JPH02100696A - ヒト由来分化誘導物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は細胞分化誘導活性を有する新規なヒト由来分化
誘導物質に関するものである。

本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣｌ
［ＩＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記法
により表示され、例えば下記の略号が使用される。

なお、アミノ酸などに関し光学異性体がありうる場合は
、特に明示しなければＬ体を示すものとする。

Ｐｒｏ　ニブロリン残基 Ｌｅｕ　：ロイシン残基 １１ｅ　：イソロイシン残基 Ｖａｌ　：バリン残基 へｌａ：アラニン残基 ×　：エドマン分解法にて同定しえない、もしくは同定
が困難なアミノ酸 ［従来の技術］ 近年、免疫反応を担う細胞群の中で、マクロファージ（
以下、Ｍφと略記する）が注目されている。Ｍφは、富
貴作用による抗原物質の生体内処理を始めとして、生体
の防御機構の中で、中心的な役割を演じている。また、
細胞外からの刺激に応じて、Ｍφは、インターロイキン
−１、腫瘍壊死因子、コロニー形成刺激因子など、多種
の重要な生理活性物質を産生ずることが知られてきた。

血液細胞は、造血幹細胞より、増殖分化を経て、成熟し
て機能細胞へと成熟する。この分化成熟の過程で増殖能
をもち、Ｍ［Ｉ癌化したものが白血病細胞である。分化
誘導物質は、このＩＩ！Ｉ瘍細胞を正常な機能をもった
細胞へと分化を促し、新しい癌の治療方法への応用が期
待されている。

なかでも安全性が高いと期待されるヒト由来の蛋白性の
分化誘導物質については、活発に研究がなされてきた。

初期の研究で示された、レクチン刺激したヒト末梢血リ
ンパ球が作り出すとされる分化誘導物質（ジャーナル　
オプ　ナショナルキャンサーインスティチュート　Ｊ、
ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉ−ｔｕｔｅ
　６７Ｓ　１２２５頁（１９８１年）およびキャンサー
　リサーチＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４２巻３
９２８頁（１９８２年））を始め特開昭６０−２８９３
４号など幾多の報告および特許出願があるものの、この
物質を単離しその性質を特定するには至っていない。

しかし注目すべき先行技術もある。マウスの白血病抑制
因子（この物質の精製方法は未だ開示されていない）の
ＤＮＡ配列を解明し、該配列をプローブとして、ヒトの
ゲノムより類似のＤＮＡ配列を捜し出した。そして該Ｄ
ＮＡ配列を酵母にて蛋白に翻訳し、その生理活性を調べ
たところ、マウスの白血病抑制因子と類似の活性を認め
た（ブロシーデインダス　オブ　ナショナル　アカデミ
オブ　サイエンス　米国Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５巻　２６２３頁（１９８８）　
）。

白血病抑制因子は、白血病細胞に対し分化誘導活性を示
すとされている。該先行技術は、マウスにおいて特定し
た生理活性物質の遺伝子に相同性の高い遺伝子配列がヒ
トに存在すること、および酵母で発現せしめた遺伝子産
物の分化誘導機能の存在を示しているが、該物質をヒト
の細胞から単離し、その性質を特定するには至っていな
い。

［発明が解決しようとする問題点］ このように、ヒト末梢血リンパ球、ヒトＴ細胞性白血病
細胞株もしくはヒト骨髄性白血病細胞株などから生成さ
れる分化誘導活性を示す蛋白性生理活性物質を単離しそ
の物質的特定を目指す。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記先行知見を認識しつつ、マクロファ
ージ（Ｍφ）系の細胞が、より安定性に優れた、強い細
胞分化誘導作用を有する蛋白性の生理活性物質を産生ず
るとの作業仮説に基いて、鋭意検討を続けてきた。その
結果、ヒトのＭφ前駆細胞に作用して、単独でＭφへと
分化を誘導する活性を有するヒト由来の蛋白性の細胞分
化誘導物質を見いだし、培養液中に微量に存在する目的
物質を単離精製し、物質的特定を行ない本発明を完成す
るに至った。

本発明において、効果的な目的物質の採取のためにＭφ
の前駆細胞に相当する白血病細胞株を使用する。該細胞
株に分化誘導能を有する物質（以下、分化誘導剤と略記
する）を作用せしめ、Ｍφ様細胞へ変化させた後、培養
液中に目的物質を生産せしめた培養液を単離精製の出発
物質として用いた。

［発明の内容］ すなわち本発明とは、プロリン残基をＰｒｏ、ロイシン
残基をＬｅｕ　、イソロイシン残基をＩｌｅ、バリン残
基をＶａｌ　、アラニン残基をＡｌａ　、シてエドマン
分解法にて同定しえないもしくは同定が困難なアミノ酸
を×と表記するとき、アミノ末端のアミノ酸配列が、Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｘ−Ｐｒｏ−νａｌ−
ＸＡｌａ−Ｘ−Ｘ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｘ−Ｘ−Ｐｒ。

で示され、下記の特性を有する糖蛋白性の生理活性物質
であって、 ａ）分子量　５１，０００±５，０００（ゲルろ過性）
ｓｏ、ｏｏｏ±５，０００（非還元５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法） ｂ）等電点　８．９±０．３（等電点電気泳動法）Ｃ）
レクチン結合性　コンカナバリンＡおよびレンチルレク
チンに結合性を有する ヒトおよびマウスの白血病細胞に対する細胞分化誘導作
用を有するヒト由来の生理活性物質である。

本発明において、細胞分化誘導作用を有する物質とはヒ
ト由来の正常細胞もしくは細胞株が産生ずる物質であっ
て、試験管内で少なくともヒトのＭφ前駆細胞に相当す
る細胞株ＴＨＰ−１、ＨＬ６０およびＵ９３７、そして
マウス間１細胞を分化させ、貧食能を誘起する能力を有
する物質を意味する。

ＴＨＰ−１は、インターナショナル　ジャーナル　オブ
　キャンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　２６
巻、１７１頁（１９８０年）、ＨＬ−６０は、ネイチャ
（Ｎａ　ｔｕｒｅ）　、　２７０巻、３４７頁（１９７
７年）、Ｕ９３７は、インターナショナル　ジャーナル
　オブ　キャンサ−１ｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　１
７巻５６５頁（１９７６年）、Ｍｌは、ジャーナル　オ
ブ　セル　フィジオロジＪ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　７４巻２２３頁（１９６９年）にその細胞の特性
が記載されている。本発明の分化誘導物質を作る細胞は
、正常細胞の利用も可能であるが、潤沢に細胞を準備す
ることは困難である。

一方、細胞株は無限に細胞を増殖することが可能であり
利用し易い。細胞株には特に制限はないが、多量の分化
誘導物質を産生ずる能力を示すＭφの前駆細胞に相当す
る白血病細胞株の利用が好ましく、具体的にはＴＨＰ−
１、ＨＬ−６０およびＵ９３７などの細胞株が該当する
。また分化誘導物質の産生に際し、分化誘導剤を作用さ
せることにより、顕著にその産生量を高められる。具体
的には分化誘導剤として、例えばホルボールエステル類
、メゼレインに代表されるジテルペン系化合物およびテ
レオシジンなどが挙げられる。またホルボールエステル
類では、４β−ヒドロキシ体が好ましく、中でも、１２
−Ｏ−テトラデカノイルホルボルー１３−アセテート（
以下、ＴＰＡと略記する）が適切である。

またＭφの活性化物質であるビタミンＡ誘導体、例えば
、ビタミンＡ酸、ビタミンＡアルコール、ビタミンＡア
セテートそしてビタミンＡアルコールなど、ジメチルス
ルホキシド、酪酸ナトリウム塩、ハイドロコーチシン、
ダラム陰性菌由来のりボポリサンカライド、リピッドＡ
、ＢＣＧ菌などの菌体壁、ムラミルジペプチドなどもそ
れぞれ単独、あるいは適宜組み合わせて用いることによ
り、Ｍφを活性化させ、細胞分化誘導物質の産生を促進
する。

分化誘導物質の産生に充分な時間をかけヒト由来細胞株
を培養した後、培養上清を収集し、遠心分離により細胞
層を除去することにより、分化誘導物質を含む溶液が得
られる。この細胞分化誘導物質を含む溶液を用い、生化
学的単離精製操作、例えば限外ろ過による濃縮および脱
塩、陽イオン交換体および陰イオン交換体によるイオン
交換クロマトグラフィー、レクチンあるいは特異抗体に
よるアフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、電
気泳動等を適宜組み合わせて精製することにより、分化
誘導物質の高純度精製標品が取得できる。

分化誘導物質の活性の測定は、試験管内でマウス間１細
胞に官金能を誘起する効果により行なった。本発明者ら
が用いている方法は、トキシコロジーフォーラム７巻５
０頁（１９８４年）に示された林の方法に改良を施した
方法である。

すなわち、増殖期にある１０万個のＭ１細胞を培地（イ
ーグルＭＥＭ十通常の２倍世のアミノ酸とビタミン助剤
＋１０％牛脂児血清）に加え、試験液（分化誘導活性を
含む）を混じ、０．５ｍｌ　とし、２４ウエル培養プレ
ートに入れ、炭酸ガス培養器中で、３７°Ｃで２日間培
養する。続いて遠心処理（１１０００ｒｐ、１０分間）
を施し、上澄み液を捨て、血清を含まない前述の培養液
０．５ｍｌを加えて再び細胞を懸濁し、終濃度２μｌ／
ｍｌのポリスチレン・ラテックス粒子（１，００４μｌ
Ｙｌ：積木化学製）を加え撹拌した後、さらに４時間培
養する。この細胞を１ｍ！のリン酸緩衝化生理的食塩液
（以下、ＰＢＳと略記する）でよく洗浄、遠心し、細胞
外のラテックス粒子を除去する。この操作を２回繰り返
したのち、遠心管の底に沈殿した細胞をピペットで吸い
上げ、スライドガラス上に１滴落とす。これに０．５％
エオシン液１滴を加え、カバーガラスをのせ、顕微鏡で
観察する。赤く染色される死細胞を除き、生細胞のみに
ついて、１０個以上のラテックス粒子を官女した細胞と
官金していない細胞とを計数し、賞金細胞の比率を求め
る。試験液を適宜希釈して上記条件にて測定を行ない、
富含細胞の比率が１０％になるのに必要な、分化誘導物
質の活性量を１単位と定義する。以下本発明における分
化誘導物質の活性量は、この官金能測定法によって測定
した単位で示されている。

上記の細胞の培養により産生される、本発明の細胞分化
誘導物質の性質を詳しく述べる。

Ａ）分子量：　５１，０００±５　、０００　（ゲルろ
過法）ＰＢＳに０．０１χ（ｗ／ｖ）のポリエチレング
リコール６０００　（以下、Ｐ！ＥＧ６０００と略記す
る）と０．０２Ｘ（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを添加
した？ｆＩ＞＆（以下、緩衝液Ａと略記する）にて平衡
化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　１２、ファ
ルマシア社！！りにてゲルろ過法による分子量を決定す
る。分化誘導物質の溶出位置は２８０ｎｍの紫外部吸収
ならびにＭ１細胞を用いた亥食能測定法を用いる。

参照する分子量の標準物質として、カタラーゼ（２４万
）、牛血清アルブミン（６，７万）、キモトリプシ、ノ
ーゲンＡ　（２，５万）およびチトクロムＣ（１，２５
万）を用いる。

Ｂ）分子量７５０．０００±５，０００（非還元５ＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動法） レムリの方法（ネーチャー　Ｎａｔｕｒｅ　２２７巻６
８０頁（１９７０年））に準じアクリルアミドゲル濃度
１０％にて非還元状態で電気泳動を行なう。また泳動さ
れた蛋白の存在位置は、モリセイの銀染色法（アナリテ
ィ力ル　バイオケミストリーＡｎａ１．Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　２４４巻１９７６頁（１９８１年））によ
る。参照する分子量の標準物質として、フォスフォリラ
ーゼｂ　（９，４万）、生血清アルブミン（６，７万）
、卵白アルブミン（４，３万）、カルボニックアンヒド
ラーゼ（３万）およびソイビイーントリプシンインヒビ
ター（２万）を用いる。

Ｃ）等電点：８．９±０．３（等電点電気泳動法）ＬＫ
Ｂ社製の等電点電気泳動装置（１１０ｍｌ）を用い、ま
た等電点電気泳動担体としてアンフオライン（ＬＫＢ社
製、ｐＨ３，５〜１０と７〜９を４対１で混合し用いる
）を）用いＬＫＢ社の示す作業手順により電気泳動を実
施する。電気泳動終了後、１．５ｄずつにｐＨ勾配が作
成された液を分取し、分化誘導物質の溶出位置は２８０
ｎｍの紫外部吸収ならびにＭ１細胞を用いた官金能測定
法を用いて測定する。

Ｄ）レクチンカラムへの吸着性： 市販の各種レクチン固定化樹脂をセパコールミニカラム
（バイオラド社製）に充填し緩衝液Ａにて充分に洗浄し
た後、本発明の分化誘導物質試料を添加し、更に緩衝液
Ａにて洗浄し、次いで各種糖類を含む溶離液で溶出を行
なう。

コンカナバリンＡ、およびレンチルレクチンのカラムを
用いた場合、レクチンカラムへの吸着が認められ、いず
れのカラムにおいても０．２〜０．５Ｍのα−メチル−
ｄ−マンノースを含む緩衝液Ａにより、分化誘導活性が
溶出する。

Ｅ）アミノ末端のアミノ酸配列： Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−１ｉｅ　−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｘ　−Ａｌａ−Ｘ　−Ｘ　−Ａｌａ−４１ｅ−Ｘ−
Ｘ−Ｐｒｏ− 本発明の分化誘導物質の前期Ａ−Ｄ項の物性値を満たす
高純度精製標品を用い、アミノ末端のアミノ酸配列を決
定する。アプライドバイオシステムズ社のシークエンサ
ーを用い、同社の標準処方にてシーフェンスを求める。

同処方により、１６残基程度までのアミノ酸配列の決定
は可能であるが、ここで×で示した残基は、同定できな
いもしくは同定し難かったアミノ酸であり、糖鎖が結合
したアスパラギン、スレオニンおよびセリン、そしてト
リプトファン、シスチン、アルギニン、ヒスチジンなど
が該当する。本性で配列決定が可能であることは、試料
が高純度であることの証明である。

Ｆ）ヒト白血病細胞に対する生理作用：１０％牛脂児血
清を含むＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地にヒト単球性白血
病細胞株（ＴＨＰ−１）、ヒト前骨髄性白血病細胞株（
ＨＬ−６０）を３７°Ｃ１炭酸ガス培養器中でそれぞれ
培養し、増殖期にて細胞を集め、ＰＢＳでよく洗浄する
。続いて５％牛脂児血清および１０　ｎＭビタミンＡ酸
を添加したＲＰＭｌ−１６４０培地（通常の２倍量のア
ミノ酸とビタミン助剤添加）に加え、それぞれ２０　、
０００細胞を含む懸濁液１００μｌとする。このものと
細胞分化誘導物質溶液（試験液）　１００μｌとの混合
液を９６穴プレートに入れ、３日間培養する。０．２％
ニトロブルーテトラゾリウム（以下、ＮＢＴと略記する
、シグマ社）と０．２μｓ／ｍｌのＴＰＡを含有する培
地１００μｌを加えて、さらに４５分間培養後、顕微鏡
下で観察する。青く沈着した色素を有する細胞がＮＢＴ
還元能陽性細胞として観察される。

本発明の分化誘導物質と３日間培養することにより、Ｔ
ＨＰ−１およびＨＬ−６０細胞にＮＢＴ還元能が誘起さ
れるのみならず、ラテックス粒子官金能、培養容器壁へ
の付着能、酵母菌殺菌能、酸性ホスファターゼ活性、β
−グルクロニダーゼ活性など、Ｍφの特徴として、細胞
鑑定に常用される各種指標の活性の増強が認められる（
マニュアル　オプ　マクロファージ　メソドロジー（Ｍ
ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｏｌｏｇｙ）、マーセル　デツカ−社、米国、１９８
１年、および図解白血球、金芳堂、１９８２年、参照）
。

なお、これまでの説明で明らかなように、本発明になる
新規生理活性物質は、Ｍφの前駆細胞に相当するヒトお
よびマウスの骨髄性白血病細胞に作用して、Ｍφ様細胞
へと分化を誘導し、Ｍφに特有な各種機能の昂進をもた
らし、溶液中での分子量、すなわちゲルろ適時の分子量
が５１，０００±５．０００であり、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動での分子量も５０，０００±５
，０００であること、コンカナバリンＡおよびレンチル
レクチンに対して結合性を有することから、本発明の細
胞分化誘導物質は、糖蛋白質であると考えられる。

また本発明の用途分野としては、医薬品への応用がある
。具体的には、白血病などのＭｆｆｉ　ｍ　ｆｉｌ域、
そして骨形成、消化管などの機能不全に対する治療薬な
どがある。

本発明で使用される細胞の培養には、高等動物細胞の培
養に適した各種合成培地が用いられる。

代表的な培地としては、例えばＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０
培地、イーグルのＭＥＭ培地、ダルベツコ変法のＭＥＭ
培地、α−ＭＥＭ培地、ハムの培地、１９９培地、フシ
コイ５Ａ培地、イスコツの培地などを単独もしくは適宜
混合し、た培地が用いられる。これらの培地の組成は、
底置、「細胞ｍ織培養マニュアル」講談社　１９８２年
に記載されている。これらの培地には、アルブミン、イ
ンシュリン、トランスフェリンなどの血清由来の蛋白質
、ヒト血清、牛胎児血清、牛血清、馬血清などの動物血
清を単独で、あるいは適宜組み合わせて添加してもよい
。

培養容器の材質は特に限定しないが、プラスチック、ガ
ラスあるいは金属製のものであって、細胞の増殖が可能
であり、細胞の接着性に優れたものが好ましい。

次に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。なお以下
の記載において、％は特に記載しない限り容量パーセン
ト（Ｖ／Ｖ）％を表わす。

また特に記載がない限り、培養は３７°Ｃ２湿度９０〜
１００％、５％炭酸ガス含有空気中で行なった。

実施例Ｉ Ａ）培養上清の採取 ヒト単球性白血病細胞株ＴＨＰ−１を、５〜１０％の牛
胎児血清を含むＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地（通常の２
倍量のアミノ酸とビタミン助剤を含む）にて培養した後
、血清を含まない前述の培地（分化誘導剤の１２−〇−
テトラデカノイルホルボールー１３−アセテート（ＴＰ
Ａ）　０．　１　μｇ／ｍｌとＭφ活性化物質のビタミ
ンＡ酸（ＲＡ）　　１μｇ　／　ｍ　Ｉ含む）に細胞を
懸濁し細胞密度６００，０００個／ｍｌ　とした。同溶
液３リツトルをスピナーフラスコ（ベルコ社製）に加え
７２時間培養した。培養終了後上清を収集し、１０００
　ｒｐｍで１０分間、続いて２０００　ｒｐｍで１５分
間遠心し細胞層を除去した。同繰作を繰り返し合計３０
リツトルの培養上清を得た。該上清中の分化誘導物質の
活性をＢ）に示す方法により測定した。

Ｂ）分化誘導物質の活性測定法 増殖期にある１０万個のＭ１細胞を培地（イグルＭＥＭ
十通常の２倍量のアミノ酸とビタミン助剤＋１０％牛脂
児血清）に加え、試験液（分化誘導活性を含む）を混じ
、０．５ｍｌ　とし、２４ウエル培養プレートに入れ、
炭酸ガス培養器中で、２日間培養した。続いて遠心処理
（１０００ｒｐｍで１０分間）を施し、上澄み液を捨て
、血清を含まない前述の培養液０．５ｍｌを加えて再び
細胞を懸濁し、終濃度２μＩ／ｍｌのポリスチレン・ラ
テックス粒子（１，００４μＩ　：積木化学社製）を加
え撹拌した後、さらに４時間培養した。この細胞を１償
１のＰＢＳでよく洗浄、遠心し、細胞外のラテックス粒
子を除去した。この操作を２回繰り返した後、遠心管の
底に沈殿した細胞をピペットで吸い上げ、スライドガラ
ス上に１滴落とし、これに０．５％エオシン液１滴を加
え、カバーガラスをのせ、顕微鏡で観察した。赤く染色
される死細胞を除き、生細胞のみについて、１０個以上
のラテックス粒子を官女した細胞と官女していない細胞
とを計数し、官女細胞の比率を求めた。試験液を適宜希
釈して、上記の測定を行ない、露文細胞の比率が１０％
になるのに必要な、分化誘導物質の活性量を１単位と定
義した。Ａ）で得られた培養液の活性量は、１３８単位
／ｍｌであった。

Ｃ）分化誘導物質の単離精製 得られた培養液のレクチンにたいする吸着性を予備的に
検討した。市販の各種レクチン固定化樹脂を市販セパコ
ールミニカラム（バイオラド社製）に充填し、ＰＢＳに
０．０１χ（−／ν）のＰＥＧ６０００および０．０２
χ（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを添加した溶液（以下
、緩衝液Ａと略記する）で充分に洗浄後、培養液試料を
添加し、同緩衝液にて洗浄し、次いで、各種ＩＪ！ｌを
含む溶離液で溶出を行なった。コンカナバリンＡおよび
レンチルレクチンのカラムを用いた場合吸着が認められ
、いずれのカラムにおいても０．２〜０．５Ｍのα−メ
チル−ｄ−マンノース溶液により、分化誘導活性が溶出
した。

この知見を基に、分化誘導物質の単離精製を実施した。

Ａ）の操作で得られた培養上清を、ゼタブレップ１５（
ＱＡＥ）ディスク（ＡＭＦ社製）に通液し、固形分およ
び酸性夾雑物を除去した。

続いて該溶液をポリスルフォン限外ろ過モジュール（カ
ットオフ分子量１万、旭化成工業）にて濃縮し４４０ｍ
１とした。つぎに該溶液をレンチルレクチン−セファロ
ース（ファルマシア社）を充填したカラム（５０ｍｌ容
量）に吸着させ、０．５Ｍのα−メチル−ｄ−マンノー
スを含む緩衝液Ａにて溶出し６０ｍ１とした。この段階
までで分化誘導活性の５３％が回収された。

つぎに、該粗精製試料を陽イオン交換クロマトグラフ法
にて精製した。液体クロマトシステムとしては、ＰＰＬ
Ｃシステム（ファルマシア社）を用いた。　　０．０１
χ（ｗ／ｖ）のＰＥＧ６０００および０．０２χ（＋＋
／ｖ）のアジ化ナトリウムを含む５０ｍＭメス（２（Ｎ
−Ｍｏｒｐｈ。

１ｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）
緩衝液（ｐＨ５，０、以下、緩衝液Ｂと略記する）で平
衡化したＭｏｎｏＳカラム（５×５、ファルマシア社製
）に塩酸にてｐＨを５．０に合わせた２０ｍ　ｌの粗精
製試料を添加し、緩衝液Ｂで洗浄した後、緩衝液Ｂのｐ
Ｈを６．０とした液（以下、緩衝液Ｃと略記する）にて
再度洗浄し、ＩＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃにて
塩濃度勾配溶出し、活性画分（３ｉ１）を取得した。該
操作を繰り返し粗精製試料の全量処理を施して得られた
活性画分を、同様の処方にて更にＭｏｎｏＳカラム（５
×５、ファルマシア社）にかけ、濃縮精製試料を得た。

次に、該試料を０．０１χ（ｉｙ／ｖ）のＰＥＧ６００
０および０．０２＄（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含
む１０ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ　（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅ
ｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液（ｐＨ８
，８、以下、緩衝液りと略記する）にて平衡化した脱塩
カラム（ＰＤ−１０、ファルマシア社製）に添加し、次
の陰イオンクロマト操作のための緩衝液交換を行なった
。

緩衝液りにて平衡化したＭｏｎｏＱカラム（５×５、フ
ァルマシア社製）に上記操作で得られた試料を添加し、
緩衝液りで洗浄した後、ＩＭの塩化ナトリウムを含む緩
衝液りにて塩濃度勾配溶出し、溶出位置が異なり、分化
誘導活性を示す２つの最終精製標品（標品ＡおよびＢと
名づけだ）各０．５ｍｌを得た。

Ｄ）最終精製標品ＡおよびＢの分子量の測定ゲルろ適法
による分子量は各々、５１　、０００±５，０００であ
った。

緩衝液Ａにて平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｏ
ｓｅ　１２、ファルマシア社製）を用いて分子量を決定
した、分化誘導物質の溶出位置は２８０ｎｍの紫外部吸
収ならびにＭ１細胞を用いた官金能測定法を用い、また
参照する分子量の標準物質として、カタラーゼ（２４万
）、牛血清アルブミン（６゜７万）、キモトリプシノー
ゲンＡ　（２，５万）およびチトクロムＣ（１，２５万
）を用いた。

非還元状態での５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は各々、５０．０００±５，０００であ
った。

レムリの方法に準じアクリルアミドゲル濃度１０％にて
非還元状態で電気泳動を行なった。また泳動された蛋白
の存在位置は、モリセイの銀染色法にて検出した。参照
する分子量の標準物質として、フォスフォリラーゼｂ　
（９，４万）、牛血清アルブミン（６，７万）、卵白ア
ルブミン（４，３万）、カルポニンクアンヒドラーゼ（
３万）およびソイビイーントリプシンインヒビター（２
万）ヲ用いた。

Ｅ）分化誘導物質の等電点の測定 アンフオラインを用いた等電点電気泳動法による等電点
は、標品ＡはｐＩ９．０に、また標品Ｂはｐｒ８．８に
ピークを示し、いづれの標品もｐＩ８．９±０．３の範
囲の等電点を示した。

ＬＫＢ社製の等電点電気泳動装置（１１０ｍｌ）を用い
、また等電点電気泳動担体としてアンフオライン（ＬＫ
Ｂ社製、３．５〜１０と７〜９のｐｌ＋範囲のものを４
対１に混合し用いる）を用いＬＫＢ社の示す作業手順に
より、分化誘導物質の等電点電気泳動を実施した。電気
泳動終了後、１．５ｍｌずつにｐＨ勾配が作成された液
を分取し、分化誘導物質の溶出位置は２８０ｎｍの紫外
部吸収ならびにＭ１細胞を用いた官金能測定法を用いて
測定した。

Ｆ）分化誘導物質に存在する糖鎖の確認コンカナバリン
Ａおよびレンチルレクチン（ファルマシア社製）をセパ
コールミニカラム（バイオラド社製）に充填し、緩衝ｅ
Ａにて充分に洗浄した後、分化誘導物質の最終精製標品
ＡおよびＢを添加し、更に緩衝液Ａにて洗浄し、次いで
０．５Ｍのα−メチル−ｄ−マンノースを含む緩衝液Ａ
により？客用したところ、いづれも分化誘導゛活性の？
客用が認められた。

Ｇ）アミノ末端のアミノ酸配列の決定 Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｘ　−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｘ−＾１ａ−Ｘ　−ＸＡｌａ−１１ｅ−Ｘ−Ｘ−Ｐ
ｒ。

本発明の分化誘導物質の前記Ｄ−Ｆ項の物性値を満たず
最終精製標品ＡおよびＢについて、アミン末端の１６個
のアミノ酸配列を決定した。その結果いづれの標品も、
上記のアミノ末端のアミノ酸配列を示すことが判明した
。アプライドバイオシステムズ社のシークエンサーを用
い、また同社の標卓処方にてアミノ酸配列を求めた。同
処方により、高純度かつ適当量の試料を用いれば１６残
基程度までのアミノ酸配列の決定は通常可能である。

しかし、該分化誘導物質の場合、×で示したが、同定で
きないもしくは同定し難かったアミノ酸が存在していた
。この原因として糖鎖が結合したアスパラギン、スレオ
ニンおよびセリン、そしてトリプトファン、シスチン、
アルギニン、ヒスチジンなどが該当する。末法による配
列の特定より、単離精製を完成し、かつ物質の物理化学
的同定をなしえた。

Ｈ）分化誘導物質の生理機能 ヒト白血病細胞に対する生理作用を確認すべく、牛胎児
血清を１０％含むＲＰ　Ｍ　Ｔ−１６４０培地にヒト単
球性白血病細胞（ＴＨＰ−１）およびヒト前骨髄性白血
病細胞（ＨＬ−６０）をそれぞれ培養し、増殖期にある
細胞をＰＢＳにてよく洗浄した。続いて５％牛脂児血清
および１０ｎＦＩビタミンＡ酸を添加したＲ　Ｐ　Ｍ　
ｌ−１６４０培地（通常の２倍最のアミノ酸とビタミン
助剤を含む）に加え、それぞれ２０．０００細胞を含む
懸濁液１００μｌとする。このものと細胞分化誘導物質
溶液（試験液）１００μｌとの混合液を９６穴プレート
に入れ、３０間培養した。０．２％のＮＢＴと０．２　
ｕ　ｇ／ｍｌのＴＰＡを含有する培地１００μｍを加え
て、さらに４５分間培養後、′Ｊ１微鏡下で観察したと
ころ、青く沈着した色素を有する細胞がＮＢＴ還元能陽
性細胞として観察され、Ｍφ様細胞への分化誘導能が示
された。

実施例２ ヒト前骨髄性白血病細胞株（ＨＬ−６０）を用い実施例
１と同様の操作を施したところ、その培養液中に、約７
０単位／　ｍ　ｌの分化誘導活性が検出され、また該培
養液より、物理化学的および生理機能においても、実施
何重と同一の物理化学的および生物学的特性を存する分
化誘導物質を取得した。

以上詳細に説明した、本発明の分化誘導物質を医薬品製
造の常套手段、例えば加熱処理、ろ過滅菌、凍結乾燥、
分注等の処理を適宜層して製剤化することにより、従来
にない新しい医薬品を得ることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 プロリン残基をＰｒｏ、ロイシン残基をＬｅｕ、イソロ
   イシン残基をＩｌｅ、バリン残基をＶａｌ、アラニン残
   基をＡｌａそしてエドマン分解法にて同定しえないもし
   くは同定が困難なアミノ酸を×と表記するとき、アミノ
   末端のアミノ酸配列が、【アミノ酸配列があります】 で示され、下記の特性を有する糖蛋白性の生理活性物質
   であって、 ａ）分子量５１，０００±５，０００（ゲルろ過法）５
   ０，０００±５，０００（非還元ＳＤＳ−ポリアクリル
   アミド電気泳動法） ｂ）等電点８．９±０．３（等電点電気泳動法） ｃ）レクチン結合性コンカナバリンＡおよびレンチルレ
   クチンに結合性を有する ヒトおよびマウスの白血病細胞に対する細胞分化誘導作
   用を有するヒト由来の生理活性物質。