z CLP2p lub samymi rekombinowanymi cytokinami lub z mieszaninami tych czynników. Ponadto, komórki potraktowano CLP2p lub cytokinami w obecności przeciwciał monoklonalnych do cytokin. Produkcję cytokin mierzono w teście ELISA (wszystkie odczynniki nabyte z Pharmingen, San Diego, USA). Należy zauważyć, że stwierdzono, że FSLE nie zawierał IL-2, IL-6 i IL-10.

IL-12 jest pierwszorzędowym fizjologicznym bodźcem do produkcji cytokin przez makrofagi podczas zapalenia [Wang, J., 1999] i LPS może uczestniczyć w jego efektach pobudzających poprzez indukowanie produkcji IL-12. Podobnie, IL-13 może być fizjologiczną substancją zlicząjącą-regulującą pobudzania przez IL-12 [Machado, F., 1998]. W celu porównania efektów pobudzania CLP1b i CLP2p tymi rekombinowanymi cytokinami, przed analizą produkcji cytokin, komórki adherentne śledziony hodowano z LPS (1 μg/ml), CLP2p lub z rIL-12 lub rIL-13, samymi lub w kombinacji. W kilku hodowlach włączono przeciwciało monoklonalne do LI-12. (Cytokiny rekombinowane otrzymywano zgodnie z konwencjalnymi protokołami). Dane uzyskane z 3 takich badań przedstawiono w Tabeli 1.

PL 211 789 B1

T a b e l a 1:

Jednoczesne pobudzanie makrofagów z CLP2p i rekombinowanych cytokin

Poddanie działaniu3	Poziom cytokin w supernatantach hodowlanychb
	TNFa	IL-1	IL-6
	Ng/ml		pg/ml
brak	<10	2.0	24
LPS (1 pg/ml)	135	190	362
CLP2p (0.3 pg/ml)	85	135	167
RIL-12 (0.1 pg/ml)	149	235	359
RIL-13 (0.1 pg/ml)	40	15	1040
CLP2p+rIL-12	92	370	152
CLP2p+rIL-13	90	705	1140
CLP2p+anty-IL-12 (10 pg/ml)	20	180	1250
LPS+rIL-12	166	340	790
LPS+rIL-13	69	110	1450
LPS+anty-IL-12	68	80	75

^a Świeże komórki adherentne śledziony otrzymane z puli 4-8 tygodniowych myszy DBA/2. 500 pl hodowli zawierającej 0.5 x 10⁶ komórek/ml inkubowano w trzech powtórzeniach w danych warunkach, pokazano wyniki dla 18 h i supernatanty zebrane z równoważnych grup do analizy cytokin.

^b Średnia arytmetyczna (±SD) dla niezależnych analiz, każda wykonana w trzech powtórzeniach.

Pobudzanie LPS i CLP2p wydaje się być podobne do pobudzania przez rIL-12. Istnieje pewne oddziaływanie synergistyczne z rIL-12; pobudzanie produkcji cytokin przez LPS jest znacznie inhibitowane przez anty-IL-12 i ostatecznie, rIL-13 znacznie antagonizuje produkcję cytokin przez LPS (z kolejną indukcją zwiększonego poziomu IL-6). Oczywiście, pobudzanie przez CLP2p powiela wiele efektów pobudzania LPS (i/lub rlL-12).

3.3.1.5 Inhibicja LPS lub CLP2p indukowanej aktywacji makrofagowej przez przeciwciała skierowane przeciwko CD14

Biorąc pod uwagę podobieństwo pobudzania indukowanego w adherentnych komórkach śledziony przez LPS i CLP2p, badano czy CLP2p może rzeczywiście pobudzać komórki po związaniu (i aktywowaniu) z CD14, cząsteczką powierzchniową makrofagów, istotną w pobudzaniu, w którym uczestniczy LPS. Stosując handlowe przeciwciało monoklonalne przeciw-CD14 (UCHM-1, Sigma), porównywano pobudzanie produkcji IFNa przez komórki adherentne śledziony w obecności/braku różnych stężeń przeciwciała przeciwko CD14. Dane uzyskane z trzech takich eksperymentów przedstawiono w Tabeli 2. Dane wskazują, że CLP2p jest znacznie inhibitowany przez przeciwciała przeciwko CD14 i że nie było żadnych dostrzegalnych różnic w inhibicji aktywności LPS i CLP2p.

T a b e l a 2:

Inhibicja pobudzania komórek dla LPS lub CLP2p przez przeciwciała anty-CD14

Bodzieca	Dodane przeciwciało anty-CD14b	TNF-ac ng/ml	Inhibicja %
1	2	3	4
Brak	Brak	<10
Brak	10 pg/ml	<10
LPS (1 pg/ml)	Brak	138 ± 24	-
LPS (1 pg /ml)	10 pg/ml	26 ± 8	81

PL 211 789 B1 ciąg dalszy Tabeli 2

1	2	3	4
LPS (1 gg /ml)	2.5 gg /ml	58 ± 10	58
CLP2p (0.3 gg /ml)	Brak	98 ± 21	-
CLP2p (0.3 gg /ml)	10 gg /ml	20 ± 5	80
CLP2p (0.3 gg /ml)	2.5 gg /ml	53 ± 10	46

^a Świeże komórki adherentne śledziony otrzymano z puli 4 do 8 tygodniowych myszy DBA/2. 500 gl hodowli zawierającej 0.5 x 10⁶ komórek/ml inkubowano w trzech powtórzeniach w danych warunkach przez 18 h a supernatanty zebrano z równoważnych grup do analizy cytokin.

^b Próby, do których dodano anty-CD14 podczas pobudzania z LPS/CLP2p, wskazano użyte stężenia. W testach kontrolnych z wykorzystaniem standardowej ilości rTNFa, stężenia dodanego przeciw-CD14 w analizie cytokin nie zmieniały wykrytego poziomu TNF-α.

^c Średnia arytmetyczna (± SD) z 3 niezależnych analiz, każdej wykonanej w trzech powtórzeniach.

3.3.1.6 Indukcja tolerancji na pobudzanie CLP2p przez LPS

Ostatnie badania wykazały, że pobudzanie makrofagów przez LPS może być inhibitowane przez wstępną inkubację tych samych komórek z niższym od optymalnego (1/100 optymalnej dawki aktywacyjnej) stężeniem LPS [Ziegler-Heitbrock, H.-W., 1992]. W celu zbadania możliwej tolerancji krzyżowej, indukowanej przez LPS dla optymalnego pobudzenia przez LPS lub CLP2p, komórki inkubowano wstępnie z LPS lub CLP2p. 18 godz. później, analizowano produkcję TNF-α. Dane uzyskane w trzech doświadczeniach przedstawiono w Tabeli 3.

T a b e l a 3:

Indukcja tolerancji na pobudzanie CLP2p przez LPS

Wstępne działaniea	Pobudzanieb	Wyprodukowany TNFac ng/ml	Inhibicja %
Podłoże	Brak	<10	-
Podłoże	LPS (1 gg/ml)	155 ± 20	-
Podłoże	CLP2p (0.3 gg/ml)	124 ± 18	-
LPS (10 ng/ml)	Brak	20 ± 5	-
LPS (10 ng/ml)	LPS (1 gg/ml)	30 ± 8	81
LPS (10 ng/ml)	CLP2p (0.3 gg/ml)	33 ± 10	77
LPS (10 ng/ml) + Wort (0.3 mM)	Brak	14 ± 4
LPS (10 ng/ml) + Wort (0.3 mM)	LPS (1 gg/ml)	149 ± 23	4
LPS (10 ng/ml) + Wort (0.3 mM)	CLP2p (0.3 gg/ml)	127 ± 21	0

^a 6 x 10⁶ świeżych komórek adherentnych śledziony wyizolowanych z puli 4-8 tygodniowych myszy DBA/2 inkubowano przez 24 godz. z samym podłożem (pierwsze trzy rzędy) lub podłożem z 10 ng/ml LPS (następnych sześć rzędów) lub 3 ng/ml CLP2p (ostatnie trzy rzędy). Pewne komórki potraktowane wstępnie LPS hodowane były z wortmaniną (0.3 M). Komórki przemywano czterokrotnie 10 ml świeżego podłoża i, jak pokazano, ponownie hodowano (druga kolumna).

^b 5 x 10⁵ komórek inkubowano w trzech powtórzeniach przez 18 godz. w 500 gl podłoża lub w podłożu zawierającym LPS (1 ng/ml) lub CLP2p (0.3 gg/ml). Supernatanty zbierano w pule z równoważnych hodowli po 18 godz.

Zgodnie z wynikami uzyskanymi dla innych grup [Zuckermann, S.H., 1991], wstępna inkubacja adherentnych komórek śledziony z 10 ng/ml PS prowadziła do niezdolności do pobudzania produkcji TNF -α przez te komórki z optymalnymi stężeniami (1 gg/ml) LPS 24 godz. później. W szczególności, wstępna inkubacja LPS znosiła również kolejne pobudzanie przez CLP2p. Jak wykazano, ta indukcja tolerancji ulegała sama inhibicji, jeżeli inkubacja przebiegała w obecności 0.3 gM wortmaniny.

PL 211 789 B1

Podsumowując, dane przedstawione w Tabelach 1-3, wskazują, że aktywny związek w CLP2p stanowi lub zawiera nowy składnik, którego funkcja w aktywowaniu makrofagów/komórek dendrytycznych nie jest możliwa do zastąpienia przez poszczególne, opisane cytokiny. Ponadto, gdy pobudzanie CLP1b/CLP2p ulega inhibicji przez monoklonalne przeciwciało przeciw-CD14, pobudzanie przez te pule jest nieco odmienne od uzyskanego przez sam wyizolowany LPS. Ogólnie, jednakże, istnieje znaczne podobieństwo z aktywnością LPS, w tym ścisła korelacja zwiększonej aktywności biologicznej (TCGI i produkcja NO, jak również produkcja cytokin) i zwiększonej, wykrywalnej zawartości LPS (analiza LAL) w pulach CLP otrzymanych z homogenatu wątroby płodowej po kontrolowanej inkubacji w 37°C.

W skrócie, dane najlepiej wyjaśnia stwierdzenie, że LPS obecny jest w pulach CLP1b i CLP2p, i że odgrywa kluczową rolę w aktywności biologicznej tych preparatów oraz jego aktywność jest modyfikowana przez inną cząsteczkę(-i) oddziałującą z LPS.

3.3.2 Białka

3.3.2.1 Metody

3.3.2.1.1 Szacowanie białka i obraz (SDS-PAGE)

Zawartość całkowitego białka z CLP1b i CLP2p określano poprzez analizę kwasu bichinchoninowego (BCA^TM) zakupionego od PIERCE (Rockford, Illinois, U.S.A.), stosując jako standard do kalibracji, albuminę surowicy wołowej (BSA) nie zawierającą kwasów tłuszczowych. Skład całościowy białek preparatów CLP analizowano w SDS-PAGE w 15% (wag./obj.) żelach akryloamidowych oraz poprzez barwienie srebrem, według [Laemmeli, U.K., 1970] i [Heukeshoven & Demick (1988)]. Poszczególne białka izolowano w preparatywnej SDS-PAGE i kolejno poprzez elektrobloting na membranę polifluorku winylidenu (PVDF) Immobilon-P, uzyskaną z Millipore (Bedford; U.S.A.). Po wybarwieniu Coomassie Blue R250, wycinano prążki białek i poddawano N-końcowemu mikrosekwencjonowaniu z użyciem sekwencera białek Applied Biosystems 473 A [Hunkapiller i wsp., 1983].

3.3.2.1.2 Dwuwymiarowa analiza elektroforetyczna FSLE, CLP1b i CLP2p

W celu szczegółowego określenia składu białek w FSLE, jak i w CLP1b i CLP2p, wykonano wysokorozdzielczą, dwuwymiarowa elektroforezę (2-DE) [Jungblut, P., 1992; Jungblut, P., 1994; Otto, A., 1996, Thiede, B., 1996; M^ler, E.-C, 1999]. Dla porównania, technikę 2DE zastosowano również do analizowania składu białek w preparacie CLP1b pochodzącym z wątroby dorosłej owcy. W skrócie, preparaty CLP1b solubilizowano w buforze do próbek (25 mM Tris-HCl, pH 7.1; 9M mocznik; 50 mM KCl; 3 mM EDTA; 70 mM DTT; 2.9 μΜ benzamidyna, 2.1 μΜ leupeptyna; 0.1 μΜ pepstatyna; 1 mM PMSF i całość z 4% (wag./wag.) nośnika amfolitycznego WITAlytes, pH 2-11, WITA, Teltow, Niemcy), w stężeniu 10 mg CLP1b na ml. Następnie, 12 μl roztworu próbki nakładano po anodowej stronie żelu izoelektroforetycznego ogniskowania (pierwszy wymiar; 3,5% (wag./obj.) akrylamid, 0.3% (wag./obj.) diakrylamid piperazyny; Bio-Rad, Monachium, Niemcy) i nastawiano 8870 Vh. Po zogniskowaniu, żele równoważono przez 10 min w buforze zawierającym 125 mM Tris/fosforan, pH 6.9, 40% (wag./obj.) glicerolu, 70 mM DTT i 3% (wag./obj.) SDS i przechowywano zamrożony w -70°C. Po rozpuszczeniu, izoelektrycznie ogniskujące żele były natychmiast stosowane do żelu SDS-PAGE (23x30 cm; 15% (wag./obj.) akrylamidu; 0.2% (wag./obj.) N,N'-metylenobisakrylamidu) i prowadzono elektroforezę w drugim wymiarze, stosując dwuetapowy wzrost napięcia, rozpoczynając od 120 mA przez 15 min, po czym pozostawiając przez 7-8 h pod 150 mA. W celu badań analitycznych, białka w 0.75 mm żelach wykrywano poprzez barwienie srebrem zgodnie z metodą opisaną przez Heukeshoven'a [Heukeshoven, J., 1985], natomiast do celów mikropreparatywnych związanych z technikami spektrometrii masowej, zastosowano metodę barwienia srebrem Blum'a [Blum, H., 1987]. Po trawieniu trypsyną w żelu wyciętych prążków, mieszaniny peptydów oczyszczano i odsalano stosując urządzenie do gromadzenia białek [Otto, A., 1996] i poddawano analizie spektrometrii masowej. Określenie masy i sekwencji peptydów wykonano stosując spektrofotometr masowy z hybrydowym, czterokątno-ortogonalnym przyspieszeniem czasu przepływu (Q-Tof) (Micromass, Manchester, UK), wyposażony w nanoprzepływowe źródło jonów Z-spray w złożonym urządzeniu spektrometrii masowej (MS/MS) [M^ler, E.C., 1999]. Ponadto, odpowiadające 1.5 mm żele 2-DE poddawane były elektroprzeniesieniu na membrany Immobilon PVDF (Millipore, Eschborn, Niemcy) w półsuchych warunkach blottingu. Po przeniesieniu, białka uwidaczniano stosując barwnik Coomassie Brilliant Blue R-250 i wycięte prążki białek analizowano w automatycznym sekwencerze Edman'a, w 477A pulsowo-cieczowym sekwencerze, wyposażonym w PTH-aminokwasowy analizator on-line 120A (Applied Biosystems, Foster City, CA; U.S.A.). Po pierwszej identyfikacji poszczególnych prążków w barwionych srebrem żelach 2-DE

PL 211 789 B1 dla CLP1b, kreślonych na podstawie spektrometrii masowej i/lub sekwencjonowania Edman'a, zestawiano odpowiednie białka w preparatach płodowych CLP1b i w próbach CLP1b otrzymanych z wątroby dorosłej owcy, przy użyciu programu komputerowego nakładającego obraz pakietu Delta2D (DECODON GmbH; Greifswald).

3.3.2.2 Wyniki

3.3.2.2.1 Obraz białek z CLP1b i CLP2p (SDS-PAGE)

Stwierdzono wysoką zawartość białka w CLP1b (> 70% wag./wag.) z liofilizowanego materiału. Przeciwnie, około trzy do czterokrotnie niższą zawartość białka wykryto w odpowiadających preparatach CLP2p. Wyniki analizy SDS-PAGE, a następnie barwienia srebrem wykazały przewagę białek o niskiej masie cząsteczkowej w obu pulach CLP zawarte w przedziale cząsteczkowym między od około 4 a 30 kDa dla CLP1b i około 4 do 10 kDa dla CLP2p (Fig. 11). Jednakże, badanie większych ilości drugiej puli CLP wykazało również obecność 10 do 30 kDa rodzajów białek w CLP1b, były również wykryte w mniejszych ilościach w CLP2p. W sumie, około 20 do 25 pojedynczych prążków białek uwidoczniono przez barwienie srebrem w obu pulach CLP, które następnie podzielono na podstawie względnych intensywności zabarwienia na grupę 8 do 10 głównych prążków i komplementarny podzestaw mniejszych prążków. Po preparatywnej SDS-PAGE, elektroblotingu i sekwencjonowaniu N-końcowym Edman'a, zidentyfikowano pięć głównych białek na jednowymiarowym obrazie elektroforetycznym CLP1b i CLP2p, jako białka wiążące fosfatydyloetanol (PEBP lub PBP; P23.4), peptydylo-cis-trans-izomeraza A (PPIaza A; p16.9), komórkowe białko wiążące retinol I (cRBP I; p14.6), tioredoksyną (Trx; p9.5) i ubikwityną (Ub; p6.2).

3.3.2.2.2 Dwuwymiarowa elekteroforetyczna analiza (2-DE) FSLE, CLP1b i CLP2p

Analiza dwuwymiarowej elektroforezy (2-DE) i barwienia srebrem okazała się być szybką i odtwarzalną techniką do charakterystyki całościowego składu białka wyjściowego FSLE (Fig. 12), jak również frakcji pochodzących z ekstraktu CLP1b (Fig. 13) i CLP2p (Fig. 14). W dwuwymiarowej elektroforetycznej analizie FSLE wykryto szeroki obraz około 2200 prążków pojedynczych białek w zakresie masy cząsteczkowej 100 do 2 kDa i przedziale punktu izoelektrycznego (I.P.) 4.0 do 9.0 (Fig. 12). Analiza 2-DE preparatów CLP1b wykazała dobrze odtwarzalny obraz w sumie 576 poszczególnych prążków, które kolejno zliczono według malejącej masy cząsteczkowej i zestawienia wartości I.P. (Fig. 13). Znaczną większość prążków w obrazie rozdziału 2-DE wykryto o widocznej masie cząsteczkowej między 40 a około 6 kDa i wartościach punktu izolelektrycznego (I.P.) w zakresie od 4.0 do 9.0. Oprócz grupy białek opisanych w poprzednim rozdziale, 20 innych białek odpowiadającym prążkom o dużej intensywności na obrazie rozdziału 2-DE dla CLP1b zostało zidentyfikowanych poprzez sekwencjonowanie Edman'a lub trawienie tryptykowe i analizę MS/MS w połączeniu z badaniami homologii sekwencji związanych z bazą danych (Tabela 4). Zidentyfikowane białka stanowiły białka cytoplazmatyczne, ewolucyjnie silnie konserwatywne u gatunków ssaków (Tabela 4). Potwierdzeniem początkowych danych opartych na jednowymiarowym rozdziale elektroforetycznym, było przypisanie głównym prążkom 321, 403/405 i 454 w 2-DE obrazie dla CLP1b białka wiążącego fosfatydyloetanoloaminę (PBP iub PEBP), peptydylo-prolylo-cis-trans-izomerazy A (PPIaza A)/cylofiliny A (Cyp A) i białka I wiążącego komórkowy retinoł (cRBP I).

Stwierdzono występowanie prozapalnych cytokin i czynnika inhibitującego migrację makrofagów (MIF) proteohormonu w ilości około 0.5% (wag./wag.) całkowitego białka z CLP1b (prążek 536). Ze względu na to, że pierwszorzędowe struktury MIF z ludzkiego i wołowego źródła wykazują identyczność całości sekwencji około 93% [Weiser, W.Y.; 1989, Galat, A., 1994], przypuszcza się, że forma owczego białka wykaże analogicznie wysoki stopień filogenetycznego charakteru konserwatywnego zachowania. Wykazano, że MIF przechowywane jest w wewnątrzkomórkowych granulach w komórkach ssaczych z różnych rodzajów tkanek, włączając monocyty i makrofagi [Calandra, T., 1994], limfocyty T [Bacher, M., 1996], komórki kortykotropowe przedniego płatu przysadki [Bernhagen, J., 1993], komórki wysepkowe trzustki β [Waeber, G., 1997], jak również hepatocyty i komórki Kupffer'a z wątroby szczura [Bacher, M., 1997]. Czynnik scharakteryzowano jako centralny immunoneurowewnątrz-wydzielniczy mediator, wykonujący serię regulacyjnych i enzymatycznych aktywności [Bernhagen, J., 1998; Metz, C.N., 2001]. Przede wszystkim, MIF neutralizuje i znosi immunosupresyjny wpływ glukokortykoidów i wzmacnia odpowiedź komórek szpiku na bakteryjny LPS [Calandra i wsp., 1994; Bernhagen, J., 1998; Metz, C.N., 2000]. Zatem, MIF może uczestniczyć w przeciwrakowych, immunostymulacyjnych efektach indukowanych przez składnik LPS z CLP1b w układach testowych na myszy i człowieku.

PL 211 789 B1

W początkowej analizie stwierdzono wysoki poziom identyczności sekwencji peptydów tryptykowych z prążka 458 z częściową sekwencją 204 aminokwasową zdeponowaną w bazie danych TrEMBL pod numerem przyjęcia Q12915. Wykorzystanie bazy danych pozwoliło na przypuszczenie, że stanowi to fragment białka 1 choroby zapalnej jelita (IBD1). Zgodnie z analizą powiązań genetycznych, locus IBD1 uczestniczy w określaniu podatności ludzi na chorobę zapalną jelita, taka jak choroba Crohn'a i zapalenie okrężnicy wrzodziejące (Mirza i wsp., 1998; Forabosco i wsp., 2000). Jednakże, zgodnie z nowymi danymi sekwencjonowania genomu, zdeponowanymi w bazie danych TrEMBL pod hasłem Q9BRA2, Q95M49 i Q921A9, prążek ten zidentyfikowano jako reprezentujący przypuszczalne białko 42-9-9, charakteryzujące się przewidzianą domeną 2 typu tioredoksyny, jako głównym elementem strukturalnym.

W celu potwierdzenia płodowego pochodzenia preparatu, wykazano, że prążek 498 był identyczny z owczą formą łańcucha gamma hemoglobiny płodowej (HbY), natomiast prążki 506 i 510 zidentyfikowano jako izoformy łańcucha alfa hemoglobiny owczej (Hba). Na podstawie względnych intensywności barwionych srebrem wszystkich prążków reprezentujących łańcuchy alfa i gamma hemoglobiny, oszacowano całkowitą ilość hemoglobiny płodowej (HbF) w CLP1b, w przybliżeniu na 5.6% (porównaj Przykład 4.2).

Większa grupa białek zidentyfikowanych w CLP1b stanowiła „białka odpowiedzialne za utrzymanie prawidłowego stanu”, których przykładami jest 1-epimeraza aldozowa, dehydrogenaza alkoholowa, izoformy II i III anhydraży węglowej, białko wiążące acylo CoA, białka wątroby wiążące kwasy tłuszczowe (L-FABP) i ubikwityna. Inaczej niż w przypadku apoptozy lub programowanej śmierci komórki, nekroza komórek ssaczych charakteryzuje się uwalnianiem wielu wewnątrzkomórkowych składników i dowiedziono, że dostarcza pro-zapalnych i przeciwrakowych bodźców komórkom szpiku in vitro [Reiter i wsp., 1999]. Zatem, zewnątrzkomórkowe zastosowanie małych i filogenetycznie konserwatywnych białek „odpowiedzialnych za utrzymanie prawidłowego stanu” może również uczestniczyć w efektach immunopobudzających preparatów CLP. Porównując z wynikami uzyskanymi dla CLP1b, analiza 2DE dla CLP2p ujawniła w większości analogiczny obraz całościowy, charakteryzujący się wzbogaceniem ilości niskocząsteczkowych białek w zakresie między 20 a 6 kDa (Fig. 14). Poszczególne prążki w żelach 2-DE barwionych srebrem dla CLP1p mogą być zestawione z godnie z białkami zidentyfikowanymi w CLP1b z użyciem programu komputerowego Delta2D (DECODON GmbH; Greifswald).

W dodatkowej analizie 2DE dla CLP1b próby otrzymane z wątroby dorosłej owcy (Fig. 15) i kolejno poddane nałożeniu w programie komputerowym Delta2D, umożliwiły zidentyfikowanie grupy prążków, obecnych w większej ilości w materiale płodowym w porównaniu z jedynie małą ilością lub nawet brakiem odpowiadających im białek w preparacie CLP1b z dorosłych osobników (Fig. 16). Ta szczególna grupa dominujących białek płodowych obejmuje prążki łańcucha gamma hemoglobiny płodu owcy (HbY) (prążek 498 w płodowym CLP1b), jak również łańcuch alfa hemoglobiny owczej (Hba) (Prążki 506 i 510 w płodowym CLP1b), jak też prążek odpowiadający czynnikowi inhibicji migracji makrofagów (MIF; prążek 536 w płodowym CLP1b). Znacznie wyższa całościowa zawartość hemoglobiny w próbach CLP1b płodu w porównaniu z preparatami dorosłych jest wyraźnie skorelowana z specyficzną funkcją płodowej wątroby ssaka, jako głównego narządu hematopoetycznego podczas rozwoju płodu, natomiast w okresie bliskim urodzin i etapach życia ssaka po urodzeniu, dominujące miejsce hematopoezy przesuwa się do czerwonej substancji szpiku kostnego.

Większość zidentyfikowanych białek wykazuje silnie konserwatywny charakter ewolucyjny i jest szeroko rozpowszechniona w tkankach gatunków ssaków [Schoentgen, 1987; Seddiqi, N. 1994; Harding, M.W., 1986; Haendler, B., 1987; Colantuoni, V., 1985, Sherman, D.R., 1987; Droogmans, L. 1994; Wollman, E.E., 1988; Schlesinger, D.H., 1975; Ozkaynak, E., 1984]. Oczekuje się, zatem, że są aktywne funkcjonalnie, gdy zastosowane do leczenia organizmu ludzkiego i nie wywierają ksenogennych skutków ubocznych. Zgodnie z opublikowanymi właściwościami MIF, tioredoksyny i ubikwityny, zgodnie z niniejszym wynalazkiem uważa się, że białka te uczestniczą w aktywnościach silnie immunopobudzających, przeciwrakowych itp. puli CLP, w sposób wzmacniający je lub synergistyczny [Bernier, I., 1986; Lotan, R., 1996; Bertini, R., 1999; Nabika, T., 1999].

PL 211 789 B1

T a b e l a 4:

Prążek nr	Identyfikacja/baza danych	Białko ludzkie AA; MWwylicz. I-P-wylicz./widoczny	Identyczność sekwencji ludzkiego białka z...
1	2	3	4
16	Epimeraza-1-aldozowa	342 AA; 37765 Da I.P.wylicz.: 6.18	Świni: 89% Myszy: 87%
51	Dehydrogenaza alkoholowa (ADH)	374 AA; 39723 Da I.P.wylicz.: 8.26	Mysie: 83% Szczurze: 80%
52	Prostaglandyno-F-syntaza (PGF)	323 AA; 36826 Da I.P.wylicz.: 8.05	Wołowe: 78%
64 78	Prostaglandyno-F-syntaza 2 (PGF2)	Wołowe 323 AA; 36742 Da I.P.wylicz.: 6.80	Wołowe: 75% [z ludzkim PGF(1)]
74	Regukalcyna (RGN)/senescencyjny marker białkowy-30 (SMP-30)	299 AA; 33253 Da I.P.wylicz.: 5.89	Mysie: 88% Szczurze: 88%
81	Sulfurotransferaza tiosiarczanowa (TST)	296 AA; 33297 Da I.P.wylicz.: 8.09	Wołowe: 89% Mysie: 90% Szczurze: 90%
125 126	Reduktaza karbonylowa 1 (CBR1)	276 AA; 30244 Da I.P.wylicz.:8.55	Królicze: 83% Mysie: 86% Szczurze: 85%
145	3,4-dioksygenaza 3-hydroksyantranilanu	286 AA; 32542 Da I.P.wylicz.: 5.62	Szczurze: 87%
158	N-metylotransferaza guanidynooctanu (GAMT)	236 AA; 26318 Da I.P.wylicz.:5.74	Mysie: 87% Szczurze: 86%
168 172	Anhydraza węglanowa III (CA-111)	259 AA; 29440 Da I.P.wylicz.: 6.94	Końskie: 87% Mysie: 90% Szczurze: 91%
180	Anhydraza węglanowa II (CA-II)	Owcze [ludzkie]: 259 AA; 29080 Da [259 AA; 29115 Da] I.P.wylicz.: 6.40 [6.86]	Owcze: 78% Wołowe: 78%
292	Rozpuszczalna izoforma katecholo-O-metylotransferazy (S-COMT)	220 AA; 24318 Da I.P.wylicz.:5.15	Myszy: 80% Szczurze: 79%
321	Białko wiążące fosfatydyloetanoloaminę (PEBP)	186 AA; 20925 Da I.P.wylicz.: 7.33	Wołowe: 95% Szczurze: 85%
403 405	Peptydylo-prolylo-cis-trans-izomeraza A (PPIaza A) Cyklofilyna A (Cyp A)	164 AA; 17881 Da I.P.wylicz.: 6.67; 7.06; 7.59; 8.04	Wołowe: 98% Myszy: 95%
425	Dysmutaza nadtlenkowa (SOD)	Owcze [ludzkie]: 151 AA; 15563 Da [153 AA; 15804 Da] I.P.wylicz.: 6.16 [5.70]	Owcze: 82% Wołowe: 82% Końskie: 80% Mysie: 83% Szczurze: 83% Królicze: 81%

PL 211 789 B1 ciąg dalszy Tabeli 4

1	2	3	4
454	Białko wiążące retinol komórkowy I (cRBP I)	134 AA; 15719 Da I-P-wylicz.· 4.70	Mysie: 96% Szczurze: 98%
457	Białko H układu cięcia glicyny (GCSH)	125 AA; 13813 Da 1^.^02.: 4.36	Wołowe: 96%
458	Białko przypuszczalne 42-9-9	123 AA; 13941 Da I.P.wylioz.· 5.40	Mysie: 79%
498	Łańcuch gamma hemoglobiny (Hb-gamma)	Owcze [ludzkie]: 145 AA; 15931 Da [146 AA; 16009 Da] I.P.wylicz..: 6.59 [6.71]	Owcze: 72% Wołowe: 72% Królicze: 78%
506 510	Łańcuch alfa hemoglobiny (Hb-alfa)	Owcze [ludzkie]: 141 AA; 15033 Da [141 AA; 15126 Da] I.P.wylicz.: 8.73 [8.73]	Owcze: 86% Wołowe: 87% Mysie: 85% Szczurze: 78%
520	Wątrobowe białko wiążące kwasy tłuszczowe (L-FABP)	127 AA; 14208 Da I.P.wylicz.:6.60	Wołowe: 81% Świni: 89% Mysie: 84% Szczurze: 82%
536	Czynnik inhibitujący migracje makrofagów (MIF)	114 AA; 12345 Da I.P.wylicz.: 8.24	Wołowe: 93% Mysie: 89% Szczurze: 90%
555	Białko wiążące acylo-CoA (ACBP)	86 AA; 9913 Da I.P.wylicz.: 6.11	Wołowe: 93% Świni: 89% Mysie: 77% Szczurze: 77%

Tabela 4: Identyfikacja głównych prążków na obrazie rozdzielonych białek w 2-DE dla CLP1b na podstawie sekwencjonowania N-końcowego Edman'a lub analizy MS/MS tryptykowych peptydów

3.3.2.3 Arginaza - składnik FSLE o potencjale aktywności biologicznej

Istotnym białkiem, obecnym w standardowym FSLE jest arginaza, enzym, który inhibitująco oddziałuje na in vitro hodowle komórek, głównie poprzez jego zdolność usuwania argininy. Można przedstawić bezpośredni, zależny od dawki wpływ arginazy na wzrost komórek rakowych Abelson 8-1. W celu stwierdzenia, w jakim zakresie arginaza może być odpowiedzialna za TCGI obserwowany w hodowlach nastawionych z CLP1b i CLP2p, określano jej aktywność w tych pulach według [Corraliza, J.M., 1994]. W Tabeli 5 wykazano, że CLP1b wykazywał nieco mniejszą aktywność arginazową, natomiast pula 1 przejawiała wysoką aktywność arginazową, w porównaniu z odnotowaną dla standardowego FSLE. Przeciwnie, żadnej aktywności arginazowej nie można było wykryć w CLP2p, pomimo faktu, że pula ta była bardzo aktywna w analizie TCGI. Zatem, arginazę można wykluczyć jako główną przyczynę efektów inhibicji wzrostu w hodowlach z pulami CLP1b i CLP2p.

T a b e l a 5:

Aktywność arginazy w FSLE i pulach CLP

Analizowany preparat	Aktywność arginazy U/mg białka
CLP1	19.6
CLP1b	0.8
CLP2p	-*
FSLE	22.0

* zawartość arginazy poniżej granicy wykrywalności na poziomie 0.2 U/ml 4.

PL 211 789 B1

4. P r z y k ł a d 4

Oddziaływanie lipopolisacharydu z hemoglobiną płodową

Niskie ilości endotoksyny obecnej w FSLE nie wyjaśniają całkowicie stopnia aktywności biologicznej tego preparatu. Zatem, przypuszczano, że uczestniczy w niej dodatkowy składnik FSLE, CLP1b i CLP2p, modyfikujący aktywność biologiczną endotoksyny poprzez oddziaływanie z nią. W celu scharakteryzowania tego składnika wykonano następujące doświadczenia.

4.1 Metody

W celu zidentyfikowania białka(-ek) oddziałującego z LPS lub lipidem A w CLP1b przeprowadzono analizę adsorpcyjną specyficzną dla LPS/lipidu A. W tym układzie skriningowym, polichlorowinylową, 96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania (Becton Dickinson) pokryto na 14 godz. w 4°C preparatem zawierającym formę S LPS z Salmonella enterica sv. Minnesota 188233, Re-LPS z E.coli F515 lub lipid A. Następnie, roztwory dekantowano a studzienki przemywano czterokrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem Dulbeccos (D-PBS; Lifetechnologies) bez soli magnezu lub wapnia. Do redukcji potencjalnego nie zależnego od LPS lub nie zależnego od lipidu A wiązania białek w CLP1b, studzienki pokryte LPS lub lipidem A i odpowiadające im studzienki kontrolne traktowano 0.2% (wag./obj.) żelatyną (Aurlon) w D-PBS, w 37°C, przez 1 godz. stale wytrząsając. Po etapie dodatkowego przepłukania (cztery razy D-PBS) studzienki inkubowano z roztworami CLP1b z 1.0 i 0.1 mg/ml w D-PBS w 37°C przez 1 godz. stale wytrząsając. Supernatanty po inkubacji z reakcją wiązania liofilizowano do ostatecznej analizy SDS-PAGE. Następnie, wykonano cztery serie płukania w D-PBS, w 37°C, przez 20 min stale wytrząsając i odpowiednie roztwory po przemyciu również suszono przez zamrażanie. Po tej procedurze intensywnego płukania, dodawano 50 pl buforu do próbek SDS do każdej studzienki w celu uwolnienia pozostałych zaadsorbowanych białek i materiału opłaszczającego. Ponadto, liofilizowane próby sprzed inkubacji CLP1b i po sekwencji etapów płukania, zawieszano ponownie w 50 pl bufom do próbek SDS i analizowano skład zebranych prób na podstawie analizy adsorpcji za pomocą SDS-PAGE w 15% (wag./obj.) żelach poliakrylamidowych i barwienia srebrem według metody opisanej przez Heukeshoven [Heukeshoven, J., 1986].

4.2 Wyniki

Analiza SDS-PAGE i barwienia srebrem zgodnie ujawniła zależną od LPS lub lipidu A adsorpcję pojedynczego prążka białka z CLP1b wykazującego widoczną masę cząsteczkową w przybliżeniu 12.0 (±1.0) kDa w studzienkach pokrytych odpowiednio formą S LPS z Salmonella enterica sv. Minnesota (Fig. 17), Re-LPS z E.coli F515 (Fig. 18) i preparatem lipidu A pochodzącym ze szczepu E.coli (Fig. 19). Dzięki wykonaniu preparatywnej analizy adsorpcji (materiał pokrywający: Re-LPS z E.coli F515), a następnie analizy spektrometrii masowej peptydów tryptykowych, zidentyfikowano główny składnik tego prążka białkowego jako łańcuch alfa hemoglobiny owczej (Hb alfa) (Fig. 20). W celu dalszego potwierdzenia obserwowanej, wysoko wybiórczej adsorpcji płodowej hemoglobiny owczej (HbF) lub odpowiednich podjednostek HbF na pokrytych LPS lub lipidem A płytkach do mikromiareczkowania, do układu testowego włączono początkowy etap, ukierunkowany na wyłapanie hemoglobiny z użyciem silnie reagującej ludzkiej haptoglobiny (1-1) [h-Hp(1-1); Sigma-Aldrich] jako odczynnika hemoglobino specyficznego. Wstępna inkubacja CLP1b z h-Hp(1-1) w analizie adsorpcyjnej (materiał pokrywający: Re-LPS z E.coli F515) prowadziła do znacznego zmniejszenia intensywności 12 kDa prążka w ostatecznej analizie SDS-PAGE, w porównaniu z próbą CLP1b nie poddaną działaniu haptoglobiny (Fig. 21). W poprzednich badaniach, opisano wiązanie ludzkiej, wołowej i wieprzowej hemoglobiny dorosłych osobników (HbA) z LPS lub wolnym lipidem A, a także kolejne wzmocnienie aktywności biologicznej LPS in vivo i in vivo przez obecność preparatów oczyszczonej hemoglobiny dorosłych co wskazywało na nową immunomodulacyjną funkcję hemolitycznie uwolnionych hemoglobin ssaczych, oprócz ich podstawowej funkcji transportowania tlenu w nienaruszonych czerwonych krwinkach [Roth, R.J., 1994; Roth R.J., 1999; Belanger, M.1995].

Zatem, zidentyfikowano płodową hemoglobinę owczą [HbF owcy, s-HbF] jako główny składnik oddziałujący z LPS/lipid A w preparatach CLP1b. Szacowanie ilościowe z użyciem pomiaru absorpcji białka przy 405 nm ujawniło widoczną zawartość HbF, w przybliżeniu 10% (wag./wag.) w FSLE z około 3.2% (wag./wag.) w CLP1b i około 1.2% (wag./wag.) w CLP2p. Potwierdziło to dane z 2-DE (patrz, Przykład 3.3.2.2.2). Zatem, HbF stanowi główny białkowy składnik ekstraktu pochodzącego z wątroby płodowej.

Na Fig. 22 przedstawiono strukturę pierwszorzędową łańcucha alfa i gamma hemoglobiny owczej.

PL 211 789 B1

5. P r z y k ł a d 5

T a b e l a 6:

N-końcowe sekwencjonowanie preparatu hemoglobiny płodowej owcy

Pozycja

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

V M

L

S.T

A

A E

D.E

K

S.A

N.S

V

k.i

A.S

A.L

W.F

G.A

K

V

L

S

A

A

D

K

S

N

V

K

A

A

W

G

K

M

L

T

A

E

E

K

A

S

V

I

S

L

F

A

K

M

L

T

A

E

E

K

A

A

V

T

G

F

W

G

K

Podkreślono reszty aminokwasowe specyficzne dla łańcucha γ w pozycji 9, 11, 12 i 13.

5.2 Usunięcie hemu z oczyszczonej hemoglobiny płodu i dorosłych owiec [Winterhalter i Huehns, 1964]

Do 50 mg liofilizowanej, oczyszczonej hemoglobiny płodu lub dorosłych owiec, rozpuszczonej w 2 ml lodowej H2O dodano 45 ml acetonu zawierającego 6 mM HCl i pozostawiono w -20°C. Po 30 minutowej inkubacji w - 20°C, oddzielano i usuwano różowy supematant od wytrąconych białek. Białka, które uległy precypitacji przemywano trzykrotnie 45 ml czystego acetonu w -20°C. Po odwirowaniu przy 2500xg, aceton usuwano i zebrane białka rozpuszczano w 3 ml lodowej wody i liofilizowano. Białka rozpuszczały się doskonale w wodzie w 4°C i nie posiadały już czerwonej barwy. W wyniku analizy w żelu SDS-PAGE białek potraktowanych acetonem uzyskano niemal taki sam wzorzec, jak dla oczyszczonej, całej hemoglobiny z głównym prążkiem odpowiadającym 17 kDa i mniejszym prążkiem 34 kDa w warunkach nieredukujących i pojedynczy prążek o 17 kDa, w warunkach redukujących (Fig. 25). Zatem, można przyjąć je za globinę lub hemoglobinę bez grupy hemowej.

5.3 Próba dysocjacji i oczyszczenia łańcucha y z hemoglobiny płodowej

5.4 5.3.1 Konwencjonalne metody [Bucci i Fronticelli, 1965; Winterhalter i Colosimo, 1971]

Do 50 mg liofilizowanej, oczyszczonej płodowej oksyhemoglobiny, rozpuszczonej w 4 ml roztworu 0.1 M KH2PO4 zawierającego 8 mg 4-hydroksy benzoesanu rtęci (HMB) (Sigma) rozpuszczonego, najpierw w 1 ml 0.1M NaOH, do którego dodano następnie 2 ml 0.1 M KH2PO4 i miareczkowano do pH 5.8 stosując około 75 μl 1M kwasu octowego. Stosunek molarny między HMB a hemoglobiną wynosił 7.5 do 1. Po inkubacji w 4°C przez 18 godz., nadmiar HMB usuwano przez filtrację na kolumnie Sephadex G25 (Pharmacia), zrównoważonej buforem 10 mM MES, pH 6.0.

Następnie, Hb płodową nakładano na kolumnę kationowymienną UNO-S (BIO-RAD), zrównoważoną tym samym buforem MES i wymywano w gradiencie wzrastającej molarności NaCl, aż do molarności 1. Jak pokazano na Figurze 26, wymytą hemoglobinę reprezentują dwa piki. Pierwszy pik zawiera całość tetramerycznej hemoglobiny, natomiast drugi zawierał monomeryczne łańcuchy hemoglobiny, o odczytanej masie cząsteczkowej około 17 kDa, co wykazano po ich elucji na kolumnie Superdex S75 (Pharmacia) (Fig. 27).

Drugi pik z kolumny UNO-S analizowano dalej na kolumnie anionowymiennej UNO-Q (BIO-RAD), zrównoważonej 10 mM buforem Tris, pH 8.0, gdzie został wymyty jako pojedynczy pik z użyciem wzrastającej molarności NaCl do 1 M (Fig. 28). Zatem, uzyskano białko, które dawało pojedynczy pik z odczytaną masą cząsteczkową 17 kDa na kolumnie sita molekularnego, jak również homogenny, pojedynczy pik na wykresie elucji z zarówno kationo-, jak i anionowymiennej chromatografii.

Analiza sekwencji aminokwasowej pierwszej N-końcowej pozycji ujawniła, że białko było mieszaniną łańcuchów α- i γ płodowej hemoglobiny owczej (fig. 22).

Oczyszczano mieszaniny łańcuchów α, β hemoglobiny z krwi dorosłej owcy uzyskując takie same wyniki.

5.3.2 Nowa procedura: metoda agarozy tiolowej

Opisano nową i bardziej wydajną metodę separacji podjednostek hemoglobiny (łańcuchy α, β i γ globiny) za pomocą chromatografii kowalencyjnej.

W pierwszym etapie, ludzka i inna hemoglobina jest immobilizowana na aktywowanej tiolem żywicy z wykorzystaniem możliwych do cięcia mostków dwusiarczkowych wiążących „wystawione” grupy SH łańcuchów beta lub gamma z fazą stałą. Następnie, łańcuch a jest wybiórczo wymywany 50% kwasem octowym lub innymi silnie rozpuszczającymi środkami.

PL 211 789 B1

Sposób opisany poniżej nie jest przeznaczony jedynie do zastosowania w niniejszym wynalazku, do celów wynalazku należą także dalsze modyfikacje wynikające z rozwoju tiolowych żywic hemoglobinowych/aktywowanych i protokoły elucji.

Nowy sposób obejmuje: 1) kowalencyjne wiązanie płodowej hemoglobiny owczej z tiolowo aktywowaną, poprzecznie wiązaną agarozą (grupa aktywna: 2-pirydylo disiarczek); 2) selektywne wymywanie łańcuchów alfa przy użyciu 50% kwasu octowego i 3) redukcja mostków disiarczkowych z użyciem 20 mM ditiotreitolu, po czym elucja łańcuchów gamma z fazy stałej z użyciem 50% kwasu octowego.

Szczegóły powyższych etapów są następujące:

1. Aktywowana żywica agarozy tiolowej otrzymywana jest wyjściowo z Affigel 102 (Biorad) z nominalną, bez aminy substytucją 10-12 mikromoli/ml suchego żelu. 5 g handlowo dostępnej żywicy w pierwszym etapie kilkakrotnie przemywano buforem octanu amonu, pH 7.5, w celu wyeliminowania dodatkowych substancji, a następnie poddawano reakcji przez noc, w temperaturze pokojowej, z 10 równoważnikami (wyliczonymi przez substytucje aminowe) Pierce Sulfo-LC-SPDP (sulfobursztynyloimidylo 6-[-3-(2-pirydyloditio)propionoamido]heksanianu). Nadmiar odczynnika usuwano poprzez płukanie buforem octanu amonu, pH 7.5. 1.5 ml suchej, aktywowanej żywicy tiolowej poddawano następnie reakcji z 25 mg płodowej hemoglobiny owczej, rozpuszczonej w 0.2 ml buforu PBS, pH 7, przez około 3h. Całkowitą ilość związanej z żywicą hemoglobiny (ok. 15 mg) otrzymano w wyniku odjęcia ilości hemoglobiny wymytej podczas nakładania na żywicę i końcowego przemywania.

2. Wybiórcza elucja łańcucha alfa prowadzona była z użyciem około 20 ml 50% kwasu octowego. Zebrane, zawierające heminę frakcje 1.0 ml oceniano stosując MALDI/MS (spektrometrię masową desorpcji laserowej matrycy z analizatorem czasu przelotu jonów), z użyciem aparatu Voyager-DE RP (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA). Dla każdej frakcji dokonywano dwóch, oddzielnych niezależnych pomiarów MALDI, w celu oceny powtarzalności uśrednionych 50 strzałów lasera. Analiza masowa wykazała obecność pojedynczego piku dla 15,120 Da, odpowiadającego oczekiwanej masie łańcucha a globiny. Oczyszczona alfa-globina/hemina dała w wyniku typowe widmo absorpcji o pikach przy 556, 538, 420, 343 i 270 nm. Produkt wyizolowano poprzez suszenie sublimacyjne. (Wydajność, 3.2 mg).

3. Żywicę inkubowano z 20 mM ditiotreitolu w buforze octanu amonu, pH 7.5, przez około godz. w temperaturze pokojowej, przemywano kilkukrotnie buforem octanu amonu, pH 7.5, w celu wyeliminowania uwolnionego 2-tiopirydonu i nadmiaru tiolu, a następnie traktowano 50% kwasem octowym, w celu wymycia łańcuchów Y wciąż zaadsorbowanych na fazie stałej. Zebrane frakcje analizowano stosując MALDI/MS, jak opisano wcześniej dla łańcuchów alfa. Analiza masowa wykazała istnienie pojedynczego piku dla 15,997 Da, który odpowiadał oczekiwanej masie łańcucha gammaglobiny z płodu owcy (dane nie przedstawione). Widmo absorpcji było bardzo podobne do widma uzyskanego dla łańcuchów a. Produkt wyizolowano stosując suszenie sublimacyjne. (Wydajność, 1.8 mg).

Zatem, sposób rozdziału ludzkiej i innej niż ludzka hemoglobiny na podjednostki (łańcuchy a, β i Y-globiny), opiera się na wykorzystaniu substratów w fazie stałej i charakteryzuje się następującymi etapami:

1. reakcja „wystawionych” grup tiolowych hemoglobiny z aktywowaną tiolową żywicą agarozową;

2. wybiórcza elucja alfa globiny/heminy z użyciem silnych środków rozpuszczających;

3. redukcja wiązań disiarczkowych, po czym elucja czystych łańcuchów beta- lub gamma globiny z użyciem silnych środków rozpuszczających.

5.3.3 Klonowanie i ekspresja wyizolowanych łańcuchów hemoglobiny owczej i ludzkiej

Oprócz zastosowania procedur biochemicznych izolacji łańcuchów hemoglobiny, przeprowadzono również klonowanie molekularne. Procedury wykorzystane w klonowaniu i ekspresji łańcuchów Hb ludzkich i owczych są następujące:

Zaprojektowano eukariotyczny wektor ekspresji, PIRESneo3, zawierający sekwencję liderową łańcucha κ Ig (atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac) powyżej genów globiny, co umożliwiło wydzielanie łańcuchów globiny w komórkach eukariotycznych (CHO). Do tego celu użyto następującego zestawu starterów (z mRNA wyizolowanego z ludzkich PBL):

Starter sensowny: TAA ATG CTA GCG CCA CCA TGG AGA CAG AC

Starter antysensowny: ATT ATA CCG GTG TCA CCA GTG GAA CCT GG

Ludzkie i owcze łańcuchy a, β i Y hemoglobiny amplifikowano stosując RTPCR i wykorzystując ekstrakty mRNA z odpowiednio, handlowo dostępnego ludzkiego szpiku kostnego i płodowej wątroby

PL 211 789 B1 owczej, z użyciem następujących par starterów (podkreślony region oznacza miejsce restrykcyjne Agel do klonowania w eukariotycznym wektorze ekspresji).

Ludzki łańcuch a:

Starter sensowny: TAA TA A CCG GT A TGG TGC ACC TGA CTC CTG AGG A

Starter antysensowny: ATT TA A CCG GT A GCT TAG TGA TAC TTG TGG GCC A

Ludzki łańcuch β:

Starter sensowny: TAA TA A CCG GT A TGG TGC ACC TGA CTC CTG AGG A

Starter antysensowny: ATT TA A CCG GT A GCT TAG TGA TAC TTG TGG GCC A

Ludzki łańcuch γ:

Starter sensowny: TAA TA A CCG GT A TGG GTC ATT TCA CAG AGG AG

Starter antysensowny: ATT TA A CCG GT C TCA GTG GTA TCT GGA GGA CA

Owcze łańcuchy a, β i γ:

Starter sensowny: TAA TA A CCG GT A TGC TGA CTG CTG AGG AGA A

Starter antysensowny: ATT TA A CCG GT G GAA GGG GAG CTT AGT GAT A

Należy zauważyć, że w przypadku łańcuchów hemoglobiny owczej, podobieństwo sekwencji między łańcuchami spowodowało, że konieczne było klonowanie „po omacku” z użyciem identycznych par starterów, a następnie przeprowadzenie analizy RFLP (późniejszej) klonów i sekwencjonowanie poszczególnych DNA, w celu zidentyfikowania klonów unikalnych pod względem poszczególnych łańcuchów hemoglobiny.

Kolejne etapy były powszechnie stosowanymi etapami we wszystkich strategiach klonowania: Trawienie żelu z produktami PCR i wektorem, po czym oczyszczanie strawionych w żelu produktów PCR fenolem i chloroformem i traktowanie wektora CIP, z użyciem zestawu do ekstrakcji z żelu QIAgen quick Gel Extration. Następnie dokonano ligacji z użyciem ligazy DNA T4 i transformacji. Liczne, niezależnie transformowane kolonie bakteryjne były zbierane i hodowane w 5 ml podłoża LB. DNA plazmidowy, wyizolowany z każdej hodowli analizowano poprzez trawienie EcoRI (dla owczych łańcuchów a, β i γ) lub BamHI (dla ludzkich łańcuchów a, β i γ), po czym rozdzielano w żelu elektroforetycznym. Posłużyło to do zidentyfikowania klonów, które prawdopodobnie zawierały jedyny insert dla odpowiedniego łańcucha hemoglobiny. Następnie, wyniki potwierdzono sekwencjonowaniem DNA.

W kolejnym etapie, po otrzymaniu wektorów zawierających łańcuchy hemoglobiny połączone z insertem łańcucha κ Ig, zaprojektowano zestaw wektorów PIRESneo3, które obejmowały sekwencję 6-His tag z miejscem cięcia enterokinazy, wstawionym, w celu łatwego oczyszczania klonowanych białek, między sekwencją liderowa κ Ig a sekwencją kodującą łańcuch hemoglobiny. Na tym etapie zastosowano następujące pary starterów:

6xHis-ludzka hemoglobina a - sensowny:

AGCACCGGTCATCATCATCATCATCATGATCTGTACGACGATGACGATAAGATGGTGCACC

TGACTCCTGAGGA

6xHis-ludzka hemoglobina β - sensowny:

AGCACCGGTCATCATCATCATCATCATGATCTGTACGACGATGACGATAAGATGGTGCACC

TGACTCCTGAGGA

6xHis-ludzka hemoglobina γ - sensowny:

AGCACCGGTCATCATCATCATCATCATGATCTGTACGACGATGACGATAAGATGGGTCATT

TCACAGAGGAGGAC

6xHis-owcza hemoglobina a-, β- i γ - sensowny:

AGCACCGGTCATCATCATCATCATCATGATCTGTACGACGATGACGATAAGATGCTGACTG

CTGAGGAGAAGGC

Antysensowny starter uniwersalny: TCCGAATTCGAATCCGGAGAC

Po trawieniu Agel, ligacji T4 i transformacji, niezależne klony zawierające łańcuchy hemoglobiny zaznaczone sekwencją 6-His tag zastosowano do transfekcji komórek CHO, po czym dokonano selekcji w G418. Klony poddano skriningowi pod kątem wydzielania materiału reagującego w teście ELISA z opisanymi poniżej przeciwciałami heterologicznymi (rozdział 5.4). Następnie, klony o wysokiej produkcji, seryjnie przystosowywano do wzrostu w warunkach bez surowicy, z użyciem podłoża Sigma 301. 10x stężone supematanty z tych klonów nakładano na żele Western, przed i po trawieniu enterokinazą, rozwijając poszczególne ścieżki w żelach z przeciwciałem anty-His lub skierowanym przeciwko hemoglobinie.

PL 211 789 B1

5.4 Przeciwciała do Hb i łańcucha γ Hb

W celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych do łańcucha γ ludzkiej Hb, zsyntetyzowano 25-meryczny peptyd (odpowiadający pozycjom 48-72 pełnej długości łańcucha γ, SAIMGNPKVKAHGKKVLTSLGDAI) (American Peptide Co., CA) i sprzężono z KLH. W celu otrzymania hybrydomy do produkcji mAbs wykrywających ludzki łańcuch γ, szczury immunizowano białkiem sprzężonym z KLH przed pobraniem komórek śledziony, fuzją z komórkami macierzystymi szpiczaka YB2 i selekcją w teście ELISA (z płytkami pokrytymi peptydem lub łańcuchem y hemoglobiny).

Podobną strategię wykorzystano do produkcji przeciwciała przeciwko owczemu łańcuchowi γ, zastosowano zsyntetyzowany peptyd DAILGNPKVKGHGKKVLNSFSEGLK, immunizację BSA-sprzężonym peptydem i skrining jak wyżej. Potwierdzenie, że heterologiczne i mAbs wykrywały odpowiedni łańcuch hemoglobiny uzyskano na podstawie analizy w żelu Western.

Handlowo dostępne przeciwciała wobec owczej i ludzkiej hemoglobiny uzyskano z Sigma.

6. P r z y k ł a d 6

Otrzymywanie i charakterystyka LPS, lipidu A i monofosforylo heksaacylolipidu a

6.1.1 Wzrost bakterii, ekstrakcja LPS i otrzymywanie monofosforanu lipidu a (MPLa)

Cztery grupy mutanta Re E.coli szczepu F515 [Schmidt i wsp., 1970] hodowano w 10 l fermentorze(Biostate E) w kazeino-peptonowym podłożu [Schlecht S. i wsp., 1975], zaszczepianym 2% 1 godz. hodowli w 37°C, pH 7.2 przez 18 h, do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Bakterie uśmiercano 1% fenolem i zbierano poprzez wirowanie (JLA-8100, Beckman). Komórki (masa mokra 402 g) przemywano 2 l każdego destylowanej wody, etanolu, acetonu (dwukrotnie) i raz 1 l eteru dietylowego, następnie suszono (wydajność: 101.5 g).

LPS ekstrahowano z suszonych sublimacyjnie komórek, stosując metodę ekstrakcji fenolem-chloroformem-eterem naftowym (PCP I) [Galanos C. i wsp., 1969]. Ostatni precypitat przemywano dwukrotnie acetonem (100 ml) w celu usunięcia pozostałości fenolu, odwirowano (10,000 xg, JA-10, Backman) a osad zawieszano w wodzie destylowanej (20 mg/ml); doprowadzano pH do ~8 i prowadzono intensywną dializę wobec wody destylowanej. Uzyskany materiał liofilizowano otrzymując oczyszczony Re-LPS (3.23 g, 3.2% wag./wag.).

6.1.2 Izolacja i oczyszczanie monofosforylo lipidu A „Surowy” monofosforylo lipid A (MPLA) otrzymano z 1.0 g Re-LPS z E.coli F515 w wyniku hydrolizy prowadzonej w 100 ml kwasu chlorowodorowego (0.1 M HCl), w 100°C, przez 30 min. Hydrolizat oziębiano na lodzie, wirowano (4.000 obr./min, 4°C, 10 min, Hattich, Rotixa RP), osad zawieszano ponownie w chloroformie:metanolu 80:20 (obj.) i suszono otrzymując 731.8 mg surowego MPLA (~73% wag./wag.). TCL dla tego materiału wykazało znaczną homogenność naturalnego MPLA z dwoma głównymi lipidami migrującymi z hehsa-acylo (RF 0.77) i penta-acylo (RF - 0.71) MPLA (Figura 29).

6.1.3 Analityczna chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i preparatywna (PLC)

Analityczną TLC (Fig. 29) wykonano na płytkach z żelem krzemianu glinu (0.2 mm, Kieselgel 60 F254, Merck), na które nakładano 30 μg każdej próbki na ścieżkę. Płytki TLC rozwijano w mieszaninie chloroform:metanol:1% kwas octowy 100:50:3 (obj./obj./obj.) i barwiono przez zanurzenie w mieszaninie etanol:stęż. kwas siarkowy 85:15 (obj./obj.) i ogrzewanie. Preparatywne oczyszczanie frakcji lipidu A przeprowadzono poddając surowy lipid A (całkowita masa 170 mg) na płytki preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej (PLC), pokryte żelem krzemionkowym i stosując ten sam układ rozpuszczalników, jak w analitycznej TLC. Preparatywna chromatografię warstwową (PLC) przeprowadzono nakładając surowy MPLA (160 mg) w ośmiu równych, 20 mg porcjach na płytkę PLC (2 mm grubości, 20x20 cm, Kieselgel 60, Merck). Po PLC, prążki MPLA stały się widoczne po spryskaniu płytek dwukrotnie destylowaną wodą. Frakcje zdrapywano z wysuszonych płytek i wymywano mieszaniną chloroform:metanol 80:20 (obj./obj.) z żelu krzemionkowego poprzez filtrację i dwukrotne przemycie 10 ml powyższego rozpuszczalnika. Czyste frakcje MPLA zatężano na wyparce obrotowej i zawieszano ponownie w 2-5 ml wody, do której dodano kroplami wodną trietyloaminę (TEN, 0.36 M), do uzyskania pH ~8.5. Zawiesinę soli lipid A TEN dializowano wobec wody (600 ml, cztery razy) i suszono sublimacyjnie.

6.1.4 Analiza składu, cukier, fosforan i kwasy tłuszczowe

GlcN określano stosując metodę Strominger'a i wsp. [Strominger J.L. i wsp., 1959] po hydrolizie w 4 M HCl (100°C, 16 h) a fosforan według metody Lowry i wsp. 1954. W celu analizy kwasów tłuszczowych, suszone sublimacyjnie próby lipidu A (200 μg) wymieszano z 50 μg wzorca wewnętrznego (kwas heptadekanowy, 17:0). Analizę całościową kwasów tłuszczowych wykonano po metanolizie

PL 211 789 B1 z 1.5 ml 2M HCl/MeOH w 120°C przez 16 h w zamkniętych szczelnie ampułkach. Metanolizowane próby rozpuszczono w wodzie a uzyskane estry metylowe kwasów tłuszczowych ekstrahowano trójkrotnie 3 ml chloroformu, zatężano i analizowano w GLC.

Analizę GLC przeprowadzono stosując chromatograf model Varian 3700, wyposażony w kolumnę kapilarną z SPB-5® (Supelco Inc., Bellefonte, USA), stosując gradient temperatury od 120°C do 260°C przy 5°C/min. Temperatura iniekcji i detekcji wynosiła 290°C. Jako gaz nośny użyto wodór, o prędkości przepływu 1 ml/min, ciśnienie kolumny 2 kg-cm² i stosunek rozszczepienia 1:10. Jako standard zewnętrzny zastosowano estry metylowe kwasów tłuszczowych, do jakościowego i ilościowego określenia uwolnionych kwasów tłuszczowych.

6.1.5 Spektrometria masowa desorpcji laserowej matrycy z analizatorem czasu przelotu jonów (MALDI-TOF)

MALDI-TOF MS wykonano stosując Bruker-Reflex II (Bruker-Franzen, Bremen, Niemcy) w liniowej konfiguracji, o napięciu przyspieszenia 20 kV. Lipid A rozpuszczono w wodnej TEN (0.07 M), w stężeniu 2 pg/pl, potraktowano małą ilością żywicy kationowymiennej Amberlite IR-120 (H⁺) w celu usunięcia nadmiaru sodu i potasu i 1 pl roztworu wymieszano z 1 pl 0.5 M 2,4,6trihydroksyaceto-fenonu (Aldrich, Deisenhofen, Niemcy) w metanolu jako roztworze matrycy. Porcje 0.5 pl nakładano do metalowego pojemnika na próbki i analizowano natychmiast po wysuszeniu w strumieniu powietrza. Spektra masowe zapisywano dla jonów ujemnych i dodatnich. Aparat kalibrowano zewnętrznie podobnymi związkami o znanej strukturze chemicznej.

6.1.6 Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego

W celu analizy NMR, należało otrzymać w pełni uprotonowaną formę lipidu A, co uzyskano poprzez zawieszenie 13 mg oczyszczonego MPLA w 2 ml destylowanej wody, w 0°C, zwiększanie pH do ~9 przez dodanie 0.36 M wodnej TEN, a następnie obniżenie pH ~2 przez dodanie kroplami 0.1 N HCl w zimnie. Wytrącony lipid A izolowano przez wirowanie (2500 g, 5 min, 4°C). Osad rozpuszczano w 3 ml mieszaniny 4:1 chloroform/metanol (obj./obj.) i przemywano trzy razy 5 ml wody destylowanej. Po usunięciu rozpuszczalnika, pozostałość suszono nad P4O10 w eksykatorze. Widma NMR dla MPLA zapisywano dla 0.5 ml chloroform-d/metanol-d4 4:1 (obj./obj.) w 5 mm wysokodokładnych probówkach do prób NMR (Promochem).

Proton(¹H) i wszystkie protony wykryte w 2D-NMR widmach zapisano na spektrofotometrze Bruker DRX-600 AVANCE przy 600 MHz. Widma w 2:1 chloroform-d/metanol-d4 (obj./obj.) zapisywano przy 295 K i odnoszono do wewnętrznego metanolu (δ_Η 3.35 ppm, δ₀ 49.0 ppm) ¹H/¹H-COSY eksperymenty wykonano stosując standardowy program komputerowy Bruker (XWINNMR2.6).

6.2 Wyniki

6.2.1 Oczyszczanie lipidu A i analiza TLC z immunobarwieniem

Analiza TLC surowego hydrolizatu lipidu A, otrzymanego w wyniku kwaśnej hydrolizy LPS, ujawniła zaskakująco jedynie dwie frakcje (Fig. 29). Następujące dwie frakcje MPLA uzyskano w wyniku preparatywnej chromatografii warstwowej (PLC) i próbnie oznaczono w oparciu o ich znane wartości RF [Zahringer U. i wsp., 2001] i spektrometrii masowej MALDI-TOF: MPLAheksa (RF 0.77, 13.1 mg), (wydajność 8% wag./wag.). MPLAheksa obecny w surowym lipidzie A nie był dalej badany.

6.2.2 Analiza składu chemicznego LPS: cukry, fosforan i kwasy tłuszczowe

Analiza kwasów tłuszczowych MPLA ujawniła (R)-3-hydroksytetradekanian [14:0(3-OH)] (1411 nmol/mg) w stosunku molarnym 3.7 mol/2 mol GlcN, natomiast stwierdzono, że 12:0 (1.0 mol/2 mol GlcN) i 14:0 (0.8 mol/2 mol GlcN) znajdują się w oczekiwanym zakresie. Zawartość fosforanu oszacowano jako 0.9 mol/2 mol GlcN, zgodnie z strukturą szkieletu lipidu A MPLA [(4'-P-e-D-GIcpN-(1'->6)-D-GIcpN]. W celu określenia pozycji różnych kwasów tłuszczowych w oczyszczonym MPLA_heksa konieczna była dalsza analiza spektrofotometrii masowej MALDI-TOF i spektrometrii NMR dla analizy pełnej struktury badanej cząsteczki.

6.2.3 Spektrometria masowa MALDI-TOF dla MPLAheksa

Strukturę pierwszorzędową MPLAheksa badano dalej stosując protonową (¹H), węglową (¹³C) i fosforową (³¹P) spektroskopię NMR w mieszaninie 2:1 chloroform-d/metanold4 (obj./obj.). Widma 1D i 2D NMR umożliwiły jednoznaczne określenie pierwszorzędowej struktury lipidu A, włączając obraz fosforanów i podstawienia kwasów tłuszczowych (Fig. 31).

Redukujący koniec GlcN wykazuje dwa anomeryczne protony (Η-1α 4.68 ppm i Η-1β 4.03 ppm) i stałe sprzężenia J1,2 3.5 Hz i 8.4 Hz, odpowiednio wskazujące konfigurację α- i β, w proporcji 5:1 dla redukującego MPLA. Sygnał H-1' (4.26 ppm) z GlcN II (J1,2 8.1 Hz) wskazuje na β(1'>6) wiązanie międzyglikozydowe w szkielecie lipidu A. Wszystkie inne protony w GlcN I i GlcN II oznaczono przez

PL 211 789 B1 ¹H/¹H-COSY (Fig. 24c) i ¹H/¹H-TOCSY (dane nieprzedstawione), z wykorzystaniem dołączalności, poczynając odpowiednio, od sygnałów H-1 lub H-1'. Wszystkie chemiczne przesunięcia pozostają w zgodzie z wcześniej opublikowanymi danymi NMR dla nie derywatyzowanych heksaacylowych cząsteczek lipidu A [Zahringer, U. i wsp., 2001; Ribeiro A.A. i wsp., 1999].

Obraz acylacji czterech pierwszorzędowych [14:0(3-OH)] i dwóch drugorzędowych kwasów tłuszczowych (14:0 i 12:0) wywnioskowano na podstawie porównania widm NMR dla lipidu Aheksa (bifosforan lipidu A) [Ribeiro A.A. i wsp., 1999]. Diagnostyczne piki krzyżowe H-3^c i H-3^d w pierwszorzędowych kwasach tłuszczowych posiadały takie samo przesunięcie chemiczne, jak analogiczne jądra w lipidzie Aheksa, dając identyczny wzór acylacji (4+2).

Biorąc pod uwagę wszystkie wyniki analizy chemicznej, spektrometrii masowej MALDI-TOF i 1D i 2D homo- i heterojądrowej spektroskopii NMR, w niniejszych badaniach wykazano jednoznacznie identyczność strukturalną naturalnego heksa-acylo monofosforylo lipidu A (MPLAheksa) ze szczepu mutanta E.coli F515. Szkielet tego związku określono jako [(4'-P-e-D-GicpN¹], którego obie grupy aminowe w pozycji 2 i 2' i obie grupy hydroksylowe w pozycji 3 i 3' ulegały acetylacji przez kwasy 3-hydroksytetradekanowe. 14:0(3-OH) w pozycji 2' i 3' (GlcN II) są dalej acetylowane, odpowiednio z 12:0 i 14:0. Grupy hydroksylowe w pozycjach 4 (GlcN I) i 6' (GlcN II) szkieletu lipidu A pozostają niepodstawione. Pełną strukturę MPLAheksa przedstawiono na Figurze 2.

7. P r z y k ł ad 7

Biochemiczna charakteryzacja aktywności preparatów hemoglobiny pochodzącej z płodów owiec oraz wolnej od hemu hemoblobiny HbF, hamujących agregację lipopolisacharydów (LPS)

7.1 Metody

W odniesieniu do molekularnego mechanizmu wzmocnienia biologicznych aktywności LPS przy pomocy preparatów hemoglobiny HbA pochodzącej z dojrzałych organizmów ssaczych w publikacjach Roth, R.J., 1994; Kaca W., 1994; Roth R.j., 1994 opisano fakt całkowitego rozproszenia fizjologicznie dominujących agregatów LPS o dużych rozmiarach (MW > 10⁶) przy pomocy HbA. W celu analizy potencjalnie analogicznych efektów przy zastosowaniu wysoko oczyszczonej hemoglobiny pochodzącej z embrionów owczych (s-HbF), opracowano zautomatyzowany system analizy oparty na elektroforezie natywnej z zastosowaniem aparatu PhastSystem^TM (Amersham Pharmacia Biotech). W skrócie, Re-LPS wyizolowane z E.coli F515 lub LPS w formie S pochodzące z Salmonella enterica sv. Minnesota 188233 o końcowym stężeniu 0.275 ąg/ąl inkubowano w obecności preparatu analizowanej hemoglobiny (w stężeniu 0.375 ąg/ąl), lub przy jej braku w temp. 37°C przez 30 min. Następnie próby umieszczano w lodzie i doprowadzono je do warunków, w których prowadzona była natywna elektroforeza, poprzez dodanie czterokrotnie stężonego buforu do natywnej elektroforezy (200 mM Tris HCl, ph 7.6; 40 mM 2-merkaptoetanol; 40% (w/v) glicerol; 0.008% (w/v) bromofenolblu). Następnie próby w ilości 1 ąl zostały automatycznie naniesione do studzienek w żelu zagęszczającym PhastGel^TM homogeneous-20 buforze do natywnej elektroforezy PhastGel^TM Native buffer (Amersham Pharmacia Biotech). Elektroforezę prowadzono w środowisku natywnym z zastosowaniem aparatu PhastSystem^TM w temp. 4°C przy stałym napięciu 400 V. Po skończonej elektroforezie żele barwiono srebrem zgodnie z protokołem opisanym przez Heukeshovena i Demicka [Heukeshoven, J., i Demick, R., 1988]. Integralność białkowych komponentów w trakcie inkubacji w warunkach natywnych analizowano w następujący sposób: do prób dodawano SDS do końcowego stężenia 2% (w/v), następnie próby poddawano denaturacji prze 5 min w 95°C. Zdenaturowane próby analizowano w elektroforezie w warunkach denaturujących w żelu PhastGel^TM homogeneous-20 i w buforze PhastGel^TM SDS buffer (Amersham Pharmacia Biotech) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta aparatury PhastSystem^TM, następnie żele barwiono srebrem.

W natywnej elektroforezie z zastosowaniem PhastSystem^TM porównywano zdolność do hamowania agregacji lipopolisacharydów (LPS) przez takie preparaty, jak owcza HbF, preparat ludzkiej HbA (SIGMA-Aldrich), hemoblobina izolowana z dojrzałych owiec (s-HbA) oraz wolna od hemu hemoglobina izolowana z owczych embrionów (s-HbF/hf).

7.2 Wyniki

Wyniki uzyskane w natywnej elektroforezie z zastosowaniem aparatu PhastSystem^TM wskazały, że zarówno w obecności owczej hemoglobiny płodowej i tej pochodzącej z dojrzałych owiec, oraz hemoglobiny pochodzenia ludzkiego (HbA), LPS typu R i typu S migrują pokonując granicę między żelem zagęszczającym i żelem rozdzielającym i rozdzielane są w 20% żelu rozdzielającym. Natomiast rozdział elektroforetyczny preparatu LPS nie inkubowanego z roztworem hemoglobiny w natywnych

PL 211 789 B1 warunkach wskazywał na wolniejszą migrację takich LPS na granicy żelu zagęszczającego co sugeruje, że w preparacie takim powstaje duża ilość agregatów o masie MW > 10⁶Da (Rys. 32)

Wyniki natywnej elektroforezy uzyskane dla ludzkiej HbA były analogiczne do wyników uzyskanych we wcześniejszych eksperymentach, w których stosowano natywną elektroforezę na „dużą skalę [Kaca, W., 1994]. Nasze wyniki silnie wskazują na całkowitą dyspersję agregatów LPS przez wysoko oczyszczone preparaty owczych HbA i HbF [Roth, R.J., 1999] W szczególności, wyniki natywnej elektroforezy wskazuje na silniejszą aktywność hamującą agregacją LPS w przypadku owczej hemoglobiny pochodzenia płodowego, niż w przypadku zastosowania preparatu owczej HbA. Niespodziewanie podczas dodatkowych analiz z zastosowaniem natywnej elektroforezy zaobserwowano aktywności hamujące agregację LPS również w przypadku inkubacji z preparatem owczej hemoglobiny pochodzenia płodowego pozbawionej hemu. (Rys. 33).

Obserwowane zdolności do rozpraszania agregatów LPS wskazują na nowe własności owczej hemoglobiny pochodzenia płodowego, nieopisywane dotychczas dla gatunków ssaczych. Ponadto w odróżnieniu od dobrze udokumentowanej funkcji transportera tlenu w przypadku hemoglobiny płodowej nasze analizy ujawniają, że w aktywnościach hamujących agregację LPS pośredniczą łańcuchy białkowe, co jest funkcją niezależną od cząsteczki hemu.

8. P r z y k ł a d 8

Synergistyczne bioaktywności LPS lub MPLA i owczej hemoglobiny pochodzenia embrionalnego w testach in vitro

8.1 Indukcja tlenku azotu przez LPS lub Lipid A i Hemoglobinę

8.1.1 Metody

8.1.1.1 Reagenty

Do testów użyto LPS i wolny Lipid A pochodzące z S. enterica sv Minnesota Re-mutant R595 oraz MPLA.

8.1.1.2 Myszy

Myszy płci męskiej i żeńskiej pomiędzy 6 a 10 tygodniem życia otrzymano z hodowli udostępnionej przez Max-Planck-Institut fur Immunobiologie w Freiburgu.

8.1.1.3 Preparacja makrofagów pochodzących z mysiego szpiku kostnego (BMDM) zobacz przykład 3.1.1.1

8.1.1.4 Indukcja i oznaczanie tlenku azotu uwalnianego przez mysie makrofagi BMDM zobacz przykład 3.1.1.4

8.1.1.5 Komórki ludzkie

8.1.1.5.1 Izolacja komórek jednojądrzastych z ludzkiej krwi heparynowej

Ludzkie komórki jednojądrzaste (MNC) izolowano w krwi pochodzącej od dorosłych i zdrowych dawców metodą wirowania w gradiencie gęstości fikolu [Boyum, 1968] MNC przemywano czterokrotnie w HBSS i zawieszono w medium RPMI 1640, do osiągnięcia stężenia 4x10⁶ komórek/ml. Medium RPMI 1640 wzbogacono dodatkowo 1% roztworem L-glutaminy i 1% mieszaniną penicyliny i streptomycyny.

8.1.1.5.2 Stymulacja i detekcja TNFa

Świeżo wyizolowane ludzkie MNC umieszczono na płytkach do testów ELISA w ilości 1.6x10⁶ komórek/400 μl na każdy dołek. SHbF2 (10 μΓ^Γ) i/lub CLP2p (10 nl/ml) preinkubowano w obecności lub bez LPS (10 nl/ml) przez 30 min. w temp. 37°C i dodano do MNC. Następnie prowadzono inkubację przez 22-24 h. Po inkubacji zbierano supernatant (nie zawierający komórek) i analizowano przy użyciu czytnika ELISA ilość uwolnionego TNFa

8.1.2 Wyniki (Myszy)

8.1.2.1 Indukcja produkcji tlenku azotu przez BMDM stymulowane przez LPS lub monofosforyl-Lipid A i HbF zawierające hem i pozbawione hemu.

W celu zbadania zależności efektu synergistycznego pomiędzy LPS i hemoglobiną płodową jak również pomiędzy LPS i hemoglobiną pozbawioną hemu, zbadano ich zdolność do stymulacji produkcji tlenku azotu w BMDM.

Wyniki tych eksperymentów (Rys. 34 a,b, 35 a,b, oraz 36 a,b) wskazują na widoczny efekt synergistyczny, niezależnie od obecności grupy hemowej, zarówno w przypadku Re-LPS jak i monofosforylu Lipidu A. Wyraźnie widoczny efekt synergistyczny w przypadku zastosowania hemoglobiny pozbawionej hemu wskazuje na to, że grupa hemowa nie jest konieczna dla uzyskania takiego efektu.

PL 211 789 B1

8.2 In vitro indukcja cytokin (TNFa i Interleukiny 6) przez LPS, Lipid A lub frakcje Lipidu A oraz przez hemoglobinę lub subfrakcje pochodne

8.2.1 Metody

Mysie splenocyty lub ludzkie PBL w ilości 1x10⁶ komórek/ml, (oczyszczane z zastosowaniem Fikolu) inkubowano przez 24 h w temp. 37°C w 1 ml medium MEM (z dodatkiem 10% FCS), same lub w obecności LPS o zmieniającym się stężeniu, z lub bez dodatku wolnych od LPS FSLE (protokół LAL) lub z albo bez Hb lub subfrakcji. Po upływie czasu inkubacji zbierano supernatant (nie zawierający komórek) i analizowano przy użyciu czytnika ELISA ilość uwolnionego TNFa lub oznaczano stopień zahamowania wzrostu komórek guza Wehi 1643, przy użyciu rekombinacyjnych mysich TNFa jako standardu.

8.2.2 Wyniki

Wyniki

Zaplanowano dwa typy eksperymentów w celu zbadania zależności synergicznej pomiędzy LPS i Hb lub jej subfrakcje.

W pierwszej serii eksperymentów (Rys. 37 i 38) z użyciem mysich komórek pochodzących ze śledziony zauważono wyraźne wzmocnienie produkcji TNFa (Rys. 37) lub IL-6 (Rys. 38) przy użyciu owczej hemoglobiny pochodzenia płodowego, czego nie zaobserwowano, gdy do eksperymentu użyto hemoglobiny pochodzącej od dorosłej owcy. W drugiej serii eksperymentów inkubowano LPS i Hb z ludzkimi komórkami PBL i podobnie jak w pierwszej serii zaobserwowano wyraźne wzmocnienie produkcji TNFa (Rys. 39) w przypadku inkubacji z HbF, czego nie zaobserwowano, gdy do eksperymentu użyto HbA. Podsumowując, przy użyciu ludzkich komórek PBL pochodzących od dwóch niezależnych dawców (panele A i B, Rys. 40) testowano zdolności do oddziaływania synergicznego dwóch różnych substruktur - HbA i HbF. Z otrzymanych wyników jasno wynika, że optymalną zdolność do wzmocnienia produkcji TNFa wykazały a, γ-dimery Hb płodowej w koniunkcji z LPS (Rys. 40).

W kolejnym cyklu eksperymentów testowano zdolności do działania synergicznego sklonowanych łańcuchów γ i β owczej Hb (Rys. 40a). Oznaczenie poziomu produkcji TNFa w komórkach śledziony mysiego pochodzenia (używanych w powyższym teście), wyniki przedstawione na Rys. 40a wskazują na imponujące współdziałanie pomiędzy łańcuchem γ a LPS. W przypadku klonowanego łańcuch a otrzymane wyniki nie były tak oczywiste, jak w przypadku łańcucha γ, co wskazuje na to, że łańcuch γ jest zaangażowany we współdziałanie pomiędzy LPS i Hb. Jednocześnie nie wyklucza się, że dimer a, γ może być zaangażowany w opisywane działanie synergiczne.

8.3 Współdziałanie pomiędzy monofosforyl-Lipidem A (MPLA) i oczyszczonym owczym łańcuchem γ w układzie komórek ludzkich

W celu odpowiedzi na pytanie, czy biochemicznie oczyszczony owczy łańcuch γ pochodzenia płodowego może wpływać na aktywność biologiczną MPLA inkubowano te dwa czynniki w obecności ludzkich monocytów peryferyjnych a następnie oznaczono ilość TNFa wyprodukowaną przez monocyty. Uzyskanie wyniki wskazują na znaczący wpływ oczyszczonego łańcucha γ na podwyższenie aktywności biologicznej MPLA. Przy zastosowaniu w analogicznym teście łańcucha a zanotowano znacznie niższą aktywność MPLA (Rys. 40b). Taki wynik potwierdza wcześniejsze założenia, wskazujące na to, że to łańcuch γ jest zaangażowany we współdziałanie pomiędzy Hb i LPS.

8.4 Współdziałanie in vitro pomiędzy LPS, Hb i CLP w układzie komórek mysich

Otrzymane wyniki (Rys. 40c.) demonstrują efekt współdziałania pomiędzy LPS i odpowiednią substrukturą Hb, który dodatkowo zostaje wzmocniony przez pulę CLP. Poziom cytokiny TGFe uwalnianej z mysich komórek śledziony inkubowanych w obecności tylko LPS i Hb (panel górny) jest niski (< 250 pg/ml). Zaś w przypadku analizy LPS i odpowiedniej substruktury Hb w obecności CLP1b lub CLP2p (poniższy panel) można zauważyć jednoznaczny efekt współdziałania w przypadku płodowego łańcucha γ. Zatem dodatek CLP1b prowadzi do dwukrotnie zwiększonej produkcji TGFe (panel środkowy) w porównaniu do kontroli (panel górny, bez dodatku CLP1b). Te wyniki wskazują, że w obecności CLP1b/CLP2p współdziałanie LPS/Hb jest mocniejsze, co manifestuje się produkcją większej ilości cytokiny w użytym do testu układzie komórek śledziony izolowanych z myszy.

8.5 Współdziałanie w warunkach in vitro LPS, Hb i CLP w układzie komórek ludzkich

W celu zbadania czy FSLE (w formie CLP2p) może wpływać na współdziałanie sHbF/LPS również w przypadku ludzkich komórek, peryferyjne monocyty ludzkie inkubowano w obecności LPS, sHbF i CLP2p zgodnie z opisem zawartym w paragrafie 8.1.1.5.1.. W obecności CLP2p zaobserwowano wzmocnienie produkcji TNFa i znaczący wzrost współdziałania LPS/sHbF (Rys. 40d). Te wyniki

PL 211 789 B1 wskazują, że w obecności czynnika FSLE dochodzi do wzmocnienia efektu współdziałania Hb/LPS/ również w komórkach ludzkich.

9. P r z y k ł a d 9

Regulacja czynników odpornościowych w warunkach in vivo poprzez podawanie (w szczególności) doustnie LPS, Hb i subfrakcji FSLE i LPS.

9.1. Metody

Preparaty podawano myszom doustnie przez zgłębnik (w 100 pl PBSu) i/lub drogą domięśniową lub dootrzewnowo. Po upływie 24 h od podania preparatów myszy uśmiercano i oznaczano w ich surowicy poziom TNFa (opis metody oznaczania w paragrafie 8.2.1) oraz poziom IFNy z zastosowaniem testów ELISA. Dodatkowo poddawano wirowaniu płyn otrzewnowy w celu usunięcia komórek i następnie oznaczano w nim poziom cytokinin.

9.2. Wyniki

W większości publikowanych dotychczas eksperymentów CLP1b/2p podawano (w warunkach in vivo) dożylnie domięśniowo lub dootrzewnowe Tu zbadano natomiast, czy frakcje te podawane inną drogą np. doustnie również będą działały (lokalnie lub systematycznie).

9.2.1 Współdziałanie pomiędzy CLP, LPS i Hb (włączając substruktury Hb)

W celu zbadania, czy współdziałanie pomiędzy FSLE, strukturami Hb i LPS prowadzi do indukcji cytokiny, pośrednio stymulowano komórki do produkcji TNFa i IFNy w warunkach in vivo. Myszy otrzymywały 10 pg LPS drogą dootrzewnową lub doustnie (w 100 pl PBSu) lub FSLE doustnie, w ilości 300 pg na mysz. Każdy preparat podawano zarówno oddzielnie jak i w kombinacji. 24 h po podaniu preparatów zwierzęta uśmiercano i izolowano z nich krew, przeprowadzając punkcję serca. 2.0 ml ciepłego roztworu MEM z 10% FCS wstrzyknięto do jamy otrzewnowej i sterylnie pobrano płyn otrzewnowy. Następnie otrzymany płyn otrzewnowy i surowicę miareczkowano w celu oznaczenia ilości emitowanych TNFa i stężenia IFNy (Rys. 41). Prezentujemy tylko wyniki pochodzące z testów biologicznych (test ELISA oraz wyniki dla IFNy uzyskane z zastosowaniem komórek Wehi279). Dodatkowo w prezentowanej pracy zostały pokazane jedynie wyniki uzyskane dla pojedynczego stężenia surowicy oraz dla pojedynczego stężenia płynu otrzewnowego (20 pl/200 ul objętości testowanej próby). Rys. 41 prezentuje synergiczny wzrost produkcji TNFa w surowicy i IFNy w płynie otrzewnowym, przy doustnym podawaniu CLP za pomocą zgłębnika oraz doustnym lub dootrzewnowym podaniu LPS. Optymalne wyniki oddziaływania synergicznego uzyskano dla doustnego podawania preparatu zawierającego FSLE/LPS.

We wcześniejszych badaniach [Gorczynski, R.m., 1997; Gorczynski, R.m., 1998;] wykazaliśmy, że długotrwałe podawanie CLP w warunkach in vivo starym myszom prowadziło do odwrócenia polaryzacji produkowanych cytokin obserwowanego po stymulacji w warunkach in vitro komórek śledziony pochodzących z tych zwierząt przez Con A. Tak więc komórki pochodzące z młodych zwierząt (w wieku około 8 tygodni ) produkują w przeważającej większości cytokiny typu 1 (IL-2, IFNy) podczas gdy komórki pochodzące ze starych myszy (powyżej 20 miesięcy) produkują głównie cytokiny typu 2 (IL-4, IL-10). Jednakże po ciągłym podawaniu FSLE nawet komórki pochodzące od starych myszy, po aktywacji przez Con A w warunkach in vivo, produkowały w przeważającej mierze cytokiny typu 1. Natomiast w tych systemach nie analizowano współdziałania CLP1b i CLP2p wraz z LPS.

Następnie zostało przeprowadzone dochodzenie, czy istnieje współdziałanie pomiędzy LPC i CLP w komórkach pochodzących ze starych myszy, w których dochodzi do odwrócenia wzoru polaryzacji produkowanych cytokin. Grupom po pięć myszy, podawano doustnie LPS w ilości 10 pg/mysz lub FSLE (150 pg/mysz), sam lub w kombinacji. Preparaty podawano w zerowym i dziesiątym dniu eksperymentu. Następnie w dwudziestym dniu eksperymentu wszystkie myszy uśmiercono. Z każdej myszy pobrano komórki śledziony. Wyizolowane komórki przez 40 h stymulowano przez Con A (5 pg /ml). Następnie w supernatancie oznaczono w testach ELISA ilość IL-2 i IL-4, a w testach biologicznych oznaczono odpowiednio stymulację wzrostu CTLL-2 lub CTL-4.S. Na Rys. 42 zostały zaprezentowane tylko wyniki uzyskane w teście ELISA (średnia arytmetyczna z trzech eksperymentów).

Komórki pochodzące od młodych myszy produkowały w przeważającej części IL-2 typu pierwszego, (wyniki z prawej strony Rys. 42). Natomiast komórki pochodzące od starych myszy (które nie zostały poddane działaniu LPS i FSLE) w przeważającej części wytwarzały IL-4 typu drugiego a rzadziej IL-2 (wyniki po lewej stronie Rys. 42) Podawanie starszym myszom LPS i FSLE w różnych kombinacjach prowadziło do widocznego przesunięcia u nich produkcji cytokin z kierunku wytwarzania IL-2, co jest cechą charakterystyczną młodych organizmów. Podobnego efektu nie zaobserwowano przy podawaniu FSLE, czy LPS rozdzielnie w stosowanych dawkach. Dopiero zastosowanie dużo

PL 211 789 B1 wyższych dawek (300-500 pg/mysz) przy częstszej ekspozycji (4x z pięciodniowymi przerwami) w przypadku FSLE prowadziło do podobnych efektów.

9.2.2 Analiza wzmocnienia indukcji TNFa w warunkach in vivo u myszy, którym doustnie podawano CLP i LPS lub frakcje Lipidu A, lub oczyszczone łańcuchy hemoglobiny i LPS W celu oceny synergicznych interakcji pomiędzy FSLE (lub białkowymi łańcuchami hemoglobiny) i LPS (lub frakcji Lipidu A) przeprowadzono następujące eksperymenty. Grupy liczące po pięć myszy linii C57BL/6 przynajmniej raz stymulowano przez podanie doustne 100 p preparatu soli fizjologicznej. W eksperymentach, których wyniki zostały przedstawione na Rys. 43. jako czynniki stymulujące podano dootrzewnowo LPS lub frakcje Lipidu A. Natomiast na Rys. 44 prezentujemy wyniki otrzymane z komórek myszy, którym dodatkowy czynnik stymulujący podano doustnie. Wszystkie myszy zostały uśmiercone 24 h po podaniu preparatów, następnie w surowicy pochodzącej z tych myszy oznaczono w teście ELISA w trzech powtórzeniach poziom cytokin. Więcej informacji zawarto w opisie pod rycinami.

Zarówno w przypadku podawania FSLE i LPS (lub frakcji Lipidu A) - Rys. 43., jaki i w przypadku podania LPS i hemoglobiny (Rys. 44) zaobserwowano wzmocnioną produkcję TNFa, w przypadku, gdy przynajmniej jeden z czynników został podany doustnie. Również przy podaniu obu czynników stymulujących doustnie, można zaobserwować efekt wzmocnienia produkcji TNFa (Rys. 44 i Rys. 42).

9.2.3 Podawanie LPS i CLP1b oddzielnie.

Myszom podawano różne dawki CLP1b/CLP2p dootrzewnowo, dożylnie, domięśniowo lub doustnie (w 0.2 ml sterylnego PBSu). Podawane dawki mieściły się w przedziale od 0,5 do 50 pg/mysz. Następnie myszy były uśmiercane w różnym czasie po podaniu preparatów (w przedziale od 1h do 48 h). Komórki limfoidalne pochodzące ze śledziony; z kępek Peyera (PP); pachwinowe LN; krezkowe LN oraz komórki otrzewnowe inkubowano (bez dodatkowej stymulacji) przez 24 h a następnie w supernatancie oznaczono poziom cytokin. Wyniki (prezentowane w Tabeli 7) wskazują na produkcję cytokin przez komórki PP izolowane z myszy, którym podano CLP1b doustnie. W tabeli zaprezentowane zostały tylko wyniki dla cytokinin produkowanych przez komórki PP po podaniu CLP1b doustnie. Jednak zestawienie uzyskanych przez nas wyników wskazuje na to, że powstawanie cząsteczek mRNA oraz bioaktywnych cytokin/chemokin jest stymulowane lokalnie (w komórkach PP i MLN) po podaniu doustnym CLP1b i/lub CLP2p, podczas gdy podanie tych związków domięśniowo, dootrzewnowo lub dożylnie, indukuje systemiczne pojawienie się podobnych chemokin/cytokin (pachwinowe LN, śledziona). W tabeli 7 widać również, że ilościowo CLP1b, po podaniu doustnym jest aktywniejsze niż podanie wolnych LPS, co manifestuje się większą indukcją produkcji cytokin. Otrzymane wyniki wskazują również na większą odporność aktywnych płodowych związków na enzymy przewodu pokarmowego, chociażby odporność na proteazy demonstrowana przez CLP1b i CLP2p (opisana w przykładzie 3.2.2).

T a b e l a 7:

Dawki preparatówa (w pg) podawane myszom 24 h przez uśmierceniem	Spontaniczna produkcja cytokin przez komórki Kępek Peyerab po 24 h hodowli
	Tynfa [ng/ml]	TGFp	IL-6 [pg/ml]
1	2	3	4
None	<5.0	<5.0	30
CLP1b 50 pg	92	61	380
CLP1b 15 pg	79	51	325
CLP1b 5 pg	34	28	180
CLP1b 1.5 pg	28	21	155
CLP1b 0.5 pg	21	18	120
LPS 250 pg	70	41	255
LPS 50 pg	24	19	140
LPS 10 pg	14	14	67

PL 211 789 B1 ciąg dalszy Tabeli 7

1	2	3	4
LPS 2.0 ąg	6.2	n.d.	n.d.
LPS 0.4 ąg	n.d.	n.d.	n.d.

^a Grupy złożone z pięciu myszy linii C57BL/6 otrzymujące LPS lub CLP doustnie przez zgłębnik (w 0.2 ml PBSu) 24 h przed uśmierceniem. Odzysk komórek był taki sam we wszystkich testowanych grupach.

Poszczególne zawiesiny komórek Kępek Peyera (2x10⁶ komórek/ml) hodowano przez 24 h w buforze aMEM z dodatkiem 10% FCS bez stymulacji. Następnie w supernatantach zlanych z nad hodowli komórkowych oznaczono cytokiny (w teście opisywanym wcześniej).

^b Średnie arytmetyczne (SD<15% we wszystkich przypadkach) dla różnych cytokin.

n.d. oznacza wartości poniżej limitu detekcji ustalonego dla danego testu.

10. P r z y k ł a d 10

Aktywności immunomodulacyjne CLP (część I)

Aktywności CLP obejmujące produkcję TNFa, produkcję tlenku azotu oraz proliferację komórek śledziony przy użyciu uszkodzonego genu TLR4 pochodzącego od myszy.

10.1 Metody

10.1.1 Myszy

Myszy linii C57BI/10ScSn i Balb/c oraz myszy C57BI/10ScCr, z defektem w genie TLR4 pozyskano z Max-Planck-Institut fur Immunobiologie w Freiburgu FRG. Myszy hodowano w klatkach w ilości 3-5 myszy/klatkę, przy stałym dostępie do wody i pożywienia.

10.1.2 Izolacja splenocytów

Myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni uśmiercano przez ukręcenie karku. Następnie sterylnie usunięto z martwych organizmów śledziony i poddano je homogenizacji w szklanym homogenizatorze (Braun, Melsungen, Niemcy). Otrzymaną zawiesinę komórek przemywano dwukrotnie roztworem RPMI nie zawierającym dodatków, a następnie komórki zawieszono w roztworze RPMI z dodatkiem 10% FCS, 100 U/ml penicyliny i 100 ąg/ml streptomysyny (cRPMI).

10.1.3 Analiza (oznaczanie) proliferacji komórek śledziony

Proliferację splenocytów oznaczano poprzez pomiar inkorporacji ³H-tymidyny w strukturę DNA. Kultury komórek umieszczono na równym dnie dołka mikro- płytki w ilości końcowej 150 ąl/dołek. Mieszaninę 3x10⁵ splenocytów i CLP1b (100, 20, 4 ąg/ml), CLP2p (100, 20,4 ąg/ml, lub LPS (1, 0.1 ąg/ml) hodowano w medium cRPMI, przy 5% nasyceniu CO2. Hodowle kontrolne umieszczono w prostym medium. Po upływie 24 h komórki były przez następne 24 h inkubowane z ³H-tymidyną (23.125 KBq/dołek na płytce.). Następnie po zamrożeniu i rozmrożeniu oznaczono stopień inkorporacji ³H-tymidyny w strukturę DNA, przy pomocy licznika scyntylacyjnego.

10.1.4 Oznaczenie ilości produkowanego TNFa

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) (4x10⁵/dołek) umieszczono na mikro- płytkach z 24 dołkami (Fa. Falcon, Becton Dickinson Europe, Le Pont de Claix, Francja) Końcowa objętość próby wynosiła 600 ąl/dołek. Następnie komórki stymulowano do produkcji TNFa przez dodanie LPS w stężeniu od 10 ng/ml do 0.01 ng/ml i 5 ąg/ml FSLE. Hodowle kontrolne inkubowano w prostym medium. Wszystkie hodowle inkubowano w temp. 37°C, przy 5% nasyceniu CO2 Ilości TNFa oznaczono w teście ELISA (zgodnie z protokołem załączonym przez producenta aparatu)w supernatancie zbieranym po upływie 4 lub 24 godzin od momentu podania czynników stymulujących, (wszystkie odczynniki pochodziły z firmy Pharmingen, BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy).

10.1.5 Oznaczanie ilości produkowanego tlenku azotu.

Ilość produkowanego tlenku azotu w supernatancie z nad hodowli makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego oznaczono zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 3.1.1.4.

10.2. Wyniki

10.2.1 Indukcja proliferacji komórek śledziony przy użyciu uszkodzonego genu TLR4 pochodzącego od myszy

Wyniki eksperymentów proliferacji komórek śledziony demonstruje Ryc. 45. Mysie komórki C57BI/10 ScSn prezentuję normalną reakcję na LPS, to manifestuje się znacznie podwyższoną inkorporacją ³H-tymidyny w strukturę DNA po stymulacji przez LPS w stężeniu 1 i 0.1 ąg/ml LPS. Blisko spokrewnione myszy C57BI/10 ScCr noszą mutację typu null w genie LPS ulokowanym na 4 chromosomie [Poltrak, A. 1998]. To czyni komórki tych myszy (jak pokazano to dla splenocytów) silnie odpornymi na

PL 211 789 B1 stymulację przez LPS. U myszy stymulowanych przez LPS podanie CLP1b w stężeniach 100, 20 lub 4 μg/ml wywołuje znacznie podwyższoną inkorporacją ³H-tymidyny w strukturę DNA. Maksymalną aktywność zaobserwowano przy stężeniu 100 μg/ml. Aktywność CLP1b przewyższa znacznie tę oznaczoną dla CLP2p. W myszy nie będących odbiorcą LPS CLP1b i CLP2p wywołują dużo słabszą inkorporacją ³H-tymidyny, ale znaczącą przy stężeniach 100, 20 lub 4 μg/ml

10.2.2 Indukcja produkcji tlenku azotu przy użyciu uszkodzonego genu TLR4 pochodzącego od myszy

Wyniki eksperymentów indukcji produkcji NO przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy z defektem genu TLR4 przedstawiono na Ryc. 46.

W makrofagach BMDM z myszy linii C57BI/10 ScSn, stymulowanych przez LPS obserwowano silnie wzmożone wydzielanie NO przez 48 h po podaniu CLP1b lub CLP2b w stężeniach od 0.8 do 100 μg/ml. U myszy niebędących odbiorcą LPS, z defektem w genie TLR4 zaobserwowano aktywność CLP1b iCLP2p na znacznie niższym poziomie. Ten eksperyment wskazuje na to, że aktywność biologiczna CLP jest zależna od LPS, ale w tej aktywności pośredniczy(ą) inny(e) czynnik(i).

11. P r z y k ł a d 11

Immunomoddulujące działanie CLP-POOLS (część II)

Odwrócenie zaburzeń równowagi immunologicznej związanych z wiekiem

11.1 Systemy biologiczne (Metody)

11.1.1 Systemy mysie w eksperymentach dotyczących wieku

Młode (8-tygodniowe) i stare (100- 115- tygodniowe) myszy BALB/cNia, DBA/2Nia oraz C57BL/6Nia zostały zakupione od The National Institute on Aging, od laboratorium Charles River (Stony Ridge, NY). Myszy były hodowane po 5 w klatce i otrzymywały pożywienie i wodę ad libitum (w zależności od potrzeb). Wszystkie myszy były użyte do doświadczeń w ciągu 2 tygodni od przybycia od dostawcy. W niektórych przypadkach myszy poddawane były naświetlaniu 800 radami promieniowania γ (źródło promieniowania: ¹³⁷Cs, dawka 102R/min), łącznie z rekonstytucją (przywróceniem pierwotnej postaci) komórek śledziony, indukowaną poprzez żyłę ogonową boczną.

11.1.2 Sposób traktowania myszy z pools FSLE

Zwierzęta otrzymywały dootrzewnowo zastrzyki z 10-100 μg CLP1b/CLP2p w 0,25 ml buforu PBS co 3,5 dnia cztero- lub sześciokrotnie (po naświetlaniu i przywróceniu pierwotnej postaci komórkom śledziony). Myszy uśmiercano 2 dni po ostatnim zastrzyku i izolowano komórki śledziony (lub kępek Peyera, gruczołów chłonnych). W niektórych przypadkach myszy były immunizowane in vivo erytrocytami owczymi (SRBC) w liczbie 4x10⁸ lub otrzymywały 1x10⁵ syngenicznych komórek szpiku kostnego po letalnym naświetlaniu 900 radami. W niektórych eksperymentach niektóre grupy myszy również otrzymywały codziennie zastrzyki dożylne z N^G-metylo-L-argininą (L-NMMA), w dawce 30 mg/kg.

11.1.3. Oznaczanie cytokin

W hodowlach używanych do określenia produkcji cytokin stymulowano w trzech powtórzeniach po 5x10⁵ komórek uwrażliwionych na płytkach do mikromiareczkowania z 5 μg/ml ConA lub na płytkach z dołkami pokrywanymi anty-CD3-:; (100 ng/ml). Supernatanty były zbierane i łączone, gdy pochodziły z dołków z powtórzeń (w których wykonano identyczne procedury) po 40 godzinach hodowli i użyte do oznaczenia produkcji limfokin za pomocą testu ELISA, wykonywanego w trzech powtórzeniach. Do testu IFNy używano 96-dołkowych, płaskodennych płytek hodowlanych Nunc (Gibco, BRL), pokrytych 100 ng/ml R4-6A2. Wiązanie różnych objętości supernatantów wykonywano w trzech powtórzeniach inkubując na płytkach w 4^oC. Następnie płytki trzykrotnie przemywano i dodawano biotynylowane przeciwciało anty-IFNY (XMG1.2). Po przemyciu płytki były inkubowane ze streptawidyną sprzężoną z peroksydazą chrzanową, wywoływane z odpowiednim substratem, a następnie mierzono gęstość optyczną (OD405) za pomocą systemu ELISA plate reader.

IL-10 testowano z zastosowaniem podobnego systemu ELISA używającego JES5-2A5 jako przeciwciało wiążące (pierwszorzędowe, capture antibody) oraz biotynylowanego SXC-1 jako przeciwciała wywołującego reakcję (drugorzędowego, developing antibody). W testach ELISA dla IL-2 oraz IL-4 stosowano JES6-1A12 i 11B1 jako przeciwciała wiążące oraz biotynylowane JES6-5H4 lub BVD6-24G2 jako przeciwciała wywołujące reakcję. Czułość detekcji wynosiła 10 pg/ml dła wszystkich cytokin, jak określono w badaniach z użyciem oczyszczonego rekombinowanego materiału.

Testy IL-1 wykonano przy użyciu zależnych od cytokin komórek D10, podczas gdy w testach IL-6 wykorzystano linię komórkową B9. TGFe był testowany poprzez inhibicję wzrostu (ponad 40 godzin inkubacji) linii komórkowej komórek nabłonka płucnego norek (mink lung cell line, ATCC). Podobnie

PL 211 789 B1

TNFa testowano poprzez inhibicję wzrostu linii komórkowej Wehi 1643 (ATCC). We wszystkich przypadkach czułość wykrywania wynosiła 30 pg/ml cytokiny, ponownie jak określono poprzez normalizację z użyciem materiału rekombinowanego.

W hodowlach 36-cio- do 50-cio- godzinnych nie stwierdzono różnic w poziomach cytokin. Podobnie, nie stwierdzono znaczących różnic pomiędzy komórkami stymulowanymi anty-CD3^ a ConA. Jako testy tworzenia przeciwciał dla SRBC zastosowano standardowe testy Jerne PFC, zmodyfikowane przez Cunningham [Gorczynski, R.M., 1978]; kolonie śledzionowe były liczone w 12-14 dniu po naświetlaniu i rekonstytucji (przywróceniu pierwotnej postaci) szpiku kostnego.

11.2. Systemy Biologiczne (Wyniki)

11.2.1. Rola CLP1b i CLP2p jako czynników przeciwko starzeniu się

We wszystkich dotychczas badanych gatunkach ssaków udokumentowano znaczące zmiany w odpowiedzi immunologicznej, związane z wiekiem [Wechsler, M.E., 1992; McLachlan, J.A., 1995; Burns, E.A., 1997]. Zmiany te wydają się najwyraźniej zaznaczone w części układu immunologicznego zależnej od komórek T. Niektóre badania szukały możliwego wytłumaczenia tego rozregulowania odpowiedzi immunologicznej komórek T z wiekiem, pytając, czy dochodzi do uogólnionego spadku częstości występowania komórek odpowiedzi immunologicznej, związanej z wiekiem funkcjonalnej zmiany zdolności komórek do odpowiedzi, i/lub przerwania wysoko wyspecjalizowanej sieci cytokin, czynników wzrostu i hormonów regulujących działanie układu odpornościowego [Miller, R.A., 1996]. Powyższe badania jasno pokazują, że CLP1b/2p może odwrócić związane ze starzeniem się zmiany immunologiczne u myszy.

W doświadczeniu pokazanym w Tabeli 8, grupa młodych i starych myszy DBA/2 lub C57BL/6 otrzymywała wlewy z CLP2p lub z soli fizjologicznej (brak traktowania substancją badaną- no treatment) przed immunizacją SRBC. Poziomy przeciwciał śledzionowych IgG-PFC anty-SRBC były określane w 7 dniu po immunizacji. Jest oczywiste, że trzykrotne obniżenie poziomu IgG-PFC, widoczne u starych myszy, jest odwrócone (nie występuje) u myszy otrzymujących CLP2p przed immunizacją.

T a b e l a 8:

Odnowienie produkcji przeciwciał u starych myszy DBA/2 i C57BL/6 po wstrzyknięciu CLP2p

Linia Myszya	Traktowanieb	Produkcja przeciwciał
IgG PFC/106 komórek śledziony (dzień7)c
DBA/2
Młoda	brak	3,255 ± 565
Młoda	CLP2p	3,015 ± 635
Stara	brak	1,105 ± 360
Stara	CLP2p	2,850 ± 510*
C57BL/6
Młoda	brak	3,345 ± 610
Młoda	CLP2p	3,650 ± 545
Stara	brak	1,240 ± 415
Stara	CLP2p	3,010 ± 675*

^a użyto 6 myszy/grupę. Młode myszy miały 12 tygodni, a stare pomiędzy 100 a 120 tygodni. Wszystkie myszy otrzymały 4x10⁸ erytrocytów owczych (SRBC) dożylnie w 0,5 ml PBS.

^b myszy otrzymały 5 zastrzyków dożylnych CLP2p (50 pg/mysz) w odstępach trzydniowych przed immunizacją

SRBC.

^c PFC/1x10⁶ komórek śledziony u myszy w 7 dniu po SRBC. Średnia liczba izolowanych komórek/śledzionę była równa we wszystkich grupach (120x10⁶ ± 10x10⁶).

Druga seria badań dotyczyła pytania, czy CLP2p jest również w stanie stymulować formowanie się kolonii śledziony ze szpiku kostnego po letalnym naświetlaniu, będące miarą rekonstytucji hematopoezy [Worton, R.G., 1969]. Osiem myszy/grupę młodych i starych myszy DBA/2 otrzymało sól fizjologiczną lub CLP2p dożylnie w trzech dawkach przed letalnym naświetleniem i rekonstytucją 1x10⁵

PL 211 789 B1 komórek syngenicznego szpiku kostnego pochodzącego od młodych (12 tygodniowych) dawców DBA/2. Zwierzęta uśmiercano 12 dni po rekonstytucji a następnie liczono kolonie śledziony (Tabela 9).

T a b e l a 9:

CLP2p wywiera wpływ na hematopoetyczną rekonstytucję naświetlanych (900 radów) młodych myszy DBA/2, jak pokazuje test kolonii śledziony

Szpik kostny3	Traktowanie biorcówb	CFU-S(dzień 12)/1x105 szpiku kostnego0
Młoda	brak	8,4±2,6
Młoda	CLP2p	16±3,3*
Stara	brak	8,0±2,9
Stara	CLP2p	14±3,1*

^a Szpik kostny był zbierany i łączony od trzech dawców/grupę. Młode myszy miały 12 tygodni, a stare myszy miały 24 miesiące.

^b Myszy otrzymały CLP2p dożylnie w trzech dawkach (50 mg/mysz/zastrzyk) w odstępach trzydniowych przed naświetlaniem ^c Myszy były uśmiercane w dniu 12 i kolonie śledziony liczone wzrokowo. Dane są średnimi arytmetycznymi (+ odchylenie standardowe SD) dla 8 myszy w grupie.

*p<0,05 w porównaniu z kontrolą dobraną wiekowo

Te dane pokazują, że CLP2p jest w stanie odwrócić spadek PFC (w odpowiedzi na SRBC) u starych myszy oraz zwiększać formowanie się kolonii śledziony (regeneracja Iimfohematopoetyczna) po letalnym naświetlaniu i rekonstytucji szpiku kostnego (Tabela 9).

11.2.2 Zdolność CLP1b i CLP2p do odwracania profilu produkcji cytokin u starych myszy

Jak widać powyżej, najważniejszą obserwacją w literaturze immunologicznej jest fakt, że starzenie się jest związane ze zmienioną produkcją cytokin przez stymulowane limfocyty [Miller, R.A., 1996; Wechsler, M.E., 1992]. Podczas kiedy młode zwierzęta (i ludzie) produkują głównie IFNY i IL-2, z wiekiem produkowane są zwiększone ilości IL-4, IL-6, IL-10 i TGFe. W związku z tym zaprojektowano szereg badań w celu określenia, czy FSLE i, w szczególności, CLP pools (CLP1b lub CLP2p) wstrzyknięte myszom są w stanie odwrócić zmienione profile produkcji cytokin u starych myszy i do jakiego stopnia efekt ten może być tłumaczony (znaną) zmianą ilości limfocytów naiwnych względem limfocytów pamięci w starzejących się zwierzętach (patrz [Gorczynski, R.M., 1998] o FSLE).

Grupy młodych i starych myszy DBA/2 otrzymały domięśniowe zastrzyki z CLP1b (lub CLP2p) przed uśmierceniem. Komórki śledziony stymulowano in vitro ConA, a następnie zbierano supernatanty w celu określenia produkcji cytokin po 40 godzinach. Dane otrzymane w dwóch takich doświadczeniach są pokazane w Tabeli 10.

Tabela 10:

CLP pools odwracają związaną z wiekiem produkcję cytokin przez leukocyty pochodzące od starych myszy

Źródło komórek dawcya	Poziomy cytokin w supernatantach hodowlanychb
IL-2	IL-4	IL-6	IL-1	IL-10	TGFe	IFNy
pg/ml	ng/ml
Młode-NS	1025±210	50±9	30±42	6,3±1,5	13±3	50±9	85±15
Stare-NS	340±76*	200±17*	930±145*	16±2,5*	60±9*	102±21*	160±22*
CLP1b	530±60*	90±14*	650±110*	12±2,2*	49±10*	85±11*	114±18*
CLP2p	840±120#	69±10#	490±85*#	8,0±1,8#	25±5#	58±10#	103±19#

^a Badane były indywidualne próbki komórek śledziony od 4 dawców/grupę. 5x10⁵ komórek uwrażliwionych inkubowano w trzech powtórzeniach z 5 ąg/ml ConA na płytkach mikrodołkowych (microtitre plates) a supernatanty zbierano w 40 godzinie. Myszy otrzymały 5 domięśniowych zastrzyków z 50 ąg/mysz CLP1b (lub CLP2p) w odstępach trzydniowych, przed uśmierceniem. Komórki wyizolowano celem użycia do badań produkcji cytokin in vitro 3 dni po ostatnim zastrzyku. Myszy kontrolne otrzymały sól fizjologiczną (normal saline, NS). Pokazane wyniki badań CLP pools dotyczą wyłącznie myszy starych.

^b Średnie arytmetyczne (± odchylenie standardowe SD) poziomów cytokin, uśredniają trzy badania, z potrójnie powtórzonych doświadczeń z użyciem komórek pochodzących od młodych (8-tygodniowych) i starych (110PL 211 789 B1

-tygodniowych) myszy DBA/2Nia. Nie zaobserwowano istotnego wpływu podawania CLP pool na produkcję cytokin u młodych biorców (dane odpowiadające wynikom prezentowanym w pierwszym rzędzie).

*p<0,05, w porównaniu z kontrolą (pierwszy rząd) # p<0,05, w porównaniu z myszami kontrolnymi w tym samym wieku, nastrzykniętymi PBS.

Te dane jasno wskazują, że CLP1b/2p, wstrzyknięte w dawce 50 pg/mysz, odwracają zmiany w produkcji cytokin, widoczne przy użyciu stymulowanych limfocytów pochodzących od osobników starych.

Wcześniej pokazano, że zaburzenia równowagi immunologicznej mogą być odwracane za pomocą dehydroepiandrosteronu (DHEA) i jego pochodnej siarczanowej (DHEAS) [Daynes, R.A., 1992; Daynes, R.A., 1993]. CLP1b i CLP2p nie zawierają DHEA ani DHEAS. CPL pools, skutecznie działające u myszy, nie są szkodliwe, ani nie wywołują działań niepożądanych, jednakże były zastrzeżenia do klinicznego stosowania DHEA [Durgan, J., 1997].

12. P r z y k ł a d 12

Immunomodulacyjne działanie CLP POOLS (część III)

Przeciwnowotworowe działanie CLP-Pools

12.1 Kolejne systemy mysie (Metody)

12.1.1 Określenie cytostazy nowotworu, w której pośredniczą makrofagi/splenocyty (test proliferacji)

Cytostaza, w której pośredniczą makrofagi i komórki śledziony została zbadana w systemie hodowli wspólnej komórek efektorowych i docelowych poprzez redukcję wbudowywania ³H-tymidyny (metylo-³H-TdR, aktywność specyficzna 5Ci = 185 GBq/mMol, Amersham Buchler, Braunschweig, FRG) przez DNA komórek nowotworu. Hodowle prowadzono w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania w objętości całkowitej 200 pl- 5x10³ komórek nowotworowych hodowano razem z BMDM i/lub komórkami śledziony oraz CLP pools w rożnych stężeniach w cDMEM (Abelson) lub cRPMI (Sp2/0) przez 1-3 dni odpowiednio w 10% lub 5% CO2. Proliferujące komórki znakowano przez ostatnie 4 godziny hodowli poprzez dodanie 25 pl = 0,5 Ci³ H-TdR/dołek. Znakowane hodowle zamrażano w -20°C, rozmrażano i zbierano na płytki z filtrem z włókna szklanego (glass fiber filter plates) za pomocą automatycznego urządzenia zbierającego komórki (automatic cell harvester, Pharmacia LKB, Freiburg, FRG). Wbudowana radioaktywność była określana przy użyciu licznika scyntylacji w roztworze (liquid scintillation counting, Beta Plate, Pharmacia LKB). Hodowle kontrolne zawierające tylko BMDM i/lub komórki śledziony były traktowane podobnie i wartości cpm z tych hodowli były odejmowane od wartości cpm ze wspólnych hodowli w celu korekty wyników radioaktywności pochłoniętej przez komórki efektorowe.

12.2 Indukcja przeciwnowotworowego działania FSLE/CLP-Pools w systemie mysim

12.2.1 Hamowanie wzrostu komórek nowotworowych przez makrofagi i/lub komórki śledziony stymulowane przez CLP1b/2p

W teście TCGI użyto CLP1b/2p w szerokiej gamie stężeń. Obydwie pule indukowały silną zależną od dawki aktywację makrofagów i, w konsekwencji, wyraźną inhibicję wzrostu komórek nowotworowych Abelson 8-1 począwszy od stężenia około lub poniżej 1 pg/ml (Fig. 47A). Dodanie komórek śledziony do wspólnej hodowli makrofagów i komórek nowotworu wywoływało istotny wzrost aktywności TCGI w hodowlach z CLP1b lub CLP2p (Fig. 47B).

12.2.2 Działanie anty-przerzutowe FSLE

Modele badań fenomenu przerzutów nowotworowych z ogniska pierwotnego nowotworu są w centrum zainteresowania, ponieważ przerzuty są krytycznym problemem medycyny. System wykorzystujący raka Lewis-lung, nowotworu który spontanicznie pojawił się u myszy C57BI/6 [Seguira, S., 1955], jest szczególnie przydatny, ponieważ nowotwór ten przerzutuje do płuc. Wysoka złośliwość tego raka jest związana z jego niskimi właściwościami immunogennymi [De Wys, W.D., 1972].

Model ten działa następująco [Berdel, W.E., 1981]: 1 milion żywych komórek nowotworowych w 0,05 ml medium jest wstrzykiwany podskórnie do lewej tylnej stopy każdej myszy. W przeciągu 6-10 dni nastrzyknięta stopa wskutek wzrostu nowotworu osiąga średnicę 0,5- 0,6 cm. 18- 21 dni po pierwotnej transplantacji nowotworu zwierzęta zaczynają umierać z powodu przerzutów do płuc.

Imitując sytuację kliniczną, pierwotne ognisko nowotworowe może zostać usunięte chirurgicznie w dowolnym czasie po transplantacji nowotworu. Płuca zwierząt poddanych dalszemu leczeniu, jak i zwierząt pozostawionych bez dalszego leczenia, mogą być badane w celu określenia mikroprzerzutów, liczonych histologicznie po wybarwieniu. Zapobiec przerzutom można jedynie w przypadku interwencji chirurgicznej, wykonanej we wczesnym stadium po transplantacji nowotworu.

PL 211 789 B1

Przy użyciu tego systemu, grupie 10 myszy wstrzykiwano podskórnie FSLE w dawce 1 mg w 0,1 ml, począwszy od 1 dnia po zabiegu chirurgicznym, a następnie po 2 i 4 dniach. Myszy kontrolne otrzymywały 0,1 ml chlorku sodu. Zwierzęta były poddane obserwacji przez kolejne tygodnie. Jak przewidywano, myszy kontrolne umierały z powodu przerzutów do płuc, pomiędzy 18 a 39 dniem eksperymentu, jak pokazano na Fig. 48. Natomiast 8 spośród myszy, którym podano ekstrakt (80% myszy) wciąż żyło do dnia 39 i żadna z nich nie umarła w ciągu kolejnych 120 dni. Badania histologiczne wykazały, że żadna z myszy, które przeżyły nie miała przerzutów do płuc. Podobne wyniki uzyskuje się po wstrzyknięciu 10 μg/ml CLP2p.

12.2.3 Zdolność wyciągów z wątroby owiec w różnym stadium rozwojowym do aktywacji makrofagów i limfocytów

W celu ustalenia poziomów czynników aktywujących makrofagi i splenocyty, zawartych w ekstraktach wątroby owczej lub połączonych ekstraktach pochodzących z różnych stadiów rozwoju, przygotowywano ekstrakty wątroby noworodków oraz 3-4-letnich zwierząt, a następnie oczyszczano je przy użyciu Sephadex G-100®, a uzyskane frakcje łączono, wg opisu w Przykładzie 2. Działanie indukujące TCGI tych połączonych frakcji (pools) było badane w porównaniu do CLP pools. Główne różnice były widoczne w porównaniu z CPL2p pools: CPL2p pochodzące z płodów i noworodków stymulowało makrofagi 100 do 1000 razy bardziej aktywnie niż CPL2p otrzymane z dorosłych zwierząt (Fig. 49). Przy porównaniu względnych aktywności TCGI w pulach 1b i 2p otrzymanych z ekstraktów pochodzących z różnych stadiów rozwojowych w taki sposób, że aktywność najbardziej aktywnej puli z każdej separacji (ekstrakt z płodów, ekstrakt z noworodków i ekstrakt z dorosłych owiec) jest odgórnie przyjęty jako 100 (Patrz Fig. 50), widoczne staje się, że względna aktywność CPL1b i CPL2p spada po urodzeniu. Może to być wyjaśnione zarówno przez zanik aktywności stymulującej podczas życia płodowego bądź też przez modyfikację substancji aktywnej u płodu w okresie okołoporodowym, -podobnie jak hemoglobiny- której skutkiem jest różne zachowanie się tego składnika podczas separacji. To wskazuje, że opisane tu czynniki bioaktywne mogą być produkowane preferencyjnie z tkanki wątrobowej pobranej przed urodzeniem lub przy porodzie (Fig. 49 i 50).

12.3 System ludzki (Metody)

12.3.1 Izolacja ludzkich MNC z krwi obwodowej i wzbogacanie w monocyty

Próbki krwi pobierano od zdrowych ludzkich dawców (Transfusionmedicine, University Hospital Freiburg). Krew rozcieńczano w stosunku 1:2 w buforze PBS i izolowano komórki jednojądrzaste (MNC) za pomocą gradientu Ficoll Paque (gęstość 1,077 g/ml, Pharmacia, Freiburg). Komórki przemywano czterokrotnie buforem PBS i umieszczano na płytkach Petriego (1-2x10⁸ MNC/20 ml RPMI 1640 (F1215, Seromed Biochrom KG, Berlin) uprzednio pokrytych autologicznym osoczem ludzkim. Komórki inkubowano przez 1-1,5 godziny pozwalając monocytom na przylgnięcie. Następnie ostrożnie usuwano komórki nieprzyczepione, a przylegające do podłoża monocyty były delikatnie zbierane przy użyciu cell scraper. Komórki przemywano jeden raz i zawieszano w RPMI 1640 zawierającym 10% FCS, 1% roztwór nieendogennych aminokwasów, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny (cRPMI) w celu bezpośredniego użycia do testów cytostazy lub późniejszego różnicowania in vitro do makrofagów (patrz poniżej).

12.3.2 Test cytostazy nowotworowej, w której pośredniczą monocyty

Testy cytostazy były wykonywane w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania (Falcon 3075, Becton Dickinson, Heidelberg) w cRPMI (patrz powyżej). Wyizolowane monocyty (5x10⁴ lub 2,5x10⁵/dołek) inkubowano z 5x10³ komórek nowotworowych U937 oraz w różnych stężeniach różnych stymulantów w całkowitej objętości wynoszącej 200 μl/dołek przez 72 godziny w 37°C, 5% CO₂. Przez ostatnie 4 godziny wspólnej hodowli, proliferujące komórki nowotworowe były znakowane poprzez dodanie [³H]-tymidyny (125 Bq = 0,625 Ci/dołek; aktywność specyficzna: 185 GBq/mmol; Amersham Buchler, Braunschweig). Po zamrożeniu i rozmrożeniu, hodowle zbierano na filtry z włókna szklanego za pomocą urządzenia do automatycznego zbierania komórek (automatic cell harvester, typ 1295-001, Pharmacia LKB, Freiburg) i mierzono radioaktywność wbudowaną w DNA komórek nowotworowych za pomocą licznika scyntylacji w roztworze (liquid scintillation counter, Betaplate 1205, Pharmacia LKB). Inhibicja proliferacji, np. obniżenie wbudowywania radioaktywności, było liczone poprzez przyjęcie komórek U937 inkubowanych w obecności niestymulowanych monocytów jako kontroli negatywnej (0% inhibicji).

W celu zmierzenia hamującej rozwój nowotworu aktywności cytostatycznej czynników rozpuszczalnych pochodzących z monocytów, 5x10⁵ monocytów/500 μl/dołek stymulowano w 24-dołkowych płytkach przez 4-48 godzin. Supernatanty zbierano po różnym czasie, wirowano z dużą prędkością

PL 211 789 B1 w celu usunięcia pozostałości komórkowych a następnie testowano ich aktywność cytostatyczną. W tym celu 50 pl supernatantu dodawano do 5x10³ komórek U937 hodowanych w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania; całkowita objętość wynosiła 200 pl. Następnie kontynuowano hodowle przez 48 godzin, a przez ostatnie 4 godziny hodowli znakowano komórki proliferujące za pomocą [³H]-tymidyny. Następnie określano wbudowaną radioaktywność i wykonywano obliczenia, jak opisano powyżej.

12.3.3 Indukcja aktywności komórek LAK przez CLP1b i CLP2p

Ludzkie komórki PBMC otrzymano w wirowaniu w Ficolu (Ficoll) z gradientem gęstości przez 20 minut w 1400 x g (gęstość 1,077g/ml, Pharmacia LKB, Freiburg, FRG). W celu usunięcia zanieczyszczających płytek krwi, uzyskane komórki przemywano do sześciu razy buforem PBS. Zawartość monocytów i limfocytów B była redukowana za pomocą ich przywierania do plastiku przez 1 godzinę w 37°C i 5% CO2. Nieprzyczepione komórki były hodowane w RPMI 1640 wzbogaconym w 25 mM HEPES, 2 mM L-glutaminę, 1% NEAA, 10% dezaktywowaną termicznie cielęcą surowicę płodową, 100 U/ml penicyliny, 50 pg/ml streptomycyny (wszystkie odczynniki z Seromed Biochrom KG, Berlin). Komórki hodowano w stężeniach 1x10⁶/ml przez 3-4 dni w 37°C i 5% CO2. W celu uzyskania komórek LAK do odpowiednich hodowli dodawano rhuIL-2 (100 U/ml; Becton Dickinson, Heilderberg, FRG) lub roztwór CPL1b i -2p w stosunku 1:1.

12.3.4 Określenie indukowanej przez CLP pool aktywności komórek LAK.

Nadchloran 3,3'dioktadecyloksacarbocyjaniny (DIOC18(3)/DIO; 2,5 mg/ml w DMSO; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) dodawano bezpośrednio do komórek Raji (5x10⁵/ml) w końcowym stężeniu wynoszącym 10 pg/ml. Znakowanie wykonywano przez noc w standardowych warunkach hodowli. Przed rozpoczęciem testu cytotoksyczności, komórki przemywano medium hodowlanym w celu usunięcia niezwiązanej substancji znakującej.

1x10⁵/ml znakowanych uprzednio komórek docelowych ponownie zawieszano w medium hodowlanym i rozdzielano na 96-dołkowych płytkach hodowlanych typu microtiter (3077, Becton Dickinson, Heidelberg, FRG; 100 pl/dołek). Komórki efektorowe również ponownie zawieszano w medium uzyskując gęstość 1x10⁶/ml. 100 pl, 20 pl lub 3,3 pl zawiesin komórek efektorowych dodawano do hodowli komórek docelowych, uzyskując końcowy stosunek komórek efektorowych do docelowych wynoszący odpowiednio: 10:1, 1:1, 0,3:1. Jako kontrolę do komórek docelowych dodawano czyste medium. Komórki inkubowano przez 4 godziny w 37^oC i 5% CO2 a końcowa objętość hodowli wynosiła 200 pl. Do analizy za pomocą cytometrii przepływowej komórki z każdego dołka hodowlanego zawieszano i przenoszono do fiolek okrągłodennych (2058, Becton Dickinson). Wyniki analizy FACS uzyskiwano i analizowano za pomocą cytometru przepływowego EPICS XL-MCL (Coulter), wyposażonego w laser jonów argonu z długością fali wzbudzającej wynoszącą 488 nm. Przed wykonaniem pomiaru do próbek dodawano barwnika jądrowego propidium iodide (PI, w końcowym stężeniu: 20 pg/ml). Fluorescencja DIO była nagrywana w kanale zielonym (FL1) z użyciem szerokopasmowego filtra (bandpass) 530 x 20 nm, a fluorescencja PI była mierzona w kanale czerwonym (FL3; 630 nm, długopasmowy filtr). Fluorescencję odnotowywano za pomocą skali logarytmicznej bez kompensacji interakcji międzykanałowych, podczas gdy charakterystyka „forward” oraz „right angle scatter” były nagrywane w skali liniowej. Specyficzną lizę (w %) obliczano poprzez odjęcie niespecyficznej śmierci komórek w próbkach kontrolnych (w %) od lizy komórek docelowych w próbkach eksperymentalnych, analizując w ten sposób jedynie podwójnie pozytywne przypadki FL1-FL3:

% lizy specyficznej = % [FL1⁺/FL3⁺]exp - % [FL1⁺/FL3⁺]control.

12.4 Indukcja anty-nowotworowej aktywności ludzkich leukocytów (Wyniki)

Wzbogacone ludzkie monocyty pochodzące z krwi obwodowej można uczynić cytostatycznymi dla nowotworu za pomocą CLP1b lub CLP2p w sposób zależny od dawki. Cytostazę określano po 3-dniowej wspólnej hodowli za pomocą badania wbudowywania ³H-tymidyny do DNA docelowych komórek nowotworowych U 937: obie pule indukowały dość silną aktywność cytostatyczną (Fig. 51).

Ludzkie monocyty stymulowane CLP1b lub CLP2p uwalniały znaczące ilości rozpuszczalnych czynników cytostatycznych już po 4 godzinach inkubacji. Cytostaza nowotworu wywołana tymi czynnikami była badana po 2 dniach hodowli za pomocą wbudowywania ³H-tymidyny do DNA docelowych komórek nowotworowych U 937. Jak poprzednio, obie pule były aktywne (Fig. 52).

W innych doświadczeniach pokazano indukcję aktywności komórek LAK (lymphokine activated killer) przez CLP pools. Pochodzące z krwi obwodowej ludzkie limfocyty pozbawione monocytów, były stymulowane in vitro przez 3 dni mieszaniną CLP1b i -2p w stosunku 1:1, przygotowaną z płodów, noworodków lub zwierząt dorosłych (3-4 letnich); 50-80 pg/ml. Na koniec inkubacji komórki badano na

PL 211 789 B1 aktywność komórek LAK w 4-godzinnym teście z komórkami nowotworowymi Raji (ludzkiego chłoniaka z limfocytów B) jako komórkami docelowymi. Pule pochodzące z płodów i noworodków były niemal tak skuteczne w indukowaniu aktywności komórek LAK jak IL-2, podczas gdy te uzyskane ze zwierząt dorosłych wykazywały jedynie 55% aktywności, w porównaniu z kontrolą pozytywną (Fig. 53). Te dane, brane pod uwagę łącznie z wynikami otrzymanymi w systemie mysim, wskazują, że CLP2p pochodzący z płodów i noworodków, ma znacznie wyższą aktywność stymulacyjną leukocytów w porównaniu z pulami uzyskanymi ze zwierząt dorosłych.

12.5 Indukcja anty-nowotworowej aktywności ludzkich monocytów przeciwko komórkom raka prostaty

12.5.1 Komórki nowotworowe

Linia komórek ludzkich przerzutów gruczolakoraka prostaty LNCaP była hodowana w medium hodowlanym RPMI-1640 (Gibco BRL, Eggenstein, FRG), wzbogaconym w 10% dezaktywowaną termicznie FCS, 1% roztwór nieendogennych aminokwasów (NEAA), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (wszystkie odczynniki z Seromed Biochrom, KG, Berlin, FRG).

12.5.2 Izolacja ludzkich komórek jednojądrzastych (MNC) z krwi obwodowej i wzbogacanie w monocyty

Próbki krwi pobierano od zdrowych ludzkich dawców (Transfusionmedicine, University Hospital Freiburg). Krew rozcieńczano w stosunku 1:2 w buforze PBS i izolowano komórki jednojądrzaste (MNC) za pomocą gradientu Ficoll Paque (gęstość 1,077 g/ml, Pharmacia, Freiburg). Komórki przemywano czterokrotnie buforem PBS i umieszczano na płytkach Petriego (1-2x10⁸ MNC/20 ml RPMI 1640 (F1215, Seromed Biochrom KG, Berlin) uprzednio pokrytych autologicznym osoczem ludzkim. Komórki inkubowano przez 1-1,5 godziny pozwalając monocytom na przylgnięcie. Następnie ostrożnie usuwano komórki nieprzyczepione, a przylegające do podłoża monocyty były delikatnie zbierane przy użyciu cell scraper. Komórki przemywano jeden raz i zawieszano w RPMI 1640 zawierającym 10% FCS, 1% roztworem nieendogennych aminokwasów, 100 ml U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny (cRPMI) w celu bezpośredniego użycia do testów cytostazy.

12.5.3 Test cytostazy nowotworowej, w której pośredniczą monocyty

Testy cytostazy były wykonywane w płaskodennych płytkach do mikromiareczkowania (Falcon 3072, Becton Dickinson, Heidelberg) w cRPMI (patrz powyżej). Wyizolowane monocyty ludzkie (5x10⁵, 2,5x10⁵ lub 5x10⁴/dołek) inkubowano przez noc. Następnie dodano 5x10⁴ komórek nowotworowych LNCaP oraz różne czynniki stymulujące w różnych stężeniach i inkubowano w całkowitej objętości wynoszącej 200 μl/dołek przez 72 godziny w 37°C, 5% CO₂. Przez ostatnie 24 godziny wspólnej hodowli proliferujące komórki nowotworowe były znakowane poprzez dodanie [³H]-tymidyny (23 125 Bq = 0,625 μCi/dołek; aktywność specyficzna: 185 GBq/mmol; Amersham Buchler, Braunschweig).

Po zamrożeniu i rozmrożeniu, hodowle zbierano na filtry z włókna szklanego za pomocą urządzenia do automatycznego zbierania komórek (automatic cell harvester, typ 1295-001, Pharmacia LKB, Freiburg) i mierzono radioaktywność wbudowaną w DNA komórek nowotworu za pomocą licznika scyntylacji w roztworze (Betaplate 1205, Pharmacia LKB). Inhibicja proliferacji, np. obniżenie wbudowywanej radioaktywności, była liczona poprzez przyjęcie komórek LNCaP inkubowanych w obecności nie stymulowanych monocytów jako negatywnej kontroli (0% inhibicji).

Te eksperymenty pokazują, że CLP1b i CLP2p pools mogą indukować wzbogacone ludzkie monocyty, wywołując ich przeciwnowotworową aktywność przeciwko komórkom ludzkiego gruczolakoraka prostaty w dawkach progowych wynoszących ok. 1-5 μg/ml (Fig. 54), z maksymalną aktywnością w stężeniach 50-100 μg/ml. W tym samym systemie czyste LPS osiąga maksymalną aktywność w stężeniu 10 ng/ml (Fig. 55).

13. P r z y k ł a d 13

Indukcja produkcji cytokin i tlenku azotu przez pule FSLE/CLP w linii komórek podobnych do szpiku

13.1 System mysi (Metody)

13.1.1 Przygotowanie komórek dendrytycznych/makrofagów

Do każdego eksperymentu używano aseptycznie przygotowanych zawiesin komórek śledziony od indywidualnych myszy pochodzących z różnych grup. W przypadku, gdy komórki były używane do

PL 211 789 B1 przygotowania komórek dendrytycznych/makrofagów, tkanki były najpierw trawione w 37°C przez 45 minut w mieszaninie kolagenazy/dyspazy, następnie były podawane rozdziałowi przy użyciu mysiego lymphopaque (CedarlaneLabs, Hornby, Ontario, Canada) i adhezji do płytek hodowlanych w 37°C przez 90 minut w a-Minimal Essential Medium wzbogaconym w 2-merkaptometanol i 10% płodową surowicę cielęcą (aF10). Nieprzyczepione do podłoża komórki były usuwane poprzez trzykrotne przemywanie 25 ml uprzednio ogrzanego medium. Komórki dendrytyczne izolowano następnie z odmytych komórek, które nie uległy adhezji po całonocnej inkubacji na płytkach, a komórki zdrapane z tych płytek hodowlanych reprezentowały nieoczyszczoną pulę makrofagów. W naszym przypadku, po zakończeniu procedury rozdziału, rutynowe barwienie limfocytów śledzionowych przy zastosowaniu FITC-NLDC-145 (przeciwko DC) lub FITC-MAC-1 (przeciwko makrofagom) w mieszaninie nieoczyszczonych komórek dendrytycznych/makrofagów dawało następujący wynik: odpowiednio 85%±14%, 12%±5% i 5%±3%, 82%±16%.

13.1.2 Pomiar azotynu/azotanu w surowicy

Porównaj Przykład 3.1.1.5

13.2 System mysi (wyniki)

13.2.1 Indukcja produkcji cytokin in vitro przez CLP1b/2p w mysich makrofagach/komórkach dendrytycznych

Najpierw testowano produkcję cytokin w makrofagach i komórkach dendrytycznych pochodzących ze śledziony, izolowanych z młodych i starych myszy (jak w opisie powyżej) i inkubowano in vitro z CLP1b (CLP2p) przez 24 godziny. Wyniki zostały przedstawione w Tabelach 11 i 12. Dla porównania komórki pochodzące od tych samych zwierząt były stymulowane 100 ng/ml LPS.

T a b e l a 11:

CLP1b i CLP2p indukują produkcję cytokin przez mysie makrofagach pochodzące z tkanki śledziony

Traktowanie3 komórek	Poziomy cytokin w supernatantach hodowlanychb
IL-1	TNFa	TGFe	IFNy	IL-6
ng/ml	pg/ml
Młodzi dawcy
Brak	17±5	10±4	18±6	24±7	45±9
LPS (100 ng/ml)	128±20*	16±15*	72±13*	108±20*	290±41*
CLP1b (50 ng/ml)	26±8	44±7*	32±6	37±9	80±23
CLP2p (15 ng/ml)	81±14*	99±15*	70±9	72±12*	315±48*
Starzy dawcy
Brak	30±7	28±5	69±12	48±8	160±34
LPS (100 ng/ml)	81±12*	66±12*	130±22*	153±22*	740±130*
CLP1b (50 ng/ml)	39±9	30±8	55±10	53±9	210±54
CLP2p (15 ng/ml)	57±10*	49±7*	99±15*	109±13*	440±70*

^a Użyto 4 myszy DBA/2Nia/grupę, kolejno testując indywidualne próbki śledziony w każdej grupie. Makrofagi tkankowe uzyskano z każdego preparatu śledziony w sposób opisany powyżej. Komórki inkubowano przez 24 godziny z pulami CLP a supernatanty sprawdzano na obecność różnych cytokin. Hodowle kontrolne inkubowano albo tylko w medium albo w medium zawierającym 100 ng/ml LPS.

^b Przedstawione wyniki (średnia arytmetyczna ± odchylenie standardowe SD) zostały zgrupowane z czterech identycznych badań, wykorzystując potrójne hodowle prowadzone w celu sprawdzenia obecności każdej cytokiny. Poziomy cytokin są przedstawione jako ng/ml, za wyjątkiem IL-6 (pg/ml).

*p<0.05, porównanie z komórkami kontrolnymi, odpowiednio dobranymi wiekowo, inkubowanymi jedynie w medium (pierwszy rząd każdej grupy dawców).

PL 211 789 B1

T a b e l a 12:

CLP1b i CLP2p indukują produkcję cytokin przez komórki dendrytyczne pochodzące ze śledziony

Traktowanie3 komórek	Poziomy cytokin w supernatantach hodowlanych
IL-1	TNFa	TGFP	IFNy	IL-6
ng/ml	pg/ml
Młodzi dawcy
Brak	4±2	4±2	6±2	9±2	15±5
LPS (100 ng/ml)	156±25*	37±9*	36±9*	65±10*	330±55*
CLP1b (50 ng/ml)	46±8*	10±3	14±4	24±6*	137±13*
CLP2p (15 ng/ml)	93±13*	22±6*	24±5*	35±6*	152±28
Starzy dawcy
Brak	12±4	5±2	7±2	4±4	44±8
LPS (100 ng/ml)	196±35*	25±6*	63±7*	88±12*	1230±230
CLP1b (50 ng/ml)	59±18*	8±3	28±6*	39±8*	470±76*
CLP2p (15 ng/ml)	139±16*	12±4	46±9*	64±9*	740±120

^a+b tak jak dla Tabeli 4. Komórki dendrytyczne były uzyskiwane dla każdego preparatu śledziony w sposób wcześniej opisany [patrz Przykład 13.1.1]. Przedstawione wyniki (średnia arytmetyczna ± odchylenie standardowe SD) zostały zgrupowane z pięciu eksperymentów, wykorzystując potrójne hodowle prowadzone w celu sprawdzenia obecności każdej cytokiny.

*p<0.05, porównanie z komórkami kontrolnymi, odpowiednio dobranymi wiekowo, inkubowanymi jedynie w medium (pierwszy rząd każdej grupy dawców).

Wyniki te sugerują, że regulacja produkcji monokin/cytokin przez makrofagi jest istotną zmienną w procesie starzenia się, oraz że manipulacja tej funkcji przez frakcje CLP1b (CLP2p) może przyczynić się do zmiany immunokompetencji u osobników starych. Szczególnie interesujący jest efekt puli CLP na produkcje IL-6 od kiedy odkryto, że sama IL-6 może przyczyniać się do zmian w produkcji cytokin typu-1 (IL-2, IFNy) oraz typu-2 (IL-4, IL-10, TGFe) przez aktywowane komórki T [Gorczynski, R.M., 1997; Rincon, M., 1997].

13.2.2 Tlenek azotu pochodzący od makrofagów jako mediator efektów wywołanych przez CLP in vivo i in vitro

Wskazywano już na rolę produkcji NO przez makrofagi w immunoregulacji prowadzonej przez te komórki [Stuehr, D.J., 1989; Nathan, C, 1992]. Aby sprawdzić czy pule CLP mogą indukować niektóre z tych efektów poprzez zaburzenie produkcji NO (przez wpływanie na indukcję/aktywność iNOS), sprawdzono i porównano efekt jednoczesnego podawania CLP2p i L-NMWA, inhibitora iNOS, na modulację produkcji cytokin in vivo u starych względem młodych myszy. Wyniki tych badań są przedstawione w Tabeli 13. Surowiczy azotyn/azotan jak również produkcja cytokin przez stymulowane komórki śledziony wywołana ConA były mierzone w sposób wyżej opisany.

T a b e l a 13:

Efekt L-NMMA na odwrócenie zmian w produkcji cytokin przez CLP2p związanych ze starzeniem się

Źródłoa komórek/surowica	Surowicab azotan/azotyn (PM)	Poziomy cytokin w supernatantach hodowlanych'
IL-2	IL-4	IL-10	IFNy	IL-6
ng/ml	pg/ml
1	2	3	4	5	6	7
Młode (S)	52±13	1120±220	55±9	16±5	115±22	220±35
Młode (E)	94±22*	1260±180	52±8	16±4	107±24	254±32
Młode (E+N)	12±3,0*	1280±240	49±9	18±5	119±19	228±39
Stare (S)	43±10	385±70*	139±25*	55±9*	179±30*	1146±110*

PL 211 789 B1 ciąg dalszy Tabeli 13

1	2	3	4	5	6	7
Stare (E)	136±26#	910±130#	54±13#	16±3#	105±22#	575±63#
Stare (E+N)	22±5,0*	480±88*	146±26*	63±8*	162±28	1095±153*

^a Użyto młode lub stare (120 tygodni) myszy C57BL/6Nia (4/grupę). N odnosi się do dziennych wstrzyknięć

L-NMMA (30 mg/Kg) w czasie trwania eksperymentu. E oznacza wstrzyknięcie CLP2p (100 pg/mysz, domięśniowo (i.m.); cztery dawki w odstępach trzydniowych). Myszy były uśmiercane trzy dni po ostatnim wstrzyknięciu CLPp2 lub roztworu soli fizjologicznej (S).

^b średnia wartość surowicy (azotan+ azotyn) (średnia arytmetyczna ± odchylenie standardowe SD) w pM w momencie uśmiercenia. ^c Jak w Tabelach 11 i 12.

*p<0.05, w porównaniu z pierwszym rzędem.

#p<0.05, w porównaniu z rzędami 4 lub 6.

Inhibicja iNOS in vivo (przez L-NMMA) hamowała odwrócenie związanych z wiekiem zmian w produkcji cytokin indukowanych przez wstrzyknięcie in vivo CLP2p z jednoczesną inhibicją indukcji surowiczego azotanu/azotynu wywołaną przez CLP2p. W osobnych badaniach, gdzie makrofagi tkankowe były bezpośrednio stymulowane in vitro przez CLP1b'2p, dawka wymagana do stymulacji cytokiny lub produkcji NO była między 0,02 i 0,05 pg/ml.

13.2.3 Indukcja uwalniania tlenku azotu w mysich BMDM

Stymulacja mysich BMDM in vitro przez CLP1b lub 2p przez 42-48 godzin, indukowała uwolnienie NO w sposób zależny od dawki. Obie pule były mocnymi induktorami (Fig. 56). Określono kinetykę tego procesu dla CLP1b i 2p (Fig. 56). Udział indukowalnej izoformy syntazy NO (iNOS) może być pokazany poprzez dodanie L-NMMA (Fig. 57). Ponadto, CLP1b/2p współdziałają z IFN-γ w aktywacji iNOS (Fig. 58); efekt ten jest także obserwowany w przypadku LPS. Zdolność puli CLP do indukcji uwalniania NO nie była ograniczona do wsobnego szczepu BALB/c, ale była obserwowana w przypadku BMDM z innych szczepów wsobnych (n.p. C57BI/6, C57BI/10, 129Sv).

13.3. Ludzki system in vitro (Metody)

13.3.1 Indukcja i określenie cytokin

Próbki pełnej krwi ze świeżo pobranej krwi obwodowej pochodzącej od zdrowych dawców zostały przygotowane w 5 ml probówkach (Falcon, Becton Dickinson) w całkowitej objętości 500 pl. Próbki składały się z 50 pl całkowitej krwi, 50 pl stymulatora (PHA w stężeniu 100 pg/ml lub CLP1b/2p w rozcieńczeniach 1:10) i 400 pl medium RPMI 1640 wzbogaconego L-glutaminą (2 mM) i antybiotykami. Po 48 godzinach hodowle były wirowane, supernatanty były zbierane i testowane na zawartość cytokin za pomocą testu ELISA.

Hodowle ludzkich monocytów pochodzących z krwi obwodowej umieszczone na płytkach 24-dołkowych (5x10⁶ komórek/500 pl/dołek) były stymulowane CLP1b lub -2p przez 18-72 godzin. Supernatanty zebrano o różnym czasie, odwirowano z dużą prędkością, usunięto resztki komórek i, przy pomocy ELISA (R & D Systems, Wiesbaden), testowano na obecność TNF-α oraz Interleukiny 6 (IL-6). Testy ELISA były przeprowadzone zgodnie z instrukcją producenta.

13.4 Ludzki system in vitro (Wyniki)

13.4.1 Indukcja cytokin przez CLP1b/2p w hodowlach ludzkich leukocytów i wyizolowanych monocytów

Przygotowano hodowle krwi pełnej i komórki stymulowano CLP1b i CLP2p przez 48 godzin. Test ELISA został użyty do określenia sekrecji IL-1 β, TNF-α i IL-6. Obie pule indukowały zbliżoną sekrecję wszystkich trzech cytokin (Fig. 59).

Hodowle monocytów z krwi obwodowej zostały przygotowane w wyżej opisany sposób i stymulowane CLP1b i CLP2p przez różne okresy czasu. Przy zastosowaniu testu ELISA określono sekrecję cytokin TNF-α i IL-6 do supernatantów po 18, 48 i 72 godzinach (Fig. 60). Wyniki były zgodne z wynikami uzyskanymi przy użyciu hodowli krwi pełnej. Uwalnianie TNF-α osiągnęło maksymalne wartości po 18 godzinach. Natomiast w przypadku IL-6 maksymalna sekrecja przypadała między 48 a 72 godziną stymulacji.

14. P r z y k ł a d 14

PRZECIWWIRUSOWE DZIAŁANIE PULI CLP W MYSICH MAKROFAGACH

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (10⁶/dołek w 200 pl buforu hodowlanego (DMEM)) poddano działaniu różnych stężeń Puli CLP (Tabela 14). Komórki zostały przemyte i były trzymane

PL 211 789 B1 w 37°C przez 24 godziny. Do komórek L929 dodano supernatanty (100 pl) a następnie zainfekowano wirusem pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (VSV). Komórki były trzymane w supernatancie przez 48 godzin a ich zniszczenie zostało potwierdzone mikroskopowo. Zgodnie z Tabelą 14, Pule CLP były w stanie hamować cytostatyczne działanie wirusa, najprawdopodobniej poprzez indukcję (przeciwwirusowych) interferonów. To działanie przeciwwirusowe jest potwierdzone przez obserwacje kliniczne, z których wynika że infekcje wirusami herpes są wrażliwe na działanie FSLE. Yokochi [Yokochi, S. (1977)] doniósł, że ekstrakt fenolowy ze świńskiej wątroby w połączeniu z INFa ma działanie przeciwwirusowe. Ponieważ zastosowano całkowicie inne metody przygotowania ekstraktu, inne sposoby analizy biologicznej oraz inne systemy testowania, te odkrycia nie mają związku z niniejszym wynalazkiem.

T a b e l a 14:

	Inhibicja indukowanej wirusem cytopatogenności przez CLP-pools w dawkach pg/hodowlę*)
CLP-pools	100	50	25	12,5	6,3	3,2	1,6	0,8	0
CLP1b	+	+	+	+	+	+	+	-	-
CLP2p	+	+	+	+	+	+	-	-	-
Medium	-	-	-	-	-		-	-	-

*) + = Hamowanie wirusa spowodowane obecnością Interferonu

- = Zniszczenie komórki (efekt cytopatogenny) przez aktywnego wirusa

15. P r z y k ł a d 15

KLINICZNE ASPEKTY FSLE oraz CLP-Pools

15.1. Immunomodulacj a

We współpracy ze zdrowymi ochotnikami obu płci, będącymi w różnym wieku (od 45 do 85 lat), którzy wyrazili świadomą zgodę, przeprowadzono badania pod kątem dynamiki produkcji cytokin przez pełną krew po domięśniowych zastrzykach FSLE (300 mg białek na jednostkę iniekcji).

W każdym eksperymencie brały udział grupy 6-8 ochotników a indywidualne dane były wykorzystane do obliczenia uśrednionych liczb. Oczywiście liczba uczestniczących ochotników biorących udział w danym eksperymencie (6-8) jest zbyt mała, aby przeprowadzić wiarygodną analizę statystyczną; ale można np. zauważyć tendencje w zmianie produkcji cytokin. Ponadto, ogólnie wiadomo, że indywidualne parametry odporności u ludzi mogą się różnić, co oznacza, że aby można było wyciągnąć końcowe wnioski potrzebna będzie znacznie większa liczba uczestników eksperymentu. Zmierzono efekt pojedynczego wstrzyknięcia oraz dwóch wstrzyknięć podawanych w odstępie dwóch lub siedmiu dni. W tym celu całkowite próbki krwi, pobrane przed oraz w różnych okresach (tygodnie, miesiące) po wstrzyknięciach FSLE, były poddane analizie pod kątem produkcji cytokin bez dodatkowej aktywacji po 24, 48, 72 i 96 godzinach hodowli.

15.2 Wyniki

Z tych pierwszych badań wynika, że wstrzyknięcia domięśniowe (i.m.) FSLE wywołują falę zmian w produkcji kilku istotnych cytokin w okresie od dni do tygodni. W pojedynczych przypadkach poziomy pozostawały zmienione przez miesiące.

Po wstrzyknięciu domięśniowym (i.m.) FSLE produkcja Interferonu γ (INF-γ), produktu komórek T, bardzo silnego czynnika aktywującego makrofagi [Robert, W.R., 1982; Vitteta, E.S., 1990], wzrasta około pięciokrotnie z maksymalnym poziomem osiąganym po 14-21 dniach. Wzrost poziomu IFN-γ może wyjaśniać obserwowane efekty przeciwwirusowe FSLE oraz pul CLP1b/2p (patrz Przykład 14).

Interleukina-2 (IL-2) to silny stymulator wzrostu komórek T indukujący transformację naiwnych komórek T do efektorowych komórek T [Janeway, Ch.A., 1995]. Ponadto pokazano wzrost oraz różnicowanie się komórek B. Ponadto IL-2 może działać jako inhibitor wzrostu w komórkach nowotworowych [Rosenberg, S.A., 1987; Hatakeyama, M., 1991]. Opisane zostało również synergistyczne współdziałanie IL-2 i INF-γ, przejawiające się w przeciwnowotworowej aktywności [patrz Vitteta, E.s., 1990]. Po dwóch- trzech tygodniach po domięśniowym (i.m.) wstrzyknięciu FSLE, produkcja IL-2 wzrasta maksymalnie dwukrotnie w stosunku do średniej wartości kontroli i pozostaje podwyższona przez kilka miesięcy.

Natomiast poziom Interleukiny-6 (IL-6) wykazuje tendencję do obniżania się po wstrzyknięciach FSLE. Większość wartości mierzonych, szczególnie po dwóch wstrzyknięciach (w odstępach dwu lub siedmio dniowych), są poniżej wartości kontroli, niepoddawanych działaniu FSLE. Efekt ten może być

PL 211 789 B1 zgodny z opisanym tutaj odkryciem, że wstrzyknięcia FSLE odwracały związane z wiekiem zachwiania poziomów cytokin u myszy, któremu towarzyszyło zmniejszenie wzmożonej produkcji IL-6 (Przykład

11.2.2 oraz Tabela 10). Efekt ten może także zostać wywołany przez podanie przeciwciał anty IL-6 [Gorczynski, R.M., 1997]. Wiadomo, że u starzejących się ludzi występują podniesione poziomy IL-6 w surowicy.

W kręgu zainteresowania jest dynamika Interleukiny-10 (IL-10), znanej jako pleotropiczny przeciwzapalny regulator aktywności makrofagów [Marchant, A., 1999; Moore, K.W., 1993]. Po dwóch wstrzyknięciach FSLE podanych w odstępie tygodniowym, produkcja IL-10 wzrasta około cztero- pięciokrotnie, z maksimum osiąganym po 14-21 dniach po wstrzyknięciu. Poziomy IL-10 wracają do normalnych wartości po okresie jednego, dwóch miesięcy.

Z tych eksperymentów wynika, że FSLE stymuluje produkcję zapalnych regulatorów stymulujących i inhibujących w „naturalnym” stanie równowagi. Fakt ten może także wyjaśnić dobrą tolerancję zastrzyków oraz zapobieganie każdej niepożądanej trwającej dłużej nadmiernej aktywacji makrofagów [patrz D'Andrea, A., 1993]. Warto zaznaczyć, że dwa następujące po sobie, w odstępach dwudniowych, wstrzyknięcia FSLE mogą prowadzić do częściowego stanu krótkotrwałej „tolerancji” in vivo. (in vitro: porównaj z Przykładem 8.9); jej indukcja lub brak mogą być klinicznie istotne.

15.3. Podsumowanie

Podsumowując, FSLE in vivo oraz CLP1b i CLP2p indukują w sposób zaplanowany kaskadę immunoregulatorów stymulujących i inhibujących o znaczeniu klinicznym. Ponadto, wyniki kliniczne uzyskane po podawaniu ekstraktu z wątroby płodu ludziom (ochotnikom) jasno potwierdziły obserwacje poczynione in vitro i in vivo przedstawione w powyżej przytoczonych Przykładach - głównie w tych, w których wykorzystano ludzkie komórki gruczolakoraka gruczołu prostaty oraz monocyty ludzkie; a także w eksperymentach opisujących odwrócenie wzoru cytokin starzejących się myszy. Około 100 pacjentów było leczonych w ostatnich latach z powodów onkologicznych lub z powodu przewlekłych nawrotów albo przewlekłych chorób wirusowych (opryszczka i zapalenie wątroby typu B oraz typu C). Wielu pacjentów poddanych radioterapii z powodu gruczolakoraka gruczołu prostaty reagowało natychmiastowo na FSLE poprzez obniżenie wartości specyficznego antygenu prostaty PSA do normalnego poziomu o wiele wcześniej niż zazwyczaj pojawiały się efekty naświetlania. Wielu pacjentów cierpiących na nawroty zakażeń wirusem opryszczki (herpes) odczuło natychmiast, że nawroty albo nie pojawiały się lub pojawiały się rzadziej. U kilku niereagujących na terapię pacjentów zakażonych wirusem zapalenia wątroby typu B i C kontrolowano infekcję utrzymując poziom wirusa poniżej poziomu wywołującego chorobę, prawdopodobnie w związku ze stymulacją produkcji interferonu.

Podsumowując, składniki FSLE zawarte w CLP1b i CLP2p są obecnie poddawane dalszym eksperymentom klinicznym a obserwacje kliniczne dużej liczby ochotników i pacjentów potwierdzają dobrą tolerancję i efekty utrzymujące się przez 18-24 miesiące, potwierdzone przez dobry stan pacjenta i odpowiedź immunologiczną.

Bibliografia

Alexander, C. i Rietschel E. Th.: J. Endotoxin Res. 7, 167-202 (2001).

Aliprantis, A.O. i wsp.: Science 285, 736-739 (1999)

Ausubel i wsp.: Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989) Bacher, M. i wsp.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 7849-7854(1996).

Bacher, M. i wsp.: Am. J. Pathol. 150, 235-246 (1997).

Belanger, M. i wsp.: Infect Immun. 63, 656-662 (1995).

Berdel, W. E. i P. G. Munder: Anticancer Res. 1, 397-402 (1981).

Bemhagen, J. i wsp.: Nature 365, 756-9 (1993).

Bemhagen, J. i wsp.: J. Mol. Med 76, 151-161 (1998).

Bertok, L.: Microbiology-1980 (D. Schlesinger, wyd.) (1980), 91-93.

Bernier, I. i wsp.: Biochim. Biophys. Acta 871, 19-23 (1986).

Bertini, R. i wsp.: J. Exp. Med. 189, 1783-89 (1999).

Blum, H. i wsp.: Electrophoresis 8, 93-99 (1987).

Boyum, A.: Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, 77-89 (1968)

Brabetz, W. i wsp.: Symp. In Immunology VIII, 89-121 (1999). Eibl. i wsp.wyd. Springer Berlin, Heidelberg.

Brade, H. i wsp.(wyd.): Endotoxin in Health and Disease, 950 stron. Marcel DEKKER; New York, Basel (1999).

Brandenburg, K. i wsp.: J. Endotoxin Res. 3,173-78 (1996).

PL 211 789 B1

Bucci i Fronticelli: J. Biol. Chem. 248, 551-556 (1965) Burns, E.A. i J.S. Goodwin: Immundeficiency and Aging (Praca przeglądowa) Drugs and Aging 11 (5), 374-397 (1997).

Calandra, T. i wsp.: J. Exp. Med. 179, 1895-1902 (1994).

Carrillo E. H. i wsp.: J. Trauma 52, 449-452 (2002)

Coggin, J. H. i wsp.: J. Immunol. 107, 526-331 (1971).

Colantuoni, V. i wsp.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 130, 431-39 (1985).

Coley, W. B.: Am. J. Med. Sci 105,487-511 (1893)

Corraliza, J. M. i wsp.: J. Immunol. Methods 174, 231-35 (1994).

D'Andrea, A. i wsp.: J. Exp. Med. 178, 1041-48 (1993).

David, S. A.: patrz Brade, H., 413-423 (1999).

Daynes, R. A. i B. A. Araneo: Aging, Immunol. Infect. Dis. 3, 135-53 (1992).

Daynes, R. A. i wsp.: J. Immunol. 150, 5219-30 (1993).

DeWys, W. D.: Cancer Res. 32, 374-79 (1972).

Droogmans, L. i wsp.: DNA Seq. 4, 277-279 (1994).

Dunn, D. L. i wsp.: Surgery 93, 653-659 (1983).

Durgan, J.: J. Natl. Cancer Just. 89, 681-83 (1997).

Elin, R. J.: J. Infect. Dis. 144, 329-36 (1981).

Engelhardt, R. i wsp.: J. Biol. Resp. Med. 9,480-491 (1990).

Forabosco, P. i wsp.: Eur. J. Hum. Genet. 8, 846-852 (2000).

Freudenberg, M. A. i Ch. Galanos: Int. Rev. Immunol. 6, (4), 207-21 (1990).

Freudenberg, M. A. i wsp.: Infect. Immun. 59, 3487-91 (1991).

Freudenberg, M. A. i wsp.: Infect. Immun. 51, 891-895 (1986).

Galanos, Ch. i wsp.: Eur. J. Biochem. 9, 245-249 (1969).

Galanos, Ch. and O. Lϋderitz: Europ. J. Biochem. 54, 601-10 (1975).

Galat A. i wsp.: Eur. J. Biochem. 224, 417-421 (1994).

Godin, D. V. i J. M. Tuchek: Brit. J. Pharmacol. 79, 421-28 (1983).

Gorczynski, R. M. i Cunningham A. J.: Eur. J. Immunol. 8, 753-755 (1978).

Gorczynski, R. M. i wsp.: Eur. J. Immunol. 10, 781-787 (1980).

Gorczynski, R. M. i wsp.: Immunology 92, 20-25 (1997).

Gorczynski, R. M. i wsp.: Immunol. Letters 60, 154-64 (1998).

Gorczynski, R. M. i wsp.: Clin. Immunol. 101, 328-334 (2001)

Gorczynski, R. M. i wsp.: Europ. J. Immunol. 31, 2331-2337 (2001)

Goto, S. i wsp.: Cancer Immunol. Immunotherap. 42, 255-61 (1996).

Green, L. C. i wsp.: Analyt. Biochem. 126, 5241-44 (1982).

Hammerberg i wsp.: Ann N.Y. Acad. Sci. 241, 672-682 (1974)

Harding, M. W. i wsp.: J. Biol. Chem. 261, 8547-8555 (1986)

Handler, B. i wsp.: EMBO J. 6, 947-50 (1987).

Hateyama, M. i T. Toniguchi: W: Peptide Growth Factors and their Receptorsl., M. B.

Spom i A. B. Roberts (wyd.), 523-540 (1991), Springer New York.

Heimburger, N. i H.E. Karges: W: Current Studies in Hemato. and Blood.

Transfusion No. 56, A. Hassigetol. wyd. Karger, Beseldo. (1989).

Heukeshoven, J. i Demick, R.: Electrophoresis 6, 103-112 (1985)

Heukeshoven, J. i Demick, R.: Electrophoresis 9, 28-32 (1988).

Hoffmann, P. i wsp.: Biol. Chem. Hoppe-Seyler 370, 575-82 (1989).

Horiuchi, M. i wsp.: J. Gen. Virology 76, 2583-87 (1995).

Hunkapiller, M. W. i L.E. Hood: Science 219, 650-59 (1983).

Inagawa, H. i wsp.: Anticancer Res. 17, 2153-58 (1997).

Janeway, Ch.A. i P. Travers: Immunologie (Textbook, wersja niemiecka), 297 (1995), Spektrum-Verlag, Berlin, Oxford.

Jeanin, J. F. i wsp.: Gastroenterology 101, 726-33 (1991).

Jungblut, P i wsp.: Electrophoresis 13, 739-741 (1992).

Jungblut, P. i wsp.: Electrophoresis 15, 685-707 (1994).

Kaca, W. i wsp.: J. Biol. Chem. 269, 25078-25084 (1994)

Kaca W. i wsp.: Biochim. Biophys. Acta 17,49-56 (1995)

Katayama, Y. i wsp.: Japan J. Med. Sci. 28,304-307 (1975).

Kusama, T. i wsp.: Chem. Pharm. Bull. 39,3244-53 (1991)

PL 211 789 B1

Laemmli, U. K.: Nature 227, 680-85 (1970).

Lambert, G.: Conquest of Life-The extraordonary story of Dr. Paul Niehans.

Rinehart & Co. Inc., New York, Toronto (1959).

Levin, J.: Progr. Clin. Biol. Res. 93, 7-24 (1982).

Lotan, R. i wsp.: FASEB J. 10, 1031-39 (1996).

Lowry O. H. i wsp.: J. Biol. Chem. 207, 1-17 (1954)

Lϋderitz, O. i wsp.: Biochem. Z. 330, 34-46 (1958).

Machado, P. i wsp.: Europ. J. Dermatol. 8, 98-103 (1998).

Malmgren, R. A. i W. Mills: J. Natl. Cancer Inst. 26, 525-31 (1961).

Marchant, A. i wsp.: W: Endotoxin in Health and Disease, H. Brade i wsp., (wyd. ), 581-590 (1999), Marcel Dekker, Inc., New York.

McLachlan, J. A. i wsp.: J. Immunol. 154, 832-43 (1995).

Metz, C. N. i Bucala, R.: Cytokine Reference: 703-716 (2001); Academic Press; CA, USA (wyd. Oppenheim, J. J., Feldmann, M., Durum, S. K., Hirano, T., Vilcek, J., Nicoal, N. A.).

Miller, R. A.: Science 273, 70-74 (1996).

Mirza, M. M. i wsp.: J. Med. Genet. 35, 218-221 (1998).

Modolell, M. i P. G. Munder: J. Immunol. Methods 174, 203-208 (1994).

Moore, K. W. i wsp.: Ann. Rev. Immunol. 11, 165-190 (1993).

M^ler, EC. i wsp..: Electrophoresis 20, 320-330 (1999).

Munford, R. S. i C. L. Hall: Science 234, 203-205 (1986).

Nabika, T. i wsp.: Biochim. Biophys. Acta 1450, 25-34 (1999).

Nathan, C: FASEB Journal 6, 3051-3056 (1992).

Neter, E. i wsp.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 88, 339-341 (1955).

Neter, E. i wsp.: Can. J. Microbiol. 4, 371-383 (1958).

Nishizawa, T. i wsp.: Chem. Pharm. Bull. 40, 479-483 (1992).

Opal, S. M. i R. L. Yu: Drugs Apr. 55, 497-508 (1998).

Otto, A. i wsp.: Electrophoresis 17, 1643-1650 (1996).

Ozkaynak, E. i wsp.: Nature 312, 663-66 (1984).

Pfannes, S. D. C. i wsp.: J. Leukoc. Biol. 69, 590-597 (2001).

Połtorak, A. i wsp.: Science 282, 2085-2088 (1998).

Porro, M.: patrz Brade, H. i wsp., 1999, 403-412.

Poetstra, K. i wsp.: Am. J. Pathol. 151, 1163-1169 (1997).

Reiter, I. i wsp.: J. Immunol. 15; 163, 1730-1732 (1999).

Renner, H.: Fortsch. Med. 92, 175-178 (1974).

Ribeiro, A. A. i wsp.: Magn. Reson. Chem. 37, 620-630 (1999).

Rietschel, E. Th. i wsp.: FASEB J. 8, 217-225 (1994)

Rincon, M. i wsp.: J. Exp. Med. 185, 461-467 (1997).

Rifkind, D.: J. Bacteriol. 93, 1463-1464 (1967).

Robert, W. K. i A. Vasil: J. Interferon Res. 2, 519-532 (1982).

Rohrer, H.: Krebs-Medizin 8, 3-10 (1987).

Roger, T. i wsp.: Nature 414, 920-924 (2001)

Rosenberg, S. A. i wsp.: New Engl. J. Med. 316, 889-897 (1987).

Rosenberg, S. A. i wsp.: Ann. Surg. 208, 121-135 (1988).

Roth, R. J. i wsp.: Prog. Clin. Biol. Res. 388,161-172 (1994)

Roth, R. J. i Levin, J.: Endotoxin in Health and Disease: patrz Brade i wsp. (1999) 389-402 Sambrook i wsp.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor(1989).

Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982).

Schlecht, S. Zbl. Bakt. Hyg. I Abt. Orig. A232, 61-72 (1975)

Schlesinger, D. H. i wsp.: Biochemistry 14, 2214-18 (1975).

Schmid, F. i J. Stein (wyd.): Zellforschung und Zelltherapie (Cellular Research and Cell Therapy). H. Huber, Bern, Stuttgart (1963).

Schmidt, G. i wsp.: Eur. J. Biochem. 16, 382-392 (1970)

Schoentgen, F. i wsp.: Eur. J. Biochem. 166, 333-38 (1987).

Schreck, R. i wsp.: EMBO Journal 10, 2247-2258 (1991).

Seddiqi, N. i wsp.: J. Mol. Evol. 39, 655-60 (1994).

Seguia, I. i Ch. C. Stock: Cancer Res. 15, 38-51 (1955).

PL 211 789 B1

Sherman, D. R. i wsp.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3209-13 (1987).

Strominger, J. L. i wsp.: J. Biol. Chem. 234, 3263-3267 (1959)

Stuehr, D. J. i C. F. Nathan: J. Exp. Med. 169, 1543-1555 (1989).

Su D. i wsp.: Infect. Immun. 65, 1258-1266 (1997)

Takeuchi, O., i wsp.: Immunity 11, 443-451 (1999)

Thiede, B. i wsp.: Electrophoresis 17, 588-599 (1996).

Ulrich, J. T. and Myers K. R.: Pharm. Biotechnol. 6, 495-524 (1995)

Van Bossuyt, H. i wsp.: J. Hepathology 7, 325-337 (1988).

Vitteta, E. S. i W. E. Paul: W: Peptide Growth Factor and their Receptors, II., 412, (1990). Waeber, G. i wsp.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 94, 4782-4787 (1997).

Wang, J. i wsp.: J. Clin. Invest. 103, 1023-1029 (1999).

Wechsler, M. E. i R. Schwab: Exp. Clin. lmmunogenetics 9, 182-187 (1992).

Weiser, WY. i wsp.: Proc. Natal. Acad. Sci. U. S. A 86, 7522-7526 (1989).

White C. T. i wsp.: J. Lab. Clin. Med. 108,132-137 (1986)

Winterhalter i Colosimo: Biochem. 10, 621-628 (1971)

Winterhalter i Huehns: J. Biol. Chem. 239, 3699-3705 (1964)

Wollman, E. E. i wsp.: J. Biol. Chem. 263, 15506-12 (1988).

Worton, R. G. i wsp.: J. Cell. Physiol. 74, 171-179 (1969).

Yokochi, S. i wsp.: Arzneimittel-Forsch./Drug-Research 47, 968-974 (1997).

Zahringer, U. i wsp.: Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 50, 211-276 (1994).

Zahringer, U. i wsp.: J. Endotoxin Res. 7, 133-146 (2001)

Zhang, M. i K. J. Tracey: patrz H. Brade i wsp.(wyd.), str. 915-926. (1999).

Ziegler-Heitbrock, H. W. i wsp.: Immunology 75, 264-270, (1992).

Zuckermann, S. H. i wsp.: Infect. Immun. 59, 2774-2781, (1991).

PL 211 789 B1

Wykaz sekwencji <110> Cliniąue La Prairie Research SA <120> Kompozycje zawierające hemoglobinę płodową i endotoksynę bakteryjną oraz opcjonalnie, dodatkowe składniki wątroby płodowej <130> G3118 PCT <140> PCT/EP2004/001553 <141> 2004-02-18 <160> 28 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> Capra hircus AND Ovis aries AND Ammotragus lervia <300>

<308> SWISS-PROT / P01970 <309> 1986-07-21

<400>

1

Trp

Gly 15

Lys

Val 1

Leu

Ser

Ala

Ala 5

Asp Lys

Ser

Asn

Val 10

Lys Ala Ala

Val

Gly

Gly

Asn

Ala

Gly

Ala

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe

Leu

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Leu

35

40

45

Ser

His

Gly

Ser

Ala

Gin

Val

Lys

Gly

His

Gly

Glu

Lys

Val

Ala

Ala

50

55

60

Ala

Leu

Thr

Lys

Ala

Val

Gly

His

Leu

Asp

Asp

Leu

Pro

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Asp

Leu

Ser

Asp

Leu

His

Ala

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

90 95

PL 211 789 B1

Asn	Phe	Lys	Leu Leu 100	Ser	His	Ser Leu 105	Leu Val	Thr Leu Ala 110	Cys	His
Leu	Pro	Asn	Asp Phe	Thr	Pro	Ala Val	His Ala	Ser Leu Asp	Lys	Phe
		115				120		125
Leu	Ala	Asn	Val Ser	Thr	Val	Leu Thr	Ser Lys	Tyr Arg
	130				135			140
<210	2
<211>	141
<212>	PRT
<213>	Capra hircus	AND	0vis aries AND Anunotragus lervia
<300
<308>	SWISS-PROT /	P01970
<309>	1986-	-07-21
<400>	2
Val	Leu	Ser	Ala Ala	Asp	Lys	Ser Asn	Val Lys	Ala Ala Trp	Gly	Lys
1			5				10		15
Val	Gly	Gly	Asn Ala	Gly	Ala	Tyr Gly	Ala Glu	Ala Leu Glu	Arg	Met
			20			25		30
Phe	Leu	Ser	Phe Pro	Thr	Thr	Lys Thr	Tyr Phe	Pro His Phe	Asp	Leu
		35				40		45
Ser	His	Gly	Ser Ala	Gin	Val	Lys Gly	His Gly	Glu Lys Val	Ala	Ala
	50				55			60
Ala	Leu	Thr	Lys Ala	Val	Gly	His Leu	Asp Tyr	Leu Pro Gly	Thr	Leu
65				70			75			80
Ser	Asp	Leu	Ser Asp	Leu	His	Ala His	Lys Leu	Arg Val Asp	Pro	Val
			85				90		95
Asn	Phe	Lys	Leu Leu	Ser	His	Ser Leu	Leu Val	Thr Leu Ala	Cys	His
			100			105		110
Leu	Pro	Asn	Asp Phe	Thr	Pro	Ala Val	His Ala	Ser Leu Asp	Lys	Phe

115 120 125

PL 211 789 B1

Leu Ala Asn Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 3 <211> 141 <212> PRT <213> Capra hircus AND Ovis aries AND Ammotragus lervia <300>

<308> l <309>

SWISS-PROT / 1986-07-21

P01970

<400> .

3

Val

Leu

Ser

Ala

Ala

Asp

Lys

Ser

Asn

Val

Lys

Ala

Ala

Trp

Gly

Lys

1

5

10

15

Val

Gly

Ser

Asn

Ala

Gly

Ala

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe

Leu

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Leu

35

40

45

Ser

His

Gly

Ser

Ala

Gin

Val

Lys

Gly

His

Gly

Glu

Lys

Val

Ala

Ala

50

55

60

Ala

Leu

Thr

Lys

Ala

Val

Gly

His

Leu

Asp

Asp

Leu

Pro

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Asp

Leu

Ser

Asp

Leu

His

Ala

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85

90

95

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Ser

His

Ser

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Ala

Cys

His

100

105

110

His

Pro

Ser

Asp

Phe

Thr

Pro

Ala

Val

His

Ala

Ser

Leu

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu

Ala

Asn

Val

Ser

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

130

135

140

<210> 4 <211> 141

PL 211 789 B1 <212> PRT <213> Ovis aries <300>

<308> : <309> :

SWISS-PROT / 1986-07-21

P01970

<400> .

i

Val

Leu

Ser

Ala

Ala

Asp

Lys

Ser

Asn

Val

Lys

Ala

Ala

Trp

Asp

Lys

1

5

10

15

Val

Gly

Gly

Asn

Ala

Gly

Ala

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe

Leu

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Leu

35

40

45

Ser

His

Gly

Ser

Ala

Gin

Val

Lys

Gly

His

Gly

Glu

Lys

Val

Ala

Ala

50

55

60

Ala

Leu

Thr

Lys

Ala

Val

Gly

His

Leu

Asp

Asp

Leu

Pro

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Asp

Leu

Ser

Asp

Leu

His

Ala

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85

90

95

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Ser

His

Ser

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Ala

Cys

His

100

105

110

Leu

Pro

Asn

Asp

Phe

Thr

Pro

Ala

Val

His

Ala

Ser

Leu

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu

Ala

Asn

Val

Ser

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

130

135

140

<210> 5 <211> 145 <212> PRT <213> Ovis aries <300>

<308> SWISS-PROT / P02083 <309> 1986-07-21

PL 211 789 B1 <400> 5

Met 1

Leu Thr Ala

Glu 5

Glu

Lys

Ala

Ser

Val 10

Ile

Ser

Leu

Phe

Ala 15

Lys

Val

Asn

Val

Glu

Glu

Val

Gly

Gly

Glu

Ala

Leu

Gly

Arg

Leu

Leu

Val

20

25

30

Val

Tyr

Pro

Trp

Thr

Gin

Arg

Phe

Phe

Glu

His

Phe

Gly

Asp

Leu

Ser

35

40

45

Ser

Ala

Asp

Ala

Ile

Leu

Gly

Asn

Pro

Lys

Val

Lys

Gly

His

Gly

Lys

50

55

60

Lys

Val

Leu

Asn

Ser

Phe

Ser

Glu

Gly

Leu

Lys

Gin

Leu

Asp

Asp

Leu

65

70

75

80

Lys

Gly

Ala

Phe

Ala

Ser

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Cys

Asp

Lys

Leu

His

85

90

95

Val

Asp

Pro

Glu

Asn

Phe

Arg

Leu

Leu

Gly

Asn

Val

Leu

Val

Val

Val

100

105

110

Leu

Ala

Arg

Arg

Phe

Gly

Gly

Glu

Phe

Thr

Pro

Glu

Leu

Gin

Ala

Asn

115

120

125

Phe

Gin

Lys

Val

Val

Thr

Gly

Val

Ala

Asn

Ala

Leu

Ala

His

Arg

Tyr

130 135 140

His

145 <210> 6 <211> 141 <212> PRT

<213>	Homo	sapiens	AND	Pan	troglodytes	And	Pan	paniscus
<300>
<308>	SWISS	-PROT /	P01922
<309>	1986-	07-21
<400>	6
Val Leu	. Ser	Pro Ala	Asp	Lys	Thr Asn Val	Lys	Ala	Ala Trp i

PL 211 789 B1

10 15

Val Gly

Ala

His

Ala

Gly

Glu

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe Leu

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Leu

35

40

45

Ser His

Gly

Ser

Ala

Gin

Val

Lys

Gly

His

Gly

Lys

Lys

Val

Ala

Asp

50

55

60

Ala Leu

Thr

Asn

Ala

Val

Ala

His

Val

Asp

Asp

Met

Pro

Asn

Ala

Leu

65

70

75

80

Ser Ala

Leu

Ser

Asp

Leu

His

Ala

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85

90

95

Asn Phe

Lys

Leu

Leu

Ser

His

Cys

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Ala

Ala

His

100

105

110

Leu Pro

Ala

Glu

Phe

Thr

Pro

Ala

Val

His

Ala

Ser

Leu

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu Ala

Ser

Val

Ser

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

130

135

140

<210>

7

<211>

141

<212>

PRT

<213>

Bos taurus

<300>

<308>

SWISS-PROT /

P01966

<309>

1986-

-07-21

<400> '

7

Val Leu

Ser

Ala

Ala

Asp

Lys

Gly

Asn

Val

Lys

Ala

Ala

Trp

Gly

Lys

1

5

10

15

Val Gly

Gly

His

Ala

Ala

Glu

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe Leu

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Leu

PL 211 789 B1

40 45

Ser

His 50

Gly

Ser Ala

Gin Val 55

Lys

Gly

His

Gly

Ala 60

Lys

Val

Ala

Ala

Ala

Leu

Thr

Lys Ala

Val Glu

His

Leu

Asp

Asp

Leu

Pro

Gly

Ala

Leu

65

70

75

80

Ser

Glu

Leu

Ser Asp

Leu His

Ala

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85

90

95

Asn

Phe

Lys

Leu Leu

Ser His

Ser

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Ala

Ser

His

100

105

110

Leu

Pro

Ser

Asp Phe

Thr Pro

Ala

Val

His

Ala

Ser

Leu

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu

Ala

Asn

Val Ser

Thr Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

130

135

140

<210>

8

<211>

141

<212>

PRT

<213>

Mus musculus

<300>

<308>

SWISS-PROT /

P01942

<309>

1986-

-07-21

<400>

8

Val

Leu

Ser

Gly Glu

Asp Lys

Ser

Asn

Ile

Lys

Ala

Ala

Trp

Gly

Lys

1

5

10

15

Ile

Gly

Gly

His Gly

Ala Glu

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe

Ala

Ser

Phe Pro

Thr Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Val

35

40

45

Ser

His

Gly

Ser Ala

Gin Val

Lys

Gly

His

Gly

Lys

Lys

Val

Ala

Asp

50

55

60

Ala

Leu

Ala

Ser Ala

Ala Gly

His

Leu

Asp

Asp

Leu

Pro

Gly

Ala

Leu

PL 211 789 B1

65

70

75

80

Ser

Ala

Leu

Ser

Asp

Leu

His

Ala

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85

90

95

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Ser

His

Cys

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Ala

Ser

His

100

105

110

His

Pro

Ala

Asp

Phe

Thr

Pro

Ala

Val

His

Ala

Ser

Leu

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu

Ala

Ser

Val

Ser

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

130 - 135 140 <210> 9 <211> 141 <212> PRT <213> Rattus norvegicus

<300>	P33583
<308> <309>	SWISS-PROT / 1986-07-21	P01946;
<400>	9
Val Leu	Ser Ala Asp	Asp Lys	Thr Asn Ile Lys Asn Cys Trp Gly Lys
1	5		10 15
Ile Gly	Gly His Gly	Gly Glu	Tyr Gly Glu Glu Ala Leu Gin Arg Met
	20		25 30
Phe Ala	Ala Phe Pro	Thr Thr	Lys Thr Tyr Phe Ser His Ile Asp Val
	35		40 45
Ser Pro	Gly Ser Ala	Gin Val	Lys Ala His Gly Lys Lys Val Ala Asp
50		55	60
Ala Leu	Ala Lys Ala	Ala Asp	His Val Glu Asp Leu Pro Gly Ala Leu
65		70	75 80
Ser Thr	Leu Ser Asp	Leu His	Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val
	85		90 95
Asn Phe	Lys Phe Leu	Ser His	Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Cys His

PL 211 789 B1

100 105 110

His Pro Gly Asp Phe Thr Pro Ala Met His Ala Ser Leu Asp Lys Phe 115 120 125

Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg 130 135 140 <210> 10 <211> 141 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <300>

<308> : <309> :

3WISS-PROT / 1986-07-21

P01948

<400> :

10

Val

Leu

Ser

Pro

Ala

Asp

Lys

Thr

Asn

Ile

Lys

Thr

Ala

Trp

Glu

Lys

1

5

10

15

Ile

Gly

Ser

His

Gly

Gly

Glu

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ala

Val

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe

Leu

Gly

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Phe

35

40

45

Thr

His

Gly

Ser

Glu

Gin

Ile

Lys

Ala

His

Gly

Lys

Lys

Val

Ser

Glu

50

55

60

Ala

Leu

Thr

Lys

Ala

Val

Gly

His

Leu

Asp

Asp

Leu

Pro

Gly

Ala

Leu

65

70

75

80

Ser

Thr

Leu

Ser

Asp

Leu

His

Ala

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85 '

90

95

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Ser

His

Cys

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Ala

Asn

His

100

105

110

His

Pro

Ser

Glu

Phe

Thr

Pro

Ala

Val

His

Ala

Ser

Leu

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu

Ala

Asn

Val

Ser

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

PL 211 789 B1

130 135 140 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: peptyd odpowiadający pozycjom 48

	- 72 łańcucha gamma	ludzkiej	hemoglobiny
<400>	11
Ser Ala	Ile Met	Gly Asn Pro	Lys Val	Lys Ala His Gly Lys	Lys Val
1		5		10	15
Leu Thr	Ser Leu	Gly Asp Ala	Ile
	20

<210>	12
<211>	25
<212>	PRT
<213>	Sekwencja Sztuczna
<220>
<221>	źródło
<223>	/uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: peptyd	odpowiadający pozycjom 51
	- 75 łańcucha gamma owczej hemoglobiny
<400>	12
Asp Ala	Ile Leu Gly Asn Pro Lys Val Lys Gly His	Gly Lys Lys Val
1	5 10	15
Leu Asn	Ser Phe Ser Glu Gly Leu Lys
	20 25

<210>	13
<211>	63
<212>	DNA
<213>	Sekwencja Sztuczna
<220>
<221>	źródło

PL 211 789 B1 <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: sekwencja liderowa łańcucha kappa Ig zawarta w eukariotycznym wektorze ekspresyjnym PIRESneo3 <400> 13 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gac 63 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do wbudowywania sekwencji liderowej łańcucha kappa Ig do eukariotycznego wektora ekspresyjnego PIRESneo3 <400> 14 taaatgctag cgccaccatg gagacagac 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer antysensowny do wbudowywania sekwencji liderowej łańcucha kappa Ig do eukariotycznego wektora ekspresyjnego PIRESneo3 <400> 15 attataccgg tgtcaccagt ggaacctgg 29 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do amplifikacji techniką RTPCR sekwencji kodującej ludzkiej hemoglobiny łańcucha alfa Ig

PL 211 789 B1 <400> 16 taataaccgg tatggtgcac ctgactcctg agga 34 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer antysensowny do amplifikacji techniką RTPCR sekwencji kodującej ludzkiej hemoglobiny łańcucha alfa Ig <400> 17 atttaaccgg tagcttagtg atacttgtgg gcca 34 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do amplifikacji techniką RTPCR sekwencji kodującej ludzkiej hemoglobiny łańcucha beta Ig <400> 18 taataaccgg tatggtgcac ctgactcctg agg 33 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer antysensowny do amplifikacji techniką RTPCR sekwencji kodującej ludzkiej hemoglobiny łańcucha beta Ig <400> 19 atttaaccgg tagcttagtg atacttgtgg gcca 34 <210> 20

PL 211 789 B1 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do amplifikacji techniką RTPCR sekwencji kodującej ludzkiej hemoglobiny łańcucha gamma Ig <400> 20 taataaccgg tatgggtcat ttcacagagg ag 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer antysensowny do amplifikacji techniką RTPCR sekwencji kodującej ludzkiej hemoglobiny łańcucha gamma Ig ” <400> 21 atttaaccgg tctcagtggt atctggagga ca 32 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do amplifikacji techniką RTPCR sekwencji kodującej owczej hemoglobiny łańcuchów alba, beta i gamma <400> 22 taataaccgg tatgctgact gctgaggaga a 31 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna

PL 211 789 B1 <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer antysensowny do amplifikacji techniką RTPCR sekwencji kodującej owczej hemoglobiny łańcuchów alba, beta i gamma <400> 23 atttaaccgg tggaagggga gcttagtgat a 31 <210> 24 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do klonowania sekwencji kodującej łańcucha alfa ludzkiej hemoglobiny zawierającej tag 6-His i miejsce trawienia enterokinazy <400> 24 agcaccggtc atcatcatca tcatcatgat ctgtacgacg atgacgataa gatggtgcac 60 ctgactcctg agga 74 <210> 25 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do klonowania sekwencji kodującej łańcucha beta ludzkiej hemoglobiny zawierającej tag 6-His i miejsce trawienia enterokinazy <400> 25 agcaccggtc atcatcatca tcatcatgat ctgtacgacg atgacgataa gatggtgcac 60 ctgactcctg agga 74 <210> 26 <211> 75 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło

PL 211 789 B1 <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do klonowania sekwencji kodującej łańcucha gamma ludzkiej hemoglobiny zawierającej tag 6-His i miejsce trawienia enterokinazy <400> 26 agcaccggtc atcatcatca tcatcatgat ctgtacgacg atgacgataa gatgggtcat 60 ttcacagagg aggac 75 <210> 27 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: primer sensowny do klonowania sekwencji kodujących łańcuchów alfa, beta i gamma owczej hemoglobiny zawierającej tag 6-His i miejsce trawienia enterokinazy <400> 27 agcaccggtc atcatcatca tcatcatgat ctgtacgacg atgacgataa gatgctgact 60 gctgaggaga aggc 74 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja Sztuczna <220>

<221> źródło <223> /uwaga=„Opis Sekwencji Sztucznej: uniwersalny primer antysensowny do klonowania sekwencji kodujących łańcuchów alfa, beta i gamma ludzkiej i owczej hemoglobiny zawierającej tag 6-His i miejsce trawienia enterokinazy <400> 28 tccgaattcg aatccggaga c 21

Claims (31)

1. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera endotoksynę lub jej fragment o aktywności endotoksycznej, hemoglobinę płodową lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów i, opcjonalnie, dodatkowy związek(-i) oraz, dowolnie, zaróbkę; albo zawiera endotoksynę lub jej fragment o aktywności endotoksycznej, hemoglobinę płodową lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinację(-e) jej łańcuchów, opcjonalnie dodatkowy związek(-i) oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz/lub rozcieńczalnik oraz/lub zaróbkę, przy czym wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), pochodzi(-ą) z innej niż ludzka tkanki płodowej.

3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że wspomniana inna niż ludzka tkanka płodowa pochodzi od owcy, kozy, konia łub wołu.

4. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 3, znamienna tym, że wspomniany dodatkowy związek(-i) pochodzi(-ą) z (gliko)peptydu(-ów) wątroby płodowej.

5. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 4, znamienna tym, że kombinacją łańcuchów jest dimer α, Y hemoglobiny płodowej.

6. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 4, znamienna tym, że pojedynczym łańcuchem jest łańcuch Y hemoglobiny płodowej.

7. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 6, znamienna tym, że kombinacja(-e) łańcuchów nie zawierają hemu.

8. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 7, znamienna tym, że wspomniana endotoksyna jest bakteryjnym, w formie S-lub R-lipolisacharydem (LPS).

9. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 7, znamienna tym, że endotoksycznie aktywny fragment endotoksyny jest związkiem lipidu A nie zawierającym LPS-pochodnego polisacharydu.

10. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 7, znamienna tym, że wspomniana endotoksyna jest naturalnym lub syntetycznym penta- i/lub heksoacylo-lipidem A.

11. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 7, znamienna tym, że wspomniana endotoksyna jest naturalnym lub syntetycznym penta- i/lub heksaacylo monofosforanem lipidu A.

12. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 11 znamienna tym, że stosunek wagowy składników mieści się w zakresie od 1:1 do 1000:1 hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczych łańcuchów lub kombinacji jej łańcuchów do endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej.

13. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 4 do 12 znamienna tym, że wspomniany płodowy (gliko)peptyd wątroby jest białkiem wiążącym fosfatydyloetanoloaminę (PBP), peptydylo-prolylo-cis-trans-izomerazą A (PPIaza A), tioredoksyną, czynnikiem inhibicji migracji makrofagów (MIF) lub ubikwityną lub jakimikolwiek innym białkiem wymienionym w Tabeli 4.

14. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 13 znamienna tym, że jest w opakowaniu do doustnego podawania.

15. Kompozycja farmaceutyczna według dowolnego z zastrz. od 1 do 14 znamienna tym, że zawiera od 0.1 do 10 mg hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczych łańcuchów lub kombinacji jej łańcuchów i od 0.01 do 1000 ąm endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej.

16. Zastosowanie endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i opcjonalnie, dodatkowego związku(-ów) do otrzymywania kompozycji do pobudzania wrodzonego i nabytego układu immunologicznego, gdzie wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że wspomniana kompozycja jest w opakowaniu do doustnego podawania.

18. Zastosowanie endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i opcjonalnie, dodatkowego związku(-ów) do otrzymywania kompozycji do leczenia raka, gdzie wspomniana hemoglobina płodowa

PL 211 789 B1 lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że wspomniany rak wybrany jest spośród raka prostaty, raka piersi, raka płaskokomórkowego szyjki macicy i gruczolakoraka trzustki.

20. Zastosowanie według zastrz. 18 albo 19, znamienne tym, że wspomniana kompozycja jest w opakowaniu do doustnego podawania.

21. Zastosowanie endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i opcjonalnie, dodatkowego związku(-ów) do otrzymywania kompozycji do zapobiegania lub leczenia infekcji, gdzie wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że wspomniane infekcje są chronicznymi infekcjami wirusowymi.

23. Zastosowanie według zastrz. 21 albo 22, znamienne tym, że wspomniana kompozycja jest w opakowaniu do doustnego podawania.

24. Zastosowanie endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i opcjonalnie, dodatkowego związku(-ów) do otrzymywania kompozycji do zapobiegania lub leczenia stanów alergicznych, gdzie wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że wspomniane stany alergiczne obejmują alergie typu 1, gorączkę sienną i astmę alergiczną.

26. Zastosowanie według zastrz. 24 albo 25, znamienne tym, że wspomniana kompozycja jest w opakowaniu do doustnego podawania.

27. Zastosowanie endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i opcjonalnie, dodatkowego związku(-ów) do otrzymywania kompozycji do przywracania zaburzonej wiekiem równowagi odpornościowej, gdzie wspomniana hemoglobina płodowa łub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że wspomniana kompozycja jest w opakowaniu do doustnego podawania.

29. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że odwracanie wspomnianej, związanej z wiekiem nierównowagi immunologicznej związane jest z aktywacją makrofagów.

30. Zastosowanie endotoksyny lub jej fragmentu o aktywności endotoksycznej, hemoglobiny płodowej lub jej pojedynczego łańcucha(-ów) lub kombinacji jej łańcuchów i dowolnie dodatkowego związku do otrzymywania kompozycji do łagodzenia niekorzystnych skutków ubocznych naświetlania, gdzie wspomniana hemoglobina płodowa lub jej pojedynczy łańcuch(-y) lub kombinacja(-e) jej łańcuchów lub wspomniany dodatkowy związek(-i), nie pochodzi(-ą) z ludzkiej tkanki płodowej.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że wspomniana kompozycja jest w opakowaniu do doustnego podawania.