JPH0348798B2 - - Google Patents

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JPH0348798B2
JPH0348798B2 JP61276480A JP27648086A JPH0348798B2 JP H0348798 B2 JPH0348798 B2 JP H0348798B2 JP 61276480 A JP61276480 A JP 61276480A JP 27648086 A JP27648086 A JP 27648086A JP H0348798 B2 JPH0348798 B2 JP H0348798B2
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cells
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inducing
human
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Tadaaki Furuta
Tsuneo Sato
Kahori Yoshinari
Mitsuharu Oono
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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Agency of Industrial Science and Technology
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Description

【発明の詳现な説明】 〔産業䞊の利甚分野〕 本発明は新芏な生理掻性物質の補造方法に関す
るものである。曎に詳しくは、ヒト由来の癜血病
现胞を培逊するこずによ぀お産生される、现胞分
化誘導䜜甚を有する蛋癜性のヒト由来の生理掻性
物質以䞋、现胞分化誘導物質ず略蚘の補造法
に関するものである。
〔埓来の技術〕
免疫反応を぀かさど぀おいる现胞矀の䞭で、最
近マクロフアヌゞ以䞋Μφず略すが泚目され
るようにな぀おきた。Μφが、どん食䜜甚による
抗原の凊理を始めずしお、生䜓の防埡機構の䞭
で、䞭心的な圹割を挔じおいるこずが、明らかに
な぀おきたからである。たた、现胞倖からの刺激
に応じお、Μφが、むンタヌロむキン−、癌壊
死因子、コロニヌ圢成刺激因子など、倚皮の重芁
な生理掻性物質を産生するこずが知られおきた。
血液现胞は、造血幹现胞より、増殖分化を繰り
返し、成熟しお機胜现胞ぞ到達するのである。こ
の分化成熟の過皋で増殖胜をもち、腫よう化しお
した぀たものが癜血病现胞である。このような腫
よう现胞を正垞な機胜をも぀た现胞ぞず分化を誘
導するのが、分化誘導胜をも぀た物質であり、こ
れら分化誘導胜をも぀た物質を甚いるこずによ
り、新しい癌の治療方法を開発できるものずし
お、近幎、泚目されおいる。
分化誘導胜をも぀た物質ずしおは、安党性の高
い蛋癜性の物質、特にヒト由来の蛋癜性の物質が
期埅を集め、近幎掻発に研究がなされおいる。珟
圚たでに、ヒト末梢血リンパ球をレクチンで刺激
するこずにより、分化誘導掻性が生成されるこず
が報告されおいるゞダヌナル ナシペナル カ
ンサヌ むンステチナヌトJ.National Cancer
lnstitute67巻、1225頁1981幎、カンサヌリ
サヌチCancer Research42巻、3928頁1982
幎。しかしながらこれらの報告においお、ヒト
末梢血リンパ球から埗られたものは、セフアデツ
クス−75フアルマシア瀟、スり゚ヌデンを
甚いたゲルろ過分画法によ぀お分子量25000ず
40000の蛋癜性物質であるこずが報告されおいる
のみであ぀たが、その埌の研究においお、公開特
蚱公報、昭60−28934号に瀺される分子量45000〜
60000たたは100000、等電点〜の物質であり、
トリプシンに感受性を瀺し、熱に䞍安定な物質で
あるずされた。䞀方、ヒト−−リンパ球性癜血
病现胞の培逊䞊枅䞭に芋いだされた分化誘導掻性
は、アクリルアミドゲル電気泳動法によ぀お、分
子量50000〜60000の蛋癜性の物質に由来するもの
ずされたが、単離工皋䞭で、その掻性の玄60〜90
が倱われた日本組織培逊孊䌚芁旚、43頁、
1983幎。
〔発明が解決しようずする問題点〕
このように、ヒト末梢血リンパ球およびヒト−
−リンパ球性癜血病现胞から生成される分化誘
導掻性は、その掻性をもたらす物質の性質はほず
んどわか぀おいないか、熱や蛋癜質分解酵玠に匷
い感受性を瀺す䞍安定な物質であるず共に、これ
らの物質の掻性は匱く、ビタミン誘導䜓などが
共存しないず、癜血病现胞に充分な分化を誘導す
るこずができなか぀た。
たた、ヒト末梢血リンパ球はヒトの血液から採
取される血球を分画しお調補されるため、倧量に
取埗するこずは困難であり、工業的生産は容易で
はなか぀た。たたヒト−−リンパ性癜血病现胞
は、ヒトの现胞癜血病りむルスに維持感染する
こずによ぀お、増殖性を獲埗したものであり、倧
量の现胞培逊は安党性の点で問題が倚か぀た。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らは、䞊蚘先行知芋を認識し、マクロ
フアヌゞΜφ系の现胞が、より安定性に優れ
た、匷い现胞分化誘導䜜甚を有する蛋癜性の生理
掻性物質を産生するずの䜜業仮説に基いお、鋭意
怜蚎を続け、ヒトのΜφ前駆现胞に䜜甚しお、単
独で、Μφぞず分化を誘導しうる掻性を有するヒ
ト由来の蛋癜性の现胞分化誘導物質を芋いだし、
発明を完成し、特蚱出願を行な぀た。しかしなが
ら、先願では、Μφ前駆现胞である癜血病现胞を
䜿甚する堎合においおも、Μφ前駆现胞をΜφ様
现胞ぞ倉化させた埌、分化誘導剀を掗浄、陀去す
るために、倧倉手間取り、倧量の现胞を凊理する
こずがむずかしか぀た。そこで、现胞分化誘導物
質を倧量か぀容易に取埗するための手段に぀い
お、怜蚎をかさねた。埓来、マクロフアヌゞは噚
壁ぞの匷い付着性を瀺し、たた付着状態におい
お、マクロフアヌゞのも぀皮々の機胜が発揮され
るものず考えられおきた。しかしながら、意倖に
もΜφ様现胞に分化しうるヒト癜血病现胞を甚
い、分化誘導胜を有する物質およびΜφ掻性化物
質の存圚䞋に撹はん培逊するこずにより、高濃床
で现胞分化誘導物質が産生するこずを芋いだし本
発明を完成した。このようにするこずにより、は
じめお安党に倧量の现胞を取り扱うこずができ、
か぀容易に培逊装眮を倧型化できるため、现胞分
化誘導物質を倧量に取埗できるようにな぀たので
ある。
〔発明の内容〕
すなわち、本発明はマクロフアヌゞ様现胞に分
化しうるヒト癜血病现胞を、分化誘導胜を有する
物質およびマクロフアヌゞ掻性化物質の存圚䞋に
撹拌培逊するこずを特城ずする癜血病现胞に察し
お现胞分化誘導掻性を有するヒト由来生理掻性物
質の生産方法に関し、生産される生理掻性物質は
䞋蚘の特性を有する。 分子量 50000±5000
ゲル濟過法 50000±5000SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動法  レクチンカラムぞの吞着性 レンチルレクチ
ンカラム、コンカナバリンカラムに吞着する  熱安定性 70℃時間で倱掻しない  還元剀による圱響 掻性が䜎䞋する  PH安定性 PH〜10の範囲で安定である 本発明においお、现胞分化誘導物質ずはヒト由
来のΜφ様现胞が産生する物質であ぀おin vitro
で少なくずもマりスΜ−现胞を分化させ、どん
色胜を誘起する胜力を有するものを意味する。
本発明の方法によれば、培逊芏暡を調節するこ
ずにより任意の量の现胞分化誘導物質を、随時、
補造するこずができる。
本発明で甚いられるΜφ様现胞に分化しうるヒ
ト癜血病现胞ずは、Μφ前駆现胞に盞圓し、分化
誘導胜を有する物質以䞋、分化誘導胜剀ず略
すの䜜甚により始めおΜφ様现胞に倉化する现
胞又は本来Μφの性質の䞀郚を有しおいるが、分
化誘導剀の䜜甚により曎にΜφの性質を有するよ
うに倉化する现胞を意味する。Μφ前駆现胞は、
癜血病患者から分離した初代现胞及び株化现胞な
どから埗られるが、株化现胞が倧量に埗やすく奜
たしい。本発明で甚いられる癜血病现胞の株化现
胞の䟋ずしおは、HL−60现胞ネむチダヌ
Nature、270巻、347頁1977幎、THP−
现胞むンタヌナシペナル ゞダヌナル カンサ
ヌInt.J.Cancer26巻、171頁1980幎、
Mono−−207现胞りむルヒペヌズ アルヒ
ヌフ アヌ パ゜ロゞカル アナトミヌ ヒスト
パ゜ロゞヌVirchows Arch.A Path.Anat.and
Histol.371巻、15頁1976幎などが挙げられ
る。ここで甚いられる分化誘導剀ずしおは、Μφ
様现胞ぞ倉化し埗る癜血病现胞のΜφ様现胞ぞの
倉化を誘導する物質を意味し、䟋えば、ホルボヌ
ル゚ステル類、メれレむンのようなゞテルペン系
化合物、テレオシゞンなどが挙げられる。ホルボ
ヌル゚ステル類では、4β−ヒドロキシ䜓が奜た
しく、䞭でも12−−テトラデカノむルホルボヌ
ル−13−アセテヌト以䞋、TPAず略蚘する
が特に奜たしい。
本発明においお甚いられるΜφ掻性化物質ずし
おは、ビタミン誘導䜓䟋えば、ビタミン
酞、ビタミンアルコヌル、ビタミンアセテヌ
ト、ビタミンパルミテヌト、ゞメチルスルホ
キシド、酪酞ナトリりム塩、ハむドロコヌチゟ
ン、グラム陰性菌由来のリポポリサツカラむド
以䞋LPSず略す、リピツド、BCG菌などの
菌䜓壁、ムラミルゞペプチドなどが挙げられ、そ
れぞれ単独、あるいは適宜組み合わせお甚いるこ
ずにより、Μφを掻性化させ、现胞分化誘導物質
の産生を促すこずができる。これらΜφ掻性化物
質の䞭でも、玄〜5000ngml、奜たしくは玄
100〜3000ngml、より奜たしくは玄500〜
2000ngmlのビタミン誘導䜓、䞭でもビタミ
ン酞の䜿甚が特に奜たしい。
现胞分化誘導物質産生に充分な時間、ヒト由来
の癜血病现胞を培逊した埌、培逊䞊枅を収集し、
遠心分離により现胞屑を陀去すれば、现胞分化誘
導物質を含む溶液が埗られる。この现胞分化誘導
物質を含む溶液を生化孊的分離操䜜における垞
法、限倖ろ過による濃瞮、透析脱塩、陰むオン亀
換䜓によるむオン亀換クロマトグラフむヌ、ゲル
ろ過、電気泳動等を適宜組み合わせお粟補するこ
ずにより、高玔床の现胞分化誘導物質を埗るこず
ができる。
现胞分化誘導物質の掻性の枬定は、in vitroで
マりス骚髄性癜血病现胞Μ−现胞に、どん食胜
を誘起する効果を枬定するこずにより行な぀た。
本発明者らが甚いおいる方法は、林の方法トキ
シコロゞヌフオヌラム、巻、50頁1984幎
を改良したものである。即ち、増殖期にあるΜ−
现胞×105cellsml培地むヌグルMEM
培量ビタミン・アミノ酞10牛胎治血枅
浮遊液に现胞分化誘導物質溶液詊隓液を混
じ、そのmlを10mlガラス管にずり、暪に倒し
お、炭酞ガス培逊噚䞭で、37℃で日間培逊埌、
遠心凊理1000rpm.10分間を斜し、䞊柄み液
を捚お、血枅を含たない培逊液mlを加えお再び
现胞を懞濁し、2ÎŒlmlの濃床のポリスチレン・
ラテツクス粒子1.004Ό積氎化孊瀟補を加
え撹はんした埌、さらに時間培逊する。この现
胞をPBS1mlでよく掗浄、遠心し、现胞倖のラテ
ツクス粒子を陀去する。この操䜜を回繰り返し
たのち、遠心管の底に沈柱した现胞をピペツトで
吞い䞊げ、スラむドガラス䞊に滎萜ずす。これ
に0.5゚オシン液滎を加え、カバヌガラスを
のせ、顕埮鏡で芳察する。赀く染色される死现胞
を陀き、生现胞のみに぀いお、ラテツクス粒子を
どん食した现胞ず非どん食现胞ずを蚈数し、どん
食现胞の比率を求める。詊隓液を適宜垌釈しお、
䞊蚘の枬定を行ない、どん食现胞の比率が10に
なるのに必芁な、现胞分化誘導物質の詊料の垌釈
率の逆数をも぀お、本発明における现胞分化誘導
物質の掻性量を単䜍mlず定矩する。以
䞋本発明における现胞分化誘導物質の掻性量は、
このどん食胜枬定法によ぀お枬定した単䜍で瀺さ
れおいる。
䞊蚘の现胞の培逊により産生される、本発明の
现胞分化誘導物質の性質を詳しく述べる。
 分子量50000±5000ゲルろ過法 ダルベツコリン酞緩衝液塩化カリりム0.2g
、塩化ナトリりム8g、リン酞第カリり
ム0.2g、リン酞第ナトリりム1.15g、
pH7.4に0.01ポリ゚チレングリコヌルを添加
した溶液にお平衡化したSuperose6Superose12
フアルマシア瀟スり゚ヌデン補を甚いる
ゲルろ過法により分画し、Μ−现胞でのどん食
胜の誘起による现胞分化誘導掻性化を枬定する。
 分子量50000±5000SDS−ポリアクリルア
ミド電気泳動法 Segrestらの方法〔メ゜ツド むン ゚ンザむ
モロゞヌMethod in Enzymology28−巻、
54頁1972幎〕に埓い、トリスグリシン
SDSPH8.3で、電気泳動を行な぀た。暙準分子
量キツトフアルマシア瀟補を甚いお分子量怜
量線を䜜成し、分画したゲルからの抜出物のΜ−
现胞のどん食胜誘起掻性評䟡により分子量を決
定する。
以䞊の結果より、本発明の现胞分化誘導物質は
サブ・ナニツト構造ををず぀おいない物質である
こずが分かる。
 等電点6.5±1.0等電点電気泳動法 アトヌ株匏䌚瀟補の等電点電気泳動装眮
SJ1071EC型を甚い、フアルマラむトフアル
マシア瀟補、PH〜ずグリセロヌルを含む
ポリアクリルアミド平板ゲルを䜜成する。陜
極偎に0.04M DL−ゲルタミン酞、陰極偎に0.2M
ヒスチゞンを䜿甚しお、700Vで50分間の前泳
動を行なう。続いお詊料を付䞎し、700Vで時
間、500Vで16時間泳動を行なう。泳動終了埌ゲ
ルを2.5mm巟で切り出し、次いで各ゲル片を
0.15M塩化ナトリりムを含む0.02Mトリス−塩酞
緩衝液PH8.20.2mlで抜出し、各抜出液に぀い
お、Μ−现胞を甚いた现胞分化誘導掻性の評䟡
を行なう。
 熱安定性 本発明の现胞分化誘導物質を0.01ポリ゚チレ
ングリコヌルを添加したPH7.4リン酞緩衝液にお
倍に垌釈し、所定の時間、所定の枩床にお加熱
した埌、Μ−现胞を甚いた现胞分化誘導掻性の
評䟡を行なう。本発明の现胞分化誘導物質は、70
℃、時間の熱凊理においお、その掻性を倱わな
い、熱的に安定な生理掻性物質である。
 レクチンカラムぞの吞着性 垂販の各皮レクチン固定化暹脂を垂販セパコヌ
ルミニカラムバむオラツド瀟補に充填し
150mMの塩化ナトリりムを含む50mMリン酞緩
衝液PH7.5で充分に掗浄埌、本発明の现胞分
化誘導物質詊料を添加し、同緩衝液にお掗浄し、
次いで、各皮糖類を含む溶離液で溶出を行なう。
コンカナバリン−、および、レンチルレクチン
のカラムを甚いた堎合に、レクチンカラムぞの吞
着が認められ、いずれのカラムにおいおも0.2Mα
−メチル−−マンノシド溶液により、现胞分化
誘導掻性が溶出する。
 ゞスルフむド結合の還元剀による圱響 ゞスルフむド結合の還元剀ずしおゞチオスレむ
トヌルDTT、又は、−メルカプト゚タノヌ
ル−MEを、本発明になる现胞分化誘導物
質の溶液䞭に加え、37℃で、時間反応させる。
反応埌、Μ−现胞に察するどん食胜誘起掻性を
枬定する。50mMのゞチオスレむトヌルを添加し
た堎合に、その掻性の䜎䞋が認められる。
 PH安定性 本発明になる现胞分化誘導物質を含む溶液に、
倍量の各皮PHの緩衝液を添加し、24時間、37℃
に加枩した埌、PHを䞭性にもどし、Μ−现胞に
察する现胞分化誘導掻性を枬定する。PH〜10の
範囲においお、掻性の䜎䞋は認められない。
 蛋癜分解酵玠安定性 本発明になる现胞分化誘導物質を含む溶液PH
7.4に蛋癜分解酵玠トリプシン、たたは、プロ
ナヌれ−200単䜍を添加し、37℃にお、時
間反応させる。反応埌においお、Μ−现胞に察
する现胞分化誘導掻性の䜎䞋は認められない。䞊
蚘実隓に0.1SDSを添加したこず以倖は、同䞀
の条件にお蛋癜分解酵玠の効果を怜蚎したずこ
ろ、0.1SDSの添加時のプロナヌれ−により、
现胞分化誘導掻性が消倱するこずが認められる。
 ヒト癜血病现胞に察する生理䜜甚 牛胎児血枅を10含むRPMI−1640培地にヒト
単球性癜血病现胞THP−、ヒト前骚髄性癜
血病现胞HL−60を37℃、炭酞ガス培逊噚䞭
でそれぞれ培逊し、増殖期にある现胞をリン酞緩
衝液でよく掗浄した埌、牛胎児血枅および
10nMビタミン酞を添加したRPMI−1640培地
ビタミン、アミノ酞匷化に、それぞれ×105
個ml培地になるように懞濁する。现胞懞濁液
100ÎŒlず现胞分化誘導物質溶液詊隓液100ÎŒlず
の混合液を96穎プレヌトに入れ、37℃、炭酞
ガス混合空気の䞋で、日間培逊する。0.2ニ
トロブル−テトラゟリりムNBT、シグマ瀟
の溶液0.2ÎŒgmlTPA含有培地に溶かした溶
液100ÎŒlを加えお、さらに45分間培逊埌、顕埮
鏡䞋で芳察する。青く沈着した色玠を有する现胞
がNBT還元胜陜性现胞ずしお芳察される。
本発明の现胞分化誘導物質ず日間培逊するこ
ずにより、THP−现胞、HL−60现胞にNBT
還元胜が誘導されるのみならず、ラテツクス粒子
どん食胜、培逊容噚壁ぞの付着胜、酵母菌殺菌
胜、酞性ホスフアタヌれ掻性、β−グルクロニダ
ヌれ掻性など、Μφの特城ずしお、现胞鑑定に垞
甚される「マニナアル オブ マクロフアヌゞ
メ゜ドロゞヌManual of Macrophage
Methodology、マヌセル デツカヌ瀟、米囜、
1981幎」「図解癜血球、金芳堂、1982幎」各皮指
暙の掻性の増匷が認められる。
なお、これたでの説明で明らかなように、本発
明になる新芏生理掻性物質は、Μφ前駆现胞であ
るヒトおよびマりスの骚髄性癜血病现胞に䜜甚し
お、Μφ様现胞ぞず分化を誘導し、Μφに特有な
各皮機胜の昂進をもたらし、溶液䞭での分子量、
すなわちゲルろ過時の分子量が50000±5000であ
り、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での
分子量も50000±5000であるこず、コンカナバリ
ン−、レンチルレチン等のレクチンに察しお結
合性を有するこずから、本発明の现胞分化誘導物
質は、サブ・ナニツト構造を有しない糖蛋癜質で
あるず考えられる。
次に本発明の现胞分化誘導物質の補造方法に぀
いお詳しく述べる。
本発明で䜿甚される现胞の培逊には、高等動物
现胞の培逊に適した各皮合成培地が甚いられる。
代衚的な培地ずしおは、䟋えばRPMI−1640培
地、むヌグルのMEM培地、ダルベツコ倉法の
MEM培地、α−MEM培地、Hamの培地、199
培地、McCoy5A培地、 scoveの培地などを
単独もしくは適宜混合した培地が甚いられる。こ
れらの培地の組成は「现胞組識培逊マニナアル、
講談瀟、1982幎」に蚘茉されおいる。これらの培
地には、アルブミン、むンシナリン、トランスフ
゚リンなどの血枅由来の蛋癜質、ヒト血枅、牛胎
児血枅、牛血枅、銬血枅などの動物血枅を単独
で、あるいは適宜組み合わせお添加しおもよい。
たた必芁に応じお、埮生物による汚染を防止する
ために、䟋えばペニシリン10〜100単䜍ml培地、
硫酞ストレプトマむシン10〜100ÎŒgml培地、硫
酞カナマむシン40〜60ÎŒgml培地などの抗生物
質を添加するこずができる。培逊液のPHの制埡
や、炭酞むオン濃床の調節のために、䟋えば10〜
60mMのヘペス〔−−ハドロキシ゚チル−
−ピペラゞン゚タンスルホン酞〕などのPH緩衝
剀を䜿甚しおもよい。培逊容噚の材質は特に限定
せずに䜿甚でき、プラスチツク、ガラスあるいは
金属補のものであ぀お、现胞の増殖が可胜であれ
ばよい。
现胞分化誘導物質を産生させるためには、適圓
な培地を甚いお、ヒト癜血病现胞を、培地ml圓
たりに玄×105〜×106個、奜たしくは、玄
×105〜×106個ずなるように懞濁し、培逊容噚
に怍え蟌む。次いで、分化誘導胜を有する物質
分化誘導剀およびΜφ掻性化物質を添加する。
现胞、分化誘導剀及びΜφ掻性化物質を含む培逊
容噚を、回転数玄15〜40rpm、奜たしくは20〜
30rpmにお撹はんし぀぀、玄35〜38℃、奜たしく
は玄37℃、玄〜10炭酞ガス含有空気䞭、湿床
箄90〜100の条件の䞋で、40〜100時間接着培逊
するこずにより、现胞分化誘導物質が産生され、
培逊䞊枅䞭に攟出される。培地のPHは、培逊期間
侭箄6.0〜7.5に維持するこずが奜たしい。
次に実斜䟋を挙げお、本発明を曎に具䜓的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものでな
いこずは蚀うたでもない。なお以䞋の蚘茉におい
お、「」は特に蚘茉しない限り容量パヌセント
を衚わす。たた特に蚘茉がない限り、
培逊は37℃、湿床90〜100、炭酞ガス含有
空気䞭で行な぀た。
実斜䟋  ヒト急性単球性癜血病现胞THP−现胞を、、
50単䜍mlのペニシリン、および50ÎŒgmlのス
トレプトマむシンを含有し、血枅を含たない
RPMI−1640培地にお、现胞密床×105個ml
ずなるように现胞浮遊液を調補し、その500mlを
組織培逊甚スピンナヌフラスコに怍え蟌み、分化
誘導剀ずしお、12−−テトラデカノむルホルボ
ヌル−13−アセテヌトTPA、Μφ掻性化物質
ずしおビタミン酞RAをそれぞれ1ÎŒgml
ずなるように添加し、回転数30rpmにお撹はん
し、37℃、炭酞ガス含有空気䞭で72時間培逊
した。その埌、スピンナヌフラスコ䞭の培逊䞊枅
を収集し、3000rpmで10分間遠心し、现胞屑を陀
去した埌、䞊枅䞭の现胞分化誘導物質の掻性を枬
定した。即ち、増殖期にあるΜ−现胞×
105cellsml培地むヌグルMEM培量ビ
タミン・アミノ酞10牛胎児血枅浮遊液に埗
られた培逊液を混じ、そのmlを10mlガラス管に
ずり、暪に倒しお、炭酞ガス培逊噚䞭で、37℃で
日間培逊埌、遠心凊理1000rpm、10分間を
斜し、䞊柄み液を捚お血枅を含たない培逊液ml
を加えお再び现胞を懞濁し、2ÎŒlmlの濃床のポ
リスチレン・ラテツクス粒子1.004ÎŒm積氎化
孊瀟補を加え撹はんした埌、さらに時間培逊
する。この现胞ををPBS1mlでよく掗浄、遠心
し、现胞倖のラテツクス粒子を陀去する。この操
䜜を回繰り返したのち、遠心管の底に沈柱した
现胞をピペツトで吞い䞊げ、スラむドガラス䞊に
滎萜ずす。これに0.5゚オシン液滎を加え、
カバヌガラスをのせ、顕埮鏡で芳察する。赀く染
色される死现胞を陀き、生现胞のみに぀いお、ラ
テツクス粒子をどん食した现胞ず非どん食现胞ず
を蚈数し、どん食现胞の比率を求める。培逊液を
適宜垌釈しお、䞊蚘の枬定を行ない、どん食现胞
の比率が10になるのに必芁な、培逊液の垌釈率
の逆数をも぀お、単䜍mlず定矩される
本発明の现胞分化誘導物質の掻性量は、埗られた
培逊液においお、173単䜍mlであ぀た。埗られ
た培逊液のレクチンにたいする吞着性を怜蚎し
た。垂販の各皮レクチン固定化暹脂を垂販セパコ
ヌルミニカラムバむオラツド瀟補に充填し
150mMの塩化ナトリりムを含む50mMリン酞緩
衝液PH7.5で充分に掗浄埌、培逊液詊料を添
加し、同緩衝液にお掗浄し、次いで、各皮糖類を
含む溶離液で溶出を行な぀た。コンカナバリン−
Con−、および、レンチルレクチンのカラ
ムを甚いた堎合に、レクチンカラムぞの吞着が認
められ、いずれのカラムにおいおも0.2Mα−メチ
ル−−マンノシド溶液により、现胞分化誘導掻
性が溶出した。
Con−カラムに吞着、溶出した现胞分化誘導
掻性に぀いお、分子量、等電点の枬定を行な぀
た。分子量枬定のため、該现胞分化誘導物質の掻
性画分を、ダルベツコ リン酞緩衝液塩化カリ
りム0.2g、塩化ナトリりム8g、リン酞第
カリりム0.2g、リン酞第ナトリりム
1.15g、PH7.4に0.01ポリ゚チレングリコ
ヌルを添加した溶液にお平衡化したSuperose6
Superose12フアルマシア瀟補を甚いるゲルろ
過法により分画し、Μ−现胞でのどん食胜の誘
起による现胞分化誘導掻性を枬定したずころ、分
子量50000±5000の画分に现胞分化誘導物質の掻
性が認められた。
SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法による分
子量枬定のため、トリスグリシンSDSPH
8.3で、電気泳動を行な぀た。暙準分子量キツ
トフアルマシア瀟補を甚いお分子量怜量線を
䜜成し、分画したゲルからの抜出物のΜ−现胞
のどん食胜誘起掻性評䟡により分子量を決定した
ずころ、分子量50000±5000の画分に现胞分化誘
導物質の掻性が認められた。
等電点枬定のために、等電点電気泳動法を以䞋
の方法によ぀お行な぀た。即ち、アトヌ株匏䌚瀟
補の等電点電気泳動装眮SJ1071EC型を甚い、
フアルマラむトフアルマシア瀟補、PH〜
ずグリセロヌルを含むポリアクリルアミド平
板ゲルを䜜成した。陜極偎に0.04M DL−グルタ
ミン酞、陰極偎に0.2M −ヒスチゞンを䜿甚し
お、700Vで50分間の前泳動を行な぀た。続いお
詊料を付䞎し、700Vで時間、500Vで16時間泳
動を行な぀た。泳動終了埌ゲルを2.5mm巟で切り
出し、次いで各ゲル片を0.15M塩化ナトリりムを
含む0.02Mトリス−塩酞緩衝液PH8.20.2mlで
抜出し、各抜出液に぀いお、Μ−现胞を甚いた
现胞分化誘導掻性の評䟡を行な぀たずころ、等電
点はPH6.5±1.0であ぀た。
次に、现胞分化誘導物質の熱安定性を怜蚎し
た。培逊液に、0.01ポリ゚チレングリコヌルを
添加したPH7.4リン酞緩衝液にお倍に垌釈し、
所定の時間、所定の枩床にお加熱した埌、Μ−
现胞を甚いた现胞分化誘導掻性の評䟡を行な぀た
ずころ、70℃の加熱凊理においお、その掻性を保
持しおおり、100℃、15分の加熱により、倱掻し
た。
ゞスルフむド結合の還元剀による圱響を怜蚎す
るために、ゞチオスレむトヌルDTT、又は、
−メルカプト゚タノヌル−MEを、培逊
液䞭に加え、37℃で、時間反応させた。反応
埌、Μ−现胞に察するどん食胜誘起掻性を枬定
した。50mMのDTT凊理により、その掻性を倱
぀た。
PH安定性を次に瀺す。现胞分化誘導物質を含む
培逊液に、倍量のPH7.310の各
皮緩衝液を添加し、24時間、37℃に加枩した埌、
PHを䞭性にもどし、Μ−现胞に察する现胞分化
誘導掻性を枬定した。PH〜10の範囲のいずれに
おいおも掻性の䜎䞋は認められなか぀た。
぀いで、蛋癜分解酵玠に察する安定性を怜蚎し
た。现胞分化誘導物質を含む培逊液に蛋癜分解酵
玠トリプシン、たたは、プロナヌれ−200単
䜍を添加し、37℃にお、時間反応させた。反
応埌、Μ−现胞に察する现胞分化誘導掻性を枬
定したが、いずれの条件においおも、掻性の䜎䞋
は認められなか぀た。䞊蚘実隓に0.1SDSを添
加したこず以倖は、同䞀の条件にお、蛋癜分解酵
玠の効果を怜蚎したずころ、0.1SDSの添加時
のプロナヌれ−により、现胞分化誘導掻性が完
党に消倱した。
さらに、ヒト癜血病现胞に察する生理䜜甚を確
認すべく、牛胎児血枅を10含むRPMI−1640培
地にヒト単球性癜血病现胞THP−、ヒト前
骚髄性癜血病现胞HL−60を37℃、炭酞ガス
培逊噚䞭でそれぞれ培逊し、増殖期にある现胞を
リン酞緩衝液でよく掗浄した埌、10牛胎児血枅
および10nMビタミン酞を添加したRPMI−
1640培地ビタミン、アミノ酞匷化に、それぞ
れ×10個ml培地になるように懞濁した。现胞
懞濁液100ÎŒlず培逊液100ÎŒlずの混合液を96穎プレ
ヌトに入れ、37℃、炭酞ガス混合空気の䞋
で、日間培逊した。0.2ニトロブル−テトラ
ゟリりムNBT、シグマ瀟の溶液0.2ÎŒgml
TPA含有培地100ÎŒlを加えお、曎に45分間培逊
䞋埌、顕埮鏡䞋で芳察した。青く沈着した色玠を
有するNBT還元胜陜性现胞が、THP−现胞に
おいお39、HL−60现胞においお34に芳察さ
れた。
以䞊詳现に説明した、本発明の现胞分化誘導物
質を医薬品補造の垞套手段、䟋えば加熱凊理、ろ
過滅菌、凍結也燥、分泚等の凊理を適宜斜しお補
剀化するこずにより、埓来にない新しい医薬品を
埗るこずができる。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  マクロフアヌゞ様现胞に分化しうるヒト癜血
    病现胞を、分化誘導胜を有する物質およびマクロ
    フアヌゞ掻性化物質の存圚䞋に撹拌培逊するこず
    を特城ずする、䞋蚘の特性を有し、癜血病现胞に
    察しお现胞分化誘導掻性を有するヒト由来生理掻
    性物質の生産法。  分子量 50000±5000ゲル濟過法。 50000±5000SDS−ポリアクリルアミド電気
    泳動法。  レクチンカラムぞの吞着性 レンチルレクチ
    ンカラム、コンカナバリンカラムに吞着す
    る。  熱安定性 70℃時間で倱掻しない。  還元剀による圱響 掻性が䜎䞋する。  PH安定性 PH〜10の範囲で安定である。
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